无朊病毒的转基因有蹄类动物

无朊病毒的转基因有蹄类动物

相关申请交叉引用本申请要求对2000年3月24日申请的美国临时专利申请系列号60/191,772的优先权，在此引用作为参考。

发明领域本发明涉及转基因和克隆的有蹄类动物，特别是含有基因缺失或破坏的牛，特别是朊病毒基因缺失或破坏的牛。不表达朊病毒的牛可能不易患朊病毒相关疾病，如牛海绵状脑病(BSE)，或疯牛病，因此是生产人用治疗剂和其它产品的优选来源。生产受保护不会感染和传播朊病毒相关疾病的牛品系将防止这类疾病向人类的可能的扩散。

发明背景基于朊病毒的疾病朊病毒疾病是致死的神经变性疾病，可传播给人类和其它哺乳动物6。最众所周知的形式是羊瘙痒病、牛海绵状脑病(BSE)或疯牛病和人类的克-雅氏病。在1987年以前，认为海绵状脑病非常少见，只限于绵羊。到二十世纪九十年代，有越来越多的牛患有BSE，主要是在英国。另外，在动物园动物、貂、鹿和家猫中也检出了海绵状脑病6。

BSE在1986年首先在英国发现。现在有一些报道称，在英国有超过55％的牛感染BSE7。报道病例数的快速增长可能与二十世纪七十年代后期牛肉食品中含有感染的牛和绵羊骨头和肉制品有关，这是一种食用牛肉习惯8。在控制实验中，BSE能通过脑内注射或直接食用感染的组织传播给牛、小鼠、绵羊、山羊、猪和猴8-13。

已经明确了几种人类朊病毒疾病。在新几内亚高地人(ForeHighlander)中发现的库鲁病的特征在于丧失协调性(共济失调)，以后通常成为痴呆。这可能是通过仪式上的食人肉传播，在那里该部落通过食用死者的脑子为死者举行葬礼。相反，CJD在世界范围内发生，一般表现为痴呆。它通常偶发，发病率为百万分之一，一般感染60岁左右的老人。约10-15％的病例是遗传的，一些病例是在治疗其它疾病时无意引起的。例如，角膜移植、脑中植入硬膜或电极和在重组产生之前注射人生长激素可传播CJD。另外两种人类疾病是Gerstmann-Straussler-Scheinker病和致死性家族性失眠症，它们通常都是遗传性的，一般在中年发病47。

在二十世纪九十年代，发现了克-雅氏病的一种变型(vCJD)。这种人类变型中蛋白酶抗性朊病毒蛋白的形式不同于遗传性CJD，但与自然传播的和实验诱导的BSE相同14。因此，假定vCJD是人类食用污染的牛肉或其它牛制品被传染的结果14。BSE也通过食用污染的食物传播给家猫15，16。在英国已经有超过100万的感染母牛进入了食物链，建议必须控制进入美国和其它国5家，以防止这种致死性疾病的扩散。迄今为止，已经有48名英国人死于vCJD，有新的证据表明CJD的这种变型与BSE相同。

PrP基因和蛋白质BSE和其它基于朊病毒的疾病的传染物是一种称为PrP的细胞蛋白质。PrP是一种在中枢和周围神经系统中表达的细胞膜相关糖蛋白17，18。在瘙痒病、BSE和CJD中，蛋白酶敏感的PrP蛋白通常变为蛋白酶抗性的。这显然是通过蛋白质构象改变发生的，主要由α螺旋组成的正常细胞形式变为主要由β折叠组成的疾病形式47。由于某些PrP突变可能更容易地发生这种构象改变。例如，在人类CJD的一种遗传形式中，Pro102突变为Leu。当向转基因小鼠中引入这种突变时，这些动物发展为CNS退化和淀粉样PrP斑块19-21。

还不清楚一种或所有细胞朊病毒是如何突然转换构象的，但一种假说是，具有β折叠构象的疾病朊病毒以某种方式诱导α螺旋朊病毒，也变为β折叠构象。例如，已经证明，当细胞和瘙痒病朊病毒在试管中混合时，细胞朊病毒转变为瘙痒病朊病毒47。曾经假定朊病毒基因的某些突变使产生的蛋白质更易于变为β折叠构象。一个分子自发转变大概要花费一定的时间，而疾病朊病毒积累并损伤脑子引起综合征需要更长的时间47。此外，也可能存在影响转化可能性的其它因子或蛋白质。例如，已经证明某些细菌和酵母伴侣蛋白能使得向β折叠形式的转化更加有效48。

PrP的基因称为PRNP，位于人类的染色体20上22，23。对于人类，该基因包含三个外显子，mRNA约2.4kb。PRNP的第三个外显子含有完整的蛋白质编码域，编码25kDa的蛋白质。在遗传性朊病毒疾病中已经发现了人PRNP基因中的20个不同突变6。在偶发的CJD中，未发现PrP蛋白中有编码突变，但是所有患者的位点129处的甲硫氨酸残基都是纯合的。这可能表明，这种多态性倾向于感染某些朊病毒株。来自CJD新变型株(vCJD)的朊病毒颗粒具有不同于其它人类朊病毒同种型，但类似于BSE朊病毒的糖基化模型，与偶发性CJD类似，在残基位点129处没有蛋白质编码突变14。这些数据符合CJD的新变型株来源于BSE向人类传播的假说。

基于朊病毒的疾病的预防和控制所有基于朊病毒的脑病都没有确知的治愈方法。因此，世界卫生组织和其它国内和国际联盟采取了控制该疾病在家畜和人类中扩散的方针。1988年，所有牛类材料被禁止用于食用24。到1989年，海绵状脑病顾问委员会(SEAC)建议，应丢弃所有牛的脑、脾、胸腺、扁桃体和肠，而临床病牛应当焚化。然而遗憾的是，据SEAC所说，对于防止BSE从感染的肉制品向人类扩散，这些方针采取得太迟了。

已显示只有一种药物能控制动物中朊病毒引起的神经退化的发病。在使用两性霉素B的控制研究中，该药物延迟了感染瘙痒病的仓鼠中PrPac的积累25。其它化合物，包括多硫酸戊聚糖和刚果红，能防止细胞培养物中PrPac的积累，但未对动物模型检测26。

在基于朊病毒的疾病的预防和控制领域的研究表明，一个拷贝的正常PRNP基因是对该疾病的易感性和传播所必需的。两个拷贝PRNP基因定向缺失的小鼠对脑内接种瘙痒病朊病毒有抗性27，49-51。因此，该疾病需要合成内源朊病毒来积累足以导致神经退化综合征的疾病朊病毒。PrP敲除小鼠具有正常的行为、正常的发育，并且能够繁殖，提示PrP不是生存力或生育力所必需的27。这些数据表明，生产缺乏PRNP基因的动物可以阻止基于朊病毒的疾病由家畜向人类或其它动物的扩散。

牛海绵状脑病(BSE)或人类相应疾病克-雅氏病(CJD)没有确知的治愈方法。朊病毒(PrP)基因的一种改变形式和一种内源PrP基因是感染所必需的。大家公认感染的母牛向人类传播这种疾病如CJD。一种鼠模型证实，PrP基因的去除可预防瘙痒病。我们设法在遗传修饰的牛中根除BSE的易感性。我们计划克隆PrP基因定向缺失的小牛。具体目标是：I)设计并构建一种基因靶向载体；II)用该载体在牛胎成纤维细胞中进行同源重组，并鉴定在PrP基因的一个等位基因上具有无效突变的基因靶向细胞；III)使用目标II产生的基因靶向细胞，通过核移植产生PrP杂合敲除(KO)牛胎；IV)基因型克隆胎牛并分离PrP杂合KO胎成纤维细胞；V)在PrP杂合KO胎成纤维细胞中进行同源重组，鉴定在PrP基因的两个等位基因上都具有无效突变的基因靶向细胞；VI)产生PrP纯合KO小牛。无朊病毒转基因牛将用作药品、化妆品、人类治疗剂和食品的来源。

发明概述本发明公开了具有基因缺失的第一种转基因牛。特别是，本发明涉及转基因和克隆的有蹄类动物，它们在一条或两条染色体上具有内源朊病毒基因的缺失或破坏，使得有蹄类动物对基于朊病毒的疾病如瘙痒病和牛海绵状脑病(BSE)敏感性降低或没有敏感性。缺失的构建方法一般是将一种异源DNA同源重组到朊病毒基因座中，使得全部或部分蛋白质编码区被替换或缺失。为了生产治疗用重组蛋白质，便于组织的异种移植，研究基于朊病毒的疾病，本发明的有蹄类动物还可含有与朊病毒基因座无关的异源转基因。

附图简述图1。显示根据保藏号D26150和D26151的牛PrP基因的推断的结构40。其它动物和人类的朊病毒基因包含三个外显子，第三个外显子含有完整的编码区。

图2。(A)提出的靶向载体1-4的结构。每种靶向载体的5’侧翼区都使用内含子1和外显子2的部分，3’侧翼区使用外显子3的非翻译区。所有内含子2和外显子3的所有蛋白质编码区都缺失。(B)提出的靶向载体5-8的结构。每种靶向载体的5’侧翼区都使用内含子2的部分和外显子3的部分，包括外显子3剪接受体位点。3’侧翼区与载体1-4相同，只含有外显子3的非翻译区。外显子3的大多数蛋白质编码区缺失，只留该蛋白质的3个氨基酸。

