哺乳动物促乳素变体

本发明涉及哺乳动物促乳素(PRL)变体，及其作为哺乳动物促乳 素受体(PRLRs)拮抗剂的用途，更特别的，作为人促乳素受体(hPRLR) 拮抗剂的用途。

促乳素作为一种垂体前叶激素，具有广泛的生物学活性，其中包 括生乳和生殖两方面的生物活性(BOLE-FEYSOT等，Endocr.Rev.， 19，225-268，1998)。

PRL对靶组织的作用由特异的膜结合受体——促乳素受体介导， 该受体属于细胞因子受体超家族(KELLY等，Endocr.Rev.，12， 235-251，1991)。

最近几年，几项研究表明，PRL也合成于垂体以外的位点(作为 综述，见于BEN-JONATHAN等，Endocr.Rev.，17，639-669，1996)， 例如哺乳动物上皮细胞(GINSBURG和VONDERHAAR，Cancer Res.， 55，2591-2595，1995)或者前列腺(NEVALAINEN等，J.Clin.Invest.， 99，618-627，1997)。另外有研究表明，该激素通过自分泌/旁分泌环促 进了(表达PRLR的)这些细胞的增殖(GINSBURG和VONDERHAAR， Cancer Res.，55，2591-2595，1995；MERSHON等，Endocrinology，136， 3619-3623，1995；CLEVENGER和PLANK，J.Mammary Gland.Biol. Neopl.，2，59-68，1997)。另外，有人认为，正常情况下PRL对某些靶 组织的促生长活性，在病理学条件下可能或多或少参与促进肿瘤的增 长。支持该PRL促肿瘤增长活性的实验证据为：1)在PRL转基因小 鼠中，乳腺瘤的发病延迟期被缩减(WENNBO等，J.Clin.Invest.，100， 2744-2751，1997)，2)相反，在PRL剔除小鼠中，中型T抗原介导的 乳腺瘤延迟出现(VOMACHKA等，Oncogene，19，1077-1084，2000)，或 者3)在PRL-转基因小鼠中发现了大量的前列腺增生(WENNBO等， Endocrinology，138，4410-4415，1997)。

由于临床上用多巴胺激动剂进行治疗未能降低乳腺瘤的进展，长 久以来，PRL被认为在人乳腺癌中扮演了一个微不足道的角色 (MANNI等，Breast Cancer Res.Treat.，14，289-298，1989)。然而，多 巴胺激动剂不能靶向于垂体外PRL的合成，这种合成目前看来在这些 肿瘤增生现象中至少与循环的、垂体分泌的PRL同等重要。开发能与 野生型促乳素(WT-PRL)竞争结合受体、但不能引发下游信号途径的 PRLR拮抗剂，看来是一种阻止或至少减少PRL诱导的肿瘤增生的替 代策略，所述PRL诱导的肿瘤增生可能牵涉乳腺癌以及前列腺增生等 疾病(GOFFIN等，Mol.Cell.Endocrinol.，151，79-87，1999)。虽然有报 道说生长激素(GH)的类似物，如G120K-hGH，可以拮抗 PRLR(GOFFIN等，Endocrino.，1999)，这些类似物也可以拮抗GH的 受体(GHR)。由于这种靶目标的二元性可能不适用于治疗，所以引 发了特异靶向PRLR(而不靶向GHR)的拮抗剂研究。

发明人先前鉴定、定位并表征了该激素上的两个结合位点，称为 结合位点1和2，并提出了顺序均二聚化活化PRLR的模型(GOFFIN 等，Endocr.Rev.，17，385-410，1996)。

基于这些数据，发明人通过在人PRL(hPRL)结合位点2内引 入空间位阻突变，设计了第一代人促乳素受体(hPRLR)拮抗剂，从 而防止了该区域与PRLR分子的有效结合(GOFFIN等，J.Biol. Chem.，271，16573-16579，1996)。在这些类似物中称作G129R-hPRL 的一个类似物中，甘氨酸129(属于位点2)被精氨酸所取代，这产生 了所期望的空间位阻(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，271，16573-16579， 1996；GOFFIN等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994)。

在某些生物测定实验中，发明人证明了该hPRL突变体不再能够 激活PRLR，推测可能是因为受体二聚作用受到了破坏，因此它发挥 了拮抗剂的作用。这些特性首先在涉及人或大鼠PRLR激活响应PRL 的萤光素酶报告基因的生物测定中被证实(GOFFIN等，J.Biol. Chem.，271，16573-16579，1996)，其次在不同人乳腺癌细胞系中信号通 路的激活和增殖中被证实(LLOVERA等，Oncogene，19，4695-4705， 2000)。

然而，因其亲和力降低了10倍，有效的拮抗作用需要该类似物以 与WT-hPRL(10∶1至50∶1)相比明显过量的摩尔数使用。另外，在更 灵敏的生物测定中，例如标准大鼠Nb2细胞增殖生物测定， G129R-hPRL不能发挥出任何拮抗活性(GOFFIN等，J.Biol.Chem.， 269，32598-32606，1994)，并发挥了微弱的激动剂活性，当浓度高于 hPRL时展示了全部的活性。发明人在体外通过采用其他的增殖实验 (用编码hPRLR的质粒转染的Ba/F3细胞)，以及在体内在表达 G129R-hPRL类似物的转基因鼠中证实了G129R-hPRL所残留的激动 剂活性：其中PRLR缺失型小鼠是不育的，并且不能发育出正常的乳 腺(ORMANDY等，Genes Dev.，11，167-178，1997)，而表达 G129R-hPRL类似物的小鼠不具有任何生殖缺陷，并且可以成功地分 泌乳汁，这清楚表明，在体内，G129R-hPRL不能消除PRL介导的 作用。

