转基因动物及其用途

发明背景

通过同源重组进行基因寻靶是特异性修饰目的基因的有力手 段。胚胎干细胞(ES)的可用性已有助于在小鼠中研究基因功能。 在非鼠科哺乳动物物种中，ES细胞的缺乏已经通过在原代体细胞中 进行基因寻靶、随后进行核转移而克服。尽管有分子生物学技术的进 展，原代细胞中的基因寻靶在给定低同源重组频率(McCreath等人， (2000)Nature 405：1066-1069)、原代细胞短寿命及允许选择正确靶 定的细胞的方法有限时仍然是一种挑战。目前，主要以转录活性基因 实施原代细胞基因寻靶及子代的产生，相对于沉默基因，所述转录活 性基因与较高的同源重组频率有关(Denning等人，(2001)Nat. Biotechnol.19：559-562)。另外，可以通过靶定的基因启动子驱动选择 标记表达而选择正确靶定的细胞，这是不能应用于沉默基因的方法 (Denning等人，如上；Lai等人，(2002)Science 295：1089-1092；Yifan 等人，(2002)Nat.Biotechnol.20：251-255；Thomson，A.J.等人，(2003) Reprod.Suppl.61：495-508)。

为了充分评价基因修饰的后果，需要破坏基因的两个等位基因。 在小鼠中，这通常通过从半合子转基因建立者动物(founder animal) 回交以产生纯合靶定的近交系来实现。培育至纯合性在小鼠中是极为 耗时的，而且甚至在具有长世代间隔以及受近交后果负面影响的物种 中代表更严重的障碍。在猪中已使用两条创新途径以克服此限制并产 生纯合β(1，3)-半乳糖基转移酶敲除动物。关于酶活性缺乏体外选择半 合子靶定的原代细胞，并从纯合敲除细胞系制备克隆的子代，所述酶 活性缺乏由该基因第二个等位基因中自发的点突变(Denning等人， (2003)Reproduction 126：1-11)或有丝分裂重组(Piedrahita(2000) Theriogenology 53：105-16)引起。不幸的是，这些途径既不能普遍 用于沉默基因，也不能广泛应用于活性基因。因此，需要在非人类哺 乳动物中研究基因功能的改进方法。

基因修饰动物中的抗体产生

1890年，Shibasaburo Kitazato和Emil Behring报道了具有惊人 结果的实验；具体而言，他们证实可以通过从免疫动物取血清并将其 注射到非免疫动物体内而将免疫性从一个动物转移到另一个动物。这 个划时代的实验建立了将被动免疫引入临床实践的基础。如今，针对 被动免疫的人免疫球蛋白的制备及用途是标准的医学实践。仅在美 国，关于人免疫球蛋白就有每年14亿美元的市场，且每年有16公吨 以上的人抗体用于静脉内抗体治疗。在大多数高度工业化国家经济当 中存在相当的消费水平，而且可以预期该需求在发展中国家快速增 长。目前，从集中的人类供体血清获得用于被动免疫的人抗体。这意 味着在可用于治疗和预防用途的人抗体量中存在固有局限。需求已经 超过供应，且可用性的严重不足已经普遍。

在克服某些与人免疫球蛋白供应不足相关问题的努力中，各种技 术得到开发。例如，通过重组方法在组织培养中产生人免疫球蛋白是 常规的。具体而言，人免疫球蛋白在CHO表达体系中的重组表达广 为人知，并且目前用于产生当今治疗性用途中的若干人免疫球蛋白和 嵌合抗体。

为了产生人抗体(例如单克隆抗体)，也开发了保留未重排的人 免疫球蛋白基因的小鼠(见，例如PCT公开号WO98/24893； WO96/33735；WO97/13852；WO98/24884；WO97/07671；以及美国 专利号5,877,397；5,874,299；5,814,318；5,789,650；5,770,429； 5,661,016；5,633,425；5,625,126；5,569,825；及5,545,806)。

PCT公开号WO00/10383描述了修饰人染色体片段并通过微细 胞融合将该片段转移到某些细胞中。美国专利号5,849,992和 5,827,690描述了在转基因动物(包括小鼠、羊、猪、母牛和山羊) 乳中产生单克隆抗体，其中所述转基因动物在启动子控制下表达人免 疫球蛋白基因，所述启动子提供在哺乳动物上皮细胞内表达抗体。这 基本上引起在这类动物(例如母牛)乳中表达抗体。美国专利公开号 2003-0037347-0描述了在克隆的转基因有蹄类动物体内表达异种人 免疫球蛋白。

尽管如此，产生适用作异种抗体生产的宿主的有蹄类动物的改进 方法对于该行业是很有价值的。

朊病毒蛋白质缺陷牛的产生

细胞朊病毒蛋白质PrPC是遍在表达的质膜糖基磷脂酰肌醇锚着 的糖蛋白。该蛋白质在传染性海绵状脑病(transmittable spongiform encephalopathies)(例如家畜BSE及人Creutzfeldt-Jakob病(CJD)) 的发病机理中起重要作用。其与疾病有关的抗蛋白酶同种型PrPSc具 有将正常PrPC转变为PrPSc的能力，并且被认为是海绵状脑病的发 病机理和传播所必需的。尽管PrPSc在神经元内的累积与致死性神经 变性有关，但该蛋白质的正常生理学功能尚不清楚。已经产生了破坏 限于PrP基因编码区的小鼠，而且所述小鼠仅显示轻微的表型缺陷。 重要的是，它们抵抗PrPSc感染，从而提示PrPC对于朊病毒疾病发 病机理是必要的(Prusiner等人，(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 90：10608-10612；Weissmann等人，(1994)Ann.NY Acad.Sci. 724：235-240)。

BSE首先于1986年在英国被认识，且目前已经蔓延到全世界许 多国家。BSE可以通过直接消费污染的牛肉产品而从家畜传播给人， 从而导致CJD的变形(vCJD)。目前，该致死性疾病尚无治愈。为 了降低暴露于致病性PrPSc蛋白质的危险，许多国家已实施了昂贵的 测试程序并开始努力从大量产品中去除牛成分。在PrP基因等位基因 具有纯合无效突变的家畜可用于减轻对BSE污染的牛产品的顾虑。 另外，除了小鼠外，这些动物可以用作研究PrP在BSE中的作用的 模型。

发明概述

总体而言，本发明涉及基因修饰的非人类哺乳动物(例如牛和其 他有蹄类动物)以及产生这些哺乳动物的方法。具体而言，本发明涉 及内源性IgM重链和/或朊病毒蛋白质水平降低的转基因有蹄类动 物。

IgM重链蛋白质降低的转基因有蹄类动物

我们发现牛具有两个IgM重链编码基因，每个都得到表达并经 历VDJ重排。另外，我们已使用同源重组以在牛成纤维细胞中破坏 这些基因的每一个，所述成纤维细胞然后可以在克隆方法中使用以制 备功能性IgM降低、基本消除或消除的转基因牛。

尽管在其他有蹄类动物中仅鉴定了一个IgM编码基因，但由于我 们的发现，可能存在其他这类基因。

本发明的转基因有蹄类动物可用于例如产生异种免疫球蛋白和 异种造血干细胞、以及体内维持异种组织和器官。

因此，本发明涉及转基因有蹄类动物，所述转基因有蹄类动物相 对于对照有蹄类动物产生低于10％的内源性IgM重链，且其基因组包 含IgM重链编码基因(例如牛IgμU或牛IgμAY)的突变。希望该有蹄 类动物相对于匹配的对照有蹄类动物产生低于5％、2％或甚至1％。 最希望该有蹄类动物不产生IgM重链或IgM水平低于蛋白质印迹的检 测。

在一个实施方案中，有蹄类动物是其基因组在两个IgM重链编码 基因的每一个中都包含突变的转基因有蹄类动物。希望至少一个突变 是纯合突变，且更希望两个突变均为纯合突变。突变可以是插入、缺 失或置换，但是最希望是通过例如同源重组插入外源核酸而实现。虽 然该有蹄类动物可能仍然产生一些功能性IgM重链，但最希望以所有 功能性IgM重链都丧失作为突变结果。

本发明以牛为例，但是同样可应用于其他有蹄类动物(例如绵 羊、猪和公山羊)。在牛的情况下，两个IgM编码基因是IgμU和 IgμAY。

有蹄动物可以是成年有蹄类动物、有蹄类动物胎儿或有蹄类动物 胚胎。

本发明也涉及(i)转基因有蹄类动物体细胞，其基因组包含如上所 述两个编码IgM重链的基因的突变，以及(ii)转基因牛体细胞，其基因 组包含IgμAY的半合子或纯合突变。合适的细胞包括成纤维细胞、上 皮细胞、内皮细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、 软骨细胞、淋巴细胞(B细胞和T细胞)、巨噬细胞、单核细胞、单 核的细胞、心肌细胞、其他肌细胞、以及表皮细胞。

本发明另外涉及产生异种抗体的方法。一个这种方法包括步骤： (a)提供本发明的转基因有蹄类动物，所述有蹄类动物具有移入的异种 造血干细胞；以及(b)从所述有蹄类动物(例如从血清或乳)回收异 种抗体。

另一个产生异种抗体的方法包括步骤：(a)提供本发明的转基因有 蹄类动物，所述有蹄类动物具有编码全部或部分异种免疫球蛋白基因 的核酸，所述核酸经历重排并表达异种免疫球蛋白；(b)给该有蹄类 动物施用一种或多种目的抗原；以及(c)从该有蹄类动物回收异种抗 体。

本发明也涉及扩增异种造血干细胞的方法，所述方法通过(a) 提供本发明具有移入的异种造血干细胞的转基因有蹄类动物；以及 (b)使异种造血干细胞在所述转基因有蹄类动物内扩增来实现。如 果需要，可以从该转基因有蹄类动物收集扩增的造血干细胞。

本发明也涉及体内维持所需组织或器官的方法，所述方法通过： (a)提供本发明的转基因有蹄类动物；(b)将所需异源或异种组织或 器官(例如皮肤、心脏、肺、胰、肝或肾组织)移入该有蹄类动物； 并(c)在动物中维持所述组织或器官来实现。

在本发明前述任何方面中，转基因有蹄类动物可任选地具有一个 或多个编码所有或部分异种免疫球蛋白基因的核酸，所述核酸经过重 排并表达一种或多种异种免疫球蛋白。在优选的实施方案中，编码所 有或部分异种基因的核酸基本是人的。核酸优选编码异种抗体，例如 人抗体或多克隆抗体。在各个实施方案中，免疫球蛋白链或抗体表达 于血清和/或乳中。在其他实施方案中，核酸包含在染色体片段中， 例如ΔHAC(FERM BP-7582，International Patent Organism Depository，National Institute of Advanced Industrial Science and Technology，Tsukuba Central 6，1-1，Higashi 1-Chome Tsukuba-shi， Ibaraki-ken，305-8566，日本)或ΔΔHAC(FERM BP-7581)。在另一些 实施方案中，该核酸独立于宿主染色体而维持在有蹄类动物细胞中。

在本发明任何方面的其他实施方案中，有蹄类动物具有内源性 α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因、PrP基因、和/或J链基因的一个或两个 等位基因的突变。在其他优选实施方案中，有蹄类动物具有编码外源 J链(例如人J链)的核酸。该突变优选降低或消除内源性α-(1，3)-半乳 糖基转移酶、半乳糖基(α1，3)半乳糖表位、朊病毒蛋白质和/或J链的 表达。在其他优选实施方案中，有蹄类动物含有异种J链核酸，例如 人J链核酸。有蹄类动物优选产生含有人J链的人IgA或IgM分子。在 本发明各个实施方案中，用于突变内源性有蹄类动物核酸的核酸(例 如敲除盒，其包含和选择标记编码核酸可操作地连接、并和与待突变 基因具有相当大序列同一性的核酸可操作地连接的启动子)不包含于 病毒载体(例如腺病毒载体或腺伴随病毒载体)中。例如，核酸可以 包含于质粒或人工染色体中，使用不涉及细胞的病毒感染的标准方法 (例如转染或脂转染)，将所述质粒或人工染色体插入有蹄类动物细 胞。在另一个实施方案中，用于突变内源性有蹄类动物核酸的核酸(例 如敲除盒，其包含和选择标记编码核酸可操作地连接、并和与待突变 基因具有相当大序列同一性的核酸可操作地连接的启动子)包含于病 毒载体(例如腺病毒载体或腺伴随病毒载体)中。根据所述实施方案， 使用含有病毒载体的病毒感染有蹄类动物细胞，从而引起部分或全部 病毒载体插入有蹄类动物细胞。

有蹄类动物优选为牛、绵羊、猪或公山羊。优选转基因有蹄类动 物表达来自其他属的免疫球蛋白链或抗体，例如来自任何其他哺乳动 物的抗体。尤其优选的有蹄类动物为羊、大角羊(big-horn sheep)、 水牛、山羊、羚羊、牛、马、驴、骡、鹿、麋鹿、北美驯鹿、水牛、 骆驼、美洲驼(llama)、羊驼、猪和象。

本发明也涉及产生转基因有蹄类动物(例如转基因牛)的方法， 所述转基因有蹄类动物重排并表达异种(例如人)免疫球蛋白基因 座。这可以通过例如将含有免疫球蛋白基因的人染色体片段稳定引入 有蹄类动物以产生转基因有蹄类动物而实现，所述转基因有蹄类动物 具有的B细胞除了内源性免疫球蛋白外还产生异种免疫球蛋白、或产 生异种免疫球蛋白取代内源性免疫球蛋白。这也可以通过将编码异种 免疫球蛋白链或异种抗体的核酸整合到有蹄类动物染色体中而实 现。转基因有蹄类动物在至少两个IgM编码基因具有突变，从而降低 或消除内源性IgM的表达。在一个实施方案中，本发明涉及产生转基 因有蹄类动物(例如转基因牛)的方法，所述转基因有蹄类动物中至 少两个μ恒定区遭到破坏，并且已稳定整合了人工染色体，所述人工 染色体含有编码另一个物种的免疫球蛋白(优选人)的基因座。

本发明也涉及产生有蹄类动物体细胞或胚胎干细胞(ES)(优选 成纤维细胞或B-细胞)的方法，其中通过例如同源重组已破坏至少两 个内源性IgM重链基因的一个或两个等位基因。

本发明也涉及将核酸(例如人工染色体)插入有蹄类动物中的方 法，所述核酸含有足以功能性表达非有蹄类动物免疫球蛋白或其重或 轻链的基因，所述有蹄类动物中至少两个内源性IgM重链基因已被破 坏。这些免疫球蛋白优选为人免疫球蛋白，其通过将编码这些免疫球 蛋白或免疫球蛋白链的核酸引入有蹄类动物体细胞(优选成纤维细 胞)、并产生克隆的有蹄类动物而产生，所述克隆的有蹄类动物中该 核酸被传递到生殖系。

本发明也涉及将人工染色体(优选人人工染色体(HAC))引入 前述纯合敲除细胞并产生有蹄类动物的方法，所述人工染色体含有提 供免疫球蛋白表达的基因，所述有蹄类动物对免疫应答表达非有蹄类 动物免疫球蛋白(优选人免疫球蛋白)并经过亲和力成熟。

本发明也涉及使用来自上述转基因有蹄类动物(例如转基因牛) 的B-细胞产生杂交瘤和单克隆抗体的方法。

本发明也涉及通过提供上述产生多克隆人免疫球蛋白的转基因 有蹄类动物、并从该有蹄类动物收集抗血清或乳而产生包括多克隆人 免疫球蛋白的有蹄类动物抗血清或乳的方法。这类人免疫球蛋白(优 选人IgG)可在治疗或预防人类疾病中用作静脉内免疫球蛋白 (IVIG)。多克隆人免疫球蛋白优选对目的抗原具有反应性。

朊病毒蛋白质降低的转基因有蹄类动物

本发明也涉及在内源性朊病毒核酸的一个或两个等位基因上包 括非天然存在的突变的牛或牛胎儿。该突变降低、基本上消除或消除 了功能性朊病毒蛋白质的表达，并且可能是半合子或纯合的。另外， 牛或牛胎儿可以携带另一个降低内源性抗体表达的突变。例如，该突 变可能降低或基本上消除功能性IgM重链的表达。牛胎儿优选为至少 受精后30天、但可以是最多至出生的任何年龄。优选的牛包括新生牛 和至少1周龄、且更优选至少2月龄的小牛。

在有关方面，本发明另外涉及从本发明的牛或牛胎儿产生的产 物、以及产生基本缺乏朊病毒蛋白质的产物的方法，所述方法包括在 本发明的牛或牛胎儿中制造该产物、或从中获得该产物。示例性产品 包括从牛或牛胎儿获得的乳、明胶、胶原和血清，以及在牛或牛胎儿 中产生的重组蛋白质。

产生含有多等位基因(multiallelic)或多基因突变的非人哺乳动 物和细胞的方法

本发明提供产生具有两个基因修饰(例如突变或插入转基因或人 工染色体)的细胞的方法。该方法包括步骤：(a)提供具有第一个基 因修饰的非人类哺乳动物体细胞；(b)将该细胞或其子代、或该细胞 或其子代的染色质团(chromatin mass)、或该细胞或其子代的细胞 核插入具核的或去核的卵母细胞中；(c)将从步骤(b)获得的卵母细胞 或由该卵母细胞形成的胚胎转移到受体内；(d)从该胚胎或从由其产 生的胎儿或幼儿分离细胞，其中所述细胞含有第一个基因修饰；以及 (e)将第二个基因修饰引入步骤(d)的细胞或其子代的基因组中，从而 产生具有两个基因修饰的细胞。

本发明因此提供产生含有多等位基因或多基因突变的非人类哺 乳动物或细胞的方法。这类哺乳动物的实例是有蹄类动物(例如牛、 绵羊、猪、公山羊、马或水牛)、兔、小鼠、大鼠、或灵长类(例如 猴、狒狒或大猩猩)。使用在此提供的复壮技术，细胞寿命增加，从 而允许长期基础上的细胞基因操作。

一方面，本发明提供产生含有多等位基因或多基因突变的牛细 胞，其包括步骤：(a)提供在内源性基因的第一个等位基因中具有突 变的有蹄类动物体细胞；(b)将该细胞或其子代、或该细胞或其子代 的染色质团、或该细胞或其子代的细胞核插入具核的或去核的卵母细 胞中；(c)将从步骤(b)获得的卵母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎 转移到牛输卵管或子宫中；(d)使步骤(c)中转移的卵母细胞或胚胎发 育为胎儿；(e)在妊娠25至90天从该牛分离胎儿细胞；以及(f)将突变引 入第一个内源性基因的第二个等位基因、或不同的第二个内源性基因 的等位基因中，从而产生含有多等位基因或多基因突变的牛细胞。如 果需要，本发明方法另外包括以步骤(f)中获得的细胞或其子代开始， 将上述方法重复一次或多次，从而将突变引入另外的等位基因或基因 中。

本发明另外提供产生含有两个基因修饰的非人类哺乳动物(例如 有蹄类动物)的方法，其包括步骤：(a)提供含有多等位基因或多基 因突变的非人类哺乳动物细胞(例如上面所获细胞的任何一种)；(b) 将该细胞或其子代、该细胞或其子代的染色质团、或该细胞或其子代 的细胞核插入具核的或去核的卵母细胞中；(c)将从步骤(b)获得的卵 母细胞或由所述卵母细胞形成的胚胎转移到非人类哺乳动物内；(d) 使步骤(c)中转移的卵母细胞或胚胎发育为非人类哺乳动物，从而产生 含有两个基因修饰的非人类哺乳动物。如果需要，在步骤(b)之前， 可以在允许染色质凝集的条件下将步骤(a)中提供的细胞透化。