图3。朊病毒mRNA在牛胚胎成纤维细胞(BEF)细胞中的表达。从BEF细胞和GT1-7细胞(一种下丘脑转化细胞系)中分离10微克RNA，在甲醛琼脂糖凝胶上电泳，转移到硝酸纤维素膜上，用来自人PrP cDNA的1kb Sst片段探针杂交。溴化乙锭染色的核糖体RNA证实每种样品都等量。

图4。牛PRNP基因的Southern分析。等量的BEF基因组DNA用所述酶消化，在0.8％琼脂糖凝胶上分离，转移到硝酸纤维素膜上，用人PRNP cDNA探针杂交。

图5显示一种靶向载体和重组PrP基因的结构。

图6显示用于PrP克隆的PCR产物。

图7显示pPNT和pPRP转染的BFF细胞在电穿孔中的细胞存活率。

图8显示另一个实验的结果，其中用pPNT转染BFF细胞。

图9显示含pPRP的BFF细胞的电穿孔。

图10显示未转染的BFF细胞的G418处理。

图11显示pPNT转染的BFF细胞的G418处理。

图12显示牛PrP的基因组DNA组构，并且图解显示了基因打靶策略。上图显示牛PrP基因由三个外显子和两个内含子组成，横跨20kb的区域[40]。外显子1和2分别为53bp和98bp，转录为5’UTR，外显子3含有10bp 5’UTR、795bp编码区和约3.3kb 3’UTR的序列。内含子1和2约2.4kb和14kb。中图显示该靶向载体含有内含子2序列的一部分(至少7kb)、基本PrP编码序列完全缺失并被替换为无启动子的新霉素抗性基因的外显子3，和外显子3的部分下游基因组序列。新霉素抗性基因的表达受内源PrP启动子及其调节元件控制。下图显示同源重组后靶向的牛PrP等位基因。影线盒是外显子；空心盒中含有基因名称，ATP起点用颜色识别。

发明详述本发明涉及转基因有蹄类动物，特别是具有定向基因缺失的牛。具体而言，本发明涉及具有朊病毒基因纯合或杂合缺失或破坏的转基因有蹄类动物。对于具有纯合缺失或破坏的转基因牛，这种缺失或破坏阻止了功能性内源朊病毒蛋白的表达，其中功能性内源朊病毒蛋白表达的缺乏使牛对朊病毒相关疾病不敏感。对于朊病毒缺失或破坏杂合的转基因牛，这种缺失或破坏使牛由于朊病毒蛋白表达降低而对朊病毒相关疾病的敏感性降低。具体而言，这种牛对牛海绵状脑病(BSE)或疯牛病不敏感或敏感性降低。然而，朊病毒基因的缺失或破坏将分别使动物对任何朊病毒相关疾病不敏感或敏感性降低。

本发明的朊病毒缺失或破坏优选地通过异源DNA向朊病毒基因座中同源重组产生。该异源DNA优选地含有一种选择性标记，以便于鉴定和分离含有这种缺失或破坏的细胞。然而，任何异源DNA都可用于同源重组。同样，在利用同源重组选择和分离含有缺失或破坏的细胞后，可以用第二种异源DNA交换选择性标记。此外，在产生同源重组细胞后也可排除或删除异源DNA。

当异源DNA含有选择性标记时，优选地是新霉素抗性基因。该选择性标记可与在牛细胞中起作用的启动子(如PGK启动子)有效连接。此外，如果用于产生缺失或破坏的靶向构建体重组到朊病毒基因座中，使得选择性标记基因从朊病毒基因启动子表达，选择性基因最初也可以是不含启动子的。

本发明的转基因有蹄类动物也可以含有与朊病毒基因座无关的异源基因。例如，第二种异源基因可与乳腺特异性启动子有效连接，从而能在转基因有蹄类动物的奶中生产异源蛋白质。对于牛，这是生产用于治疗人类疾病的重组治疗性蛋白质的一种合适方法，它具有一个优点，即用来生产蛋白质的牛不含朊病毒，从而降低了传播海绵状脑病的危险。因此，本发明也包括一种利用这类转基因母牛生产重组蛋白的方法。

能导入本发明的有蹄类动物中的第二种异源基因的另一个实例是突变朊病毒基因。已经鉴定了来自不同种的朊病毒基因的几个等位基因，它们使得对朊病毒相关疾病的敏感性提高。本发明的有蹄类动物，它们含有内源朊病毒基因纯合缺失或破坏，突变等位基因是转基因，它们是研究这些动物中朊病毒相关疾病进展的理想工具，而没有来自该基因其它等位基因编码的朊病毒的干扰。而且，建立这类转基因有蹄类动物的克隆系还有另一个优点——具有等基因背景，对于研究可能涉及其它蛋白质的复杂疾病过程这是特别理想的。

因此，本发明也包括具有相同基因型的克隆转基因有蹄类动物。利用核移植技术克隆牛的技术在美国专利5,945,577和6,147,276中已有详述，在此引用作为参考。克隆的转基因有蹄类动物也可能携带与朊病毒基因座无关的异源基因。

建立转基因哺乳动物的克隆系具有不必为研究疾病进展产生等基因背景的优点。这些技术允许同时生产几种动物；这些技术允许性选择起始(founder)动物；可能不需要动物的完整生殖，从而加速了转基因系的生产。因此，本发明的克隆转基因牛包括此处所述有蹄类动物的每种变异。

就此而言，本发明也不只包括一种克隆的转基因牛，而是涉及全都具有相同基因型的转基因牛的“系”。正因为遗传学均相同的细胞系是有利的，所以遗传学相同的哺乳动物系对于可靠性、均一性等是有利的。试图研究试剂对遗传学均不同的细胞群体的作用。均一的细胞群体使人们能够做出关于整个哺乳动物群体的合理预测和有根据的结论，而不需考虑遗传多样性的影响。

因此，本发明包括一种应用转基因有蹄类动物的方法，特别是克隆的转基因有蹄类动物，它们在内源朊病毒基因和异源突变朊病毒基因中具有纯合缺失或破坏，用于筛选或评价可用于治疗或预防海绵状脑病的药剂。这种方法包括(1)在所述朊病毒相关海绵状脑病发展之前或之后，对所述转基因有蹄类动物施用一种推断的治疗剂；(2)监测该有蹄类动物，以确定有关朊病毒相关海绵状脑病是否被预防或治疗。将要筛选的药剂可包括反义核酸、化学制剂、抗体或抑制突变朊病毒基因表达的其它蛋白质配体，细胞朊病毒向疾病特异性朊病毒开始的转化，或者细胞朊病毒通过与疾病特异性朊病毒相互作用的转化。

本发明的转基因有蹄类动物也可作为异种移植的组织和细胞的来源。例如，这些动物能用作治疗帕金森氏症和亨廷顿氏病的胎神经元的来源。用于帕金森氏症的一种产品已经在临床前模型中得到证明。该研究显示，来自克隆牛的胎神经元能移植到逆转帕金森氏综合征的帕金森氏症大鼠中28。因而能用转基因牛的神经元治疗人类神经退化疾病。能将胎神经元植入这些病人的患脑中，导致综合征的一定的缓解29-31。本领域中的一种争论是人胎在移植中的用途。同样，人角膜移植和硬膜移植在超过60个人中引起传染性CJD6。为了避免传染性海绵状脑病的可能性，用于移植的胎组织应当来自无PrP的有蹄类动物胚胎。

因此，本发明包括一种使用来自转基因有蹄类动物的胎组织或细胞的异种移植方法，该方法包括：(1)通过交配或克隆技术，产生内源朊病毒基因纯合缺失或破坏的转基因胎；(2)从该胎中分离目的组织或细胞；(3)将胎组织或细胞移植到受体哺乳动物中。优选地，该细胞是用于治疗帕金森氏症和亨廷顿氏病的胎神经元细胞。此外，也可用胎角膜组织代替损伤的人角膜。用作组织来源的转基因有蹄类动物也可含有一种异源DNA或第二种基因缺失或破坏，用于防止移植排斥。

就此而言，本发明也包括携带至少一种与朊病毒基因座无关的其它缺失或破坏的转基因有蹄类动物。这些动物也可包含与朊病毒破坏无关的异源DNA，尤其可用于突变朊病毒基因为转基因的有蹄类动物，因为这些哺乳动物可用来研究其它基因缺失对朊病毒相关疾病过程的影响。

无朊病毒牛也能用来提高牛源产品的安全性指标，如牛血清白蛋白(用作许多人用药品的载体，用于实验室研究)和胎牛血清(用于实验室的细胞培养)。此外，在农业工业上也能用无朊病毒牛确保对消费者安全的肉制品和家畜。生产转基因牛的方法已经生产了几只存活的转基因小牛，用生产不能传播或感染BSE的未来的转基因系补充该技术是有利的。