这些数据清楚地表明：1)在结合位点2内引入空间位阻突变 (G129R突变)改变了PRL的生物学特性，其结果是在某些类似的(人 PRLR介导的)生物测定实验中表现出了拮抗特性，2)然而，这些突 变不能完全防止受体的二聚作用，因为在更敏感的测定中，以及在转 基因鼠中，拮抗特性被G129R-hPRL的内在残留的激动活性所取代。

这样，后者不能在治疗中用作纯促乳素受体拮抗剂，因为它可能 会有与对拮抗剂所期望的相反的作用。

发明人已着手开发更有效的hPRLR拮抗剂。他们先研究了hPRL 的N-末端尾部在其与PRLR结合中的潜在作用。他们已经设计了 hPRL中的N-末端重复缺失，包括去除头9个残基至头14个残基； 野生型hPRL和hGH的N-末端序列以及hPRL的缺失突变体于图1 所示。

图1的图例：

顶部：对齐的PRL(SEQ ID No：1)和GH(SEQ ID No：2)N-末端 序列；PRL中N-末端长了9个残基，包括Cys4和Cys11之间的二硫 键。箭头指示了由同源性模型所预测的推测的螺旋1。

底部：递增的hPRL N-末端缺失。头9个残基(Δ1-9-hPRL)的缺 失模拟了hGH的N-末端，而头14个残基的缺失(Δ1-14-hPRL)去掉 了完整的N-末端尾部。

他们发现，hPRL头9个残基的缺失(Δ1-9-hPRL)轻微地加强了与 PRLR的亲合力，导致了萤光素酶分析实验中与野生型hPRL(WT hPRL)相比最大活性增加，然而头14个残基的缺失(Δ1-14-hPRL)却 导致了亲和力和最大活性的降低(Endocrine Society 82nd Annual Meeting，Toronto，June 21-24 2000，Abstract 613)。

发明人已着手测试去除G129R-hPRL类似物的N-末端对其亲合 力以及拮抗活性的影响。因而，他们通过去除头9个残基(突变体 Δ1-9-hPRL)和去除头14个残基(突变体Δ1-14-hPRL)设计了 G129R-hPRL的两种N-末端缺失。

发明人意想不到地发现，两种突变均彻底清除了G129R-hPRL所 残留的激动剂活性。

不受理论的限制，但可以设想：这些N-末端的缺失损害了Cys4 和Cys11之间二硫桥的形成，并且其他防止所述二硫桥形成的突变可 能也具有降低所残留的激动剂活性的有利效果。

相应地，本发明提供了一种哺乳动物促乳素受体的拮抗剂，其中 所述拮抗剂是哺乳动物促乳素的变体，它具有下述突变：

a)在14个N-末端氨基酸范围内的突变或者系列突变，其中所 述突变或者系列突变可防止Cys4和Cys11之间二硫桥的形成，和

b)在促乳素结合位点2内的空间位阻突变或者系列突变。

破坏Cys4-Cys11二硫桥的形成的突变a)包括例如：包括Cys4和 /或Cys11的缺失，或Cys4和/或Cys11被半胱氨酸之外的氨基酸替代。

突变b)包括特别是PRL结合位点2中的小氨基酸被大的和/或带 电的氨基酸的任何替代，以引入空间位阻。这些突变的例子是例如用 残基诸如Tyr，Phe，Asp，Glu，Arg，Lys或Trp，优选Arg，Lys或Trp替 代Gln122，Leu125，Ser26，Ala22或Gly129中的至少一个残基，优选Ala22， 更优选Gly129。

根据本发明的优选实施方案，突变a)包括缺失PRL的至少4个 N-末端残基，优选PRL的至少9个N-末端残基。

当N-末端的缺失短于11个氨基酸时，突变a)可进一步包括用 除半胱氨酸以外的其他氨基酸替代Cys11残基。这通过避免因游离SH 基团的存在而导致的聚集，进一步使得变体的纯化变得更为容易。

本发明优选的PRL变体是包括如下突变的变体：

-缺失至少9个N-末端残基，最多14个N-末端残基； 和

-G129R替换。

有益的是，本发明的变体是人促乳素(hPRL)变体。

本发明还提供了编码本发明PRL变体的多核苷酸。

本发明的多核苷酸可用公知的重组DNA技术和/或化学DNA合成 法获得。这些方法也可用于向天然存在的DNA序列引入所期望的突 变。

本发明还提供了包含本发明的多核苷酸的重组DNA结构，例如 表达盒(expression cassettes)，其中所述多核苷酸连接了允许调节其 在宿主细胞中转录和翻译的适当的控制序列，并且还提供了包含本发 明的多核苷酸或表达盒的重组载体。

这些重组DNA结构可以采用公知的重组DNA技术和基因工程技 术获得并导入宿主细胞中。

本发明还包括真核或原核宿主细胞，该细胞被编码本发明PRL变 体的多核苷酸转化。

本发明的PRL变体可通过在适于其表达的条件下培养包含含有 编码所述PRL变体的核苷酸序列的表达载体的宿主细胞，并从宿主细 胞培养物中回收所述变体而获得。

本发明还提供了用编码本发明PRL变体的多核苷酸转化的转基 因非人动物，特别是转基因非人哺乳动物。用于制备转基因动物的适 当方法例如公开于：Manipulating the Mouse Embryo，第二版.，作者 HOGAN等，Cold Spring Harbor Laboratory出版，1994年； Transgenic Animal Technology，由C.PINKERT编辑，Academic Press Inc.，1994年；Gene Targeting：A Practical Approach，由A.L. JOYNER编辑，Oxford University Press，1995年；Strategies in Transgenic Animal Science，由G.M.MONASTERSKY和J.M. ROBL编辑，ASM Press，1995年；Mouse Genetics：Concepts and Applications，作者Lee M.SILVER，Oxford University Press，1995 年。

