Acapsular p. multocida hyae deletion mutants

発明の分野 本発明は、パスツレラ・ムルトシダ（P. multocida）の無莢膜変異体、および変異体を含むワクチンに関する。 なお、本出願は、代理人整理番号000295.00015のもとで、2003年7月2日に出願された同時係属中の仮出願第60/ 号の恩典を主張し、かつ、参照により組み入れるものである。

発明の背景 パスツレラ・ムルトシダは、子牛および満一年子の髄膜脳炎、子羊のリンパ節炎、ウマおよびロバの敗血症、ウシの敗血症性パスツレラ症（出血性敗血症、バーボーン（barbone））、ブタパスツレラ症、ブタの敗血症性パスツレラ症、肺炎、ならびに家禽コレラを含む多様な疾病に関連している。

当技術分野においては、パスツレラ・ムルトシダによって引き起こされる疾病に対する防御免疫を与えるために使用できる有効なワクチンが必要である。

本発明のひとつの態様は、hyaE遺伝子の全部または一部の欠失を含む、単離された、血清群Aのパスツレラ・ムルトシダ細菌である。 欠失は細菌を弱毒化する。

本発明のもうひとつの態様は、野生型パスツレラ・ムルトシダに対する防御免疫を誘起するためのワクチンである。 ワクチンは、hyaE遺伝子の全部または一部の欠失を含む、血清群Aのパスツレラ・ムルトシダ細菌、および薬学的に許容されるビヒクルを含む。 欠失変異は細菌を弱毒化する。

本発明のさらにもうひとつの態様は、hyaE遺伝子の全部または一部の欠失を含む血清群Aのパスツレラ・ムルトシダ細菌を含む、哺乳動物（家畜、有蹄動物、およびコンパニオンアニマルまたはトリ（好ましくは家禽））に適した飼料である。 変異は細菌を弱毒化する。

本発明のなおもうひとつの態様は、野生型パスツレラ・ムルトシダに対する防御免疫を誘起する方法である。 血清群Aのパスツレラ・ムルトシダ細菌は、哺乳動物（家畜、有蹄動物、およびコンパニオンアニマルを含む）またはトリ（家禽を含む）のような動物対象に投与される。 細菌はhyaE遺伝子の全部または一部の欠失を含み、これは細菌を弱毒化する。 それにより細菌は、動物対象に、野生型パスツレラ・ムルトシダに対する防御免疫を与える。

本発明は従って、パスツレラ・ムルトシダに起因する疾病に対する防御免疫を誘起するためのツールおよび方法を提供するものである。

hyaE欠失変異体の構築の説明である。 図1Aは、計画された欠失を示す模式図である。

hyaE欠失変異体の構築の説明である。 図1Bは、hyaE挿入物が欠失したプラスミドである。

発明の詳細な説明 野生型パスツレラ・ムルトシダに対する防御免疫を与えるため、例えば、それぞれ、家畜、有蹄動物、およびコンパニオンアニマルにおける出血性敗血症または肺炎のような疾患を予防する又はその重症度を低下させるため、ならびに、トリ、特に家禽における家禽コレラを予防する又はその重症度を低下させるために、パスツレラ・ムルトシダ血清群Aの無莢膜hyaE欠失変異体は、哺乳動物（家畜、有蹄動物、およびコンパニオンアニマルを含む）およびトリ（家禽を含む）に投与できる。 「無莢膜変異体」、「無莢膜細菌」、および「変異細菌」という用語は、本明細書中では交換可能に用いられる。

パスツレラ・ムルトシダ血清群Aの無莢膜hyaE欠失変異体 血清群Aパスツレラ・ムルトシダの無莢膜hyaE欠失変異体（例えば、血清型A:1、A:3、A:4）は、莢膜生合成遺伝子座にあるhyaE遺伝子を変異誘発することによって作製できる。 血清群Aにおける莢膜生合成遺伝子座の遺伝子は周知であり、完全に配列決定されている。 Chungら、FEMS Microbiol. Lett.166(2), 289-96, 1998。 血清型A:1遺伝子座は、領域1内に4個のオープンリーディングフレーム（ORF）(hexA、hexB、hexC、およびhexD)、領域2内に5個のORF (hyaA、hyaB、hyaC、hyaD、およびhyaE)、および領域3内に2個のORF (phyAおよびphyB)を有する。