本发明也包括用于分离和表征有蹄类动物朊病毒基因、特别是牛朊病毒基因的核酸构建体，以及用于构建靶向DNA分子、靶向构建体和质粒衍生物的构建体。具体而言，本发明包括一种分离的DNA分子，它含有与选择性标记基因编码区或报道基因编码区有效连接的牛朊病毒基因启动子的至少一部分。短语“牛启动子的至少一部分”是指DNA分子含有足够的启动子区，以便在包含于含有来自或邻近牛朊病毒基因座的第二种牛DNA序列的靶向构建体中时，有利于同源重组。然而，也包括含有与选择性标记基因或报道基因有效连接的启动子功能部分的DNA分子，它可用于监测由朊病毒基因启动子的体内或体外转录，例如，由转录或翻译调节机制引起的转录。

优选地，选择性标记是新霉素抗性基因。靶向构建体也可含有胸苷激酶基因，它允许正选择和负选择同源重组子。也包括含有本发明的分离DNA分子的质粒载体，其中优选的质粒载体是含有pUC主链的质粒，如pBluescript(Stratagene)或pCR-Topo II(Invitrogen)。

一般而言，本发明包括能特异和功能性缺失或破坏有蹄类动物朊病毒基因表达的DNA靶向分子，其中通过向朊病毒基因座中同源重组发生这种破坏。在这种情况下，靶向构建体的一个臂不必是朊病毒基因启动子，只要该靶向构建体使同源重组子不能表达内源基因即可。实际上，靶向分子可包含一种选择性标记基因，它与能在有蹄类动物或牛细胞中起作用的任一启动子有效连接，但优选地使用PGK启动子。这些分子也可任选地含有胸苷激酶基因，用于通过同源重组之外的方法负选择掺入靶向分子的细胞。因为外显子3中含有该基因的完整编码区，本发明的靶向分子优选地促进至少朊病毒基因外显子3的缺失或破坏。也包括含有DNA靶向分子的质粒载体。

本发明也包括利用本发明的靶向DNA分子生产转基因有蹄类动物的方法。具体而言，生产朊病毒基因缺失或破坏杂合的转基因有蹄类动物的方法包括下列步骤：(1)从有蹄类动物细胞中分离基因组DNA；(2)从该基因组DNA中分离朊病毒等位基因；(3)确定从牛基因组DNA中分离的有蹄类动物朊病毒等位基因的限制酶切图谱和内含子/外显子结构；(4)为构建靶向DNA分子，亚克隆该朊病毒等位基因的片段；(5)构建一种能通过同源重组破坏或缺失朊病毒等位基因的靶向DNA分子；(6)转染该有蹄类动物细胞，使得同源重组子得到分离；(7)将转染细胞(含有同源重组到朊病毒等位基因中的靶向分子)的核转移到去核成熟有蹄类动物卵母细胞的细胞质中；(8)培养该卵母细胞形成胚泡；(9)转移该胚泡至受体哺乳动物，使根据本发明的转基因有蹄类动物出生。然后通过繁殖异源转基因有蹄类动物，或者通过用初级成纤维细胞靶向其它等位基因的缺失，获得纯合转基因有蹄类动物。此外，也可在初始成纤维细胞中分离纯合缺失或破坏。

应当注意，利用核移植技术最容易实施生产转基因有蹄类动物的方法，这是因为利用易于繁殖的细胞系可分离同源重组子这一事实，然后可将这些重组子的核转移到一个去核卵母细胞中。然而，应当明白，也可利用直接向胚胎干细胞中转染靶向构建体的标准技术，生产转基因哺乳动物。

用于分离基因组DNA和朊病毒基因座的细胞一般是初级成纤维细胞。对于本发明的转基因牛，这些细胞优选地来源于胎成纤维细胞，如BEF细胞。然而，用于分离基因组DNA和生产供体核的细胞也可以是成人成纤维细胞，其可行性在美国专利号5,945,577中得到证实，在此引用作为参考。

定义术语有蹄类动物包括马、牛、绵羊、山羊、鹿和其它任何有蹄的哺乳动物。

术语“破坏”是指朊病毒基因的缺失部分可以替换为异源DNA，使该基因破坏，而“缺失”包括不同时插入异源DNA的缺失。本发明的缺失不需包括完整的朊病毒基因，构建缺失或破坏，使功能朊病毒蛋白质不表达，并且不产生异常的变异蛋白质，即截短。实际上，Shmerling等人(1998)制备了表达近氨基端缺失的PrP的敲除小鼠，发现某些截短的衍生物早在出生后1-3个月内即可导致严重的共济失调和死亡1。

术语“朊病毒相关疾病”包括瘙痒病、牛海绵状脑病或疯牛病，和有蹄类动物易感的其它任何类型的基于朊病毒的神经退化疾病。包括由于有蹄类动物接触来自其它任何哺乳动物或人的传染性朊病毒引起的任何种间疾病。

术语“选择性标记”一般是指由于其表达能在不表达该基因的细胞中特异性选择表达该基因的细胞的任何基因。然而，该术语也可包括通过目视筛选试验、颜色指示试验等筛选的标记，只要该标记与转染方案联合使用能鉴定和筛选同源重组子即可。

术语“与朊病毒基因座无关”仅仅是指第二种异源DNA与朊病毒基因座处的敲除无关并且不是它所必需的。然而，因为该异源DNA存在并且独立表达，它也可位于同源重组的区域内，只要它不破坏同源重组子的选择、选择性标记的表达等。

术语“有效连接”是指DNA片段连接在一起，使得其中一个的表达依赖于另一个的作用。

术语“来源于”是指起源于，并且不包括背离本发明的精神和关键的任何衍生。

本发明的范围通过下列代表性实验说明。

实验概述本发明包括牛PrP基因(PRNP)的分离、靶向载体的构建、供体细胞的转染、供体核向去核卵母细胞的核移植、卵母细胞向受体母体的转移。核移植技术在美国专利号5,945,577中有详述，在此引用作为参考。其它技术包括：1.牛PrP基因的克隆和表征此处使用的初级成纤维细胞(BEF细胞)以前曾用于生产克隆的转基因牛4。从这些细胞中分离基因组DNA，用来生产BEF基因组文库。根据由其它牛PRNP基因序列预测的推断牛PrP结构，确定等基因(BEF)PrP基因(PRNP)的内含子/外显子结构。

2.用于牛PrP基因的靶向载体的构建提出了用于PrP基因的8个不同的靶向载体。载体2、3、6、7是正-负选择靶向载体，含有一个由PGK启动子驱动的正选择性标记(新霉素)，和一个由单纯疱疹病毒(HSV)启动子驱动的负选择性标记(胸苷激酶)，以及来自等基因牛PRNP基因的侧翼DNA(见图2A和图2B)。靶向载体1和5含有由HSV启动子驱动的胸苷激酶作为负选择性标记，和一个由HSV启动子驱动的无启动子正选择性标记，和一个无启动子正选择标记(新霉素)，以及来自等基因牛PRNP基因的侧翼DNA。靶向载体的正确整合导致由内源PrP启动子驱动的neo转录。靶向载体4和8只允许正选择，含有无启动子正选择性标记(新霉素)以及来自等基因牛PRNP基因的侧翼DNA。Neo基因的表达由内源牛PRNP启动子驱动。

3.靶向效率的优化药物筛选和电穿孔的最佳条件用对照载体和最终靶向载体确定。假如在正常二倍体细胞中同源重组率较低，则确保高转染率和有效的药物筛选条件是必要的步骤，以分离含PRNP定向缺失的稀有细胞。

实验方法延伸(长)聚合酶链反应应用表1所示引物组和EXPANDO 20kB Plus PCR系统(Boehringer Mannheim)，按照使用说明，由BEF基因组DNA扩增PRNP基因。用PCR克隆试剂盒(Invitrogen)将扩增的DNA亚克隆到pCR-XL-Topo II载体中。

表1.用于克隆牛PRNP基因的引物

文库筛查和杂交利用标准技术使噬菌体DNA与全长人PrP cDNA(ATCC)37的2.5kb EcoRI32P-随机引物标记探针杂交。

噬菌体制备和噬菌体DNA纯化为了制备噬菌体DNA，使用噬菌体纯化制备试剂盒(Promega)。这些试剂盒将噬菌体DNA的纯化时间由1天缩短为1小时，成本合适，并取消了传统方法中有毒的酚/氯仿抽提。

牛成纤维细胞的生产、保存和电穿孔按照标准胎成纤维细胞制备方法38从55天的Holstein雄性胎牛中生产牛成纤维细胞(BEF)。由这一个胎制备大量细胞，过去曾成功用于生产克隆的转基因牛。成纤维细胞在37℃和5％ CO2下保存于聚苯乙烯组织培养板中。当细胞达到80％铺满时以1∶10传代。这些初级细胞具有28-30个小时的细胞周期，在衰老前经历大约30次群体倍增。

活跃生长的细胞(80％铺满)用于电穿孔。通过胰蛋白酶消化收集细胞，以5×106细胞/500μl冰预冷PBS的密度重悬浮。降500μl等份细胞置于电洗脱池中，其中加有溶于无菌水的20μg DNA。通过拍打轻轻混合细胞和DNA，在冰上温育10分钟。温育10分钟后，再次轻轻重悬浮细胞，然后用表1所示参数电穿孔。最佳参数将由这些实验确定。脉冲后，该池再在冰上温育10分钟。在无菌条件下，我们从池中取出细胞，重悬浮于10ml上述培养基中，平板接种于10100mm2聚苯乙烯组织培养皿上总共10ml的培养基中。细胞在37℃和5％ CO2下温育过夜。