本发明的示例性非人类哺乳动物是有蹄类动物(例如牛、绵羊、 猪、公山羊、马或水牛)、灵长类(例如猴、狒狒或大猩猩)、兔、 小鼠和大鼠。希望使用在此描述的克隆方法产生含有两个基因修饰的 牛(例如黄牛(Bos taurus)或瘤牛(Bos indicus))。

在本发明的所有前述方面中可以使用任何体细胞(例如来自胚 胎、胎儿、小牛或成体的细胞)。示例性细胞包括成纤维细胞、上皮 细胞、神经细胞、表皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、 软骨细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、 胎盘细胞和肌细胞。如果非人类哺乳动物是牛，则希望在妊娠25至 90天、妊娠35至60天、妊娠35至50天、妊娠35至45天、妊娠 38至43天、并且最优选在妊娠约40天从胎儿分离体细胞。任选地， 可以如此所述将体细胞在插入卵母细胞之前透化。

基因修饰的一种类型是突变。可以将突变引入转录活性基因或转 录沉默基因。可以引入突变的示例性内源性基因是抗体编码基因(例 如，J链或Igμ基因如IgμU或IgμAY)、编码α-(1，3)-半乳糖基转移 酶的基因或朊病毒基因。

一般通过插入多核苷酸(例如，阳性选择标记，如抗生素抗性基 因)将突变引入内源性基因。任选地，引入内源性基因的突变降低该 基因的表达。另外，突变也可以包括插入编码多肽(例如抗体)的异 种核酸分子。如果需要，该多核苷酸也可以含有重组酶位点(例如loxP 位点)，所述重组酶位点在阳性选择标记侧翼，从而可以通过重组酶 (例如Cre重组酶)去除阳性选择标记。

基因修饰的另一个类型是已插入细胞基因组而不引入突变的转 基因。一个满意的转基因是人工染色体，例如人人工染色体。在此描 述人工染色体在产生异种抗体(例如人抗体)中的用途。

如此处所用的，“等位基因”指占据特定染色体上特定位置的 DNA对的一个成员。

“人工染色体”指具有人工修饰的哺乳动物染色体或其片段，所 述人工修饰例如添加选择标记、添加克隆位点、缺失一个或多个核苷 酸、置换一个或多个核苷酸等。“人人工染色体(HAC)”指从一个 或多个人染色体产生的人工染色体。人工染色体可以独立于宿主细胞 内源性染色体而保持于宿主细胞中。在此情况下，HAC可以稳定复 制，并且与内源性染色体并排地分离。另外，可以将其易位或插入到 宿主细胞的内源性染色体中。可以将两个或更多个人工染色体同时或 相继引入宿主细胞。例如，可以引入来自人14号染色体(包含Ig重 链基因)、人2号染色体(包含Igκ链基因)和人22号染色体(包 含Igλ链基因)的人工染色体。另外，可以引入包含异种Ig重链基 因和Ig轻链基因的人工染色体，例如ΔHAC、ΔΔHAC或κHAC。重 链基因座和轻链基因座优选在不同染色体臂上(即在着丝粒不同 侧)。在其他优选实施方案中，HAC总长度小于或等于约12、10、9、 8或7兆碱基。

“牛胎儿”指子宫内受精后至少30天的牛。

“来自胚胎的细胞”指由胚胎中细胞的细胞分裂产生的细胞。

“嵌合胚胎”指由两个或更多个胚胎的细胞形成的胚胎。产生的 胎儿或子代可以具有仅来自一个初始胚胎的细胞、或来自多于一个初 始胚胎的细胞。如果需要，可以使用标准FISH分析或分析加入一个 胚胎的膜染料而确定整合到胎盘组织和胎儿组织中的各胚胎的细胞 百分数。

“嵌合有蹄类动物”指由来自两个或更多个胚胎的细胞形成的有 蹄类动物。该有蹄类动物可以具有仅来自一个初始胚胎的细胞、或来 自多于一个初始胚胎的细胞。如果需要，可以使用标准FISH分析或 分析加入一个胚胎的膜染料而确定整合到胎盘组织和胎儿组织中的 各胚胎的细胞百分数。

“染色质团”指一个以上未被膜包绕的染色体。染色质团优选含 有细胞的所有染色体。可以通过将细胞核暴露于在此所述的有丝分裂 重编程介质(例如有丝分裂提取物)而形成含有凝集的染色体的人工 诱导的染色质团。另外，可以通过将细胞核暴露于在此所述的下列之 一而产生含有解凝集的或部分凝集的染色体的人工诱导的染色质 团：含有抗-NuMA抗体的有丝分裂提取物，去污剂和/或盐溶液，或 蛋白质激酶溶液。染色质团可以含有彼此没有物理接触的不连续染色 体、或可以含有两个或更多个处于物理接触中的染色体。

如果需要，可以使用标准方法通过测量以DNA染料DAPI染色 的强度而确定染色体凝集的水平。染色强度随染色体凝集而增加。因 此，可以将染色体的染色强度与间期解凝集的染色体(指定为0％凝 集的)及有丝分裂中最大凝集的染色体(指定为100％凝集的)的染 色强度比较。基于该比较，可以确定最大凝集百分数。优选的凝集的 染色质团至少为20、30、40、50、60、70、80、90或100％凝集的。 优选的解凝集或部分凝聚的染色质团为小于10％凝集的。

“妊娠天数”指从把卵母细胞或胚胎转移到子宫中的时间起的天 数。

“供体细胞”指细胞核或染色质团所来自的细胞或透化的细胞。

“胚胎”或“胚胎的”指没有植入母体宿主子宫膜的发育中的细 胞团。因此，术语“胚胎”可以指受精的卵母细胞；含有供体染色质 团、细胞核的卵母细胞或重编程的细胞；胚泡前期发育中的细胞团； 或在植入母体宿主子宫膜之前及形成生殖嵴之前的发育期的任何其 他发育中的细胞团。胚胎可以代表细胞发育的多个阶段。例如，可以 将单细胞的胚胎称为受精卵；可以将从分裂的胚胎(cleaved embryo) 产生的固体球状细胞团称为桑椹胚，而具有囊胚腔的胚胎可以称为胚 泡。“胚胎细胞”是从胚胎分离的或胚胎中含有的细胞。

“胚胎克隆”指从另一个动物的细胞或细胞材料产生胚胎的方 法。可以通过例如将供体细胞、细胞核或染色质团插入卵母细胞或与 卵母细胞融合而实施胚胎克隆。然后将得到的卵母细胞或由此卵母细 胞形成的胚胎转移到动物子宫中，从而产生克隆的动物。

“因子的富集或耗尽”指以天然存在的或重组因子最初存在于重 编程介质(例如细胞提取物)中的量的至少20、40、60、80或100 ％添加或去除该因子。另外，可以添加非天然存在于重编程介质中的 天然存在的或重组因子。优选的因子包括蛋白质，例如DNA甲基转 移酶、组蛋白脱乙酰酶、组蛋白、鱼精蛋白、核纤层、转录因子、激 活剂和阻抑物；膜小泡和细胞器。在一个优选的实施方案中，如下所 述，在加入重编程介质之前将因子纯化。另外，下述纯化方法之一可 用于从重编程介质去除不需要的因子。

“胎儿”指植入母体宿主子宫膜的发育中的细胞团。“胎儿细胞” 是在包括出生的妊娠任何阶段从胎儿分离或胎儿中含有的任何细 胞。

“片段”指具有连续氨基酸区域的多肽，所述连续氨基酸区域与 本发明抗体的相应区域相同，但是少于全长序列。基于标准测定(例 如在此描述的那些)，该片段具有结合与相应抗体相同的抗原的能 力。优选地，该片段与抗原的结合至少为相应抗体的20、40、60、 80或90％。

“基因”指由DNA序列组成的遗传单位，其在染色体上占据特 定位置，并决定生物的具体特征。基因一般具有两个等位基因。

“半合子突变”指内源性基因的一个等位基因突变而另一个没有 突变。

“纯合突变”指内源性基因的两个等位基因都突变。根据本发 明，两个等位基因的突变引入事件可能是或可能不是相同的。因此， 可以将由两个不同寻靶载体基因靶定的内源性基因的两个等位基因 认为是纯合突变。

“纯合敲除的非人类哺乳动物”指人类之外的哺乳动物，其中内 源性基因的两个等位基因都被基因寻靶，从而导致功能性基因产物的 表达显著降低或消除。根据本发明，两个等位基因上的基因寻靶事件 可能是或可能不是相同的。因此，可以将内源性基因的两个等位基因 由两个不同寻靶载体基因寻靶而导致该内源性基因无表达的非人类 哺乳动物认为是纯合敲除的非人类哺乳动物。

“无限增殖化的”指能够比自然存在的对照细胞、或比该无限增 殖化细胞来自的供体细胞进行至少多25、50、75、90或95％的细胞 分裂，所述对照细胞的细胞类型、属和物种与无限增殖化细胞相同。 无限增殖化细胞优选能够比对照细胞进行至少多2-、5-、10-或20-倍 的细胞分裂。无限增殖化细胞更优选能够经过无限次的细胞分裂。无 限增殖化细胞包括体内或体外自然获得突变的细胞，所述突变改变其 正常生长调节过程。其他优选的无限增殖化细胞包括经过基因修饰以 表达癌基因(例如ras、myc、abl、bcl2或neu)、或以转化DNA或 RNA病毒(例如EB病毒或SV40病毒)感染的细胞(Kumar等人， (1999)Immunol.Lett.65：153-159；Knight等人，(1988)Proc.Natl. Acad.Sci.USA 85：3130-3134；Shammah等人，(1993)J.Immunol. Methods 160：19-25；Gustafsson和Hinkula(1994)Hum.Antibodies Hybridomas 5：98-104；Kataoka等人，(1997)Differentiation 62：201- 211；Chatelut等人，(1998)Scand.J.Immunol.48：659-666)。细胞也 可以经过基因修饰以表达端粒酶基因(Roques等人，(2001)Cancer Res.61：8405-8507)。

“敲入(knock-in)突变”指将外源性核酸(任选编码多肽)插 入细胞染色体。

“突变”指天然存在的或参照核酸序列中的改变，例如插入、缺 失、移码突变、沉默突变、无义突变或错义突变。优选地，由核苷酸 序列编码的氨基酸序列与天然存在的序列至少有一个氨基酸改变。改 变细胞、胚胎、胎儿或哺乳动物基因组序列的重组DNA技术的实例 包括：将另一种生物(例如人)的DNA序列插入该基因组、缺失一 个或多个DNA序列以及将一个或多个碱基突变(例如定点或随机突 变)引入靶DNA序列。产生这些修饰的方法的实例包括逆转录病毒 插入、人工染色体技术、基因插入、以组织特异性启动子随机插入、 同源重组、基因寻靶、转座因子及引入外来DNA的任何其他方法。 所有这些技术为分子生物学领域技术人员所熟知。“非天然存在的突 变”是通过例如重组方法人工引入的突变。

“包含多等位基因突变的非人类哺乳动物”或“多等位基因非人 类哺乳动物”指其内源性基因的两个等位基因已突变的人类之外的哺 乳动物。两个等位基因中的突变可能在或可能不在相同位置，并且可 能是或可能不是由于相同类型的改变。例如，可以通过插入两个不同 的多核苷酸序列而突变多等位基因非人类哺乳动物中基因的等位基 因。

“包含多基因突变的非人类哺乳动物”或“多基因非人类哺乳动 物”指其两个或更多个不同基因已突变的人类之外的哺乳动物。两个 基因中的突变可能在或可能不在相同位置，并且可能是或可能不是由 于相同类型的改变。例如，可以通过插入两个不同的多核苷酸序列来 突变多基因非人类哺乳动物中的两个基因。

“细胞核”指含有细胞大部分或全部DNA的由膜围绕的细胞 器。DNA以凝集的形式包装于染色体中。包围DNA的膜优选包括一 个或两个脂双层，或具有核孔蛋白。

“透化”指在质膜中形成孔，或部分或全部去除质膜。

“胎盘”指怀孕期间在雌性哺乳动物体内发育的膜血管器官，其 衬于子宫壁并部分包被胎儿，其通过脐带与胎儿连接。

“纯化的”指与其天然相伴的其他成分分离。一般而言，当因子 为至少以重量计50％不含蛋白质、抗体及与其天然结合的天然存在 的有机分子时，该因子为基本纯。该因子优选为以重量计至少75％、 更优选至少90％、并最优选至少99％纯。可以通过化学合成、从天 然来源分离该因子或在不天然产生该因子的重组宿主细胞中产生该 因子而获得基本纯的因子。本领域技术人员可以使用标准技术(例如 Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，John Wiley& Sons，1995中所述)纯化蛋白质、小泡及细胞器。如使用聚丙烯酰胺 凝胶电泳、柱层析、光密度、HPLC分析或蛋白质印迹分析(Ausubel 等人，如上)测量的，该因子优选为起始材料纯度的至少2、5或10 倍。优选的纯化方法包括免疫沉淀、柱层析(例如免疫亲和层析)、 磁珠免疫亲和纯化及用平板结合的抗体淘选(panning)。

“再克隆的”指用于克隆的随后(例如第二)轮次。具体而言， 可以将由本发明方法产生的胚胎、胎儿或成体的细胞在有丝分裂重编 程介质(例如有丝分裂细胞提取物)中温育，以形成如上所述插入去 核卵母细胞的染色质团。另外，可以如上所述将细胞透化、在重编程 介质中温育、并插入去核卵母细胞。实施两轮或更多轮克隆可以导致 供体染色质团或供体细胞的额外重编程，从而增加在最后一轮克隆后 产生能可存活子代的机会。

“降低内源性抗体的表达”指降低由B-细胞或B-细胞群体产生 的内源性、功能性抗体的量。内源性抗体量的降低可以归因于每个B- 细胞产生的内源性抗体量减少、功能性内源性B-细胞数目的减少或 其组合。优选地，由B-细胞分泌的、或在表达或分泌内源性抗体的 B-细胞表面表达的内源性抗体的量降低至少25、50、75、90或95％。 在另一个优选实施方案中，受体哺乳动物样品(例如血液样品)中内 源性B-细胞的数目降低至少25、50、75、90或95％。

“重编程介质”指使因子能够从细胞、细胞核、染色质团或染色 体去除的溶液，或从该溶液向细胞、细胞核、染色质团或染色体添加 因子的溶液。优选地，添加或去除因子增加或降低mRNA或蛋白质 在供体细胞、染色质团、或细胞核中、或在含有重编程染色质团或细 胞核的细胞中的表达水平。在另一个实施方案中，在重编程介质中温 育透化细胞、染色质团或细胞核，使透化细胞或含有重编程染色质团 或细胞核的细胞的表型相对于供体细胞表型改变。在另一个实施方案 中，在重编程介质中温育透化细胞、染色质团或细胞核，导致透化细 胞或含有重编程染色质团或细胞核的细胞相对于供体细胞获得或损 失活性。

示例性重编程介质包括不含有生物学分子(例如蛋白质或核酸) 的溶液，例如缓冲液。这类溶液可用于从细胞核、染色质团或染色体 去除一种或多种因子。其他优选的重编程介质是提取物，例如来自细 胞核、细胞质或其组合的细胞提取物。示例性细胞提取物包括来自卵 母细胞(例如哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物卵母细胞)、雄性生 殖细胞(哺乳动物、脊椎动物或无脊椎动物生殖细胞，例如生精细胞、 精母细胞、精子细胞或精子)、以及干细胞(例如成体或胚胎干细胞) 的提取物。其他的重编程介质是已加入一种或多种天然存在或重组因 子(例如核酸或蛋白质，例如DNA甲基转移酶、组蛋白脱乙酰酶、 组蛋白、鱼精蛋白、核纤层、转录因子、激活剂、阻抑物、染色质重 建蛋白质、生长因子、白细胞介素、细胞因子或其他激素)的溶液或 提取物，或从其中去除一种或多种因子的提取物。其他重编程介质包 括去污剂溶液(例如0.01％至0.1％、0.1％至0.5％或0.5％至2％的 离子或非离子去污剂，例如一种或多种下列去污剂：SDS、Triton X-100、Triton X-114、CHAPS、脱氧胆酸钠、正辛基葡糖苷、Nonidet P40、IGEPAL、Tween 20、Tween 40或Tween 80)、盐(例如～0.1、 0.15、0.25、0.5、0.75、1、1.5或2M NaCl或KCI)、多胺(例如～1 μM、10μM、100μM、1mM或10mM精胺、亚精胺、鱼精蛋白或 聚-L-赖氨酸)、蛋白激酶(例如依赖细胞周期蛋白的激酶1、蛋白激 酶C、蛋白激酶A、MAP激酶、钙/钙调蛋白依赖性激酶、CK1酪蛋 白激酶或CK2酪蛋白激酶)和/或磷酸酶抑制剂(例如～10μM、100 μM、1mM、10mM、50mM、100mM的下列一种或多种抑制剂： 原钒酸钠、焦磷酸钠、氟化钠、NIPP1、抑制剂2、PNUTS、SDS22、 AKAP149或ocadaic acid)或核质蛋白(nuclioplasmin)。在一些实 施方案中，重编程介质含有抗NuMA抗体。如果需要，可以同时或 相继使用多种重编程介质以重编程供体细胞、细胞核或染色质团。

“重编程的细胞”指暴露于重编程介质的细胞。优选至少1、5、 10、15、20、25、50、75、100、150、200、300或更多不在供体或透 化细胞中表达的mRNA或蛋白质分子表达于重编程细胞中。在另一 个优选实施方案中，在重编程细胞中表达、但是不在供体或透化细胞 中表达的mRNA或蛋白质分子数目为1至5、5至10、10至25、25 至50、50至75、75至100、100至150、150至200或200至300(含)。 优选至少1、5、10、15、20、25、50、75、100、150、200、300或 更多不在重编程细胞中表达的mRNA或蛋白质分子表达于供体或透 化细胞中。在另一个优选实施方案中，在供体或透化细胞中表达、但 是不在重编程细胞中表达的mRNA或蛋白质分子数目为1至5、5至 10、10至25、25至50、50至75、75至100、100至150、150至200 或200至300(含)。在另一个优选实施方案中，这些mRNA或蛋白 质分子表达于供体细胞(即，供体或透化的起始细胞)和重编程细胞 两者中，但是如使用标准测定(见，例如Ausubel等人，如上)测量 的，在这些细胞中的表达水平相差至少2、5、10或20-倍。

“基本相同”指具有与另一个序列至少80、90、95、98或100 ％相同的序列。一般使用BLAST(Basic Local Alignment Search Tool)或BLAST2，以其中指定的默认参数(见Altschul等人，(1990) J.Mol.Biol.215：403-410；以及Tatiana等人，(1999)FEMS Microbiol. Lett.174：247-250)测量序列同一性。这些软件程序通过比对各种置 换、缺失和其他修饰的同源性程度而匹配相似序列。保守置换一般包 括下列组内的置换：甘氨酸、丙氨酸、缬氨酸、异亮氨酸、亮氨酸； 天冬氨酸、谷氨酸、天冬酰胺、谷氨酰胺；丝氨酸、苏氨酸；赖氨酸、 精氨酸；以及苯丙氨酸、酪氨酸。

“可存活的子代”指宫外(ex utero)存活的动物。优选该哺乳 动物自其离开母体宿主之时其存活至少一秒钟、一分钟、一小时、一 天、一周、一个月、六个月或一年。该动物不需要在宫内环境的循环 系统以存活。