本发明还涉及一种治疗组合物，其包括本发明的PRL变体，或者 编码所述PRL变体的多核苷酸，可选地，与适当的载体和/或赋型剂 相混合。

举例来说，本发明的PRL变体可进一步与一种或多种化学基团相 连，以增加它们的分子量。适当的化学基团的例子包括多元醇，如聚 乙二醇(PEG)，或者异源多肽，优选水溶性多肽，例如血清白蛋白或 其片段。

本发明的治疗组合物可用作PRLR拮抗剂，特别是用于治疗或预 防涉及PRLR介导的作用的疾病，例如在PRL靶组织(乳房、前列 腺、肝、垂体、淋巴细胞)中包括任何形式良性或恶性肿瘤(增生、 发育异常、瘤形成、腺瘤、癌)的肿瘤增生，自身免疫疾病(红斑狼 疮、类风湿性关节炎)，高促乳素血症，有代表性的是，因PRLR过 度刺激所导致的任何疾病(乳腺肥大、生殖性疾病)(BOLE-FEYSOT 等，Endocr.Rev.，1998)。

本发明治疗组合物可通过各种不同途径给药：

它们可系统或单独使用。优选的用药途径是肠胃外途径，包括， 例如肌内、皮下、静脉内、腹膜内，或者局部的肿瘤内注射。

也可采同口服途径，条件是该组合物呈适于口服给药的形式，能 够保护有效成分免受胃肠酶的影响。

在本发明所述治疗组合物包括编码本发明PRL变体的多核苷酸 的情况下，所述核苷酸通常插入表达盒中，使其可以在靶器官或组织 中表达。

表达盒可以以裸露的DNA形式直接转入细胞，或者置于适当的 载体中，例如病毒载体，如，源自腺病毒的载体。

基因转移可在从待治疗的对象身上取出的细胞上离体进行，然后 所述细胞再重新植入该治疗对象体内，或者可以通过直接将该核酸给 予该治疗对象而进行。

对转移方法和/或载体的选择取决于靶器官或组织，和/或取决于 想要短时间表达(短暂表达)还是更稳定的表达。

由于本发明的PRL变体与野生型PRL相比具有更低的PRL受体 亲和力，所以选择给药量以提供与血液和/或靶组织中的内源性PRL 相比大量过量的PRL变体。另一方面，因为本发明的PRL变体缺少 残留的激动剂活性，故可以采用高剂量，而没有出现所不期望的激动 剂活性的危险。在大多数情况下，PRL变体的量为导致与内源性PRL 相比10-100倍过量为宜。如果需要，可以给予导致比内源性的多1000 倍或更多的量的PRL变体。

本发明可由下述附加的记载更进一步地举例说明，并参照举例说 明本发明hPRL拮抗剂的特性的实施例。可以理解，这些实施例的给 出，仅用于举例说明本发明，而不对其构成任何形式的限制。

实施例1：hPRL类似物的产生和纯化

激素类

本研究中所使用的所有PRL(野生型和突变体形式)均通过重组 技术产生：WT hPRL，结合位点2类似物G129R-hPRL(用Arg替换 Gly129)，单个N-末端缺失突变体(Δ1-9-hPRL，Δ1-10-hPRL， Δ1-11-hPRL，Δ1-12-hPRL，Δ1-13-hPRL，Δ1-14-hPRL)，在Δ1-9-hPRL 或Δ1-14-hPRL中引入了突变G129R的双重突变体(产生了 Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-PRL类似物)。

突变的hPRL表达载体的构建

N-末端缺失

构建

以质粒pT7L-hPRL(PARIS等，Biotechnol.Appl.Biochem.，12， 436-449，1990)作为模板，通过聚合酶链式反应(PCR)构建编码 Δ1-9-hPRL，Δ1-10-hPRL，Δ1-11-hPRL，Δ1-12-hPRL，Δ1-13-hPRL和 Δ1-14-hPRL类似物的表达质粒。5′端引物序列对应于缺乏9个 (Δ1-9-hPRL)至14个(Δ1-14-hPRL)N-末端密码子的hPRL cDNA的5′ 端序列。将具有ATG密码子(甲硫氨酸起始密码子)的独特的NdeI 限制性位点(CATATG)插入到5′引物中。将编码Cys11的TGC密 码子突变成编码丝氨酸的TCC。

5′端引物序列如下(5′到3′)：

Δ1-9(SEQ ID No：3)：GGCAT ATGCGATCCCAGGTGACCCTTCG

Δ1-10(SEQ ID No：4)：GGCAT ATGTCCCAGGTGACCCTTCGAG

Δ1-11(SEQ ID No：5)：GGCAT ATGCAGGTGACCCTTCGAGACC

Δ1-12(SEQ ID No：6)：GGCAT ATGGTGACCCTTCGAGACCTGTT

Δ1-13(SEQ ID No：7)：GGCAT ATGACCCTTCGAGACCTGTTTG

Δ1-14(SEQ ID No：8)：GGCAT ATGCTTCGAGACCTGTTTGACC

对于所有的类似物，其3′端引物是相同的；它对应于hPRL CDNA 非编码区的位于独特的HindIII限制性位点3′端的序列(SEQ ID No：9) 5’CTGTTACACCCACGCATGG3’。

PCR反应以如下方式进行：200μM dNTP；45μM MgCl2，1.5μl Taq聚合酶(5u/μl)，PCR缓冲液，10ng模板(质粒pT7L-hPRL)， 每种引物20pmoles。PCR进行25个循环：94℃(30sec)，56℃ (30sec)，72℃(1min)。将PCR产物亚克隆到TA克隆载体(pCR II.1) 上，使用NdeI和HindIII消化重组TA质粒，并将纯化的插入序列 连接到使用同样限制性内切酶线性化的pT7L质粒中。转化后，分析 大肠杆菌(E.coli)BL21(DE3)菌落的DNA成分；提取并消化质粒来 证实预期插入序列的存在，然后测序来核实预期的突变。