牛细胞和DNA用来制备靶向构建体的牛PRNP DNA应当来源于将要转染的相同细胞。在鼠基因组靶向实验中，用等基因DNA(由与将要靶向的细胞相同的种/株克隆的基因)制备的置换载体使有效靶向率提高了2.5倍39。与小鼠不同，牛没有近交系，因此PrP基因必须从将要用于靶向实验的真正胎细胞中克隆，以提高重组频率。因而用BEF基因组DNA构建基因组文库。为了克隆的DNA片段的亚克隆和操作，选择λFIX II文库，因为它接受了DNA的大片段(9-23kb)，含有多个侧翼限制酶切位点。

牛PrP基因的鉴定100万噬斑形成单位(pfu)接种宿主细菌株XL-1 blue(Stratagene)，使之生长12-16小时，或直到出现裂解的噬斑。利用标准分子生物学技术36将噬菌体颗粒转移到硝酸纤维素滤膜上，并与含有全长人PrP cDNA(ATCC目录号#6594637)的2.5kb EcoRI片段杂交。人PrP cDNA与牛基因有大约80％的同源性(用保藏号AB001468，牛PrP cDNA进行Blast搜索比较)。

挑取第一轮克隆产生的阳性噬斑，重新平板接种，并与人朊病毒探针重新杂交。在液体培养基中扩增第三轮克隆产生的阳性噬斑，如方法部分所述纯化。噬菌体DNA如本申请中方法部分所述纯化。

牛朊病毒基因的结构表征非等基因牛PrP基因(意思是，不是来自BEF细胞)已经从黄牛(Bos taurus)中克隆，推断的图谱可从GenBank获得(保藏号#D26150、D26151)40。等基因牛PrP基因的大多数图谱能通过简单地限制酶消化噬菌体并使这些消化物与人PrP cDNA的不同外显子杂交获得。如上所述，为了用靶向载体获得最佳重组频率，对来自细胞的牛PrP基因的内含子/外显子结构作图是必要的。建议靶向载体破坏含有该基因所有蛋白质编码区的外显子3的表达或缺失外显子3。因此，对等基因牛PrP基因内的外显子3的确切位置和限制性内切核酸酶图谱作图是必要的。

图1显示根据保藏号D26150和D26151的牛PrP基因的推断的图谱40。其它动物和人的朊病毒基因含有三个外显子，第三个外显子含有PrP蛋白的完整编码区。可以用来自外显子1-3和限制性消化物的不同探针组合对等基因牛PrP基因的内含子和外显子大小作图。

限制性内切核酸酶消化和作图将显示向质粒载体中亚克隆PrP基因的合适区域。纯化这些DNA片段，并连接到pBluescript质粒(Stratagene)中。这些质粒能用于外显子的序列分析和PrP基因各区域的精确作图。

等基因牛PrP基因的序列分析对三个外显子的位置作图后，即可测定这些区域的短片段的序列，以证实其身份。这些序列数据使人们能确定基因区域，获知从基因组文库中分离的噬菌体克隆间的任何差异，它们可显示等位基因的差异。

为了对朊病毒基因测序，用ABI荧光罗丹明测序试剂盒，和质粒载体的通用引物或为内部区域设计的引物，测序含有外显子1-3的亚克隆的PrP基因片段。这些序列结果用于在开始靶向载体之前证实牛PrP基因的外显子/内含子结构的位置作图。已知确切缺失对于这种靶向构建体是最重要的，由于两个原因得到证实。第一，本发明的牛将是含有任何基因定向缺失的第一种牛。我们希望能证实基因组内缺失的确切位置，并且能对这些牛的任何后代中的缺失精确作图。第二，由于我们删除的基因的性质，必须确认删除的序列含有朊病毒蛋白的编码区，利用该技术生产的牛中没有任何蛋白质编码区。

正-负型靶向载体最常用的选择性标记基因是新霉素抗性基因，或“neo”。该基因将赋予携带靶向构建体的细胞G418抗性。胸苷激酶基因将用于在丙氧鸟苷(gancyclovir)存在下进行负选择。这使我们能选择非同源插入靶向载体的细胞。在鼠胚胎干细胞中，在G418和丙氧鸟苷存在下双选择比单独G418选择有高200倍的同源重组子富集41。据报道，人二倍体成纤维细胞的双选择只引起同源重组子的2-3倍富集42。由于以下所述的原因，我们感到甚至这种中度的提高也可导致靶向实验的最终成功。

靶向载体的最终设计取决于限制分析。由于PrP蛋白编码区本身完全包含于外显子3中，应当构建靶向载体，以删除或破坏该基因的所有蛋白质编码区。在小鼠中去除蛋白质编码区成功地消除了朊病毒传染和传播27，49-51。图2显示了根据本发明的典型靶向载体图谱，以及靶向载体插入后的PrP基因结构。

Capecchi表示，为了在胚胎干细胞中有效靶向，载体必须含有长度至少为1kb的侧翼同源DNA序列。同源序列增长两倍可使hprt基因座的靶向频率提高20倍41。因此，建议在定向缺失的任一侧有至少1kb的同源序列，最可能地是来自位于新霉素基因任一侧的PrP基因的非编码区。

本发明的neo基因来源于pPNT质粒(Heiner Westphal惠赠)43，由PGK启动子驱动。TK基因来自于HSV-TK质粒44。PGK-neo基因和HSV-TK基因都曾经亚克隆到pBluscript-SK(Stratagene)中，产生其它的克隆位点(Good，未发表)。完整靶向构建体的质粒骨架是pBluscript-SK载体(Stratagene)。限制酶切位点的约束和PRNP基因内的片段大小决定了极限侧翼大小、缺失大小和使用的PRNP基因的区域。我们的经验提示，为一个基因的两个不同区域制备两个不同的靶向载体通常是有利的。

无启动子的neo基因靶向载体3年前John Sedivy博士的实验室报道了利用正常非啮齿类动物二倍体细胞成功实现了靶向实验42。这种靶向实验使用一种无启动子的neo靶向载体，其构建方法使得当适当插入时由内源靶向基因的启动子驱动。该技术显然导致同源重组子100-200倍富集。

使用该方法的一个问题是高PrP内源PrP表达是实现充分新霉素表达必须的。PrP在鼠胚胎成纤维细胞中表达45。对分离自BEF细胞的RNA的Northern分析证实，这些细胞中也存在PrP mRNA(图3)。其水平比下丘脑细胞系GT1-7约低50％，但似乎足以支持无启动子的构建体。

图2A和图2B显示了几种无启动子的neo构建体的图谱。靶向载体的最终设计取决于对牛PrP基因的限制分析。通过PCR扩增pGEM-neo-poly A质粒，产生了一种新的新霉素盒质粒，它含有无启动子的新霉素基因。设计可识别新霉素基因5’端的一条引物(Tk-Bam：5’GCC AAT ATG GGA TCG GCC ATT GAA C-3’)，与T7启动子载体引物一起在标准PCR扩增程序中使用。将1.4kb片段亚克隆到PCR-Topo II载体中。为了确保新霉素盒与PrP蛋白(包括ATG密码子)符合阅读框地放置，由pNEO载体(Pharmacia Biotech)亚克隆无启动子的新霉素抗性基因，保留neo基因5’的一个剪接位点，在PRNP的第三个外显子内。将至少1kb的侧翼DNA序列插入neo盒的任一侧，在构建体的3’端插入TK基因，用于在丙氧鸟苷存在下负选择。

使用无启动子的neo构建体有利于在PRNP基因内产生定向缺失的目的，因为只有该构建体正确整合到PRNP基因中才能导致neo抗性基因的合成和G418抗性。另外，在正确靶向的载体中将丢失TK基因，导致丙氧鸟苷抗性。在使用传统正-负靶向载体的靶向实验中，大多数G418抗性/TK抗性菌落由基因组中的随机插入产生。无启动子型构建体只能使靠近活性启动子的随机整合对G418有抗性。因此，由于存在较少的总G418菌落，无启动子的靶向载体使人们能在一次实验中筛选每一个G418阳性菌落，而不是200个随机选择的菌落，如ES细胞靶向中所做。例如对于人二倍体成纤维细胞，这种策略产生20个G418抗性菌落和4个同源重组子——靶向频率为20％42。

BEF细胞中靶向效率的优化确定BEF细胞的最佳电穿孔条件有几篇报道表明，除了胚胎干细胞以外，大多数正常哺乳动物细胞中的同源重组较低42，46。尽管在我们的实验室中对BEF细胞进行了电穿孔并生产了转基因牛4，但为了获得含有朊病毒基因破坏或缺失的稀有同源重组子，优化转染率是必要的。