从下列详细描述及权利要求中显而易见本发明的其他特点和优 点。

附图简述

图1是描述在牛原代成纤维细胞中连续基因寻靶的示意图。将 Holstein胎儿成纤维细胞(#6939)靶定，其后选择并克隆含有靶定 的细胞的孔，使用染色质转移体系产生IgμU-/+胎儿。然后使用IgμU-/+ 细胞系(#3287)产生小牛并寻靶IgμU的第二个等位基因。再一次选 择并通过产生胎儿而再生细胞。收获胎儿用于产生IgμU-/-细胞系、分 析基因表达并产生小牛。以Cre-重组酶表达质粒转染IgμU-/-细胞系 (#4658)以同时去除neo和puro基因，继之以第三轮染色质转移以 产生克隆的胎儿和细胞系，其中neo和puro选择标记基因均被切除。 将一个Cre-切除的IgμU-/-成纤维细胞系(#1404)用于第三轮基因寻 靶以产生三次靶定的Cre/IgμU-/-/PrP-/+胎儿和细胞系。一个细胞系 (#8334)经过第四轮基因寻靶以产生双纯合KO(cre/IgμU-/-/PrP-/-) 胎儿和细胞系并用于评价PrP基因表达。

图2A是表示#6939中IgμU恒定区基因座结构、用于第一轮寻靶 的puro载体以及用于寻靶事件的基因组PCR测定的示意图。寻靶载 体由5’同源臂(7.2kb)、3’同源臂(2.0kb)、含有转录和翻译终止 序列的STOP盒、DT-A(白喉毒素A基因)、以及以loxP位点为侧 翼的(floxed)puro基因组成。设计载体以将敲除盒插入IgμU恒定 区基因座的外显子2中。在#6939成纤维细胞中，如所示的，发现多 态性序列可区别等位基因A和等位基因B。使用引物对puroF2× puroR2鉴定第一个寻靶事件。基于PCR产物中呈献的多态性序列， PCR和测序产物显示载体整合到细胞系#3287等位基因B、以及 #2184-1和2细胞系等位基因A中。

图2B是表示以puroF2×puroR2引物通过基因组PCR鉴定 IgμU-/+胎儿的照片。N是阴性对照(第一个KO载体与#6939基因组 DNA的混合物)且P是阳性对照(约104拷贝/μl覆盖puroF2-puroR2 区的质粒DNA与#6939基因组DNA的混合物)。细胞系#2184-1、 #2184-2和#3287为IgμU-/+。

图2C是表示以puroF2×puroR2引物通过基因组PCR对IgμU-/+ 小牛基因分型的照片。N是阴性对照(第一个KO载体与#6939基 因组DNA的混合物)且P是阳性对照(约104拷贝/μl覆盖puroF2- puroR2区的质粒DNA与#6939基因组DNA的混合物)。13个IgμU-/+ 出生的小牛中(也如图2C所述)，五个经基因分型并发现对第一个 寻靶事件阳性。

图3A是描述IgμU-/+#3287等位基因结构、用于靶定第二个等位 基因的neo载体以及用于寻靶事件的基因组PCR测定的示意图。使 用引物对neoF3×neoR3鉴定等位基因A的neo寻靶事件。BCμf× BCμr是用于确认不存在野生型等位基因的引物对。因为存在STOP 盒，所以引物不会从靶定的等位基因扩增序列。

图3B是表示以puroF2×puroR2、neoF3×neoR3以及BCμf× BCμr引物通过基因组PCR鉴定IgμU-/-胎儿和成纤维细胞的一系列照 片。“P”是阳性对照(约104拷贝/μl覆盖puroF2-puroR2或 neoF3-neoR3区的质粒DNA与#6939基因组DNA的混合物)。“N” 是阴性对照(第一个KO或第二个KO载体与#6939基因组DNA的 混合物)，且#6939是最初的成纤维细胞细胞系。细胞系#4658、#3655、 #5109、#5139和#4554对等位基因A(neo寻靶)和B(puro寻靶) 的寻靶事件均为阳性，但是对野生型等位基因为阴性。

图3C是显示从90天胎儿脾脏提取的mRNA中IgμU表达的 RT-PCR分析的照片。从阳性对照“P”(可通过商业途径获得的polyA +牛脾RNA)和野生型(#6939)胎儿(#1，#2)检测到明显表达， 但是IgμU-/-胎儿中未检测到。

图3D是显示以puroF2×puroR2、neoF3×neoR3以及BCμf× BCμr引物通过基因组PCR对IgμU-/-小牛基因分型的一系列照片。N 为阳性对照(第一个KO或第二个KO载体与#6939基因组DNA的 混合物)且P为阳性对照(约104拷贝/μl覆盖puroF2-puroR2和 neoF3-neoR3区的质粒DNA与#6939基因组DNA的混合物)。两个 IgμU-/-出生小牛(其中之一显示于图3D中)经基因分型且在IgμU基 因等位基因B和A的寻靶事件均为阳性，但是对于野生型等位基因 为阴性。

图4A是表示IgμU-/-#4658等位基因结构以及Cre-loxP介导的去 除选择标记基因的基团组PCR测定的示意图。来自引物对CreExF ×CreExR的扩增得到来自puro靶定的等位基因的2.5kb片段、来 自neo靶定的等位基因的4.3kb片段或当切除两个选择标记基因时的 0.4kb短片段。

图4B是显示以CreExF×CreExR引物通过基因组PCR鉴定 Cre/IgμU-/-胎儿和成纤维细胞的照片。在#4658细胞系中，引入Cre 之前，检测到2.5kb(puro)和4.3kb(neo)PCR产物。在五个 Cre/IgμU-/-胎儿和细胞系中，这些条带完全消失，且取而代之，检测 到0.4kb(无puro和neo)条带。

图5A是说明Cre/IgμU-/-#1404细胞系中PrP基因座的结构、PrP 基因寻靶载体以及寻靶事件的基因组PCR测定的示意图。载体由5’ 同源臂(1.2kb)、3’同源臂(8.3kb)、STOP盒、DT-A基因和以loxP 位点为侧翼的neo基因组成。设计该载体将敲除盒刚好插入其位于 PrP基因座外显子3中的起始ATG密码子之后。如所示的，发现等 位基因C和等位基因D之间有单碱基对多态性。设计引物对neoF7 ×neoR7以显示neo寻靶事件并且包括多态性碱基。PCR和测序产物 显示该载体整合到等位基因C中。

图5B是显示以阳性PrP引物对neoF7×neoR7以及阴性IgμU引 物对BCμf×BCμr通过基因组PCR鉴定三次靶定的胎儿和成纤维细 胞系(IgμU-/-/PrP-/+)的一系列照片。P是阳性对照(约104拷贝/μl 覆盖neoF7-neoR7区的质粒DNA与#6939基因组DNA的混合物)， 且#1404是阳性对照。来自胎儿#8103、1661、8375、8112和8443的 细胞系对PrP寻靶阳性且对野生型IgμU等位基因阴性，证明其是三 次靶定的细胞系(IgμU-/-/PrP-/+)。

图6A是显示IgμU-/-/PrP-/+#8443等位基因结构、用于靶定第二 个等位基因的puro载体以及用于寻靶事件的基因组PCR测定的示意 图。使用引物对puroF14×puroR14鉴定在等位基因D的puro寻靶 事件。BPrPex3F×BPrPex3R是用于确认不存在野生型等位基因的引 物对。由于纯合插入导致BPrPex3F引物在PrP基因两个等位基因上 的退火位点的破坏，该引物不会从靶定的等位基因扩增序列。

图6B是显示以puroF14×puroR14、neoF7×neoR7以及 BPrPex3F×BPrPex3R引物通过基因组PCR鉴定双纯合KO(IgμU-/- /PrP-/-)胎儿和成纤维细胞的一系列照片。“P”为阳性对照(约104 拷贝/μl覆盖puroF14-puroR14或neoF7-neoR7区的质粒DNA与 #6939基因组DNA的混合物)。“N”为阳性对照(第三个KO或第 四个KO载体与#6939基因组DNA的混合物)，并且指出IgμU-/-胎 儿细胞系(#4658)和IgμU-/-/PrP-/+细胞系(#8443)。细胞系#8454、 8400和6397是三个双纯合KO(IgμU-/-/PrP-/-)胎儿。它们对PrP基因 等位基因C(neo寻靶)和D(puro寻靶)的第三个和第四个寻靶事 件阳性，但是对野生型等位基因阴性。

图6C是显示对双纯合KO(IgμU-/-/PrP-/-)胎畜的RT-PCR分析照 片。使用PrPmF3×PrPmR3引物检测PrP mRNA。观察到来自#4658 (IgμU-/-)和#8443(IgμU-/-/PrP-/+)胎畜的明显表达，但是没有观察到来 自双纯合KO(IgμU-/-/PrP-/-)胎畜的表达。

图7显示GenBank登记号U63637的多核苷酸序列。

图8显示黄牛IgμU的多核苷酸序列(GenBank登记号 U636372.2)。

图9显示黄牛IgμAY的部分多核苷酸序列(GenBank登记号 AY221099)。

图10是显示可以在IgμU-/-细胞中通过PCR检测IgμAY的示意 图。

图11显示IgμAY和IgμU都经过VDJ重排并表达的序列追查 (trace)的图解。

图12是显示IgμAY的基因组组织的示意图。

图13显示IgμAY的AY和ay等位基因的序列。

图14是显示AY KO载体和ay KO载体的示意图。

图15说明PrP+/+、PrP-/+(341)、PrP-/-(342)小牛同时出生。

图16A-16D说明PrP-/- IgμU-/-小牛342的基因分型。图16A显示 从PrP-/- IgμU-/-小牛342的耳活组织检查确立的成纤维细胞系。图 16B显示通过基因组PCR证实耳活组织检查成纤维细胞中的PrP-/- IgμU-/-基因型。P，阳性对照；N，阳性对照。如所示的，使用puroF14 ×puroR14以及neoF7×neoR7引物，显示小牛342在PrP基因的两 个等位基因对寻靶标记为PCR阳性。图16C显示在PrP-/- IgμU-/-小 牛中不存在来自PrP野生型的等位基因。使用BPrPex3F×BPrPex3R 引物，小牛342对PrP基因野生型等位基因为PCR阴性。图16D显 示，使用BCμf×BCμr引物，PrP-/- IgμU-/-小牛中另外不存在来自IgμU 野生型的等位基因。

图17A-17B说明PrP-/- IgμU-/-小牛342中PrP基因的功能性失 活。图17A显示PrP-/- IgμU-/-小牛342成纤维细胞中mRNA表达的破 坏。对PrP-/- IgμU-/-小牛342进行RT-PCR分析。使用PrPmF3× PrPmR3引物检测PrP mRNA。在PrP+/+ IgμU-/-和PrP-/+ IgμU-/-(小 牛341)小牛中检测到明显表达，但是在PrP-/- IgμU-/-小牛342中没有 检测到表达。作为阳性内对照，也使用引物对bBAF×bBAR评价牛 β-肌动蛋白mRNA表达。图17B显示PrP-/- IgμU-/-小牛342成纤维 细胞中不存在PrP蛋白质。对PrP-/- IgμU-/-小牛342实施蛋白质印 迹分析。作为阳性内对照，分析PrP+/+ IgμU-/-小牛。由于用于该分 析的单克隆抗体被宣称对牛PrP蛋白特异，所以使用来自小鼠成纤维 细胞蛋白质提取物作为阴性对照。在PrP+/+ IgμU-/-和PrP-/+ IgμU-/- 小牛蛋白质提取物中检测到33-35kDa蛋白质条带(牛PrP的大小) 的存在，但是在PrP-/- IgμU-/-小牛342的蛋白质提取物中没有检测到 阳性条带。对相同印迹以抗-CDC2单克隆抗体进行染色作为阳性内 对照。

图18说明在PrP-/-小牛脑干中不存在PrP蛋白质。如在此所述 的，对PrP-/-小牛354和282脑干实施蛋白质印迹分析。在PrP-/-小 牛中没有检测到PrP蛋白质条带。

图19说明在克隆自不同PrP-/-成纤维细胞系的示例性PrP-/-小牛 352的外周血淋巴细胞(PBL)中不存在PrP蛋白质。实施PrP-/-小 牛352的PBL蛋白质印迹分析。没有检测到33-35kDa牛PrP蛋白 质的阳性条带。

详述

一般而言，本发明涉及转基因非人类哺乳动物(例如牛和其他有 蹄类动物)以及产生这些哺乳动物的方法。具体而言，本发明涉及内 源性IgM重链和/或朊病毒蛋白质水平降低的转基因有蹄类动物。下 文更加详细地对本发明进行描述。

产生含有多等位基因或多基因突变的非人哺乳动物和细胞的方 法

本发明提供在例如家畜这类非人哺乳动物(例如牛)中连续靶定 转录沉默和转录活性基因的快速方法。更具体而言，我们发现了连续 基因寻靶体系，我们首先使用该体系敲除沉默基因(牛免疫球蛋白 μU(IgμU)基因)的两个等位基因，从而产生杂合和纯合敲除小牛。 IgμU寻靶随后是在IgμU-/-细胞系中连续敲除靶定成纤维细胞中的转 录活性基因(牛朊病毒蛋白质(PrP)基因)的两个等位基因，以产 生双纯合敲除胎儿。使用本发明的方法，可以在体细胞中连续进行基 因寻靶，从而产生多等位基因或多基因非人类哺乳动物。本发明另外 采用克隆方法在各轮寻靶之后将细胞系复壮，如美国专利申请公开号 2003-0046722中所述，在此引用作为参考。

破坏目的基因首先包括产生半合子基因敲除细胞和通过胚胎克 隆产生胎儿。然后在妊娠期间任何时间从产生的胎儿收获基因靶定的 细胞。在牛中，希望这类细胞收获发生在妊娠25至90天、妊娠35 至60天、妊娠35至50天，优选35至45天，更优选38至43天， 并且最优选在妊娠约40天。然后，在收获的细胞中靶定相同基因座 的第二个等位基因，或备选的不同内源性基因的等位基因。然后将这 些细胞用于产生胎儿(从所述胎儿可以另外分离体细胞，例如成纤维 细胞)和用于进行其他轮克隆。然后可以重复上述步骤直到产生含有 所需多等位基因或多基因突变的细胞。如果需要，可以使用这些细胞 产生非人哺乳动物，例如有蹄类动物。

使用本发明的方法，我们显示从转染至确立再生的细胞系，各个 寻靶事件需要大约2.5个月，从而可以在14个月中(包括五个月用 于靶定两个等位基因和九个月妊娠)在小牛中产生单纯合基因修饰， 且可以在19个月中产生双纯合修饰。相反，培育杂合建立者以产生 纯合小牛将需要约五年，从而使得从两个杂合建立者产生双纯合小牛 是不切实际的。使用在此描述的连续寻靶策略，大动物物种中的复杂 基因修饰不仅是可行的，而且对于许多应用简明并有用。

在很多情况下，基因修饰的大动物是比小鼠更合适的用于研究人 类疾病(例如研究人囊性纤维化)的模型(Harris(1997)Hum.Mol. Genet.6：2191-2194)。当试图在基因修饰母牛中产生人多克隆抗体 时，纯合敲除寻靶可用于例如消除牛抗体(Kuroiwa(2002)Nature Biotechnol.20：889-894)。另外，失活例如IgμU基因可用于研究牛免 疫学，例如已知与人或小鼠相当不同的B-细胞发育机制(Butler(1997) Rev.Sci.Tech.17：43-70)。携带不仅关于α-1，3-半乳糖基转移酶基因 (Phelps等人，(2003)Science 299：411-414)、而且关于其他基因(例如 主要组织相容性复合体(MHC)基因)的多KO的猪也可能是更合 适的用于异种移植的器官或组织来源。在农业中，纯合敲除寻靶可以 用于改进动物的安全性或抗病性，例如灭活牛朊病毒基因及消除“疯 牛病”威胁。本发明的方法因此可以用于动物中的复杂基因修饰以进 行基因功能性分析，以及用于生物医学和农业应用，而不需要生殖系 传递。

IgM重链蛋白质降低的转基因有蹄类动物

我们确定有两个基因编码牛IgM重链。图7中显示了声称编码 牛IgM的第一个公开的序列。所述序列首先由Hammarstrom及同事 以GenBank登记号U63637(gi：1575489)于1996年公开，并继而由 他们在Immunology(93：581-588，1998)中描述。U63637于2003年2 月27日被第二个序列(GenBank登记号U63637.2；gi：2859209；图8) 取代。随后，Hammarstrom及同事递交了编码黄牛重链恒定区的第 三个序列(GenBank登记号AY221099；gi：33413901；图9)。在与第 三次递交伴随的论文(Zhao等人，(2003)J.Biol.Chem.278：35024- 35032)中，作者推断第二个和第三个序列(第一个被撤消)之间的差 异归因于多态性。

我们现在证实牛含有并且表达两个Igμ基因，我们将其称为IgμU 和IgμAY。由于两个基因都得到表达，所以产生不具有IgM重链蛋 白质的牛需要突变所有两个基因。

考虑到我们在牛中发现了两个Igμ，尽管在其他有蹄类动物中仅 仅鉴定了一个IgM编码基因，但可能存在其他这类基因。可以使用 标准技术，例如在此描述的那些，来鉴定这些其他基因。

为了改变其他有蹄类动物的免疫球蛋白基因，设计寻靶载体以含 有三个主要区域。第一个区域与待靶定的基因座同源。第二个区域是 特异地取代靶定的基因座的药物选择标记。与第一个区域类似，第三 个区域与靶定的基因座同源，但是在野生型基因组中不与第一个区域 邻接。寻靶载体与所需的野生型基因座之间的同源重组导致了寻靶载 体中表现同源性的两个区域间基因座序列的缺失、以及以药物抗性标 记取代该序列。在优选实施方案中，两个同源性区域的总大小约为6 千碱基，且取代部分靶定的基因座的第二个区域大小约为2千碱基。 该寻靶策略可广泛用于从原核细胞到人类细胞的大范围物种。使用的 各个载体的独特性在于为基因寻靶程序所选择的基因座和该策略中 采用的序列。该途径可用于所有有蹄类动物，包括但是不限于山羊 (Capra hircus)、绵羊(Ovis aries)和猪(Sus scrofa)，以及家畜(黄牛 和瘤牛)。

电穿孔在有蹄类动物细胞中靶定特异基因的用途也可以广泛用 于有蹄类动物。在此所描述的通用程序可适用于将靶定的突变引入其 他有蹄类动物基因组中。可以采取修改的电穿孔条件(电压和电容) 最优化从其他有蹄类动物获得的转染子的数目。

另外，在此使用的用于靶定家畜重链基因座的策略(例如，使用 载体去除所有编码外显子和间插序列，所述载体含有的区域与紧靠所 去除的外显子的区域同源)也可以同样好地用于其他有蹄类动物。例 如，对绵羊(Ovis aries)的一个免疫球蛋白重链基因座已实施广泛的 序列分析，且绵羊基因座在结构和序列上都与牛基因座高度相似 (GenBank登记号Z71572、Z49180至Z49188，M60441、M60440、 AF172659至AF172703)。除了关于重排的绵羊免疫球蛋白链所报导 的大量cDNA序列之外，关于重链基因座也有基因组序列信息报道， 包括重链5’增强子(GenBank登记号Z98207)、3’μ开关区(GenBank 登记号Z98680)和5’μ开关区(GenBank登记号Z98681)。绵羊重 链分泌形式的完整mRNA序列以GenBank登记号X59994保藏。所 述保藏物含有四个编码外显子的全部序列，其与相应的牛序列非常相 似。

因此，本发明涉及产生转基因有蹄类动物，优选转基因母牛，其 中内源性IgM表达经过两个或更多个Igμ基因的突变而降低或消 除。任选地，稳定引入核酸(例如人工染色体)，所述核酸包含足以 产生其他物种(优选人)的功能性抗体的基因。