蛋白质的产生和纯化

在1升大肠杆菌BL21(DE3)培养物中过量表达重组体WT hPRL 和hPRL类似物，并如前所述进行纯化(PARIS等，Biotechnol. Appl. Biochem.，12，436-449，1990；GOFFIN等，Mol.Endocrinol.，6， 1381-1392，1992)。简而言之，当细菌培养物的OD600达到约0.9时， 使用2mM异丙基硫代半乳糖苷(IPTG)诱导其过量表达4h(4h后 OD600约2.5)。使用细胞粉碎机(Basic Z，Cell D，Roquemaure，法国) 裂解细胞。蛋白作为不能溶解的包含体被过量表达，将该包含体溶解 于8M的尿素中(55℃5分钟，然后室温2h)，并通过对50mMNH4HCO3， pH 8持续透析重新折叠。

使用购于AMERSHAM-PHARMACIA BIOTECH(Orsay，法国) 的层析设备(GRADIFRAC)和柱子(HITRAP Q SEPHAROSE， SEPHACRYL S200 High Resolution)纯化蛋白。

采用了两种备选方案。先将透析过的蛋白离心至少60分钟(9000 xg)以去除聚集物，然后将清澈的上清液混合物装添到阴离子交换柱 HITRAP Q(在pH 8的50mM NH4HCO3中平衡的)上。PRLs在两个 峰中被洗脱，一个主峰在150mM NaCl浓度处洗脱，一个小峰在较高 的盐浓度(～200mM)洗脱。对这些级分的分析型凝胶过滤表明：主 峰对应于单体PRL，而小峰则包含了各种不同的多聚体形式。或者， 使用YM10 MINIPLATE生物浓缩器(MILLIPORE CORP.-AMICON， Bedford，MA；流速500ml/min)，通过切线流超滤法来浓缩重新折叠的 (透析的)蛋白，然后离心(10min，9000xg)浓缩液以去除超滤中形 成的聚积物。使用50mM NH4HCO3，150mM NaCl，pH 8中平衡过的 具具有高分辨率的SEPHACRYL S-200柱子，通过凝胶过滤层析来纯 化上清液。此第二种方案常因为在超滤步骤之中会产生较高的蛋白沉 淀而导致较低的产量。对应于单体hPRLs的级分(从分子筛或阴离 子交换柱中洗脱)被合并起来，定量，等分，并保藏于-20℃。

在还原性(β-巯基乙醇)或非还原性条件下，使用15％SDS-PAGE 来估计蛋白的大小和纯度。以BSA作为参考，通过Bradford蛋白测 定法(BIO-RAD Laboratories，Inc.，Ivry-sur-Seine，法国)来确定蛋白级 分的量。

双重突变体

通过将pT7L-G129R-hPRL质粒(包含G129R突变)(GOFFIN 等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994)中的EcoRI-BglII片段替换 成pT7L-Δ1-9-hPRL和pT7L-Δ1-14-hPRL表达载体中相应的 EcoRI-BglII片段，来构建编码Δ1-9-G129R-hPRL和 Δ1-14-G129R-hPRL类似物的表达质粒。分析获得的克隆来确认插入 片段的存在，然后通过测序以核实预期的突变。采用上面描述的方法 来用BL21(D3)细菌表达类似物并纯化蛋白。

所有在细菌中作为包含体产生的hPRL突变体都能正确地折叠， 这表明各种不同的突变体并没有干扰蛋白的整体构象。这一点通过采 用循环二色性(未给出)分析它们二级结构的成分得到了证实。突变 的hPRL和野生型hPRL之间唯一重复的差别是N-末端的缺失倾向于 增加蛋白折叠后所观察到的单体/多聚体的比率。据信，两个N-末端 半胱氨酸(Cys4-Cys11)的去除阻止了负责这些残基之间分子间二硫 键键合的共价多聚体形成。

实施例2：HPRL类似物对人PRLR的亲和力

结合研究

通过各种不同的hPRL类似物竞争[125I]-hPRL以结合到这一受体 上的能力来评估它们对人PRLR的亲和力。根据先前描述过的步骤 (KINET等，J.Biol.Chem.，274，26033-26043，1999)，使用HL5细胞 (表达人PRLR)的细胞匀浆来确定结合亲和力。

简言之，使用IODOGEN碘化hPRL，其比活性在40-50Ci/μg 之间。在30,000cpm[125I]-hPRL和递增浓度的未被标记的竞争物(野 生的或突变的hPRL)存在的条件下，使用150-300μg细胞匀浆蛋白， 室温过夜，实施结合试验。

通过Scatchard分析计算的WT hPRL对人PRLR(使用HL5细胞 匀浆)的亲和力为Kd值3.4(±1.3)×10-10M(KINET等，J.Biol. Chem.，1999)。

单个N-末端hPRL突变体结合试验。

以从竞争曲线(S型线性部分的回归)计算的hPRL类似物的IC50 和WT hPRL的IC50的比率，来计算hPRL类似物的相对结合亲和力。 图2A中所展现的结果是至少3个独立的一式两份进行的实验的代表。

这些结果表明，头10、11、12或13个残基的缺失不影响hPRL 与其受体的亲和力，但用Δ1-9-hPRL获得的曲线与野生型相比轻微地 向左移，表明亲和力有20％的小的增加，然而Δ1-14-hPRL的曲线向 右移，表明亲和力降低了2-3倍(40％相对亲和力)。