为了实现转染的优化，BEF细胞生长至亚铺满，用胰蛋白酶消化，与20μg线性化pPNT载体一起或不含DNA，重悬浮于0.5ml不含Ca+2/Mg+2的PBS中。该质粒含有在磷酸甘油激酶启动子(PGK)控制下的突变新霉素抗性基因43。利用表1所示条件电穿孔BEF细胞，然后如方法所述以5×105细胞/100mm2组织培养板的密度平板接种。列出的值是Invitrogen电穿孔装置的预设值。表2.BEF细胞电穿孔条件的优化

实验应当进行两次，每一点有6平板电穿孔细胞。所有6个平板都在37℃和5％ CO2下在无药物培养基中生长过夜。早晨用胰蛋白酶消化三个平板，计数，确定细胞存活率。将其余三个平板中的培养基更换为含G418(400μg/ml)的培养基。每日早晨更换这些平板中的培养基，保持药物水平恒定。在5-10天后，当平板上出现可见菌落时，用亚甲基蓝染色，计数每个平板上的菌落数。用三个平板的平均值确定每种电穿孔条件的转染率。每种电穿孔条件在两个分别的实验中尝试。

这些实验用来确定具有最大细胞存活率的BEF细胞的最大DNA转染参数。在开始同源重组实验之前应当优化这些数值，以提高在转染细胞群体中发现这些稀有事件的效率。一个合理的目的是提高转染率，达到每次转染至少1000-1500个G418抗性菌落(1000-1500个G418抗性菌落/3×106个转染细胞＝每3000个细胞中1个转染细胞)。我们估计，甚至在每1000个抗性细胞1个同源重组子的相对较低的同源靶向频率下，我们在1×107个细胞的转染群体中应能发现2-4个同源重组子：1×107个转染细胞＝3333个G418抗性细胞＝3.3个同源重组子3000个中1个抗性细胞1000个抗性细胞中1个同源重组子每次电穿孔这一数字(每次电穿孔3.3个同源重组子)相当于300万个转染细胞中1个的靶向效率，比人二倍体成纤维细胞的频率低30倍42。因此，即使BEF细胞中同源重组频率低于正常人成纤维细胞，这些条件也能使我们在每次实验中回收至少1-2个靶向细胞。

利用pPNT载体确定最佳参数后，应当用这些参数优化靶向载体的靶向频率。由于靶向载体可能大于检测质粒，这可能影响转染效率。

确定BEF细胞中的有效药物浓度在开始实际靶向实验之前，需要确定新霉素(G418)和丙氧鸟苷的最高浓度，它们是杀死非转染细胞所必需的，而对正确靶向的细胞没有毒性。我们实验室以前的工作确定，400μg/ml新霉素足以杀死不含新霉素的BEF细胞，而使含有转染的新霉素基因的BEF细胞快速增殖4。因为我们提出的正-负选择靶向需要在丙氧鸟苷和G418存在下筛选数天，我们建立了一条筛选曲线，来检测能在这些实验中使用的丙氧鸟苷与G418的范围。

另外，其他人的工作也显示，对于人和大鼠二倍体成纤维细胞，只在向培养物中加入1-10mg/ml的G418时才能实现有效筛选42，46。这能比通常用于BEF细胞的高10倍。因此，为了提高同源重组子的频率，首先应当确定这些细胞中是否能使用更高水平的药物。

为了回答这个问题，以5×105细胞/10ml培养基的密度接种未转染的BEF细胞，并温育过夜。次日早晨，将培养基更换为含有药物的培养基，浓度如表2所示。每一药物浓度使用两个细胞平板。G418筛选持续可达10天，或者直到完全杀死每个平板上的未转染细胞。丙氧鸟苷筛选持续4天，计算百分存活率。

表3.未转染BEF细胞的G418和丙氧鸟苷处理

TK基因将丙氧鸟苷转化为毒性核苷酸类似物。正常细胞和缺乏正确靶向的PrP基因的细胞应当对这种药物有抗性。据我们所知，这种药物尚未用于BEF细胞，这些试验使我们能确定细胞可以承受、在不含TK基因时没有大量毒性的最高丙氧鸟苷水平。BEF细胞的新霉素敏感性和丙氧鸟苷抗性的优化将提高靶向频率，并允许在转染子库中发现稀有的同源重组子。

转染的BEF细胞的筛选利用含有新霉素抗性基因以及胸苷激酶基因的pPNT载体，用如上确定的最佳条件电穿孔细胞43。在电穿孔后，细胞以5×105细胞/10ml培养基的密度接种，并温育过夜。次日早晨，将培养基更换为含有药物的培养基，浓度如表3所示。每个药物浓度使用两平板细胞。

单独或与G418组合的丙氧鸟苷筛选持续4天，培养基每24小时更换一次，以确保所有时间上培养基中的药物高浓度。4天后，培养基更换为单独的G418，或者不含根据本表的药物，筛选再继续6天，或者直到个别菌落可见。此时，从平板上除去培养基，用PBS漂洗平板一次，细胞菌落用亚甲基蓝染色。计数每个平板上的菌落数，确定每种药物的细胞死亡/生长曲线。

表2和表3中为两条生长/死亡曲线选择的新霉素浓度基于已知可有效杀伤未转染BEF细胞的最低新霉素浓度，高两个对数，这是用于正常人成纤维细胞的G418的中间范围42。丙氧鸟苷从未用于BEF细胞。因此，所选的丙氧鸟苷的浓度基于靶向实验中对鼠胚胎干细胞有效的浓度的一半(1μM)，药物提高2个对数。

根据对正常大鼠二倍体细胞的研究，G418水平能提高到20mg/ml，而正常neo基因转染的细胞只有80％被杀死46。因此，我们预期用pPNT新霉素构建体能将BEF细胞中的G418浓度由300μg/ml(这是现在使用的最高含量)提高到至少1mg/ml。如在大鼠二倍体成纤维细胞中所证实的，含有突变新霉素基因(如pPNT载体中所见43)的细胞更有效地靶向46。因此，高G418与突变新霉素基因的组合最适于有效回收同源重组的BEF细胞。

表4.pPNT转染的BEF细胞的G418和丙氧鸟苷处理

就正常和破坏的PRNP基因，对BEF基因组DNA的Southern分析应用相关限制酶缓冲液，5μg正常或转染的BEF基因组DNA用选择的限制酶消化8-24小时。消化的DNA在标准电泳缓冲液中在1％琼脂糖凝胶上分离，用标准方法(Sambrook等人，1989)转移到固体载体膜(硝酸纤维素或尼龙膜)上。膜上的DNA与来自插入的转基因和选择性标记的探针杂交。图4显示了对正常BEF PRNP基因的Southern分析。对靶向的BEF或其它有蹄类动物PRNP基因的Southern分析将揭示内源PRNP基因的结构改变，包括较小或较大的杂交PRNP片段，和外源转基因和选择性标记的存在。

实施例牛成纤维细胞的生产和保存ACT按照标准胎成纤维细胞制备方法由55天Holstein雄性胎牛生产牛胎成纤维细胞(BEF)。由一个胎制备大量细胞，用于生产克隆的转基因牛。成纤维细胞在37℃和5％ CO2下保存于聚苯乙烯组织培养板中。当细胞达到80％铺满时以1∶10传代。这些初级细胞具有28-30个小时的细胞周期，在衰老前经历大约30次群体倍增。

牛PrP基因的克隆最初的计划用于在大基因组序列中获得朊病毒基因，并且为了中断蛋白质生产掺入选择性标记。从牛胎成纤维细胞中提取高分子量的基因组DNA。通过向噬菌体载体中随机插入该基因组DNA的限制片段并包装成病毒颗粒，制备λFIX 11基因组文库(Stratagene)。自由扩增产物(8×109噬斑形成单位/ml)用来感染大肠杆菌并平板接种分离的噬斑。印迹的噬斑用来自质粒pMPRP3(ATCC)、含有小鼠朊病毒DNA序列的放射标记的2.4kb EcoRI DNA片段探针杂交。为了覆盖完整的基因组，筛查足量的噬斑。富集含有推断的牛PrP基因序列的噬斑，重新接种，再次探针杂交，以纯化并证实它们与小鼠PrP基因的序列匹配。在三次独立筛查噬斑的尝试中，获得并检测了几个初始信号。都不含能用来构建靶向载体的PrP序列。

为了获得构建靶向构建体所需的基因，进行PCR扩增。引物根据GenBank AB001468和D26150的序列制备。PCR扩增位于插入或缺失点任一侧(称作臂)的约2kb序列。应用有义引物“A”(GCAGAGCTGAGCGTCTTC)和反义引物“B”(CAGC’fCAAGTTGGATTTGTGTC)，通过扩展PCR系统(Boehringer Mannheim)扩增含有内含子I和外显子2一部分的序列的5’上游臂。PCR产物是2.4kb的DNA片段(图5)，它用TOPO XLPCR试剂盒(Invitrogen)克隆，并在马萨诸塞州大学的DNA测序机构测序。

最初应用引物C和D的工作未能产生希望的产物。需要另一组引物直接从牛基因组DNA中扩增外显子3序列。用有义引物PrP Is(GGGCAACC-I’TCCTGTTTTCATTATC)和反义引物PrP 1a(CCATACACTGCACAAA-fACATTTTCGC)克隆2.129kb PCR产物(图6)。