朊病毒蛋白质降低的转基因有蹄类动物

如在此所描述的，申请人通过连续基因寻靶已成功产生了健康的 PrP缺陷小牛。这类动物提供了用于产生来自无BSE的牛的农业和 生物医学材料(包括乳、明胶、胶原和血清)的改进群体、以及提供 了用于人类治疗的人重组蛋白质生产和用于人类异种移植的医学材 料的改进来源。本发明的牛或牛胎儿可用于产生农业上通常来自这类 动物的任何产物。它们也可用于产生包括但是不限于人类抗体的任何 重组蛋白质，通过例如美国专利申请公开号2003-0037347、2004- 0068760和2003-0056237或PCT公开号WO2004/044156中所描述的 任何方法，在此引用所有文献作为参考。

非人类哺乳动物细胞

如在此所讨论的，本发明方法涉及将突变引入非人类哺乳动物体 细胞，例如有蹄类动物体细胞。合适的体细胞包括来自胚胎、胎儿、 小牛或成体动物的细胞。优选用于基因寻靶的细胞包括分化细胞，例 如成纤维细胞、上皮细胞、神经细胞、表皮细胞、角质形成细胞、造 血细胞、黑素细胞、软骨细胞、B-淋巴细胞、T-淋巴细胞、红细胞、 巨噬细胞、单核细胞、胎盘和肌细胞。优选的细胞也包括来自任何器 官的细胞，例如膀胱、脑、食道、输卯管、心脏、肠、胆囊、肾脏、 肝脏、肺、卵巢、胰、前列腺、脊髓、脾脏、胃、睾丸、胸腺、甲状 腺、气管、输尿管、尿道和子宫。优选地，供体细胞、供体细胞核、 供体染色质团或重构的卵母细胞不是四倍体。

细胞可以来自任何非人类哺乳动物，包括有蹄类动物、兔、小鼠、 大鼠或灵长类动物。有蹄类动物包括奇蹄目(Perissodactyla)和偶蹄 目(Artiodactyla)成员，例如牛属(Bos)成员。其他优选的有蹄类 动物包括羊、大角羊、山羊、水牛、羚羊、牛、马、驴、骡、鹿、麋 鹿、北美驯鹿、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼、猪和象。非人类哺乳动 物最优选为牛(例如黄牛或瘤牛)。

如果基因靶定的细胞来自胚胎或胎儿，则可以在妊娠期直到基因 改变的非人类哺乳动物出生期间的任何时间分离该细胞。如上文所讨 论的，希望在妊娠25至90天、妊娠35至60天、35至50天、优选 35至45天、更优选38至43天、并且最优选在妊娠约40天分离牛 细胞。希望在妊娠25至150天之间、30至100天、优选35至80天、 更优选35至60天、并且最优选在妊娠约40天分离绵羊细胞。希望 在妊娠25至300天、30至100天、优选35至80天、更优选35至 60天、并且最优选在妊娠约40天分离马细胞。希望在妊娠25至110 天、30至90天、优选30至70天、更优选30至50天、并且最优选 在妊娠约35天分离猪细胞。希望在妊娠25至150天、30至100天、 优选35至80天、更优选35至60天、并且最优选在妊娠约40天分 离公山羊细胞。希望在妊娠25至150天、30至100天、优选35至 80天、更优选35至60天、并且最优选在妊娠约40天分离灵长类动 物细胞。希望在妊娠6至18天、8至16天、优选10至16天、更优 选12至16天、并且最优选在妊娠约14天分离啮齿动物细胞。

受体细胞优选为卵母细胞、受精卵或双细胞胚胎，所有这些细胞 可能是或可能不是去核的。供体和受体细胞一般来自相同物种。然 而，从使用由来自不同物种的供体和受体细胞重构的胚胎实现发育也 有成功报道。

基因寻靶

一般而言，本发明的基因寻靶事件可以包括基因的失活、去除或 修饰；基因上调；基因置换；或在预先确定的基因座转基因置换。可 以通过寻靶导致其失活、去除或修饰的基因的实例是编码对人异种反 应(xenoreactive)的抗原(例如α-1，3-半乳糖基转移酶)的基因；抗 体编码基因；负责产生朊病毒蛋白质及其在非人类动物中的正常相似 物(counterpart)的PrP基因座中的基团；造成遗传性疾病，以及 该基因的修饰、失活或缺失形式可以提供该疾病动物模型的基因(例 如，囊性纤维化跨膜传导调节物基因)；负责产生引发食物不耐受或 变态反应的物质的基因；造成特定碳水化合物残基存在于糖蛋白上的 基因(例如非人类动物中的胞苷单磷酸-N-乙酰神经氨酸羟化酶基 因)；以及造成免疫球蛋白基因体细胞重排的基因(例如RAG1和 RAG2)。

可以通过寻靶导致其上调的基因中有造成抑制补体介导的裂解 的基因(例如猪CD59、DAF和MCP)。另外，且如下又进一步所 述，也可以实施基因置换。可以置换的基因包括负责产生血液成分(例 如血清清蛋白)的基因、负责产生引发食物不耐受或变态反应的物质 的基因、免疫球蛋白基因以及负责产生表面抗原的基因。

使用本发明的方法，将鉴定、分离、分析和扩增携带靶定的事件 的原代细胞克隆所必需的时间显著最小化。这是本发明的重要方面， 因为缩短培养时间将令用作细胞核供体的细胞有生活力、正常且是整 倍体的可能性增加。

寻靶构建体

靶定的基因突变要求产生含有与目的基因中靶定的等位基因具 有同源性的区域的核酸构建体，从而由该构建体向基因组等位基因中 的整合破坏其表达。因此，为了改变基因，设计寻靶载体以含有三个 主要区域。第一个区域与要靶定的基因座同源。第二个区域是特异地 取代部分靶定的基因座的多核苷酸序列(例如编码选择标记如抗生素 抗性蛋白质)。与第一个区域类似，第三个区域与靶定的基因座同源， 但是在野生型基因组中不与第一个区域邻接。寻靶载体与所需野生型 基因座之间的同源重组导致寻靶载体中表现同源性的两个区域之间 的基因座序列的缺失、并以例如药物抗性标记取代该序列。使用的各 个载体的独特性在于为基因寻靶程序所选择的基因座和该策略中采 用的序列。该途径可用于所有哺乳动物，包括有蹄类动物，例如山羊 (Capra hircus)、绵羊(Ovis aries)、猪(Sus scrofa)以及家畜(黄 牛或瘤牛)。在此描述进行这类靶定的突变的示例性载体。构建提供 在其他靶定的位点同源重组的载体的方法为本领域技术人员所熟 知。此外，构建合适的载体在本领域技术水平之内。

为了便于同源重组，用于实现同源重组和灭活目的基因的载体分 别含有与要靶定的基因表现相当大序列同一性的DNA部分。优选 地，这些序列与靶定的基因座具有至少98％的序列同一性、更优选 至少99％的序列同一性、甚至100％的序列同一性，以便于同源重 组。在优选实施方案中，两个同源性区域的总大小为约9至9.5千碱 基，且取代部分靶定的基因座的第二个区域大小为约2千碱基。

一般而言，构建体包含使得能够选择所需同源重组子的标记基 因，所述同源重组子例如其中通过同源重组已破坏了目的基因的细 胞。标记基因除了别的外包括抗生素抗性标记、药物抗性标记和绿色 荧光蛋白。如下所述组装一个新霉素抗性构建体。设计称为 “pSTneoB”的构建体(Katoh等人，(1987)Cell Struct.Funct. 12：575；Japanese Collection of Research Biologicals(JCRB)保藏号： VE039)以含有在编码区上游SV40启动子及TK增强子控制下的新霉 素抗性基因。编码区下游是SV40终止子序列。从“pSTneoB”切除 neo盒作为XhoI片段。使用标准分子生物学技术将该片段末端转变 为平头末端之后，将该平头末端片段克隆到载体pBS246(Gibco/Life Technologies)的EcoRV位点中。该位点以loxP位点为侧翼。使用称 为“pLoxP-STNeoR”的新构建体产生μ敲除DNA构建体。该构建 体的所需片段以loxP位点和NotI位点为侧翼，所述两个位点最初存 在于pBS246克隆载体中。使用所需含有loxP-neo-loxP的NotI片段 置换免疫球蛋白μ恒定区外显子。与新霉素抗性基因可操作地连接的 SV40启动子激活新霉素抗性基因的转录，从而使得其中所需NotI片 段已取代了μ恒定区外显子的细胞基于其获得的抗生素抗性而得到 选择。

在此用于家畜中的靶定基因的策略(即，使用载体去除编码区部 分及间插序列，所述载体含有与去除的外显子侧面紧密相连的区域同 源的区域)也可以用于其他哺乳动物。例如，对绵羊(Ovis aries)的 一个免疫球蛋白重链基因座实施了广泛的序列分析，且绵羊基因座在 结构和序列上都与牛基因座高度相似(GenBank登记号Z71572、 Z49180至Z49188、M60441、M60440、AF172659至AF172703)。除 了关于重排的绵羊免疫球蛋白链报导的大量cDNA序列之外，关于重 链基因座也有基因组序列信息报导，包括重链5’增强子(GenBank 登记号Z98207)、3’μ开关区(GenBank登记号Z98680)和5’μ开 关区(GenBank登记号Z98681)。绵羊重链分泌形式的完整mRNA 序列以GenBank登记号X59994保藏。所述保藏物含有四个编码外显 子的全部序列，所述编码外显子与相应的牛序列非常相似。因此， GenBank序列可用于为设计PCR引物确定与牛IgμU序列具有高度 同源性的区域。因为使用非等基因DNA靶定牛细胞，所以使用发现 与绵羊序列具有高度同源性的区域作为母牛品种之间可能有相似的 序列保守性的指示。给定牛和绵羊免疫球蛋白基因座序列和结构之间 的相似性，在此用于去除牛免疫球蛋白基因座的寻靶策略可以应用于 绵羊体系。另外，关于猪(Sus scrofa；GenBank登记号S42881)和山 羊(Capra hircus；GenBank登记号AF140603)的已有信息显示，这两 个物种的免疫球蛋白基因座也都与牛基因座足够相似以利用该寻靶 策略。

在靶定细胞的一个方法中，寻靶构建体包括驱使标记基因表达的 调节性表达及聚腺苷酸化信号序列。这样的构建体允许独立于诱变基 因的表达而检测插入序列，并从而允许鉴定沉默基因(即，不在成纤 维细胞中表达的基因)中的重组子。为了确定标记基因是否通过同源 重组而非随机插入整合到基因组中，人们可以使用标准分子生物学技 术，例如DNA印迹、PCR或DNA测序。

靶定的细胞的选择

一般使用选择标记鉴定基因靶定的细胞。然而，如果细胞已经含 有选择标记，则可能需要含有不同选择标记的新的寻靶构建体。另 外，如果采用相同的选择标记，则可以通过增加药物浓度(例如，通 过将药物浓度加倍)在第二轮寻靶中选择细胞。

寻靶构建体也可以含有以loxP为侧翼的选择标记以便于使用 Cre/lox系统有效缺失该标记。因此，在基因寻靶事件之后的某些时 刻且优选在任何胚胎克隆之前，实施这类切除，以从细胞去除基因材 料部分。所述材料可以是选择标记或引入的基因转录激活物。可以通 过下文中描述的程序、或通过本领域所熟知的其他程序进行所述去 除。

在一个实例中，通过电穿孔以含有Cre的质粒(例如含有GFPCre 融合基因的Cre质粒，如Gagneten等人(1997)Nucleic Acids Res. 25：3326-3331所述)转染携带寻靶载体的胎儿成纤维细胞。这使得能 够快速选择含有Cre蛋白质的所有克隆。在这点上，通过FACS分选 或通过显微操作手动收获发绿色荧光的细胞而选择细胞。预期绿色细 胞携带活跃转录的将去除药物抗性标记的Cre重组酶。克隆选择用于 表达Cre的细胞，并通过PCR分析对药物抗性标记的缺失进行分析。 在这些确认之后，将这些细胞用于下一轮基因寻靶或克隆。

异种核酸的引入

如果需要，可以将编码所需多肽的异种核酸分子作为引入的突变 的部分插入内源性基因。例如，可以将编码特定物种抗体的基因引入 内源性基因。优选将人类人工染色体用于此目的，例如在PCT公开 号WO97/07671和WO00/10383中公开的那些，每个都在此引用作为 参考。在相应授权的日本专利JP 30300092中也描述了这些人类人工 染色体。在Shen等人，(1997)Hum.Mol.Genet.6：1375-1382；Kuroiwa 等人，(2000)Nature Bioteehnol.18：1086-1090；以及Loupert等人， (1998)Chromosome 107：255-259中公开了构建含有并表达人免疫球 蛋白基因的人工人染色体。稳定插入人工染色体之后，可以将细胞系 (例如胎牛成纤维细胞)用作进一步基因寻靶的供体细胞。

作为使用人人工染色体的备选方案，可以使用YAC载体、BAC 载体或粘粒载体将编码目的基因的多核苷酸整合到染色体中。可以使 用已知技术，例如电穿孔、脂转染、与含有YAC载体的酵母原生质 球融合等，将这类载体引入细胞(例如，胎儿成纤维细胞)中。希望 可以将含有目的基因的载体靶定细胞(例如，胎儿成纤维细胞)相应 的内源性基因座，从而导致同时引入目的基因并突变内源性基因。

也可以如Lonberg等人的专利(美国专利号5,545,806、 5,569,825、5,625,126、5,633,425、5,661,016、5,750,172、5,770,429、 5,789,650、5,814,318、5,874,299、5,877,397和6,300,129，所有均在 此引用作为参考)中所述进行编码目的基因的核酸的整合。在用于将 目的基因插入宿主哺乳动物染色体的“敲入”构建体中，人们可以将 一个或多个基因和抗生素抗性基因与启动子可操作地连接，所述启动 子在以该构建体转染的细胞类型中是活性的。例如，可以使用组成型 活性的、诱导型的或组织特异性启动子以激活整合的抗生素抗性基因 的转录，从而使得转染的细胞基于其获得的抗生素抗性而得到选择。 另外，可以使用其中敲入盒含有未与启动子可操作地连接的目的基因 和抗生素抗性基因的敲入构建体。在此情况下，可以基于在内源性启 动子控制下得到的抗生素抗性标记的表达选择敲入盒整合到内源性 启动子下游的细胞。可以将这些选择的细胞用于在此描述的胚胎克隆 程序，以产生含有整合到宿主染色体中的目的基因的非人类转基因哺 乳动物。另外，可以令含有外源目的基因的动物与内源性基因失活的 动物交配。

示例性基因突变

使用本方法可以将许多示例性基因突变引入哺乳动物。例如，可 以敲除有蹄类动物内源性Ig J链基因，以防止施用于人的本发明抗体 中有蹄类动物Ig J链的潜在的抗原性。为了构建寻靶载体，可以使用 GenBank登记号U02301的牛Ig J链区cDNA序列。该cDNA序列可 用作从BAC文库例如RPC1-42(BACPAC，Oakland，CA)分离牛Ig J链基因组序列、或从任何其他有蹄类动物分离J链基因组序列的探 针。另外，可以将人J链编码序列引入本发明的有蹄类动物中以功能 性表达人IgA和IgM分子。人J链cDNA序列可以以GenBank登记 号AH002836、M12759和M12378获得。可以使用标准方法，例如 在此所述的那些，将该序列插入有蹄类动物胎儿成纤维细胞中。例 如，可以将HAC、YAC载体、BAC载体、粘粒载体或敲入构建体中 的人J链核酸整合到有蹄类动物内源性染色体中或独立于有蹄类动 物内源性染色体保持。可以将得到的转基因有蹄类动物细胞用于在此 描述的胚胎克隆方法以产生所需有蹄类动物，所述有蹄类动物具有降 低或消除有蹄类动物功能性J链表达的突变、并含有表达人J链的异 种核酸。

在另一个实例中，如果非人类哺乳动物(例如有蹄类动物)经过 基因工程改造以产生人抗体，则可能也需要降低或消除有蹄类动物 α-(1，3)-半乳糖基转移酶基因的表达，该基因编码产生半乳糖基 (α1，3)半乳糖表位的酶。当作为治疗剂施用于人时，由该碳水化合 物表位修饰的糖基化人抗体有时被与该表位反应的受体抗体灭活或 消除。为了消除所述可能的免疫反应，可以使用牛α-(1，3)-半乳糖基 转移酶基因序列设计敲除构建体以灭活该基因。可以使用牛序列 (GenBank登记号J04989；Joziasse等人，(1989)J.Biol.Chem.264： 14290-14297)或猪α-(1，3)-半乳糖基转移酶序列(公开于美国专利号 5,821,117和6,153,428中)在这些物种中灭活该基因或从多种其他有 蹄类动物获得基因组α-(1，3)-半乳糖基转移酶序列，以产生该表位表 达降低或消除的哺乳动物。

也可以突变或灭活有蹄类动物PrP基因(编码朊病毒蛋白质)以 降低例如牛海绵状脑病(BSE)的可能的感染危险。牛PrP基因的突 变描述如下。

可以使用各种方法学将上述其他突变或基因灭活整合到本发明 的有蹄类动物中。一旦为各个所需突变产生了转基因有蹄类动物细胞 系，则可以使用杂交将这些其他突变整合到本发明的有蹄类动物中。 另外，可以使用具有这些其他突变的胎儿成纤维细胞作为敲除内源性 免疫球蛋白基因和/或引入异种免疫球蛋白基因的起始材料。同样， 如此所述，可以使用在内源性免疫球蛋白基因具有敲除突变和/或含 有异种免疫球蛋白基因的胎儿成纤维细胞作为这些其他突变或灭活 的起始材料。

克隆的非人类哺乳动物的产生

我们以前已经公开了许多克隆动物(例如有蹄类动物，如牛)的 方法，可以使用所述方法克隆在IgM重链编码基因中具有一个或多 个突变的动物(见如美国专利申请公开号2002-0046722和PCT公开 号WO02/051997)。在某些这类方法中，将透化细胞与重编程介质 (例如细胞提取物)温育以允许添加或从细胞去除因子，然后重新密 封透化细胞质膜以封闭所需因子并恢复细胞的膜完整性。某些这类方 法也包括供体细胞核(例如分离的细胞核或供体细胞内的细胞核)凝 集为染色质团以允许释放例如转录因子这类能够促进基因转录的细 胞核成分，所述基因不是核移植胚胎发育为可存活子代所必需的。如 果需要，可以将任何这些方法的步骤重复一次或多次，或者可以连续 实施不同的重编程方法以增加重编程程度，得到克隆胎儿的更强的生 活力。

产生克隆的哺乳动物(例如牛)及克隆的转基因非人类哺乳动物 的其他方法为本领域所公知，例如在转让至马萨诸塞大学(University of Massachusetts)的美国专利号5,995,577、以及PCT公开号 WO95/16670；WO96/07732；WO97/0669；以及WO97/0668(共同为 “Roslin方法”)中所述。Roslin方法与马萨诸塞大学技术的不同在 于他们使用休眠的而非增殖中的供体细胞。所有这些专利在此以其整 体引用作为参考。这些技术不限于用于产生转基因牛；上述技术也可 以用于其他非人类哺乳动物例如有蹄类动物的胚胎克隆。