包含G129R的突变体的结合试验

包含有Gly129→Arg突变的3个类似物获得的典型的竞争曲线显 示于图2B中：野生型hPRL(-●-)；单突变体G129R-hPRL(-◆-)； 双重突变体Δ1-9-G129R-hPRL(-■-)；双重突变体 Δ1-14-G129R-hPRL(-▲-)。

与野生型hPRL相比，这三个曲线向右移动了～1数量级，表明对 受体的亲和力降低了10倍。三个独立实验平均来看，对于Δ1-9-G129R 来说IC50为166±47ng/ml，对于Δ1-14-G129R来说是187± 49ng/ml，相比之下WT hPRL的是18±5ng/ml。与G129-hPRL(单 突变体)相比，没有一个N-末端缺失提高了亲和力。

实施例3：HPRL类似物的生物活性

实验方案

Nb2细胞增殖测定

用于催乳激素类的参照生物测定是催乳激素诱导的大鼠Nb2淋巴 瘤细胞增殖。大鼠Nb2淋巴瘤细胞获自P.W.GOUT(Vancouver，加 拿大)，用前述方法培养(BERNICHTEIN等，Endocrinology，142， 3950-3963，2001)。Nb2细胞常规维持于补加了10％HS、10％热失活 FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉素以及100mM β-巯基乙醇的RPMI 1640中。增殖测定如前叙方法进行(TANAKA等， J.Clin.Endocrinol.Metab.，51，1058-1063，1980)，并进行了较小的修 改(BERNICHTEIN等，Endocrinology，142，3950-3963，2001)。简要地 说，在最初的一天，测定采用了96孔平板，每孔2×104个细胞，终体 积为200μl，其中包括激素。激素刺激3天后，通过加入10μl WST-1 四唑盐(Roche，Meylan，法国)评估细胞增殖。该存活试剂被活细胞的 线粒体代谢，导致450nm OD值(OD450)增加，OD值增加与用血细胞 计数器所计数的细胞数成正比(BERNICHTEIN等，Endocrinology， 142，3950-3963，2001)。该实验一式三份或四份，重复进行了至少3次。

人PRLR转录的生物测定(HL5)

HL5克隆是293 HEK成纤维细胞，该细胞用编码人PRLR和PRL -应答报告基因的质粒(包含编码萤光素酶基因的序列，其处在催乳 激素响应元件(LHRE)的6重复序列的控制下，该元件为STAT5的 DNA结合元件)稳定转染(KINET等，J.Biol.Chem.，274， 26033-26043，1999)。

HL5克隆常规培养于加入了10％FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青 霉素、50μg/ml链霉素以及700μg/ml G-418(克隆选择)的 DMEM-Nut F12培养基中。测定采用了96孔平板，每孔5×104细胞 /100μl培养基，培养基中仅含有0.5％FCS。允许细胞粘附过夜，然后 每孔中加入在不含FCS的培养基中稀释的100μl激素。刺激24小时 后，裂解细胞(50μl裂解缓冲液)，然后计数包含于15μl细胞裂解物 中的萤光素酶活性，时间为10秒(BERNICHTEIN等，Endocrinology， 142，3950-3963，2001；KINET等，J.Biol.Chem.，274，26033-26043， 1999)。为避免实验间的偏差，所有待比较的类似物在相同的实验条件 下系统测试。在激动实验中，加入了待测的100μl的[2x]激素(“2x”＝ 与最终所需浓度相比浓缩2倍)，而在拮抗实验中，加入了50μl的[4x] 激素类似物和50μl的[4x]WT hPRL(以获得1μg/ml的终浓度)。

Ba/F3-hPRLR细胞增殖生物测定

Ba/F3-hPRLR细胞是小鼠前-B淋巴细胞，其生长依赖于白介素 -3。Ba/F3-hPRLR细胞是用编码hPRLR的质粒转染，并在生长培 养基中进行了包括G-418处理和用hPRL替代IL-3的双重筛选之 后所获得的。细胞用编码hPRLR的质粒转染(电穿孔)，用G-418 处理后，筛选出了稳定表达受体的群体。Ba/F3-hPRLR细胞用加入了 10％热失活FCS、2mM谷氨酰胺、50U/ml青霉素、50μg/ml链霉 素、500-1000μg/ml G-418、以及10ng/ml WT-hPRL取代IL-3的 RPMI 1640培养基维持。最佳的生物测定条件(细胞数、饥饿时间和 介值等)以WT hPRL为配体进行确定，并是如下条件：在增殖测定 之前，细胞于1％FCS RPMI培养基(加入添加物)中饥饿6小时， 然后，分装于96孔平板，密度为5×104细胞/孔，在相同培养基(排 除了激素)中，终体积为100μl。在激动实验中，加入了100μl的[2x] 激素；在拮抗实验中，加入50μl的[4x]用于测试拮抗特性的激素，和 50μl的[4x]WT hPRL(终浓度为10ng/ml)。3天激素刺激后用10μl WST-1监测细胞增殖。实验一式三份或四份至少重复了三次。

结果

缺失N-末端的类似物

激动作用

Nb2细胞增殖测定

相应于前边的报道，在标准Nb2细胞增殖测定中单体hPRL诱导 细胞增殖，在1-2ng/ml作用最大。

图3A展示了在存在浓度不断增加的hPRL(-●-)，Δ1-9-hPRL (-□-)和Δ1-14-hPRL(-△-)的情况下细胞的增殖；图3B展 示了在存在浓度不断增加的hPRL(-●-)，Δ1-10-hPRL (--*--)，Δ1-11-hPRL(--○--)，Δ1-12-hPRL(--□--)，Δ1-13-hPRL(--◇--)的 情况下细胞的增殖。