靶向载体的构建装配克隆的序列，建立靶向载体。构建开始于PrP3的克隆#3，该质粒在载体pCR-XL TOPO(Invitrogen)中含有编码序列外显子3，3’臂。将克隆的构建体的5’臂转移到3’臂上游的SstI片段。使用引物TK-Bam(GCCAATATGGGATCGGCCATTGAAC)和T7测序引物(TAATACGACTCATATAGGG)经PCR修饰neo选择(新霉素G418抗性)盒，以在5’端添加一个BamHI位点，以便更容易地亚克隆。该PCR产物PGK-neo插入BamHI片段的3’与5’臂之间。最终构建体通过MluI和NotI消化线性化，纯化该片段用于转染。当与基因组DNA重组时，该构建体用于中断外显子2的序列缺失部分，使外显子3中的编码序列不产生基因产物(图5)。然而这未获成功。回想起来，该载体有几个主要问题：(1)它不是无启动子的neo；(2)该载体具有极短的左-右基因组臂，只含2.3kb的内含子1、具有自身启动子的neo和2.2kb的外显子3；(3)该载体中完全不含14kb的内含子2基因组DNA，实际导致1.5kb的缺失。

在这些研究中使用三个构建体：EGFP-N1(Clontech)、pPNT和如上所述制备的pPRP载体。确定牛胎成纤维细胞转染效率的预电穿孔实验用含有绿色荧光蛋白和新霉素抗性基因的EGFP-NI载体(Clontech)进行。在我们实验室以前的实验中，已经用EGFP质粒成功转染BFF细胞。使用这种载体能通过荧光显微镜检容易地检测转染的细胞。转染的BFF细胞和抗性菌落在紫外线下发出绿色荧光。表I说明了在检测BFF细胞的电穿孔条件时EGFP载体的应用。在第二次EGFP转染和随后用PPNT载体转染时改变电穿孔参数。我们实验室在400伏特和250μF电容下进行了成功的BFF细胞转染。在K.D.Wells等人进行的一个类似实验中(1998年LETS会议摘要)，在0、200、300、400或500伏特和500μF电容下转染BFF细胞，诱导DNA摄取。在400和500伏特时获得最大转染。电穿孔参数集中于450-650伏，400伏特被认为是基线电压。通过以50伏特的增量提高电压检测了更高的电压。

通过在不同浓度遗传霉素(G418，400-3000μg/ml)下培养转染和未转染的牛胎成纤维细胞测试药物筛选。在我们的研究中，对于牛胎成纤维细胞，400μg/ml G418 10天是最佳药物筛选条件，产生稳定的新霉素抗性菌落。

电穿孔牛胎成纤维细胞在含15％ FBS(Hyclone)的DMEM-高葡萄糖培养基(Gibco/BRL)中生长至80％铺满。用1×胰蛋白酶/EGTA(Gibco/BRL)收集细胞，然后在室温下以1200转/分离心7分钟形成沉淀。洗涤细胞，以5×106细胞/0.5ml的密度重悬浮于无Ca+2/Mg+2的Dulbecco’s PBS中。在每次电穿孔实验中，将500pi等份重悬浮细胞和25μl无菌水中的20μg线性DNA转移到0.4cm宽间隙的电穿孔池(Biorad)中。轻轻拍打电穿孔池混合细胞和DNA，然后在冰上温育10分钟。温育后，再次轻轻混合细胞和DNA，然后用Invitrogen II电穿孔仪以表5所示参数电穿孔：表5.BFF细胞电穿孔条件的优化

在电穿孔后将电穿孔池放回冰上10分钟。在接种电穿孔细胞之前，向每个池中加入100μl不含Ca+2/Mg+2的DPBS，轻轻混合细胞。在无菌条件下，向6个20×100mm2聚苯乙烯组织培养皿的每一个中加入10ml含15％ FBS的DMEM-高葡萄糖。从池中取出100μl等份电穿孔细胞，平板接种于6个组织培养皿的每一个上。所有6个平板的细胞都在37℃和5％ CO2空气下在无药物培养基中生长过夜。次日早晨经胰蛋白酶消化收集3个平板的转染细胞，进行细胞计数，确定细胞存活率。通过更换培养基并向每个平板中加入400μg/ml遗传霉素(G418)，对其余3个平板开始药物筛选。细胞然后在G418选择下在37℃和5％ CO2下生长10天。每天更换这些平板中的培养基，以保持用于药物筛选的恒定G418水平。G418筛选10天后，出现可见菌落，计数每个平板上的菌落数。用三个平板的平均菌落计数确定每种电穿孔条件的转染效率。每种电穿孔条件在两次分别的实验中检测。

在用pPNT载体转染牛胎成纤维细胞之前，用含有绿色荧光蛋白和新霉素抗性基因的EGFP-N1载体(Clontech)进行预电穿孔实验。在我们实验室以前的实验中，已经用EGFP质粒成功转染BFF细胞。使用这种载体能通过荧光显微镜检容易地检测转染的细胞。转染的BFF细胞和抗性菌落在紫外线下发出绿色荧光。表1说明了在检测BFF细胞的电穿孔条件时使用EGFP载体。在第二次EGFP转染和随后的pPNT载体转染时改变电穿孔参数。我们实验室在400伏特和250μF电容下进行了成功的BFF细胞转染。在K.D.Wells等人进行的一个类似实验中，在0、200、300、400或500伏特和500μF电容下转染BFF细胞，诱导DNA摄取。在400和500伏特时获得最大转染。

电穿孔参数集中于450-650伏，400伏特被认为是基线电压。通过以50伏特的增量提高电压测试了更高的电压。

表6.应用EGFP和pPNT的BFF细胞的电穿孔参数

利用表6所示电穿孔参数，用pPNT对BFF细胞进行第二组转染。pPRP靶向载体的转染使用相同的电穿孔条件。

未转染的BFF细胞的检测筛选未转染的牛胎成纤维细胞以5×106细胞/10ml含15％ FBS的DMEM-高葡萄糖培养基的密度接种于20×100mm2聚苯乙烯组织培养皿上。细胞在37℃和5％ CO2下生长过夜。次日早晨更换培养基，应用遗传霉素(G418)开始药物筛选。

表7包括检测的药物浓度。G418选择进行10天，这段时间内未转染的细胞被全部杀死。每种药物浓度使用两个平板的BFF，在第0、3、7、10天对这些平板进行细胞计数。我们实验室以前的工作已经确定400μg/ml新霉素足以杀伤不含新霉素的BFF细胞，而使含有转染新霉素基因的BFF细胞快速增殖。因此，对于该实验，以400μg/ml遗传霉素(G418)开始药物筛选，检测600、800、100μg的升高的药物浓度。

表7.未转染的BFF细胞的遗传霉素(G418)处理

用未转染的牛胎成纤维细胞制作第二条死亡率曲线，药物筛选开始于400μg/ml G418，升高到600、800、100μg的浓度进行检测。表8包括所检测的药物浓度。

表8.未转染的BFF细胞的遗传霉素(G418)处理

转染的BFF细胞的检测筛选用含有新霉素抗性基因和胸苷激酶基因的pPNT载体转染BFF细胞。在450伏特和250μF电容下电穿孔细胞，诱导DNA摄取。在电穿孔后，由非休眠胎成纤维细胞生产的克隆转基因小牛的细胞以5×106细胞/10ml培养基/100mm2平板的密度接种，并在37℃和5％ CO2空气下温育过夜。次日早晨，更换培养基并用G418开始药物筛选。测试的药物浓度在表8中列出。遗传霉素选择持续12天，这时抗性菌落可见。每个药物浓度使用两平板BFF，在第0、4、7、12天对这些平板的细胞进行细胞计数。如前所述，药物筛选开始于400μg/ml G418，并测试升高的遗传霉素浓度。表7和表9中为两条生长/杀伤曲线选择的新霉素浓度基于已知可有效杀死未转染BEF细胞的最低新霉素浓度，高两个对数，这是用于正常人成纤维细胞的G418的中间范围。

表9.pPNT转染的BFF细胞的遗传霉素(G418)处理

电穿孔结果在不含DNA的未转染牛胎成纤维细胞的电穿孔中未出现自发抗性菌落。随着测试电压的升高，细胞存活率S形降低。细胞在1、100、300、450、600、800伏特和0-500μF电容下电穿孔。在100伏特时细胞存活率为89％，在800伏特时，细胞存活率显著降低到1.2％。表6说明用400μg/ml遗传霉素(G418)药物筛选10天后，三个平板的总细胞计数和平均细胞计数。在没有抗性菌落时不能计算该实验的转染效率。

表10.未转染的BFF细胞的电穿孔

用几种DNA构建体EGFP-NI(Clontech)、pPNT和pPRP对转染的BFF细胞进行电穿孔作为一系列实验。在第一个电穿孔实验中使用EGFP构建体，因为在我们的实验室中以前曾经用它成功转染BFF细胞。该构建体含有新霉素抗性基因和绿色荧光蛋白，能在荧光显微镜下容易地检测转染的BFF细胞。转染的BFF细胞在紫外线下发绿色荧光。细胞在0、100、300、450、600、800伏特和0-500μF电容下转染。如以前未转染BFF细胞所见，细胞存活率随电穿孔电压升高而降低。表11显示了药物筛选10天后三个平板的细胞总数和平均细胞计数。