胚胎克隆之后，可以通过有蹄类动物交配或通过使用前述同源寻 靶载体的第二次基因寻靶而实现所需动物的产生。

药物抗性标记的Cre/Lox切除

在本发明的一个实施方案中，使用Cre/lox系统以便于之后有效缺 失标记。以含有Cre的质粒通过电穿孔转染携带寻靶载体的胎儿成纤 维细胞。可以使用含有GFPcre融合基因的Cre质粒(Gagneten等人， (1997)Nucleic Acids Res.25：3326-3331)。这允许快速选择含有Cre 蛋白质的所有克隆。通过FACS分选或通过显微操作人工收获发绿色 荧光的细胞而选择这些细胞。预期绿色细胞携带活跃转录的Cre重组 酶，并因此缺失药物抗性标记。将选择用于表达Cre的细胞克隆，并 通过PCR分析对克隆分析药物抗性标记的缺失。将确定经过切除的那 些细胞培养为小的克隆，分开，并且在选择培养基中测试一个等分试 样，以确定药物选择基因已被缺失。另一个等分试样用于下一轮靶定 的缺失。

有蹄类动物培育方法

在上述任何产生有蹄类动物或有蹄类动物细胞的方法的优选实 施方案中，将本发明的有蹄类动物与另一个有蹄类动物交配以产生具 有两个或更多个基因修饰的胚胎、胎儿或活的子代。优选从胚胎、胎 儿或子代分离一个或多个细胞，并将一个或多个额外的基因修饰引入 分离的细胞中。

抗体产生方法

本发明也提供使用本发明表达异种抗体(例如人抗体)的有蹄类 动物产生抗体的方法。一个这样的方法包括将一个或多个目的抗原施 用于本发明的有蹄类动物，所述有蹄类动物具有编码异种抗体基因座 的核酸。该基因座中的核酸片段经过重排，从而导致产生对该抗原特 异的抗体。从该有蹄类动物回收抗体。抗体可以是单克隆的或多克隆 的，并且优选与目的抗原反应。优选从有蹄类动物血清或乳回收抗 体。

在有关方面，本发明提供另一个产生抗体的方法，其包括从本发 明的有蹄类动物回收异种抗体，所述有蹄类动物具有编码异种抗体基 因座的核酸。该基因座中的核酸片段经过重排，从而导致产生异种抗 体。抗体可以是单克隆的或多克隆的，并且优选与目的抗原反应。优 选从有蹄类动物血清或乳回收抗体。有蹄类动物抗血清或乳优选含有 多克隆人免疫球蛋白。抗血清或乳优选来自牛、绵羊、猪或公山羊。 在另一个优选实施方案中，免疫球蛋白针对所需抗原。在优选的实施 方案中，将抗血清用作治疗或预防人类疾病的静脉内免疫球蛋白 (IVIG)。在另一个优选实施方案中，将目的抗原施用于有蹄类动 物，由该有蹄类动物产生针对该抗原的免疫球蛋白。优选异种免疫球 蛋白基因座中的核酸片段重排，且产生与目的抗原反应的异种抗体。 优选地，该抗血清和/或乳含有为内源性抗体至少2、5、10、20或50 倍的异种抗体，或不含有内源性抗体。如果需要，可以使用来自上述 转基因有蹄类动物(例如转基因牛)的异种B-细胞产生杂交瘤和单克 隆抗体。也预期然后可以将从有蹄类动物分离的异种抗体(例如人抗 体)进行化学修饰，从而使它们与毒素、治疗活性化合物、酶、细胞 因子、放射性标记、荧光标记或亲和标签共价连接。如果需要，可以 将荧光或放射性标记用于抗体的体外或体内成像。

有蹄类动物及供体细胞

有蹄类动物包括奇蹄目和偶蹄目成员，例如牛属的任何成员。其 他优选的有蹄类动物包括羊、大角羊、山羊、水牛、羚羊、牛、马、 驴、骡、鹿、麋鹿、北美驯鹿、水牛、骆驼、美洲驼、羊驼、猪和象。

用于基因寻靶的优选细胞包括分化细胞，例如上皮细胞、神经细 胞、表皮细胞、角质形成细胞、造血细胞、黑素细胞、软骨细胞、B- 淋巴细胞、T-淋巴细胞、红细胞、巨噬细胞、单核细胞、成纤维细胞 和肌细胞；以及未分化细胞，例如胚胎细胞(例如干细胞和胚胎生殖 细胞)。在另一个优选实施方案中，细胞来自雌性生殖系统，例如乳 腺、卵巢丘(ovarian cumulus)、颗粒细胞或输卵管细胞。优选的细 胞也包括来自任何器官的细胞，例如膀胱、脑、食道、输卵管、心脏、 肠、胆囊、肾脏、肝脏、肺、卵巢、胰、前列腺、脊髓、脾、胃、睾 丸、胸腺、甲状腺、气管、输尿管、尿道和子宫。优选地，供体细胞、 供体细胞核、供体染色质团或重构的卵母细胞不是四倍体。

转基因有蹄类动物细胞

一方面，本发明提供在至少两个编码IgM重链的基因的一个或两 个等位基因中具有突变(例如，起始密码子ATC之后的突变，例如在 该密码子的10、20、50或100个核苷酸之内的突变)的有蹄类动物细 胞(例如牛细胞)。突变优选降低或基本消除功能性IgM蛋白质的表 达。在优选实施方案中，优选将功能性或总IgM蛋白质的表达降低至 少10、20、40、60、80、90、95或100％。突变可以是半合子或纯合 的。在一些实施方案中，突变包括将阳性选择标记(例如抗生素抗性 基因)插入核酸。优选地，阳性选择标记与异种启动子可操作地连接。 对于编码IgM重链的基因的两个等位基因均插入了抗生素抗性基因 的有蹄类动物或有蹄类动物细胞，各等位基因可以含有相同或不同的 抗生素抗性基因。在优选实施方案中，阴性选择标记(例如DT-A或 Tk)与异种启动子可操作地连接，并且存在于用于破坏内源性等位 基因的载体中。突变可能或可能不包括在基因中缺失一个或多个核苷 酸(例如邻接的核苷酸)。

在上述方面的优选实施方案中，有蹄类动物(例如牛)或有蹄类 动物细胞(例如牛细胞)具有一个或多个转基因并表达由该转基因编 码的mRNA或蛋白质(例如抗体)。优选的有蹄类动物含有天然排列 的人染色体片段(例如人染色体片段)或人工染色体，所述人工染色 体包含经过人工改造的人染色体片段(即，该片段相对于人基因组可 能重排)。在一些实施方案中，染色体片段中含有异种核酸。可以将 该核酸整合到有蹄类动物染色体中或独立于宿主染色体维持在有蹄 类动物细胞中。在各个实施方案中，染色体片段中含有该核酸，所述 片段例如ΔHAC、ΔΔHAC或κHAC。在其他实施方案中，异种抗体是 来自另一属的抗体，例如人抗体。

优选的有蹄类动物或有蹄类动物细胞在一个或多个B-细胞中含 有一个或多个核酸，所述核酸具有异种抗体基因座(例如编码全部或 部分异种免疫球蛋白(Ig)基因的核酸，所述异种免疫球蛋白基因经 过重排并表达至少一种异种Ig分子)。该核酸优选具有未重排的抗体 轻链核酸片段，其中所有编码V基因片段的核酸片段都通过一个或多 个核苷酸与所有编码J基因片段的核酸片段分离。其他优选的核酸具 有未重排的抗体重链核酸片段，其中(i)所有编码V基因片段的核酸片 段都通过一个或多个核苷酸与编码D基因片段的所有核酸片段分 离，和/或(ii)所有编码D基因片段的核酸片段都通过一个或多个核苷 酸与编码J基因片段的所有核酸片段分离。其他优选的有蹄类动物具 有一个或多个编码全部或部分重排的异种免疫球蛋白基因的核酸，所 述核酸至少表达一种异种免疫球蛋白。

在其他优选实施方案中，异种抗体的轻链和/或重链由人核酸编 码。在优选的实施方案中，重链是任何类的重链，例如μ、γ、δ、ε 或α，且轻链是λ或κ轻链。在其他优选实施方案中，编码异种免疫球 蛋白链或抗体的核酸是其未重排形式。在其他优选实施方案中，由有 蹄类动物产生多于一类的异种抗体。在各个实施方案中，由有蹄类动 物产生多于一种不同的异种Ig或抗体。异种抗体可以是多克隆或单克 隆抗体。

优选地，有蹄类动物也在编码朊病毒蛋白质、α-(1，3)-半乳糖基转 移酶和/或J链的内源性核酸的一个或两个等位基因中具有突变。优选 地，该突变降低或消除内源性α-(1，3)-半乳糖基转移酶、半乳糖基(α1，3) 半乳糖表位和/或J链的表达。该有蹄类动物优选产生含有人J链的人 IgA或IgM分子。优选的有蹄类动物细胞(例如牛细胞)包括体细胞， 例如胎儿成纤维细胞或B-细胞。

产生本发明的转基因有蹄类动物的方法包括突变(例如通过同源 重组)至少两个IgM重链基因(例如牛IgμU和IgμAY基因)的一个或 两个等位基因。基因突变可以通过同源重组实现。在优选的实施方案 中，使用合适的同源重组载体体外靶定胎儿成纤维细胞。相对于其他 一些体细胞，使用胎儿成纤维细胞是优选的，因为这些细胞易于在组 织培养中繁殖和基因操作。然而，使用胎儿成纤维细胞并不是本发明 所必需的，且其他细胞可以以相同的结果取代。合适的体细胞包括成 纤维细胞、上皮细胞、内皮细胞、神经细胞、角质形成细胞、造血细 胞、黑素细胞、软骨细胞、淋巴细胞(B-细胞和T-细胞)、巨噬细胞、 单核细胞、单核的细胞、心肌细胞、其他肌细胞、颗粒细胞、丘细胞 (cumulus cell)、胎盘细胞和表皮细胞。

靶定的基因突变需要构建DNA构建体，所述DNA构建体含有与靶 定的IgM重链等位基因具有同源性的区域，从而该构建体在整合到有 蹄类动物基因组IgM重链等位基因中后即破坏其表达。在下文实施例 中描述了进行牛IgμU和IgμAY的这类靶定的突变的示例性载体。构建 提供在其他靶定的位点同源重组的载体的方法为本领域技术人员所 熟知。此外，在本例中，构建合适的载体在本领域技术水平之内，尤 其是给定来自其他有蹄类动物(例如绵羊和山羊)的Igμ基因序列已 知时(见下文)。为了便于同源重组，用于实现同源重组和灭活IgM 基因的载体分别包含表现与有蹄类动物IgM重链和Ig轻链基因相当 大序列同一性的DNA部分。优选地，这些序列具有与靶定的基因座至 少98％的序列同一性、更优选至少99％的序列同一性、甚至更优选为 等基因的，以便于同源重组及靶定的缺失或失活。

一般而言，构建体包含使得能够选择所需同源重组子(例如成纤 维细胞)的标记基因，其中IgM重链基因已通过同源重组被破坏。示 例性标记基因除了别的外包括抗生素抗性基因、药物抗性基因和绿色 荧光蛋白。

如下所述组装一个新霉素抗性构建体。设计称为“pSTneoB”的 构建体(Katoh等人，(1987)Cell Struct.Funct.12：575；Japanese Collection of Research Biologicals(JCRB)保藏号：VE039)以含有在编 码区上游SV40启动子及TK增强子控制下的新霉素抗性基因。编码 区下游是SV40终止子序列。将neo盒作为XhoI片段从“pSTneoB” 切除。使用标准分子生物学技术将该片段末端转变为平头末端之后， 将该平头末端片段克隆到载体pBS246(Gibco/Life Technologies)的 EcoRV位点中。该位点以loxP位点为侧翼。使用称为“pLoxP- STNeoR”的新构建体产生μ敲除DNA构建体。该构建体的所需片段 以loxP位点和NotI位点为侧翼，所述两个位点最初存在于pBS246 克隆载体中。使用所需含有loxP-neo-loxP的NotI片段置换免疫球蛋 白μ恒定区外显子。与新霉素抗性基因可操作地连接的SV40启动子 激活新霉素抗性基因的转录，从而使得其内所需的NotI片段已取代 了μ恒定区外显子的细胞基于其得到的抗生素抗性而被选择。

获得IgM重链等位基因已被有效破坏的细胞系之后，将其用作 供体细胞以产生克隆的有蹄类动物胎儿(例如克隆的牛胎儿)及最终 的其中IgM重链等位基因之一被破坏的胎儿或动物。此后，使用来 自该胎儿或动物的体细胞(例如成纤维细胞)实现第二轮基因靶定的 突变，以产生第二个IgM重链等位基因被破坏的细胞。

下列实施例旨在阐明本发明。其无意以任何方式限制本发明。

实施例

实施例1：IgμU基因的靶定

我们已开发了可广泛应用且快速的产生多基因寻靶事件的方 法。如上文所讨论，采用连续应用高效寻靶体系并通过产生克隆的胎 儿来复壮细胞系(图1)。我们选择靶定在成纤维细胞中转录沉默的 IgμU基因。在雄性Holstein胎儿成纤维细胞系(#6939)中表征该基因 以鉴定KO载体序列以外的多态性标记DNA序列，所述多态性标记 DNA序列可用于区分两个等位基因(图2A；等位基因A和等位基因 B，如所示的)。以第一个KO载体(pBCμΔKOpuro；图2A)将来 自细胞系#6939的胎儿成纤维细胞电穿孔以产生446个对嘌呤霉素具 有抗性的孔。在第14天将孔分开，且将一半细胞用于经PCR(引物 对：puroF2×puroR2，图2A)筛选以鉴定含有正确靶定的细胞的孔。 最初六个孔为PCR阳性。为了排除假阳性孔，使所有PCR产物均经 过以puroF2和puroR2引物进行的双向测序分析。将两个孔(0.45 ％；#147，#384)鉴定为正确靶定的。基于通过测序分析鉴定的多态 性差异，将KO载体整合到#384孔中等位基因A及#147孔中等位基 因B中。这两孔中残余的细胞用于胚胎克隆以产生胎儿且复壮细胞 系。妊娠40天的怀孕率为50％(15/30；每个受体2个胚胎)，且在 妊娠60天，收集六个胎儿并重新建立成纤维细胞。

如通过PCR(引物对：puroF2×puroR2)和序列分析证实的， 六个胎儿中的三个(#2184-1，#2184-2和#3287)是杂合KO(IgμU- /+；图2B)。

非靶定的胎儿可能是由于孔中与靶定的细胞共存的非靶定的细 胞产生的。#2184-1和#2184-2均来自孔#384，在该孔中KO载体被整 合到等位基因A中，而胎儿#3287来自孔#147，在该孔中KO载体被 整合到等位基因B中。将从全部3个再生的细胞系产生的克隆的 IgμU-/+胚胎转移至153个受体以产生13个(8％)健康IgμU-/+小牛， 如通过PCR(图2C)和序列分析证实的。

将全部三个IgμU-/+细胞系(#2184-1和#2184-2，靶定于等位基因 A；#3287，靶定于等位基因B)用于以第二个KO载体 (pBCμΔKOneo；图3A)进行寻靶，其中以通过PCR从#6939细胞 系等位基因A直接扩增产生的序列取代该载体中的短同源臂。在 #2184-1和#2184-2细胞系中，通过PCR(引物对：neoF3×neoR3； 图3A)及随后的序列分析筛选共1211个抗G418孔。五个孔为阳性 的，且在两个孔中将载体整合到完整等位基因B中，从而产生纯合 KO(IgμU-/-)细胞，且在三个孔中取代等位基因A中的寻靶载体。在 #3287细胞系中，通过PCR(引物对：neoF3×neoR3；图3A)及随 后的序列分析筛选569个抗G418的孔。七个孔为阳性的，且在六个 孔中将载体整合到完整等位基因A中，从而产生IgμU-/-细胞，且在 一个孔中取代等位基因B中的寻靶载体。总体而言，当使用细胞系 #3287时，如预期的，载体对等位基因A具有3∶1的偏倚，并且对纯 合寻靶更加有效(与2/1211、0.17％相比为6/569、1.1％)。

选择来自细胞系#3287的两个IgμU-/-孔(#76，#91)用于胚胎克 隆以产生胎儿并复壮细胞系。总体而言，妊娠40至50天IgμU-/-胎儿 的怀孕率为45％(40/89)。在妊娠45天，收集并评价五个来自孔#76 的胎儿和15个来自孔#91的胎儿。如通过PCR(引物对：puroF2× puroR2及neoF3×neoR3)确定的，孔#76(图3B)的全部五个以及孔 #91的15个中的三个为阳性。通过对野生型等位基因(图3B)的序 列分析和阴性PCR(引物对：bCμf×bCμr；图3A)证实了PCR结 果。通过从再生的IgμU-/-成纤维细胞产生90天胎儿并评价IgμU基因 在脾细胞中的表达证实功能性KO。通过RT-PCR(引物对：bCμf× bCμr，图3C)证实不存在表达。从五个IgμU-/-细胞系制备克隆的胚 胎，并将其转移至受体以发育足月。

该组的两只小牛新出生，并且通过PCR(图3D)和序列分析证 实为IgμU-/-，从而验证了连续基因寻靶和连续轮次细胞复壮与健康小 牛的足月发育相容。

实施例2：使用Cre/LoxP系统去除选择标记

连续寻靶需要用于细胞系中新整合的寻靶载体的抗生素选择的 策略，所述细胞系已经含有一个或多个抗生素选择标记。最简单的途 径是对各寻靶事件使用不同选择标记。然而该途径限制了可以在细胞 系中实施的寻靶事件的数目。另一条途径是使用Cre-loxP重组系统 去除选择标记，正如已经在鼠胚胎干细胞中所进行的(Abuin和 Bradley(1996)Mol.Cell Biol.16：1851-1856)。在我们再生的IgμU 靶定的成纤维细胞中没有表达选择标记基因，可能是因为IgμU基因 座在成纤维细胞中沉默。尽管去除选择标记并非是在我们的IgμU-/- 成纤维细胞中进一步寻靶所必需的，但我们评价了通过以Cre重组酶 表达质粒进行转染来去除选择标记的可能性。因为目的是Cre重组酶 的瞬时表达，所以使用闭环质粒并且将抗生素选择限制在培养的头三 天。将牛IgμU-/-细胞系#4658用于转染，并通过PCR对选择的24个 孔评价抗生素选择基因从靶定的等位基因的切除(图4A)。多个孔 显示puro和neo基因均被切除的证据，并且选择一个用于胎儿克隆 及细胞系再生。妊娠40至50天的怀孕率为35％(21/60)。

回收五个胎儿，且其全部被去除了两个选择标记(图4B)。Cre 重组酶质粒整合到除#1404之外所有胎儿的基因组中。这些结果说明 Cre-loxP重组可用于在体细胞中去除选择标记。该系统的常规使用将 需要改进以降低Cre表达质粒的整合频率。

实施例3：PrP基因的寻靶

为了评价连续靶定第二个基因的可能性，将Cre切除的IgμU-/- (Cre/gμU-/-)成纤维细胞(细胞系#1404)进行第三轮寻靶以破坏PrP 基因。首先表征该基因以鉴定KO载体序列之外的多态性序列，以区 别两个等位基因(图5A；等位基因C和等位基因D，如所示的)。 以第三个KO载体(pBPrP(H)KOneo，图5A)转染细胞，且通过PCR 筛选203个G418抗性孔。

鉴定十三个(6.4％)孔，所述孔具有在Cre/IgμU-/-背景中显示杂 合KO PrP的细胞(Cre/IgμU-/-/PrP-/+)(引物对neoF7×neoR7；图 5A)。序列分析显示第三个KO载体整合到所有阳性细胞PrP基因 的等位基因C中。在妊娠45天将一些孔用于克隆以产生28个妊娠 (71％；表1)。收集五个胎儿，且如通过PCR(图5B；引物对： neoF7×neoR7)和序列分析显示的，所有均对PrP基因等位基因C 寻靶为阳性。