本测试的剂量-反应曲线在所有的突变体(Δ1-9-hPRL→ Δ1-14-hPRL)和WT hPRL(EC50的范围从0.57到0.87ng/ml)中相似， 表明N-末端地缺失不会显著地改变本测试中hPRL的促有丝分裂活 性。

Ba/F3-hPRLR细胞增殖生物测定

与用Nb2细胞的测定相反，采用了Ba/F3细胞的hPRLR-介导的 增殖测定展现出了类似物的不同促有丝分裂活性。WT hPRL以剂量 依赖的方式诱导了该细胞群的生长，在～10ng/ml时作用最大，这与在 常规培养基中用10ng/ml hPRL取代IL-3所进行的细胞筛选相关。

图4A展示了在存在浓度不断增加的hPRL(-●-)，Δ1-9-hPRL (-□-)和Δ1-14-hPRL(-△-)的情况下，Ba/F3细胞的增殖； 图4B展示了在存在递增浓度的hPRL(-●-)，Δ1-10-hPRL (--*--)，Δ1-11-hPRL(--○--)，Δ1-12-hPRL(--□--)，Δ1-13-hPRL(--◇--)的 情况下，Ba/F3细胞的增殖。

将用类似物Δ1-9-hPRL、Δ1-10-hPRL、Δ1-11-hPRL、Δ1-12-hPRL 以及Δ1-13-hPRL得到的剂量-反应曲线与用hPRL获得的曲线叠加， 发现生物活性没有改变。相反，Δ1-14-hPRL的曲线向右移动了＞1log， 表现出在本测定中显著地改变活化hPRLR的能力。只要在本测定中 加入足够的激素浓度，所有的类似物均能够诱导最大水平的细胞分裂。

人PRLR转录生物测定(HL5)

图5展示了一个典型实验和三个实验代表性的结果数据，该典型 实验一式两份进行，该图描述了在存在浓度(μg/ml)不断增加的hPRL (-●-)，Δ1-9-hPRL(-□-)，Δ1-14-hPRL(-△-)，Δ1-10-hPRL (--*--)，Δ1-11-hPRL(--○--)，Δ1-12-hPRL(--□--)，Δ1-13-hPRL(--◇--) 时的hPRL的转录活性(以WT hPRL最大值为100％，活性与之相比 得到的百分数)。

该结果表示为对萤光素酶活性的诱导的倍数(即以WT hPRL最 大作用为100％，活性与之相比得到的百分数)。

在本测定中，类似物Δ1-9-hPRL，Δ1-10-hPRL，Δ1-11-hPRL， Δ1-12-hPRL和Δ1-13-hPRL差别不大，其曲线与WT hPRL相比向 左移动(EC50降低了约～2倍)。另外，所有这些类似物所诱导的最大 反应都要高于WT hPRL(120-140％)，反应出了更强的激动特性。

相反，与hPRL相比，Δ1-14-hPRL的活性要小一些，这反应在 它的剂量反应曲线(EC50高了约3倍)及其最大活性(WT激素的60 ％)。

拮抗作用

与其内在的激动活性相一致，在本研究的所有三个生物测定中(未 给出数据)，缺失了N-末端的突变体均未能表现出拮抗活性。

G129R突变体和双重突变体

所有实验均包括单突变体(G129R-hPRL)以及双重突变体 Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL。

Nb2细胞增殖测定

激动作用。图6展示了细胞的增殖，该增殖发生在不含有 hPRL(□)，以及存在浓度递增的纯化的WT hPRL(■)，G129R-hPRL (■)，Δ1-9-G129R-hPRL 和Δ1-14-G129R-hPRL 的情况 下。

WT hPRL在1-2ng/ml诱导最大增殖，而G129R-hPRL的剂量依 赖型的促有丝分裂效应移至高浓度，但是达到(亚)最大增殖。相反， 两个双重N-末端缺失型突变体Δ1-9-G129R-hPRL和 Δ1-14-G129R-hPRL却没有明显的激动活性。

已有报道(GOFFIN等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994； BERNICHTEIN等，Endocrinology，142，3950-3963，2001)，与WT hPRL相比，获自G129R-hPRL的激动作用剂量-反应曲线向右移动 了超过两个log单位，在约0.5至1μg/ml达到最大效应。有趣的是， 当去掉G129R-hPRL的N-末端尾部之后(即在Δ1-9-G129R-hPRL 和Δ1-14-G129R-hPRL类似物中的情形)，该激动活性被完全去除，并 且，即使浓度比导致WT hPRL最大活性的浓度(1ng/ml比10μg/ml) 高多达4个数量级也仍有此现象。

人PRLR转录生物测定(HL5)

激动作用。图7A展示了LHRE-萤光素酶报告基因在存在浓度 不断增加的WT hPRL(■)，以及含有G129R的三个类似物 G129R-hPRL G129R-hPRL Δ1-9-G129R-hPRL 和 Δ1-14-G129R-hPRL 的情况下的活化。

本测试中，G129R-hPRL的激动活性急剧下降，达到的最大水平 ＜2％hPRL活性。类似的，没有双重突变体诱导可检测的萤光素酶活 性，即使在极高(最高至50μg/ml)浓度下测试也是如此。

拮抗作用：结果显示于图7B：

Δ1-14-G129R-hPRL(-■-)，Δ1-9-G129R-hPRL(-▲-)， G129R-hPRL(-◆-)。

与它们对hPRLR的相对亲和力一致，三种类似物的拮抗特性很 相似，但重复显示了如下的活性顺序：G129R-hPRL＞ Δ1-9-G129R-hPRL＞Δ1-14-G129R-hPRL。