表11.EGFP转染的BFF细胞的电穿孔

在600伏特、250μF电容时发生最大转染，每个培养板上平均出现14个抗性菌落。该电压时的细胞存活率只有8.9％，而这些细胞在每个培养板上产生最大数量的菌落。在电穿孔实验中报道了类似的结果。如其他人所述，随着电压升高，细胞存活率以S形方式降低，反之，随着电压升高，存活的转染细胞数量S形增加40。在下一次电穿孔实验中同时进行双份转染。用EGFP和pPNT构建体转染BFF细胞。根据我们以前的实验中获得的最大转染(600伏特)，这些转染使用更集中的电穿孔条件范围。成功转染通常在400伏特下进行，K.D.Wells等人在400和500伏特时获得BFF细胞的最大转染40。因此，在0、450、550、600、650伏特下转染细胞，以获得最佳转染效率。对于EGFP构建体转染的BFF，在600伏特、250μF时发生最大转染；每个培养板平均有15个抗性菌落。在pPNT转染中获得类似的结果。如前所述，随着电穿孔电压升高，细胞存活率降低，而转染效率提高。

随后的电穿孔实验使用450-650伏特的电压范围和250μF电容。再次同时分开进行两次转染：用pPNT第二次转染BFF细胞和用靶构建体pPRP第一次转染。对于pPNT载体，在600伏特和250μF电容时获得最大转染。对于pPNT转染，每个培养板获得平均28个抗性菌落。对于靶载体pPRP，在略高的电压650伏特和250μF时获得最大转染。对于pPRP转染每个培养板记录12个抗性菌落。在这些较高的电穿孔电压下，细胞存活率降低和转染效率升高的S形模式是明显的。这些结果包含于图7-9中。

使用如上所述相同的电压和电容，在第二次实验中重复pPRP对BFF细胞的转染。在600伏特和250μF时再次获得最大转染。这种重复转染获得的抗性菌落数量与以前pPRP实验中获得的相当。

药物筛选的优化未转染的牛胎成纤维细胞在不同浓度的遗传霉素(G418)下生长。我们实验室的转染实验通常使用400μg/ml的G418浓度，发现该药物浓度足以杀死不含新霉素的BFF细胞，而使新霉素基因转染的BFF细胞快速生长。因此，400μg/ml的G418浓度被认为是该实验的起点，并测试了升高的药物浓度。在第一次实验中，测试了宽范围的药物浓度：400、1000和3000μg/ml G418(表12)。在400μg/ml G418时，未转染的BFF细胞在药物筛选开始后继续旺盛生长3天。在1000μg/ml G418下，未转染的BFF细胞以降低的速度生长相同时间。在3000μg/ml G418下药物筛选3天内，BFF细胞死亡(图11)。杀死未转染的BFF细胞需要用400μg/ml G418药物筛选10天。每个药物浓度使用两个培养板的细胞，以每一时间间隔进行细胞计数。表12包括不同时间内检测的每个G418浓度的平均细胞计数。表12.未转染的I3hF细胞的G418药物筛选

对于未转染BFF细胞的第二条杀伤曲线，药物浓度范围集中于400-1000μg/ml G418。药物筛选开始后前几天，在较高药物浓度(600、800、1000μg/ml)下细胞增殖速率降低。G418处理7天后，在800μg G418时出现BFF细胞的总死亡率，在600μg G418时只有少量未转染细胞存活。根据这两条杀伤曲线显然可知，在药物筛选中有大约3天的滞后。在这段时间内，随着G418浓度升高，BFF细胞以降低的速率持续生长。

用pPNT构建体转染牛胎成纤维细胞，并进行药物筛选12天。测试了宽范围的药物浓度：400、1000、3000μg/ml G418。对于测试的任何浓度，在药物筛选12天后不发生死亡。在这些较高的药物浓度下，BFF细胞以降低的速度继续生长(图10和图11)。表13包括在12天内收集的两个BFF培养板的平均细胞计数。由于难以获得丙氧鸟苷，未用这种药物进行BFF细胞的检测筛选。

表13.pPNT转染的BFF细胞的G418处理

结论本实验的目的在于克隆牛朊病毒基因(PrP)的基因组序列，以产生靶向载体，并优化牛胎成纤维细胞的电穿孔和药物筛选的条件。产生的靶向载体并不成功，主要是因为：(1)它不是无启动子的neo；(2)该载体具有极短的左-右基因组臂，只含2.3kb的内含子1、具有自身启动子的neo和2.2kb的外显子；和/或(3)该载体中完全不含14kb的内含子2基因组DNA，导致实际1.5kb的缺失。因此，发展了一种用于构建靶向载体的备选策略，它应当能解决这些问题，如实施例2所详述。

实施例2用于从牛基因组DNA文库中分离PrP基因的DNA探针的产生设计PCR引物(5’引物：ATGGTGAAAAGCCACATAG；3’引物：TATCCTACTATGAGAAAAAT)，使PCR产物的DNA序列对应于作为PrP外显子3一部分的PrP开放阅读框。PCR产物的预测大小为794bp。

筛查基因组DNA文库和PrP基因组DNA的鉴定用非同位素洋地黄毒苷-dUTP(Roche Molecular Biochemicals)标记的794bp PrP探针筛查已经建立的牛基因组DNA文库。我们已经用这种标记系统成功克隆了两个基因组DNA。利用部分DNA测序证实鉴定的PrP基因组DNA，并作图，用于随后基因靶向载体的构建。

基因靶向载体的构建需要一个大约10kb的PrP基因组DNA作为靶向DNA片段的左臂和右臂进行同源重组。从外显子3中删除完整PrP编码序列(795bp)，替换为无启动子新霉素抗性基因。我们希望分离牛PrP基因组DNA片段，它是图12所示的区域。

设计用于基因分型PrP靶向的BEF和动物的一种探针在分离PrP基因组DNA片段、作图并证明满足构建靶向载体的需要后，确定用靶向载体中不含的0.5-1.0kb PrP基因组DNA作为探针用于基因分型基因靶向的等位基因。该探针用非同位素洋地黄毒苷-dUTP(Roche Molecular Biochemicals)标记，在Southern印迹分析中检测部分消化的野生型基因组DNA。我们已经用这种标记方法成功进行了Southern印迹分析。

必要时，可对基因组DNA文库进行数轮筛查，因为为了分离覆盖构建靶向载体所需的基因组区域的DNA片段，可能需要筛查牛基因组DNA文库数次。

无启动子靶向载体的用途(目的I)，用于在牛胎成纤维细胞中进行同源重组，以确定在PrP基因一个等位基因上有无效突变的基因靶向细胞ACT按照标准胎成纤维细胞制备方法由35-40天的Holstein雄性胎牛制备牛胚胎成纤维细胞(BEF)。由这一胚胎制备大量细胞。过去已经用类似制备的细胞成功生产了克隆的转基因牛。成纤维细胞在37℃和5％ CO2下保存于聚苯乙烯组织培养板中。当细胞达到80％铺满时以1∶10传代。这些初级细胞具有28-30个小时的细胞周期，在衰老前经历大约30次群体倍增。

PrP基因靶向构建体向BFF中的导入通过胰蛋白酶消化收集总共1×1011个BEF(80％铺满)，以5×106细胞/450μl冰预冷PBS的密度重悬浮。进行双份电穿孔。每次电穿孔，在电洗脱池中将50μl PBS中的28-50μg DNA靶向构建体与450μl重悬浮的BFF混合，在冰上温育10分钟。温育10分钟后，再次轻轻重悬浮细胞，然后用600伏特和250μF的参数电穿孔(Invitrogen II电穿孔仪)。脉冲后，池在冰上再温育10分钟。转移电穿孔的BFF，重悬浮于10ml上述培养基中，并以5×105细胞/皿的密度接种于10个100mm2聚苯乙烯组织培养皿上。在37℃和5％ CO2孵箱中温育这些细胞。

PrP基因靶向的BFF在含G418选择性培养基中的培养电穿孔后，在正常培养基中培养48小时后，向转染的BEF中加入含有400μg/ml G418的选择性培养基。转染的BEF在选择性培养基中保存约10天，或者直到形成存活的菌落。如果向培养基中补充较高浓度的G418，为了筛选杂合细胞或可能的纯合细胞，相应调节G418的浓度。

筛选后存活的BEF菌落的扩增和基因分型用克隆环分别分离存活的BEF菌落，在选择性培养基中扩增。每个存活菌落需要双份培养物。一组用于提取基因分型所需的基因组DNA，另一组冻存作为保存液。用PCR方法获得用于基因打靶的存活菌落的基因分型，作为初筛，随后是Southern印迹分析。

利用基因靶向细胞通过核移植产生PrP杂合敲除(KO)牛胎基因打靶是一种为了分离由单个细胞通过多次倍增产生的靶向细胞菌落，需要用抗生素进行细胞选择的技术。由于我们计划用初级细胞系研究，到克隆细胞系出现时，除细胞扩增外几乎没有任何群体倍增。在1998年和2000年，我们发表的工作证实了体细胞核移植使细胞系完全复原的能力。这一特征使我们能进行纯合基因打靶，第一次使用来自自然产生的胎的初级细胞，第二次使用来自克隆胎的初级细胞。