表1：含有修饰的细胞的胚胎发育、胎儿和小牛

修饰类型 产生的克隆胚 胎数目(％) 植入的受 体数目 于40-45天妊 娠(％) 阳性胎儿数目/ 收集的数目 (％)   出生的小牛   数目(％)   IgμU-/+   55/422(19)   30   15(50)   3/9(33)   -   IgμU-/+   153/3305(15)   153   99(65)   -   13(8)   IgμU-/-   438/2379(26)   89   40(45)   20/40(50)   -   IgμU-/-   333/4350(11)   171   107(63)   -   8(6)   IgμU-/+Prp-/+   112/739(22)   39   28(71)   5/19(26)   -   Igμ-/+Prp-/-   240/1673(20)   38   26(68)   33/33(100)   -

表2：三基因寻靶

    细胞系     (IgμU-/-)   筛选的集落数目 三次靶定的集落数目 (IgμU-/-/PrP-/+)   三次寻靶频率     #1404     203     13     6.4％     #4658     181     11     6.0％     #5112     187     10     5.3％

如预期的，阴性IgμU PCR后没有检测到扩增(图4B，引物对： bCμf×bCμr)。如表2所示，在牛成纤维细胞中活性的基因PrP的 寻靶效率远远高于在成纤维细胞中不表达的基因IgμU(分别为6.4％ 与0.63％)。

为了检查四次寻靶以产生双纯合KO胎儿和细胞系的可行性，对 残留的PrP基因等位基因以第四个KO载体转染三次靶定的细胞系 (#8443，Cre/IgμU-/-/PrP-/+)。通过以用于第一个等位基因的PrP寻 靶载体中的puro基因(pBPrP(H)KOpuro，图6A)取代neo基因而 构建载体。作为选择和PCR筛选(引物对：puroF14×puroR14，图 6A)的结果，发现17个孔(5.2％)含有在Cre/IgμU-/-背景中显示纯 合KO PrP的细胞(Cre/IgμU-/-/PrP-/-)。序列分析显示，除了其中等位 基因C中靶定的序列被取代的一个，第四个KO载体整合到所有阳 性细胞的PrP基因的等位基因D中。将Cre/IgμU-/-/PrP-/-阳性孔的细 胞用于克隆以产生胎儿，且妊娠45天怀孕率为71％(28/39)。如使 用寻靶事件特异性引物对(puroF14×puroR14和neoF7×neoR7(图 6B))的阳性PCR分析显示的，收集的所有18个胎儿均为 Cre/IgμU-/-/PrP-/-。序列分析证实第三个(neo)和第四个(puro)PrP 寻靶载体分别整合到等位基因C和D中。另外，我们实施阴性PCR 分析以证实不存在野生型PrP等位基因(引物对：BPrPex3F× BPrPex3R，图6B)和IgμU等位基因(引物对：bCμf×bCμr)，并 且如预期的，所有四个KO均得到证实。为了评价PrP mRNA表达， 通过RT-PCR检查IgμU-/-、IgμU-/-PrP-/+和Cre/IgμU-/-/PrP-/-细胞系 的成纤维细胞。PrP基因表达的功能性破坏得到证实(图6C)。表3 显示Cre/IgμU-/-/PrP-/-细胞系#8018中的四次寻靶的频率。

表3：四次基因寻靶

  细胞系   (IgμU-/-/PrP-/+)   筛选的集落数目 四次靶定的集落数目 (IgμU-/-/PrP-/-) 四次寻靶的频率    #8018    325  3  0.92％

我们的结果显示，使用细胞复壮方法易于在体细胞中实现对活性 和沉默基因的多轮基因寻靶。该系统证实对于靶定转录沉默和活性基 因均有效，从而证实其广泛应用，并且与通过至少两轮寻靶的健康小 牛的发育相容。另外，没有额外轮次的寻靶损害克隆的胚胎发育的迹 象。

方法

使用下列方法获得实施例1-3中所述结果。

KO载体的构建

通过用32P-标记的PCR片段探测，从非等基因Holstein基因组 文库获得IgμU恒定区基因座外显子2周围的牛基因组片段，所述 PCR片段以引物对5’-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3’(SEQ ID NO：1)和5’-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3’(SEQ ID NO：2)扩 增。通过限制酶作图另外分析一个基因组克隆。将外显子2周围的 7.2 kb的BglII-XhoI基因组片段(5’同源臂)和2.0kb的BamHI-BglII 片段(3’同源臂)亚克隆到pBluescript II SK(-)(Stratagene)中，然后 插入puro、STOP盒(pBS302，Stratagene)和DT-A(白喉毒素A) 基因(pBCμΔKopuro)。为了构建第二个寻靶载体，使用引物对5’- GCAATAGCAAGTCCAGCCTCATCTG-3’(SEQ ID NO：3)和5’- CATCCTGTCTCTGGTGGTTTGAGGTC-3’(SEQ ID NO：4)从 #6939实施基因组PCR。以BamHI-BglII消化后，该片段取代 pBCμΔKOpuro载体的3’短臂。通过测序，证实从“等位基因A”扩 增了BamHI-BglII片段。

以neo基因(pBCμΔKOneo载体)取代puro基因。通过用32P 标记的DNA片段筛选相同Holstein基因组λ噬菌体文库获得PrP基 因座外显子3周围的牛基因组片段，所述DNA片段以引物对5’- GATTGAATGGTCTCCAGGATGCC-3’(SEQ ID NO：5)和5’- GACAAGCTTAATATCCGCAGG-3’(SEQ ID NO：6)扩增。通过限制 酶作图另外分析一个基因组克隆。将含有外显子3的8.3kb的BamHI 基因组片段(3’同源臂)和1.2 kb的BamHI-Bg/II片段(5’同源臂) 亚克隆到pBluescript II SK(-)中，然后在起始ATG密码子之后的 BamHI位点插入neo和STOP盒。也将DT-A基因亚克隆 (pBPrP(H)KOneo载体)。类似地，构建另一个含有puro基因的KO 载体(pBPrP(H)KOpuro载体)。

细胞培养及转染

如上所述培养雄性Holstein胎儿成纤维细胞(Kuroiwa等人，如 上)，并使用GenePulser II(Bio-rad)在550V和50μF以30μg各寻 靶载体进行电穿孔。48小时后，将细胞在500μg/ml G418或1μg/ml 嘌呤霉素下选择两周，并挑取抗药性集落并转移至复制平板；一个用 于提取基因组DNA(24-孔板)且另一个用于胚胎克隆(48-孔板)。

基因组PCR分析

使用Puregene DNA提取试剂盒(GentraSystem)从复制24-孔 板，从小牛提取胎儿或耳活组织检查基因组DNA。为了鉴定出现在 IgμU寻靶中的各纯合重组事件，使用引物对puroF2(5’- GAGCTGCAAGAACTCTTCCTCACGC-3’，SEQ ID NO：7)、puroR2 (5’-ATGTACCTCCCAGCTGAGACAGAGGG-3’，SEQ ID NO：8)、 neoF3(5’-TTTGGTCCTGTAGTTTGCTAACACACCC-3’，SEQ ID NO：9)和neoR3(5’-GGATCAGTGCCTATCACTCCAGGTTG-3’， SEQ ID NO：10)。以包括98℃-10秒、68℃-8分钟的30个循环实施 PCR。对于阴性PCR，在由98℃-10秒、62℃-30秒、72℃-1分钟组 成的40个循环PCR中使用BCμf(5’- TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3’，SEQ ID NO：11)和BCμr(5’- TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3’，SEQ ID NO：12)。在PrP基因 座的情况下，使用引物对neoF7(5’- TGTCAAAGAGACACTCCTCATTTGTCTTCC-3’，SEQ ID NO： 13)、neoR7(5’-TCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCC-3’，SEQ ID NO：14)、puroF14(5’-TTGCTCCACCTTCCGTCTTCTGTC-3’，SEQ ID NO：15)和puroR14(5’-GTTGGCGCCTACCGGTGGATGTTTG- 3’，SEQ ID NO：16)。以包括98℃-10秒、68℃-5分钟的30个循环实 施PCR。对于阴性PCR，在由98℃-10秒、62℃-30秒、72℃-1分钟 组成40个循环PCR中使用引物对BPrPexF(5’- CCACATAGGCAGTTGGATCC-3’，SEQ ID NO：17)和BPrPexR(5’- ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3’，SEQ ID NO：18)。为了检测Cre 介导的切除，在由98℃-10秒、68℃-7分钟组成的40个循环PCR中 以引物对CreExF(5’-CAATAGCAAGTCCAGCCTCATCTGC-3’， SEQ ID NO：19)和CreExR(5’- GTGGTTTCTTCGGTGGAAACAACG-3’，SEQ ID NO：20)进行 PCR。将所有PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。

PCR产物测序

为了证实同源重组是否正确出现在各寻靶步骤中，对上面扩增的 PCR产物进行测序。PCR产物经过CHROMA SPIN-TE400柱(BD Biosciences Clontech)纯化，并且送交ACGT Inc.(Wheeling，IL)进行 测序。以用于PCR的正向和反向引物进行双向测序。通过PCR产物 序列中的多态性确定其中整合了各KO载体的等位基因。

透化细胞转移

使用如前所述的透化细胞转移程序产生克隆的胎儿和小牛 (Sullivan等人，(2004)Biol.Reprod.70：146-153)。将体外成熟的 卵母细胞在成熟后20小时去核。通过于37℃水浴中将悬浮液中的约 50000-100000个细胞与溶于100μl HBSS的31.2 U链球菌溶血素O (SLO；Sigma)温育30分钟而透化正确靶定的克隆。

将透化细胞沉淀、洗涤、并与40μl含有ATP产生体系(1mM ATP，10mM磷酸肌酸和25μg/ml肌酸激酶)的有丝分裂提取物于 38℃温育30分钟。在温育结束时，将反应混合物稀释、沉淀并洗涤。

将这些细胞与去核的卵母细胞融合，在成熟后28小时以5μM钙 离子载体活化4分钟，随后以10μg/ml环己酰亚胺和2.5μg/ml细胞 松弛素D活化5小时。活化后，洗涤胚胎并与小鼠胎儿成纤维细胞 体外共培养到胚泡期。选择1级和2级胚泡并转移到同步化受体中。 遵循由Transova Genetics Institutional Animal Care and Use Committee批准的方案进行所有动物工作。

RT-PCR

使用RNeasy mini试剂盒(Qiagen)从野生型(#6939)和IgμU-/- 胎儿脾提取RNA，且使用用于RT-PCR的superscript第一链合成体 系(Invitrogen)进行第一链cDNA合成。在由98℃-10秒、62℃-30秒、 72℃-1分钟组成的40个循环PCR中使用引物BCμf(5’- TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3’，SEQ ID NO：21)和BCμr(5’- TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3’，SEQ ID NO：22)进行PCR。从 #4658(IgμU-/-)、#8443(IgμU-/-/PrP-/+)和双纯合KO(IgμU-/-/PrP-/-)成纤 维细胞提取RNA，且如上进行第一链cDNA合成。以98℃-10秒、62 ℃-30秒、72℃-1分钟的40个循环使用引物PrPmF3(5’- CAAAACCTGGAGGAGGATGG-3’，SEQ ID NO：23)和PrPmR3(5’- ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3’，SEQ ID NO：24)进行PCR。为了 检测牛α-肌动蛋白mRNA的表达，在相同的PCR条件下使用引物 bBAF(5’-ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3’，SEQ ID NO：25)和 bBAR(5’-AACCGACTGCTGTCACCTTC-3’，SEQ ID NO：26)。

为了排除基因组DNA污染的可能性，不含逆转录酶实施另一个 RT-PCR。将PCR产物在0.8％琼脂糖凝胶上电泳。

实施例4：IgμAY的鉴定

在我们的IgμU-/-成纤维细胞分析期间，我们鉴定了转录物的表 达，可以通过设计用于扩增IgμU-/-的引物而检测到所述表达。为了确 定该转录物的特性，使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)从妊娠90天采 集的IgμU-/-胎儿脾提取总RNA。将一微升总RNA进行第一链cDNA合 成(用于RT-PCR的SuperScript第一链合成体系，Invitrogen)，随后为 如下进行的RT-PCR。使用的引物对为5’- TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3’(BCμf；SEQ ID NO：27)和5’- TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3’(BCμr；SEQ ID NO：28)。PCR 反应混合物含有32.5μl水，5μl10×Ex Taq缓冲液(TAKARA)，8μl dNTP混合物，10pmol正向引物，10pmol反向引物，2μl第一链 cDNA，以及0.5μl Ex Taq(TAKARA)。通过将反应混合物在如下条 件温育实施三十五个循环的PCR：85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10 秒钟，62℃30秒钟，及72℃1分钟。PCR后，通过电泳分析反应混 合物。在IgμU-/-胎儿中没有阳性PCR产物。然而，当将另一个引物对 5’-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3’(BCμf2；SEQ ID NO：30)和5’- CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3’(BCμr2；SEQ ID NO：31)用于 RT-PCR时，在IgμU-/-胎儿中检测到阳性PCR产物(图10)。为了确 定该矛盾的来源，通过BLAST分析各引物序列。结果显示，BCμf引 物序列对相应于U63637.2的牛Igμ序列特异。另一方面，BCμf2和 BCμr2序列匹配U63637.2及另一个序列AY230207(以前曾被报告为 U63637.2的多态性变体)。我们推断U63637.2和AY230207不是相同 基因的多态性变体，而是不同的牛Igμ基因。我们将U63637.2Igμ基因 称为IgμU，并将AY230207称为IgμAY。

为了确定IgμAY和IgμU基因是否都在VDJ重排后表达，同样从来 自#6939(最初的细胞系)的及IgμU-/-胎儿脾提取mRNA。以三十五个 循环使用5’-CCCTCCTCTTTGTGCTGTCA-3’(BL17；SEQ ID NO： 32)和5’-GTTCAGGCCATCATAGGAGG-3’(mBCμ-R2；SEQ ID NO： 33)实施RT-PCR，循环由下列条件组成：85℃3分钟，94℃1分钟， 98℃10秒钟，62℃30秒钟，及72℃1分钟。将PCR产物经CHROMA SPIN TE-100柱(BD)纯化，并送交ACGT Inc.以mBCμ-R2引物直接 测序。根据序列峰图，除了#6939胎儿中非常少量的IgμU的表达外， 主要表达IgμAY转录物，从而揭示IgμAY和IgμU均经过VDJ重排以得 到表达，且其二者在转录方面均为功能性的(图11)。然而，在IgμU KO胎儿中，是IgμAY在VDJ重排后得到表达(图11)。

实施例5：IgμAY突变

如下所述产生IgμAY KO载体。为了分离IgμAY基因外显子2周围 的基因组DNA，通过PCR使用5’-TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3’ (SEQ ID NO：34)和5’-CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3’(SEQ ID NO：35)(BCμ-f2和BCμ-r2)扩增DNA探针。使用该探针筛选来自#4658 IgμU纯合KO细胞系的牛(Holstein)基因组λ噬菌体文库，并且鉴定了 83个阳性λ噬菌体克隆。这些克隆应该含有完整IgμAY基因的两个等 位基因以及靶定的IgμU基因的两个等位基因。为了将完整IgμAY克隆 与靶定的IgμU克隆区别，使用引物对BCμ-f2和BCμ-r2将分离自各个 克隆的λDNA进行PCR。对于含有靶定的IgμU基因的克隆的情况，因 为存在整合于外显子2的KO盒，所以不能扩增PCR产物。另一方面， 可以从完整IgμAY基因座扩增PCR产物；产生PCR产物的克隆应该是 包含完整IgμAY基因的克隆，但是不产生PCR产物的克隆应该是包含 靶定的IgμU基因的克隆。在83个λ噬菌体克隆中，26个产生PCR产物， 且通过序列(引物AYU-F2；5’- GGCTGACTCCCTACCTCCCCTACAC-3’(SEQ ID NO：36))证实 其是含有完整IgμAY基因的克隆。证明至少另外10个不产生PCR产物 的克隆含有靶定的IgμU基因(通过序列(引物AYU-F2)证实)。前 文证明牛中至少有两个Igμ基因，且在我们的KO细胞系(#4658)中 破坏了一个基因(我们称为IgμU)，但是另一个基因(IgμAY)仍然 完整(图12)。

为了区别IgμAY的两个等位基因，我们使用引物AYU5’(5’- CGGAGCCCCTGGAGATGAGC-3’)(SEQ ID NO：37)对所有λ噬菌 体DNA进行测序。根据所述测序，我们发现了区别IgμAY基因的等位 基因的多态性序列，我们将其命名为AY等位基因和ay等位基因(图 13)。在26个克隆中，5个克隆含有AY等位基因而21个克隆含有ay等 位基因。为了构建AY-或ay-特异性KO载体，我们为AY选择#37克隆， 并为ay选择#49。通过限制酶作图进一步分析#37和#49的每一个。将 含有全部CμAY外显子的9千碱基的SalI-BamHI基因组片段亚克隆到 pBluescript II SK(-)中，所述pBluescript II SK(-)中已经以SrfI位点取 代KpnI位点。然后，在正好位于Cμ外显子2中的BglII位点插入bsr和 STOP盒。Bsr和STOP盒均位于相对于IgμAY基因的有义链方向。然 后将白喉毒素基因(DT-A，Gibco)加入pBluescript II SK(-)的NotI位 点。将DT-A以相对于bsr基因的正向方向插入寻靶盒，以杀死寻靶盒 被随机插入基因组的细胞(pBCμAYKObsr载体，图14)。类似地， 为ay等位基因构建另一个含有hyg基因的KO载体(pBCμayKOhyg载 体；图14)。

使用下列标准电穿孔方案以IgμAY KO载体实施IgμU纯合KO细 胞系的转染。用于培养牛胎儿成纤维细胞的培养基含有500mlαMEM (Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5ml 青霉素-链霉素(SIGMA)和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985- 023)。在转染前一天，将细胞以80-100％的汇合(如通过显微镜检 查确定的)接种于T175组织培养瓶。在转染当天，将约107个牛成纤 维细胞胰蛋白酶消化并用α-MEM培养基洗涤一次。将细胞重悬于800 μlα-MEM之后，向细胞悬浮液加入30μg SrfI-消化的KO载体 (pBCμAYKObsr载体)并通过移液(pipetting)充分混合，所述载 体溶解于含有1mM亚精胺的HEPES缓冲盐水(HBS)中。将细胞- DNA悬浮液转移到电穿孔杯中，并于550V和50μF电穿孔。此后，以 补加了血清的α-MEM培养基将电穿孔的细胞铺平板到三十个48-孔 板上。培养48小时后，以含有10μg/ml杀稻瘟素的培养基替换培养基， 并将细胞培养2-3周以选择杀稻瘟素抗性细胞。选择后，将接近100 ％汇合的所有集落分到两个复制平板中(24-孔和48-孔板)：一个用 于提取基因组DNA，而另一个板用于胚胎克隆。从集落提取基因组 DNA以通过PCR筛选所需同源重组。

使用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra SYSTEMS)按照制造 商的方案从各个24-孔独立提取基因组DNA。将各基因组DNA样品重 悬于20μl 10mM Tris-Cl(pH 8.0)和1mM EDTA(EDTA)中。使用下 列引物对AYKObsrF2(5’- GGTAGTGCAGTTTCGAATGGACAAAAGG-3’；SEQ ID NO：38)和 AYKObsrR2(5’-TCAGGATTTGCAGCACACAGGAGTG-3’；SEQ ID NO：39)实施PCR筛选。一个引物序列定位于KO载体中，且另一 个引物序列刚好定位于在靶定的内源性基因座中整合的载体之外。因 此，仅在KO载体通过同源重组整合到靶定的基因座中时检测到预期 的PCR产物。PCR反应混合物含有17.9μl水，3μl 10×LA PCR缓冲 液II(含Mg2+)，4.8μl dNTP混合物，10pmol正向引物，10pmol反向 引物，2μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过在如下条件温育反应混 合物实施四十个循环的PCR：85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒 钟，以及68℃8分钟。PCR后，通过电泳分析反应混合物。在322个 筛选的克隆中，22个克隆产生预期的PCR产物。作为PCR产物测序的 结果，设计用于靶定AY等位基因的KO载体在所有克隆中被专有地整 合到AY等位基因中。