Ba/F3-hPRLR细胞增殖生物测定

激动作用：图8A展示了在纯化的WT hPRL(■)，G129R-hPRL Δ1-9-G129R-hPRL 以及Δ1-14-G129R-hPRL 的浓度 不断增加的情况下细胞的增殖。

在10ng/ml获得WT hPRL的最大作用。G129R-hPRL诱导了次 最大增殖，其剂量反应曲线向高浓度移动了2log。相反的，双重突变 体(Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL)没有诱导明显的增殖。

如在Nb2中的测定，获自G129R-hPRL的曲线向右移动了约2 log，达到了与hPRL相比的次最高水平(50-80％)。在高浓度下，hPRL 和G129R-hPRL表现出了钟形的曲线，这是使用这些配体时典型的观 测结果(KINET等，Recent Res.Devel.Endocrinol.，2，1-24，2001)。 Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL均没有表现出任何的激动 活性，即使其浓度高达10μg/ml。

拮抗作用。通过将递增浓度的类似物与固定浓度的WT hPRL (10ng/ml)竞争，进行拮抗测定。图8B展示了细胞的增殖，其中 Δ1-9-G129R-hPRL(-■-)，Δ1-14-G129R-hPRL(-▲-)， G129R-hPRL(-◆-)浓度不断升高，与固定浓度的WT hPRL竞争。

用Arg替代Gly129的三种突变体(G129R-hPRL， Δ1-9-G129R-hPRL和Δ1-14-G129R-hPRL)表现出了类似的拮抗活 性，意味着与WT hPRL产生有效的竞争需要所用的类似物的摩尔数 远远过量(10至50倍)，而不管N-末端是否缺失。至于双重突变体， 对WT hPRL所诱导的活性的竞争性抑制大概反应了拮抗作用的真实 现象，因为这些类似物均没有内在的激动作用(图8A)。相反，由于 G129R-hPRL表现出了明显的激动活性，故在竞争测定中所观察到的 抑制效果大概反应了一种真实的拮抗和自拮抗现象的结合(GOFFIN 等，J.Biol.Chem.，269，32598-32606，1994；BERNICHTEIN等， Endocrinology，142，3950-3963，2001，KINET等，Recent Res.Devel. Endocrinol.，2，1-24，2001)。

实施例4：在野生型Balb-C/J小鼠的肝脏中，Δ1-9-G129R抑制 了PRL-诱导的MAPK活化

用10μg hPRL或不同比率的hPRL与拮抗剂(G129R-hPRL或 Δ1-9-G129R-hPRL)处理8周大的野生型balb-c/J雌鼠。在腹膜内(IP) 注射激素后六十分钟，处死小鼠，迅速收集它们的肝脏，解剖并匀浆 化，然后用常规方法制备细胞溶解物。取70μg溶解物加样到10％的 SDS-PAGE上，接下来液体转移到硝酸纤维素膜上。室温下，用5％ 脱脂乳封闭膜1小时，充分洗涤后，用一级单克隆抗体和它们过夜温 育，该单抗特异针对Erk 1和Erk 2 MAP激酶的活性形式(在苏氨酸 202和酪氨酸204上磷酸化)。充分洗涤后，使用辣根过氧化物酶(HRP) 偶联的二级抗鼠抗体温育膜1h。通过增强了的化学发光(ECL)和其 后的放射自显影显示出免疫印迹。

用脱膜缓冲液对膜进行去杂交，50℃，30min，并在洗涤和重新 封闭后，用多克隆抗-Erk1/Erk2抗体重新探测，该抗体能同时识别 活性和无活性形式的Erk1和Erk2 MAP激酶。接下来，在与HRP- 偶联的抗兔抗体温育后显示印迹。

结果如图9所示：

A：抗-MAPK印迹：

上图(MAPK-P)：磷酸化的MAPK；

底图：总MAPK(MAPK)

B：MAPK-P印迹(上图)的光密度定量

这个实验显示了，通过IP注射10μg hPRL而诱导的MAP激酶 的活化被50倍摩尔过量的Δ1-9G129R-hPRL拮抗剂所抑制。相反， 即使在更高摩尔比率(100倍)，G129R-hPRL也不能降低MAPK的 活化，甚至显示出对它有增强作用。

实施例5：在野生型balb-c/J小鼠的可分泌乳汁的乳腺中， Δ1-9-G129R抑制PRL-诱导的STAT3和STAT5的活化

拮抗作用

用200μg溴代隐亭(bromocriptine)处理(IP)8周大且分泌乳汁 (10-12天)的野生型balb-c/J雌鼠，以降低内源PRL的循环水平(溴 代隐亭是一种多巴胺类似物，是脑垂体促乳素分泌的天然抑制剂)。5h 后，仅用10μg hPRL或者用1∶100的hPRL：Δ1-9G129R-hPRL处 理(IP)小鼠。然后处死小鼠；取出第四个乳腺(右边和左边)，并用 常规方法合并和匀浆化。将总细胞溶解物(2mg)用于免疫沉淀(4℃， 旋转过夜)，其中分别使用抗-STAT5的多克隆抗体或抗-STAT3的多克 隆抗体。然后，用20ul蛋白A琼脂糖浆在旋转条件下保温1小时，来 捕获免疫复合物。通过离心沉淀蛋白A复合物，洗涤沉淀颗粒，然后 在还原性样品缓冲液中煮沸5min。在7.5％SDS-PAGE上电泳，随后 按实施例4所描述的方法作western印迹分析免疫沉淀的样品。

该实验中所使用的一级抗体(多克隆)特异识别Stat5和Stat3的 活化形式(分别是抗磷酸化的STAT5和抗磷酸化的STAT3)。解杂交 后，用可识别总(磷酸化和非磷酸化形式)Stat5和Stat3的多克隆抗 体重新探测膜。