以前对牛体细胞核移植的研究证实，该技术不仅可以用来自胎和成年动物的初级细胞重复，而且也可用转基因系重复。在我们的实验室中，我们能通过以相当高的效率克隆，生产转基因动物。40％-50％的受体母牛(每只母牛两个胚泡)怀孕。然而这个总体效率不能反映细胞系之间的差异。我们发现不是所有的克隆系(尽管它们来自同一基因组)都能保持相同的效率水平(根据健康胎的生产确定)。

我们然后用10个不同细胞系产生雄性胎。系1是来自与靶向细胞系相同的基因组的非转基因胎成纤维细胞。系2-10是PrP纯合KO细胞。测算发育至胚泡阶段的效率，以及妊娠30-35天时的妊娠率，和形成40天健康胎的能力。

每个细胞系产生的胚胎(胚泡)数量为50，移植到25只母牛中。由于这一研究的工作量不能使我们在一天内进行全部实验，我们将每个细胞系分为3个不同的重复(一天一个)，使所有不同处理随机化。

预期结果：根据我们以前使用转基因细胞的工作，我们预期获得不能引起妊娠的细胞系，以及能以40％-50％的速率和80％-90％健康胎牛产量引起妊娠的细胞系。如果有一种以上的细胞系产生健康胎牛，我们将选择能最有效地产生第二轮基因打靶的5个。

然而，所有细胞系的妊娠率可能低于平均值。这时我们将从包括不同品种的不同基因型中预先筛选细胞系。

卵子的提取和成熟在屠宰场回收卵巢，置于PBS(34℃)中，在8小时内带回实验室。用18G针头无菌吸出每个直径超过2mm的卵泡。卵母细胞的寻找在改良Tyrode培养基(TL Hepes)中进行。将含有均匀细胞质、相当大卵周间隙和完整丘细胞的卵母细胞置于成熟培养基M199(GIBCO)、10％ FCS、5μl/ml bFSH(Nobly)、5μl/ml bLH(Nobly)和10μl/ml Pen-strep(Sigma)中，38.5℃和5％ CO2下22小时。预期置于成熟培养基中的卵有70-80％能达到中期II阶段。

供体细胞的制备如下从35-40天的胎牛中分离细胞系。在无菌条件下，弃去胎的肝、肠和头。仔细切碎胎的其余部分，置于含有0.08％胰蛋白酶(Difco)和0.02％ EDTA(Sigma)的DPBS溶液中。在37℃下温育30分钟后，弃去上清液，将沉淀重悬浮于胰蛋白酶-EDTA/DPBS中。温育30分钟后，取出上清液，以300g离心10分钟。将沉淀重悬浮于培养基(DMEM+15％ FCS，4μl/ml抗生素-抗真菌剂，28μl/ml 2-巯基乙醇，0.3mg/ml L-谷氨酰胺)中，并接种于聚苯乙烯组织培养皿(Corning25010)中。传代2次后，培养液中有大部分成纤维细胞样细胞。这些细胞将用作对照或用于进一步的基因打靶实验。

卵子的去核成熟18小时后，中期II卵母细胞置于矿物油(Sigma)下的一滴100μl的TL HECM-Hepes中。卵母细胞的去核(染色体的提取)用直径25μm的斜面玻璃吸管进行。通过在紫外线下将预先培养15分钟的卵母细胞暴露于1μg/ml在TL HECM-Hepes中的二苯甲亚胺(Hoechst 33342，Sigma)中，评价去核。

细胞转移用别处所述的摇落(shake-off)法选择G1(增殖)期的供体细胞。简言之，在含有15％ FCS的培养基存在下培养细胞至50-60％铺满。在细胞转移前几分钟，以速度3振荡培养板30-60秒。随后收集培养基，以300g离心10分钟。然后将沉淀重悬浮于Hecm Hepes培养基中，细胞用于核移植。利用20微米内径的玻璃吸管，装运一个细胞，将其置于卵子的卵周间隙中。

细胞融合根据以前所述的条件，在成熟23小时后，去核的卵子和供体细胞将与卵子的细胞质融合。简言之，在0.3M甘露醇(Sigma)中，利用2.5kB-cm的电脉冲，使去核的卵子与供体细胞电融合和10-15微秒。

核移植单位(NTU)的激活现在称为NTU的融合胚胎将在细胞融合2小时后化学激活，所使用的化学激活方案包括将NTU置于含10微摩尔离子霉素的培养基中，随后在环己亚胺和松胞菌素B中温育8小时。

胚胎培养在激活后和激活后的前72小时期间，胚胎在含有小鼠胚胎成纤维细胞(MF)饲养层和含6mg/ml BSA的ACM培养基的500μl孔培养板中培养。第4天，将胚胎转移到含小鼠成纤维细胞(MF)饲养层和含6mg/ml BSA和10％ FCS的ACM培养基的500μl孔培养板中，直到胚泡期(激活后第7天或第8天)。

胚胎移植和妊娠检查胚胎移植如别处所述进行。简言之，在发情期6-7天后，将两个胚泡等级7-1或7-2(IETS分类)非手术置于子宫角中，与黄体同侧。通过子宫颈导管进入子宫角。妊娠检查在胚胎移植35天后通过直肠超声进行。存在心跳将表明健康的妊娠。

胎的获取听到心跳后，即通过剖腹手术在胚胎移植40天后取出胚胎。从子宫中取出胚胎，不需取出胚盘囊，置于含有PBS和抗生素50ml试管中，在4℃下送达实验室。

小牛分娩在预产期(280-285天)之前三周，将受体母牛带到圈中，24小时监视任何早产迹象。分娩前一周和C切前24小时，对受体母牛髓内IM注射地塞米松，以引发小牛肺的成熟。次日，进行C-切。出生后，对小牛施用表面活性剂，不断监视直到所有生命体征稳定。可以使用巴士消毒的初乳，在观察到第一次吸吮反射后即喂饲小牛。

基因型克隆的胎和分离PrP杂合KO胎成纤维细胞基因分型克隆的胎从克隆的牛胎组织中提取基因组DNA，使用与基因分型用于产生克隆胎的基因靶向BEF相同的探针，通过Southern印迹分析进行基因分型。

具有PrP杂合敲除的低传代胎成纤维细胞的分离BEF的初级培养物只有有限数量的细胞群体倍增。在BEF的同源重组过程中将使用这些倍增时间的几个。在鉴定具有PrP杂合敲除的BEF时，它们可能接近衰老，不适于一轮同源重组。我们预期必须从具有PrP杂合敲除的克隆胎中分离新的BEF，这些BEF将用于第二轮基因打靶，以获得如前所述的PrP纯合敲除BEF。

分离和保存PrP杂合敲除胎成纤维细胞的方法与前所述基本相同，不同之处在于PrP杂合敲除胎将是这些细胞的来源。

PrP杂合KO胎成纤维细胞的同源重组和鉴定在PrP基因两条等位基因上具有无效突变的基因靶向细胞该方法与前所述基本相同，不同之处在于：(1)PrP杂合敲除BFF用于第二轮基因打靶，(2)优化选择性培养基中的G418浓度，以支持具有PrP杂合敲除的细胞的存活率。在正常情况下，培养基中的G418浓度需要是筛选PrP杂合敲除细胞的浓度的两倍，即，800μg/ml。

缺陷和预期困难在含高浓度G418的选择性培养基上只有少于所需的菌落存活。为了确保在筛选后获得足够的菌落，进行三组或四组电穿孔。根据我们在其它敲除实验中的经验，在第二轮基因打靶中获得PrP纯合敲除细胞可能有困难，因为如果使用相同的靶向载体则效率极低。原因还不清楚，(1)相同的靶向载体，与PrP杂合敲除细胞的靶向等位基因没有错配，可能倾向于与靶向等位基因重组；(2)使用相同选择性标记将不能区别杂合和纯合敲除细胞。为了克服这种可能的困难，我们构建了一种基因靶向载体，它含有一种不同的选择性标记，即潮霉素，用于第二轮基因打靶。

用PrP纯合KO细胞通过核移植产生PrP纯合KO小牛原则上，我们将重复如前所述的实验设计，但应用6个细胞系，1个对照和5个靶向细胞系。确定发育至胚泡期的效率，以及妊娠30-35天时的妊娠率，和生产健康新生小牛的能力。每个细胞系产生的胚胎(胚泡)数量将是50，转移到25只母牛中。由于这一研究的工作量不能使我们在一天内进行全部实验，我们将每个细胞系分为3个不同的重复(一天一个)，使所有不同处理随机化。

预期结果：当每个受体母牛移植两个胚胎时，总妊娠率与常规人工授精随后胚胎移植所产生的胚胎相同。然而由于尚不清楚的原因，克隆胎的流产率显著提高。妊娠50-90天和220-280天时，被诊断为受孕的半数母牛流产。在我们使用KO细胞系的研究中，我们预期产生健康小牛的效率在不同细胞系中变化极大。总效率应为10-15％(移植的母牛/出生的健康小牛)。

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