也将pBCμayKOhyg载体转染到IgμU纯合KO细胞系中，只是除了 在电泳前以SalI消化该载体之外。作为筛选453个潮霉素抗性集落的 结果，使用下列引物对ayKOhygF2(5’- TGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGAC-3’；SEQ ID NO：40)和 ayKOhygR2(5’-TAGGATATGCAGCACACAGGAGTGTGG-3’； SEQ ID NO：41)通过PCR将29个克隆鉴定为阳性的。PCR产物测序证 明设计用于靶定ay等位基因的KO载体专有地整合到ay等位基因中。 由上述结果判断，可以说AY和ay KO载体均以等位基因特异的方式特 异地靶定各等位基因，并且以7-8％的频率产生正确靶定的克隆。如 下所述实施染色质转移。将体外成熟的卵母细胞于20hpm去核。将牛 IgμU敲除成纤维细胞胰蛋白酶消化，在Ca/Mg Hank氏平衡盐溶液 (HBSS)中洗涤，并通过于37℃水浴在100μl中将50000-100000个细 胞在31.25个单位的链球菌溶血素O(SLO；Sigma，St.Louis，MO)中 温育30分钟而透化。将细胞样品与碘化丙锭温育，并基于染料摄取通 过荧光显微镜以监控透化来进行观察。将透化的成纤维细胞洗涤、沉 淀并于37℃水浴在40μl从MDBK细胞制备的有丝分裂提取物中温育 30分钟，所述有丝分裂提取物含有ATP产生体系(1mM ATP、10mM 磷酸肌酸和25μg/ml肌酸激酶)。将细胞样品用Hoechst 33342染色， 并通过荧光显微镜术以监控染色质凝集来进行观察。在温育结束时， 将反应混合物以500μl细胞培养基(含有10％FBS的αMEM)稀释。 将这些细胞沉淀并重悬于TL HEPES中，并用于在去核卵母细胞中转 移染色质。确定十二个胎儿为半合子IgμAY KO胎儿，其中bsrKO载 体整合到IgμAY基因的AY等位基因中。同样，确定十一个胎儿为半 合子IgμAY KO胎儿，其中bsrKO载体整合到IgμAY基因的ay等位基 因中。这些胎儿也是IgμU-/-。将这些IgμAY-/+/IgμU-/-细胞系(A227， 在AY等位基因中靶定)之一用于使用pBCμayKOhyg的第二次寻靶实 验。作为筛选197个潮霉素抗性集落的结果，使用引物对(ayKOhygF2 和ayKOhygR2)通过PCR将18个克隆鉴定为阳性。PCR产物测序证 明，设计用于靶定ay等位基因的KO载体被专有地整合到ay等位基因 中，从而产生双纯合敲除(IgμAY-/-/IgμU-/-)细胞。

我们使用在此描述的方法产生了IgμAY-/-/IgμU-/-胎儿。为了检查 这些胎儿是否是B细胞缺陷的，我们在妊娠180天收集IgμAY-/-/IgμU-/- 胎儿。使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)从脾提取总RNA。将一微 升总RNA进行第一链cDNA合成(用于RT-PCR的SuperScript第一链 合成体系，Invitrogen)，随后为RT-PCR。如下进行一个RT-PCR反 应。使用的引物对(5’-CCCTCCTCTTTGTGCTGTCA-3’(BL17；SEQ ID NO：42)和5’-GTTCAGGCCATCATAGGAGG-3’(mBCμR2；SEQ ID NO：43))与IgμAY和IgμU扩增均相容。PCR反应混合物含有32.5μl 水、5μl 10×Ex Taq缓冲液(TAKARA)、8μl dNTP混合物、10pmol 正向引物、10pmol反向引物、2μl第一链cDNA以及0.5μl Ex Taq (TAKARA)。通过将反应混合物在下列条件温育实施三十五个循 环的PCR：85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，62℃30秒钟及 72℃1分钟。PCR后，通过电泳分析反应混合物。在IgμAY-/-/IgμU-/- 胎儿中无阳性PCR产物。PCR后，通过电泳分析反应混合物。未能检 测到IgμAY或IgμU的表达。我们也实施流式细胞仪分析以检测IgM重 链蛋白质的存在。未能检测到该蛋白质。

为了确定IgμU基因自身是否支持B细胞发育，与上文所述类似， 我们使用pbCμayKOhyg和pbCμAYKObsr载体产生IgμAY敲除体。我 们从一个IgμA-/-细胞系产生了180天胎儿，并对脾组织实施RT-PCR以 试图检测VDJ重排的IgμU转录物。RT-PCR产物序列专有地显示IgμU 转录物的VDJ重排的序列，并证实了IgμAY基因表达的破坏。我们从 序列分析证实，存在与JH-CμL片段有关的可能的VH和DH片段，其包 含相应的FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3和CDR3区。另外，RT-PCR 产物的直接测序明确显示IgμU转录物CDR3区以及IgμAY中的多样性 序列。IgμU cDNA的序列似乎编码功能性IgM-样多肽，其与IgμAY略 有不同，尤其在FR4和恒定区。这些数据证实，IgμU基因可以在功能 性VDJ-重排(包括CDR3的多样化)之后独立于IgμAY的表达而表达。

为了研究IgμU的功能性表达是否足以独立于通过IgμAY的经典 途径实施B细胞发育，我们在IgμAY-/-180天胎儿中实施流式细胞仪分 析。我们认识到与对照相当的显著的发育中的B细胞群体 (IgM+B220+)。该结果显示IgμU蛋白质可以展示于B细胞表面。然 后，为了研究不成熟B细胞(IgM+Igλ+)的产生，用抗牛IgM多克隆 抗体及抗牛Igλ单克隆抗体进行染色。检测到双阳性B细胞，提示存在 不成熟B细胞，在此IgμU重链与Igλ轻链偶联以形成B细胞受体。另 外，通过抗-CD21抗体识别，我们检测到成熟B细胞的产生，并通过 RT-PCR证实VDJ-重排的bIgD基因的基因表达。所述观察提示，IgμU 可以支持成熟B细胞发育并引起VDJ-Cδ基因的表达。而且，即使尚未 将γ恒定区片段鉴定为IgμU基因簇部分，我们也检测到出现VDJ-重排 的bIgG的类别转换和表达。有趣的是，来自IgμAY-/-胎儿的bIgG转录 物中，CDR3多样化的程度显著低于在IgμU-/-胎儿中所检测到的。然 而，IgμAY-/-胎儿IgμU转录物中的CDR3在与IgμU-/-胎儿IgμAY转录物 相当的水平多样化。该结果提示，与经典gμAY基因座相比，IgμU产 生充分多样化的IgG可能效率较低，可能是因为IgμU基因座没有与 bIgG恒定区顺式连接。这些数据强烈提示，IgμU可以大大取代在驱 动B细胞发育中的IgμAY功能缺乏，但是似乎通过某些反式类别转换 机制从IgμAY基因座招募γ恒定区片段。

从这些结果证实牛中有两个功能性IgM基因座IgμAY和IgμU，且 双纯合敲除体IgμAY-/-/IgμU-/-对于B细胞缺陷有用。

实施例6：朊病毒蛋白质表达缺陷的牛的产生

本发明涉及产生朊病毒蛋白质表达缺陷的牛。尽管PrP-/-小鼠是 可存活的并且表现健康，但以前尚未确定在家畜中敲除该基因的作 用。我们为牛成纤维细胞开发了上述连续基因寻靶体系以试图产生 PrP-/-家畜。用敲除载体(pBPrP(H)KOneo)转染雄性Holstein成纤维 细胞(细胞系4685，其也为IgμU-/-)，并在妊娠40天克隆正确靶定 的细胞以产生用于确立PrP-/+细胞系的PrP-/+胎儿。通过PCR基因分 型评价胎儿细胞系以证实正确寻靶。然后以第二个敲除载体 (pBPrP(H)KOpuro)转染PrP-/+细胞系，继之为选择和克隆以产生 PrP-/-胎儿和细胞系。通过PCR基因分型证实细胞系中的正确寻靶。 将野生型PrP+/+/IgμU-/-(细胞系5112)、杂合敲除PrP-/+IgμU-/-(细 胞系8018)以及纯合敲除PrP-/-/IgμU-/-(细胞系1718)成纤维细胞用 于胚胎克隆以产生小牛(表4)。在我们的第一个克隆系列中，我们 从PrP+/+/IgμU-/-(小牛347；5.9％)、PrP-/+/IgμU-/-(小牛341；4.3 ％)以及PrP-/-/IgμU-/-(小牛342；3.2％)细胞系各获得一只小牛(图 15)。

表4：从PrP-/-成纤维细胞系产生第一系列的克隆的小牛

    基因型   细胞系ID   植入的受体数目   出生的小牛数目   (％) 存活的小牛数 目(％) PrP+/+IgμU-/-     5112     17     1(5.9)     1(5.9) PrP-/+/IgμU-/-     8018     23     2(8.6)     1(4.3) PrP-/-/IgμU-/-     1718     31     2(6.4)     1(3.2)

为了证实小牛341和342的基因型，我们从各小牛采集一小块皮 肤活组织检查并确立成纤维细胞系(图16A)。来自两个敲除基因型 的成纤维细胞和对照成纤维细胞在形态学或生长速率中没有观察到 差异。使用对各靶定的PrP等位基因特异的引物对(引物对：neoF7 ×neoR7和puroF14×puroR14；图16B)通过PCR进行基因分型， 继之为序列分析，以进行确认。另外，我们实施第二个PCR(Kuroiwa 等人，如上)以证实不存在野生型PrP等位基因(引物对：BPrPex3F ×BPrPex3R，图16C)。结果证实小牛341为杂合PrP敲除的而小 牛342为纯合PrP敲除的。另外，我们在小牛341和342中使用引物 对BCμf×BCμr(图16D)实施了类似的PCR分析以证实不存在野 生型IgμU等位基因，并且如预期地证实了全部四个寻靶事件(PrP-/- /IgμU-/-)。这代表第一代双纯合敲除(PrP-/-/IgμU-/-)小牛，从而证 明原代体细胞中的四轮基因寻靶继之为胚胎克隆与产生活小牛相 容。

为了证明PrP基因在小牛342中的功能性失活，我们从成纤维细 胞提取mRNA和总蛋白质。作为对照，我们分析PrP-/+/IgμU-/-小牛 347和PrP-/+/IgμU-/-小牛341。对于mRNA表达分析，我们实施RT- PCR(引物对：PrPmF3×PrPmR3，图17A)，并然后证实PrP mRNA 表达在PrP-/-/IgμU-/-小牛342中破坏，而在PrP+/+/IgμU-/-小牛347和 PrP-/+/IgμU-/-小牛341中检测到明显表达。对于蛋白质表达分析，我 们使用小鼠抗牛PrP单克隆抗体实施蛋白质印迹分析。我们对 PrP+/+/IgμU-/-小牛347和PrP-/+/IgμU-/-小牛341检测到适当条带，但 是对PrP-/-/IgμU-/-小牛342或阴性对照小鼠成纤维细胞没有观察到条 带(图17B)。另外，我们从出生后第一周内死亡的两只PrP-/-小牛 采集脑样品，并对该样品实施蛋白质印迹分析。从脑样品中没有检测 到PrP阳性条带(图18)。在个别实验室也以不同的小鼠抗牛PrP 单克隆抗体(6H4，Prionics)证实该结果。这些数据清楚地证明PrP 基因在PrP-/-/IgμU-/-和PrP-/-小牛中功能性失活。

所有小牛都由注册兽医或经过培训的动物护理技术人员评价。在 一周和一个月给予小牛341和342及对照体格检查，其包括评价下列 参数：体重、体温、心搏率、心音、颈静脉扩张、呼吸速率、呼吸音、 咳嗽、存在鼻排出物或眼异常、食欲、一般行为(警觉和活跃，行动 迟缓，活动过强)、步态、姿势、关节、蹄、粪便(腹泻、便秘)、 生殖器及脐带(干燥、扩大、发炎、感染)。另外，采集血液样品用 于标准血液学和血清化学。到此为止小牛341和342的所有参数对于 这些年龄组均正常。

为了更多确认，产生第二组克隆的PrP-/-胚胎(仅PrP-/-而没有其 他基因修饰)并转移至51个受体中。由这些转移生出七只小牛(14 ％)(表5)。通过从血液活组织检查分离的外周血淋巴细胞(PBL) 的PCR基因分型和蛋白质印迹分析(图19)确认这些小牛为PrP-/-。 小牛在一周的体格检查没有揭示任何明显异常，且到此为止在PrP-/- /IgμU-/-和PrP-/-小牛之间没有明显的表型差异。

表5：从PrP-/-成纤维细胞系产生第一系列的克隆的小牛

  基因型  细胞系ID   植入的受体数目 出生的小牛数目 (％) 存活的小牛数目(％)   PrP-/-     5211     30     7(23)     5(16)   PrP-/-     5232     21     3(14)     2(10)

方法

使用下列方法获得实施例6中所述结果。

胚胎克隆

使用染色质转移程序产生克隆的小牛。在成熟后20小时将体外 成熟的卵母细胞去核。通过于37℃水浴将悬浮液中的约50000- 100000个细胞与溶于100μl HBSS中的31.2U链球菌溶血素O (SLO；Sigma)温育30分钟而透化正确靶定的克隆。将透化的细胞 沉淀、洗涤、并于38℃与含有ATP产生体系(1mM ATP，10mM 磷酸肌酸，及25μg/ml肌酸激酶)的40μl有丝分裂提取物温育30 分钟。在温育结束时，将反应混合物稀释、沉淀并洗涤。将这些细胞 与去核卵母细胞融合，并在成熟后28小时以5μM钙离子载体活化4 分钟，随后以10μg/ml环己酰亚胺和2.5μg细胞松弛素D活化5小 时。活化后，将CT胚胎洗涤并与小鼠胎儿成纤维细胞体外共培养至 胚泡期。选择1和2级胚泡并转移至同步化受体中。此部分中所述所 有动物工作均遵循Transova Genetics institutional animal care and use committee批准的方案。

细胞培养及转染

培养雄性Holstein胎儿成纤维细胞并使用GenePulser II(Bio- Rad)于550V和50μF以30μg各敲除载体进行电穿孔。48小时后， 使用500μg/ml G418或1μg/ml嘌呤霉素选择细胞两周，挑取抗药性 集落并转移到复制平板；一个用于提取基因组DNA(24-孔板)，另 一个用于胚胎克隆(48-孔板)。

基因组PCR分析

使用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra SYSTEMS)和厂商 方案从来自PrP-/-纯合KO小牛耳活组织检查或血液的成纤维细胞提 取基因组DNA。将各基因组DNA样品重悬于50-100μl 10mM Tris- Cl(pH 8.0)和1mM EDTA(EDTA)中。使用下列引物对实施PCR确 认：neoF7；5’-TGTCAAAGAGACACTCCTCATTTGTCTTCC-3’ (SEQ ID NO：44)和neoR7；5’- TCATAGCCGAATAGCCTCTCCACCC-3’(SEQ ID NO：45)用于检 测第一个靶定的等位基因，以及puroF14；5’- TTGCTCCACCTTCCGTCTTCTGTC-3’(SEQ ID NO：46)和 puroR14；5’-GTTGGCGCCTACCGGTGGATGTG-3’(SEQ ID NO： 47)用于检测第二个靶定的等位基因。PCR反应混合物含有17.9μl 水、3μl 10XLAPCR缓冲液II(含Mg2+)、4.8μl dNTP混合物、10pmol 正向引物、10pmol反向引物、2μl基因组DNA及0.3μl LA Taq。 通过在下列条件温育反应混合物实施三十个循环的PCR：85℃3分 钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，以及68℃5分钟。另外，实施另 一个PCR以证实不存在(i)野生型PrP等位基因，其中使用下列引物 对：BPrPex3F；5’-CCACATAGGCAGTTGGATCC-3’(SEQ ID NO： 48)和BPrPex3R；5’-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3’(SEQ ID NO： 49)，以及(ii)IgμU等位基因(仅对于PrP-/- IgμU-/-小牛)，其中使用 下列引物对：BCμf；5’-TGGTCACTCCAAGTGAGTCG-3’(SEQ ID NO：50)和BCμr；5’-TGGAGTGAAATCAGGTGAAGG-3’(SEQ ID NO：51)。PCR反应混合物含有17.9μl水、3μl10×Ex Taq缓冲液、 4.8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引物、2μl基 因组DNA以及0.3μl Ex Taq。通过在下列条件温育反应混合物实施 三十个循环的PCR：85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒钟，60-62 ℃30秒钟，及72℃1分钟。PCR后以电泳分析反应混合物。

RT-PCR

使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)从活组织检查样品提取总 RNA。将一微升总RNA进行第一链cDNA合成(用于RT-PCR的 SuperScript第一链合成体系，Invitrogen)，继之为RT-PCR。使用引 物对5’-AA GAAGCGACCAAAACCTGG-3’(SEQ ID NO：52)和5’- GTAACGGTGCATGTTTTCACG-3’(SEQ ID NO：53)进行RT- PCR。PCR反应混合物含有32.5μl水、5μl 10×Ex Taq缓冲液 (TAKARA)、8μl dNTP混合物、10pmol正向引物、10pmol反向引 物、2μl第一链cDNA及0.5μl Ex Taq(TAKARA)。通过在下列条件 温育反应混合物实施三十五个循环的PCR：85℃3分钟，94℃1分 钟，98℃10秒钟，62℃30秒钟及72℃1分钟。为了检测牛β-肌动 蛋白mRNA的表达，在相同PCR条件下使用引物bBAF(5’- ACATCCGCAAGGACCTCTAC-3’；SEQ ID NO：54)和bBAR(5’- AACCGACTGCTGTCACCTTC-3’；SEQ ID NO：55)。为了排除基因 组DNA污染的可能性，也实施不含逆转录酶的另一组RT-PCR反 应。PCR后以电泳分析反应混合物。在从PrP-/-或PrP-/- IgμU-/-KO 小牛制备的任何活组织检查样品中都没有阳性PCR产物。该结果证 实在该小牛中完全不存在朊病毒基因的表达。

蛋白质印迹

从活小牛的活组织检查或血液样品或死亡小牛的脑样品提取总 蛋白质，并且使用Bio-Rad蛋白质测定试剂定量蛋白质含量。在非还 原条件下将约75μg蛋白质样品在12％SDS PAGE凝胶上进行蛋白 质印迹分析。然后将蛋白质转移至硝酸纤维素膜，并且使用抗牛朊病 毒蛋白质单克隆抗体(F 89/160.1.5；Alexis Biochemicals)作为第一抗 体将膜染色，其次以抗小鼠IgG(H+L)的过氧化物酶标记的亲和纯 化抗体染色。使用ECL+蛋白质印迹检测体系(Amersham Bioscience)将染色的膜显色，并通过胶片显象剂暴光于Biomax光胶 片。使用重组牛PrP蛋白质(Alexis Biochemicals)作为阳性对照。作 为阴性对照，分析来自鼠成纤维细胞的蛋白质提取物。作为阳性内对 照，将相同印迹类似地以抗CDC2单克隆抗体染色。在从PrP-/-或PrP-/- IgμU-/-KO小牛制备的活组织检查样品中没有检测到朊病毒蛋白质条 带。该结果证实在该小牛中完全不存在朊病毒蛋白质的表达。