结果如图10所示：

A：抗-STAT印迹：

上图(P-Stat5和P-Stat3)：磷酸化的Stat5和磷酸化的Stat3；

下图(Stat5和Stat3)：总的Stat5和Stat3。

B：抗磷酸化STAT印迹(上图)的光密度定量

结果表明，加入100倍摩尔过量的Δ1-9G129R-hPRL可抑制在分 泌乳汁的乳腺中由PRL诱导的STAT3和STAT5的活化。

实施例6：在转入人PRL、大鼠PRL和G129R-人PRL的转基因 小鼠前列腺中，Δ1-9-G129R抑制PRL-诱导的MAPK组成型活化

MAPK 活化的生物测定

激动剂(PRL；G129R-hPRL)

该体内生物测定使用了表达处在遍在金属硫蛋白启动子调控下的 人PRL或G129R-hPRL(Tg Met-hPRL和Tg Met-G129R)、或者表 达处在前列腺特异性probasin启动子调控下的大鼠PRL(Tg Prob- rPRL)的转基因小鼠(雄性)。

处死1年大的转基因雄鼠；取出泌尿生殖道，在显微镜下解剖前 列腺，将腹侧叶与背外侧叶分离开。然后将背外侧叶匀浆化，按常规 的方法制备细胞溶解物。如实施例4中描述的肝脏那样，取70ug溶解 产物加载到10％SDS-PAGE上来检测Erk 1和Erk 2 MAPK的自发活 化。

结果如图11所示：

A：抗MAPK印迹：

上图(MAPK-P)：磷酸化的MAPK；

下图(MAPK)：总MAPK。

B：MAPK-P印迹(上图)的光密度定量

该实验表明：与未转基因的同窝出生的小鼠(野生型)相比，在 所有转基因小鼠系背外侧前列腺叶中，MAP激酶被组成型活化。这表 明前列腺中局部产生PRL导致了该组织中MAPK的活化。

此外，图11显示，G129R-hPRL还展示出与野生型促乳素相当的 体内激动活性。 

拮抗剂(Δ 1-9G129R-hPRL)

向7个月大的雄鼠中注射(IP)1mgΔ1-9G129R-hPRL 60分钟， 这些鼠是在前列腺特异性probasin启动子的调控下表达大鼠PRL的 转基因鼠谱系来源的。然后处死这些鼠。取出泌尿生殖道，在显微镜 下解剖前列腺，以将腹侧叶与背外侧叶相分离。将这些组织匀浆化并 按常规的方法制备细胞溶解物。取70vg裂解物加样到10％SDS-PAGE 上，接下来按实施例4中所描述的那样进行western印迹。

结果如图12所示：

A：抗-MAPK印迹：

上图(MAPK-P)：存在(+)或不存在(-)Δ1-9G129R-hPRL 突变体的前列腺腹侧和背外侧叶中的磷酸化MAPK；

下图(MAPK)：相同样品中总的MAPK。

B：抗-磷酸化MAPK-P印迹(上图)的光密度定量

该实验表明，通过注射Δ1-9G129R-hPRL在两个叶中抑制了前列 腺中PRL局部表达引起的MAP激酶的组成型激活(自分泌-旁分泌 效应，见图11)。

                          序列表

<110>  INSERM

GOFFIN，Vincent

BERNICHTEIN，Sophie

KELLY，Paul A

<120>  哺乳动物促乳素变体

<130>  MJPbv598/62

<160>  9

<170>  PatentIn version 3.1

<210>  1

<211>  38

<212>  PRT

<213>  人

<220>

<221>  VARIANT

<222>  (1)..(9)

<223>  delta 1-9 hPRL

       缺失

<220>

<221>  VARIANT

<222>  (1)..(10)

<223>  delta 1-10 hPRL

       缺失

<220>

<221>  VARIANT

<222>  (11)..(11)

<223>  delta 1-9 hPRL和delta 1-10 hPRL

       用Ser取代Cys

<220>

<221>  VARIANT

<222>  (1)..(11)

<223>  delta 1-11 hPRL

       缺失

<220>

<221>  VARIANT

<222>  (1)..(12)

<223>  delta 1-12 hPRL

       缺失

<220>

<221>  VARIANT

<222>  (1)..(13)

<223>  delta 1-13 hPRL

       缺失

<220>

<221>  VARIANT

<222>  (1)..(14)

<223>  delta 1-14 hPRL

       缺失

<400>  1

Leu Pro Ile Cys Pro Gly Gly Ala Ala Arg Cys Gln Val Thr Leu Arg

1               5                   10                  15

Asp Leu Phe Asp Arg Ala Val Val Leu Ser His Tyr Ile His Asn Leu

            20                  25                  30

Ser Ser Glu Met Phe Ser

        35

<210>  2

<211>  29

<212>  PRT

<213>  人

<400>  2

Phe Pro Thr Ile Pro Leu Ser Arg Leu Phe Asp Asn Ala Met Leu Arg

1               5                   10                  15

Ala His Arg Leu His Gln Leu Ala Phe Asp Thr Tyr Gln

            20                  25

<210>  3

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  3

ggcatatgcg atcccaggtg acccttcg                                    28

<210>  4

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  4

ggcatatgtc ccaggtgacc cttcgag                                     27

<210>  5

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  5

ggcatatgca ggtgaccctt cgagacc                                     27

<210>  6

<211>  28

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  6

ggcatatggt gacccttcga gacctgtt                                    28

<210>  7

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  7

ggcatatgac ccttcgagac ctgtttg                                     27

<210>  8

<211>  27

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  8

ggcatatgct tcgagacctg tttgacc                                     27

<210>  9

<211>  19

<212>  DNA

<213>  人工序列

<220>

<223>  引物

<400>  9

ctgttacacc cacgcatgg                                              19