实施例7：朊病毒蛋白质和IgM重链表达缺陷的牛的产生

使用下列标准电穿孔方案以pBCμAYKObsr载体实施IgμU-/-PrP-/- 细胞系的转染。用于培养胎牛成纤维细胞的培养基含有500ml αMEM(Gibco，12561-049)、50ml胎牛血清(Hy-Clone#ABL13080)、5 ml青霉素-链霉素(SIGMA)和1ml 2-巯基乙醇(Gibco/BRL#21985- 023)。在转染前一天，将细胞以80-100％的汇合(如通过显微镜检 查确定的)接种于T175组织培养瓶。在转染当天，将约107个牛成纤 维细胞胰蛋白酶消化并以α-MEM培养基洗涤一次。将细胞重悬于800 μl α-MEM中之后，向细胞悬浮液加入30μg经SrfI消化的KO载体 (pBCμAYKObsr载体)并通过移液充分混合，所述载体溶解于含有 1mM亚精胺的HEPES缓冲盐水(HBS)中。将细胞-DNA悬浮液转 移到电穿孔杯中，并于550V和50μF进行电穿孔。此后，以补加血清 的α-MEM培养基将电穿孔的细胞铺平板到三十个48-孔板上。培养48 小时后，以含有10μg/ml杀稻瘟素的培养基替换培养基，并将细胞培 养2-3周以选择杀稻瘟素抗性细胞。选择后，将接近100％汇合的所 有集落分到两个复制平板中(24-孔和48-孔板)：一个用于提取基因 组DNA，而另一个板用于核转移。从集落提取基因组DNA以通过PCR 筛选所需同源重组事件。

如上所述，使用PUREGENE DNA分离试剂盒(Gentra SYSTEMS) 按照制造商的方案从各个24-孔独立提取基因组DNA。将各基因组 DNA样品重悬于20μl 10mM Tris-Cl(pH 8.0)和1mM EDTA(EDTA) 中。使用下列引物对AYKObsrF2(5’- GGTAGTGCAGTTTCGAATGGACAAAAGG-3’；SEQ ID NO：38)和 AYKObsrR2(5’-TCAGGATTTGCAGCACACAGGAGTG-3’；SEQ ID NO：39)实施PCR筛选。一个引物序列定位于KO载体中，且另一 个引物序列刚好定位于靶定的内源性基因座中整合的载体之外。因 此，仅在KO载体通过同源重组整合到靶定的基因座中时检测到预期 的PCR产物。PCR反应混合物含有17.9μl水，3μl10×LA PCR缓冲 液II(含Mg2+)，4.8μl dNTP混合物，10pmol正向引物，10pmol反向 引物，2μl基因组DNA和0.3μl LA Taq。通过在如下条件温育反应混 合物实施四十个循环的PCR：85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10秒 钟，以及68℃8分钟。PCR后，通过电泳分析反应混合物。在198个 筛选的克隆中，14个克隆产生预期的PCR产物。作为PCR产物测序的 结果，设计用于靶定AY等位基因的KO载体在所有克隆中被专有地整 合到AY等位基因中。

将以上敲除(IgμAY-/+IgμU-/-PrP-/-)细胞或这些细胞的细胞核用 于在此描述的任何核转移方法中，以产生IgμAY-/+IgμU-/-PrP-/-敲除有 蹄类动物(例如敲除的小牛)。如果需要，可以如下所述使用敲除胎 儿或活有蹄类动物的细胞以产生纯合朊病毒敲除细胞。在一个具体方 法中，以1μg/ml的诺考达唑(nocodazole)将成纤维细胞(例如胎牛 原代成纤维细胞)同步化于有丝分裂中18小时，通过有丝分裂摇落收 获，并在磷酸缓冲盐水中洗涤两次，且在细胞裂解缓冲液(20mM Hepes，pH 8.2，5mM MgCl2，10mM EDTA，1mM DTT及蛋白酶 抑制剂)中洗涤一次。将沉淀的细胞重悬于一体积冰冷的细胞裂解缓 冲液中，使其于冰上膨胀一小时，并使用紧密适合的玻璃研杵进行 Dounce匀浆。将裂解液于4℃以15000×g离心15分钟，并将上清液(有 丝分裂提取物)等分试样，在液氮中冷冻并于-80℃保存。使用新鲜 或冷冻提取物。将体外成熟的卵母细胞在20hpm去核。将来自所选集 落的转染的胎牛成纤维细胞在无Ca2+/Mg2+Hank氏平衡盐溶液 (HBSS)中洗涤，并通过于约37℃水浴将悬浮液中的细胞与溶于100μl HBSS的31.2U链球菌溶血素O(SLO；Sigma)温育30分钟而透化。通过 不透膜的DNA染料碘化丙锭(0.1μg/ml)的摄取评价透化。将透化的 成纤维细胞沉淀、洗涤，并于约37℃在含有ATP产生体系(1mM ATP，10mM磷酸肌酸，以及25μg/ml肌酸激酶)的40μl有丝分裂提 取物中温育30-45分钟。以0.1μg/ml Hoechst 33342标记等分试样以监 控染色质凝集。在温育结束时，将反应混合物以500μl αMEM/10％胎 牛血清(Hyclone)稀释。将细胞与去核的卵母细胞融合；将卵母细胞在 28hpm活化，并将胚胎体外培养至胚泡期。每个雌性受体转移两个胚 胎。通过超声波扫描仪监控怀孕，并且为产生细胞系对受体实施剖腹 产以回收胎儿。

将pBCμayKOhyg载体转染上面的IgμAY-/+IgμU-/-PrP-/-细胞系， 只是除了在电穿孔前将载体以SalI消化。作为筛选119个潮霉素抗性 集落的结果，使用引物对ayKOhygF2(5’- TGGTTGGCTTGTATGGAGCAGCAGAC-3’；SEQ ID NO：58)及 ayKOhygR2(5’-TAGGATATGCAGCACACAGGAGTGTGG-3’； SEQ ID NO：59)通过PCR将四个克隆鉴定为阳性的。PCR产物的测序 结果证明，设计用于靶定ay等位基因的KO载体被专有地整合到ay等 位基因中。我们从上述结果推断，AY和ay KO载体都可以以等位基因 特异的方式特异地靶定各个等位基因，并产生正确靶定的克隆。

使用在此描述的方法，我们实施了从鉴定的IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/- 集落的染色质转移，并最终产生了四个IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/-胎 儿，我们由此确立了四个细胞系。另外，我们获得一只IgμAY-/- IgμU-/- PrP-/-小牛。如下实施基因分型。使用PUREGENE DNA分离试剂盒 (Gentra SYSTEMS)按照制造商方案从来自IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/-三 纯合KO小牛的耳活组织检查或血液的成纤维细胞提取基因组DNA。 将各基因组DNA样品重悬于50-100μl 10mM Tris-Cl(pH 8.0)和1 mM EDTA(EDTA)中。使用下列引物对实施PCR确认：5’- TCTCTGGTGACGGCAATAGC-3’(BCμf2；SEQ ID NO：60)和5’- CTTCGTGAGGAAGATGTCGG-3’(BCμr2；SEQ ID NO：61)用于确 认不存在IgμAY和IgμU基因的野生型等位基因，该引物对与IgμAY和 IgμU扩增都相容，以及另一个引物对BPrPex3F(5’- CCACATAGGCAGTTGGATCC-3’(SEQ ID NO：629)和BPrPex3R (5’-ATAAGAGGCCTGCTCATGGC-3’(SEQ ID NO：63)以确认不存 在PrP基因的野生型等位基因。PCR反应混合物含有17.9μl水，3μl 10 ×Ex Taq缓冲液，4.8μl dNTP混合物，10pmol正向引物，10pmol 反向引物，2μl基因组DNA和0.3μl Ex Taq。通过在如下条件温育反 应混合物实施三十个循环的PCR：85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10 秒钟，60-62℃30秒钟，以及72℃1分钟。PCR后，通过电泳分析反 应混合物。结果证明出生的小牛为IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/-。

实施例8：确认IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/-三纯合KO牛中不存在朊病毒 蛋白质表达

从取自IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/-三纯合KO小牛的血液样品提取总蛋 白质，并使用Bio-Rad蛋白质测定试剂定量蛋白质含量。在非还原条 件下将约75μg蛋白质样品在12％SDS PAGE凝胶上进行蛋白质印迹 分析。然后将蛋白质转移到硝酸纤维素膜，并且使用抗牛朊病毒蛋白 质单克隆抗体(F 89/160.1.5；Alexis Biochemicals)作为第一抗体、然 后以抗小鼠IgG(H+L)的过氧化物酶标记的亲和纯化第二抗体将膜 染色。通过ECL+蛋白质印迹检测体系(Amersham Bioscience)将染 色的膜显色，并通过胶片显象剂暴光于Biomax光胶片。使用重组牛 PrP蛋白质(Alexis Biochemicals)作为阳性对照。使用来自鼠成纤维 细胞的蛋白质提取物作为阴性对照。

在从IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/-三纯合KO小牛制备的活组织检查样品 中，没有条带以抗体染色。该结果证实在该小牛中完全不存在朊病毒 蛋白质的表达。

实施例9：确认IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/-三纯合KO小牛中不存在IgM 蛋白质表达

为了证实IgμAY-/- IgμU-/-PrP-/-三纯合KO小牛缺少IgM蛋白质， 我们如下所述实施流式细胞仪分析。通过颈静脉穿刺术从新生小牛将 外周血收集到肝素化管中。通过使用RBC裂解缓冲液(Sigma，St. Louis，MO)裂解红细胞并以无菌的Hanks缓冲盐溶液(HBSS)(Sigma， St.Louis，MO)洗涤两次，从肝素化血液分离全部白细胞。将细胞重 悬于FACS染色介质(含有4％马血清或山羊血清、2mM EDTA及0.2 ％叠氮化钠的磷酸缓冲盐水)，并于室温温育30分钟以阻断非特异性 结合。使用羊抗牛IgM-FITC(Bethyl Laboratories，Mongomery，TX) 或驴抗羊/牛Ig-生物素抗体(Amersham Biosciences，Piscataway， NJ)、随后为链霉抗生物素蛋白-FITC或链霉抗生物素蛋白-PE第二 抗体(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)标记B细胞上的牛表面 IgM(sIgM)。为了标记发育中的牛B细胞上的B220标记，使用小鼠抗 牛B220(CD45R)抗体克隆GS5A(VMRD，Pullman，WA)、随后为抗小 鼠IgG1-PE第二抗体(Caltag Laboratories，Burlingame，CA)。使用购 自Serotec Inc.(Raleigh，NC)抗体的小鼠抗牛CD21克隆MCA1424和 小鼠抗反刍动物CD43克隆1096、随后为抗小鼠IgG1-PE第二抗体 (Caltag Laboratories，Burlingame，CA)标记牛B细胞的表面CD21和 CD43标记。将五十微升在FACS染色介质中含有106个细胞(WBC)的 细胞悬浮液用于在V形底微量滴定孔或管中以各表面标记抗体单独 及组合染色。将细胞于室温与第一抗体在黑暗中温育20-30分钟，并 通过离心以FACS洗涤缓冲液(含有2mM EDTA和0.2％叠氮化钠的磷 酸缓冲盐水)洗涤两次。将细胞再次重悬于50μl FACS染色介质中， 并与适当的荧光标记的第二抗体于室温在黑暗中温育15-20分钟。最 后将细胞以FACS洗涤缓冲液洗涤两次，并以溶于PBS中的2-4％甲 醛固定。然后在FACScan流式细胞仪(BD Biosciences，San Diego， CA)中分析表面标记的固定细胞并获取数据。最后使用WinMDI软 件对列表模式文件数据(list mode file data)分析单色或双色特征。 FACS结果证实三纯合KO小牛中完全不存在任何发育中的B细胞。

实施例10：向IgμAY-/-/IgμU-/-细胞系转移HAC

IgM水平降低的动物的一种用途是产生异种抗体。产生异种抗体 的一个方法是产生具有一个或多个人工人染色体的动物，所述人工人 染色体表达抗体重链和/或轻链。最后，使用微细胞介导的染色体转 移(MMCT)(Kuroiwa等人，(2000)Nature Biotech.18：1086-1090)将 ΔΔHAC(λHAC)和κHAC从DT40细胞杂种转移至中国仓鼠卵巢 (CHO)细胞。于37℃和5％CO2在补加10％FBS(Gibco)、1mg/ml G418及0.2mg/ml潮霉素B的F12(Gibco)培养基中培养含有λHAC (“ΔΔC10克隆”)的CHO克隆。将ΔΔC10克隆扩增到十二个T25 培养瓶中。当汇合达到80-90％时，将秋水仙酰胺(Sigma)加入培 养基至终浓度0.1μg/ml。三天后，以补加10μg/ml细胞松弛素B (Sigma)的DMEM(Gibco)更换培养基。将瓶以8000rpm离心 60分钟以收集微细胞。经过8、5和3μm过滤器(Costar)纯化微 细胞，并然后重悬于DMEM培养基中。如下所述将微细胞用于与牛 成纤维细胞融合。

于37℃和5％CO2在补加10％FBS(Gibco)的α-MEM(Gibco) 培养基中培养胎牛成纤维细胞。在T175培养瓶中扩增成纤维细胞。 当汇合达到70-80％时，以0.05％胰蛋白酶将细胞从瓶脱附。将成 纤维细胞以DMEM培养基洗涤两次，然后覆盖在微细胞悬浮液上。 将微细胞-成纤维细胞悬浮液以1500rpm离心五分钟后，根据制造 商方案将PEG1500(Roche)加入沉淀以使微细胞能够与牛成纤维细胞 融合。融合后，将融合的细胞铺平板于六个24-孔板中，并在补加10 ％FBS的α-MEM培养基中培养24小时。然后以含有0.8mg/ml G418 的培养基更换培养基。在G418抗生素存在下生长约两周后，选择抗 G418的融合细胞。如此所述，将这些抗G418克隆用于染色质转移。

实施例11：于妊娠180天在HAC/IgμAY-/-/IgμU-/-胎儿中表达人 IgM、IgG和Igλ

为了检查HAC/IgμAY-/-/IgμU-/-胎儿是否可以表达人免疫球蛋白 例如IgM、IgG、Igλ和Igκ，我们在妊娠180天收集HAC/IgμAY-/-/IgμU-/- 胎儿。使用RNeasy Mini试剂盒(QIAGEN)从脾提取总RNA。将1微升 总RNA进行第一链cDNA合成(用于RT-PCR的SuperScript第一链合 成体系，Invitrogen)，继之为RT-PCR。为了检测人IgM表达，使用引 物对进行RT-PCR反应：5’-AGGCCAGCATCTGCGAGGAT-3’ (CH3-F3；SEQ ID NO：64)和5’-GTGGCAGCAAGTAGACATCG-3’ (CH4-R2；SEQ ID NO：65)。对于人IgG表达，使用下列引物：5’- CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：66)，5’- CAGGTCACCTTGAAGGAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：67)，5’- GAGGTGCAGCTGGTGGAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：68)，5’- CAGGTGCAGCTGCAGGAGTCGGG-3’(SEQ ID NO：69)，5’- GAGGTGCAGCTGGTGCAGTGG-3’，5’- CAGGTACAGCTGCAGCAGTCAGG-3’(SEQ ID NO：70)，以及5’- CAGGTGCAGCTGGTGCAGTCTGG-3’(SEQ ID NO：71)(VH All Mix)与5’-CACCACGCTGCTGAGGGAGTAGAGT-3’(hCg1R2；SEQ ID NO：72)的组合。对于人Igλ表达，使用下列引物对：5’- TCCTCTGAGGAGCTTCAAGC-3’(hCL-F2；SEQ ID NO：73)和5’- AGGGTTTATTGAGTGCAGGG-3’(hCL-R2；SEQ ID NO：74)。PCR 反应混合物含有32.5μl水，5μl 10X Ex Taq缓冲液(TAKARA)，8μl dNTP混合物，10pmol正向引物，10pmol反向引物，2μl第一链 cDNA，以及0.5μl Ex Taq(TAKARA)。通过在如下条件温育反应混 合物实施三十五个循环的PCR：85℃3分钟，94℃1分钟，98℃10 秒钟，60-62℃30秒钟，以及72℃1分钟。PCR后，通过电泳分析反 应混合物。通过RT-PCR检测到来自λHAC/IgμAY-/-/IgμU-/-胎儿的人 IgM、IgG和Igλ的表达。

为了在蛋白质水平确认人免疫球蛋白在细胞表面的表达，我们也 如上所述实施流式细胞仪分析。使用山羊抗人IgM-FITC(Bethyl Laboratories，Mongomery，TX)、山羊抗人IgM-FITC(Serotec Inc.， Raleigh，NC)或山羊抗人IgM-PE(Serotec Inc.，Raleigh，NC)抗体标记 ≥180天HAC胎儿的外周血B细胞上表达的人sIgM。为了检测表达于B 细胞上的轻链，使用山羊抗人λ-FITC抗体(Bethyl Laboratories)或山 羊抗人λ-PE抗体(Serotec Inc)。将FITC-标记的抗人IgM抗体和PE-标 记的轻链抗体组合用于双色分析。我们以抗人IgM和轻链抗体检测阳 性细胞群体。另外，我们使用亲和纯化的捕获抗体和适当的HRP-酶 标记的检测抗体实施夹心法ELISA分析，以检测λHAC/IgμAY-/- /IgμU-/-小牛中分泌的人IgG。在下表6中给出用于各测定的捕获抗体 和检测抗体的细节。

表6

测定    标准(Calibrator)      捕获抗体                  检测抗体

人IgG   人参照血清            山羊抗人IgG，亲和纯化     山羊抗人IgG-HRP缀

ELISA   (Bethyl laboratories) 的，或山羊抗人IgG-Fc特异  合的

                              的，亲和纯化的 (Bethyl     (Bethyl laboratories)

                              laboratories)

通过于室温温育1.5小时将稀释于包被缓冲液(0.05M碳酸钠， pH 9.6)中的捕获抗体包被在微量滴定板(Nunc ImmunoMaxiSorp Elisa plates)上。包被捕获抗体后，使用自动洗板机以磷酸缓冲盐水 (PBS)/Tween 20缓冲液将板洗涤3-5次。以连续稀释加入合适的标 准(Calibrators)以用于使用标准曲线进行定量。

在所有QC检查测定中包括阳性对照和阴性对照。然后将来自 λHAC/IgμAY-/-/IgμU-/-小牛的血清样品以四个连续稀释加入一式两份 孔中，并于室温温育1小时。捕获血清免疫球蛋白后，再次使用自动 洗板机以PBS-Tween缓冲液将板洗涤3-5次。将HRP-酶标记的适 当的检测抗体加入所有孔，并于室温温育1小时。在温育结束时，再 次使用自动洗板机以PBS/Tween缓冲液将板洗涤3-5次。通过加入 TMB-底物溶液(KPL Inc，Gaithersburg，MA)并于室温温育10- 20分钟检测结合的抗体。通过加入10％磷酸来终止反应。然后使用 KC4软件在微量滴定板阅读仪上读板。通过KC4软件分析数据，并 通过在四参数标准曲线上的插值法而确定值。在出生后14天采集的 血液样品中，通过ELISA检测到7.1μg/ml人IgG。

其他实施方案

本说明书中引用的所有出版物和专利在此引用作为参考，如同每 一单个出版物或专利被明确和单独地说明被引用作为参考一样。尽管 为了理解清楚的目的通过图解和实例对前述发明进行某些详细描 述，但在本发明的教导下，对本领域普通技术人员而言显而易见的 是，可以在不背离所附权利要求的精神或范围的情况下对本发明进行 某些改变和修改。