いくつかの態様においては、変異細菌はいずれの抗生物質耐性遺伝子または外因性DNAも含まず、このことは、自然環境的および生態学的な魅力を増大させる。 欠失変異体の作製方法は実施例1に記載されているが、当技術分野において公知である任意の他の方法を、欠失変異体を作製するために用いることができる。 変異体が無莢膜形質を有することを確認するための簡単な試験も、実施例1に開示されている。

hyaE遺伝子の全部または一部の任意の欠失を持つパスツレラ・ムルトシダ細菌は、その欠失が細菌を弱毒化する限りにおいては、本発明の範囲内である。 ある態様においては、欠失変異は、hyaEタンパク質のアミノ酸239-359の欠失をもたらす（すなわち、コードされたhyaEタンパク質内にアミノ酸239-359は全く存在しない）。 別の態様においては、変異したhyaEのオープンリーディングフレームはSEQ ID NO: 7またはSEQ ID NO: 8を含む。

変異細菌への曝露後に、感受性標的種の半数を殺すために野生型パスツレラ・ムルトシダの投与量の増加（すなわち、LD ₅₀増加）が必要な場合、および／または、野生型細菌の曝露と比較して、標的種を変異細菌に曝露した後、病理病変（例えば、肺炎）が縮小している場合、および／または、野生型細菌の曝露と比較して、標的種を変異細菌に曝露した後、パスツレラ・ムルトシダが存在する粘膜表面の共生コロニー形成が減少している場合に、変異細菌は弱毒化されている。

弱毒化は、当技術分野において公知である様々な手段によって評価することができる。 例えば、敗血症性疾病（家禽コレラのような）については、鼻腔内経路、静脈内経路、筋肉内経路、または腹腔内経路によって、感受性種を野生型微生物に曝露することができ、疾病を生じるために必要な投与量を、野生型と変異型の微生物間で比較することができる。 肺炎性疾病については、鼻腔内経路、気管内経路、または肺動脈弁内（intrapulmonic）経路によって感受性動物を野生型微生物に曝露し、変異型と野生型に曝露された動物間での臨床症状および病理病変の程度および重症度を比較することができる。 粘膜のコロニー形成に関しては、動物を、経口投与、鼻腔内投与または扁桃内投与によって野生型微生物を曝露することができ、曝露後一定時間ごとに、鼻腔粘液または扁桃の洗浄検体から回収された微生物の数を比較することができる。

ワクチン調製物 変異細菌を含むワクチンを、単独で、または多価ワクチンの構成成分として、すなわち他のワクチンと組み合わせて与えることができる。 ワクチン製剤中の変異細菌は生きていてもよく、または死滅していてもよい。 生存中、または死滅した細菌のいずれも凍結乾燥することができ、任意に、当技術分野において公知のように再構築することができる。 ワクチンは簡便にキットで提供することができ、これにはまた、動物対象（例えば、家畜、有蹄動物、コンパニオンアニマル）またはトリ（例えば、家禽）に対するワクチン投与のための適切な標識および使用説明書も含むことができる。

無莢膜変異体を含むワクチンは、薬学的および獣医学的に許容される担体もまた、含むことができる。 そのような担体は当業者にとって周知であり、タンパク質、多糖類、ポリ乳酸、ポリグリコール酸、重合体アミノ酸、アミノ酸共重合体、および不活化ウイルス粒子のように、ゆっくりと代謝される大きな高分子を含むが、これらに限定されるわけではない。 例えば、塩酸塩、臭化水素塩、リン酸塩、または硫酸塩のような無機塩ならびに、酢酸塩、プロピオン酸塩、マロン酸塩または安息香酸塩のような有機酸などの薬学的および獣医学的に許容される塩もまた、ワクチン中で用いることができる。 ワクチンは、水、生理食塩水、グリセロールおよびエタノールのような液体、ならびに湿潤剤、乳化剤またはpH緩衝剤のような物質も含む。 リポソームも、変異細菌の担体として用いることができる。 米国特許第5,422,120号、WO 95/13796、WO 91/14445、またはEP 524,968 B1を参照されたい。

望ましいならば、アジュバントをワクチンに添加することができる。 有用なアジュバントには、非制限的に、界面活性剤（例えば、ヘキサデシルアミン、オクタデシルアミン、リゾレシチン、臭化ジメチルジオクタデシルアンモニウム、N,N-ジオクタデシル-n'-N-ビス(2-ヒドロキシエチルプロパンジアミン)、メトキシヘキサデシルグリセロール、およびプルロニック（pluronic）ポリオール；ポリアニオン（例えば、ピラン、デキストラン硫酸、ポリIC(polyIC)、ポリアクリル酸、カルボポール）、ペプチド（例えば、ムラミルジペプチド、ジメチルグリシン、タフトシン）、油性乳濁剤、ミョウバン、ならびにその混合物が含まれる。

哺乳動物、特に家畜、有蹄動物およびコンパニオンアニマルの処置 「哺乳動物」とは単孔類（例えば、カモノハシ）、有袋類（例えば、カンガルー）、および有胎盤類を含み、これには、家畜（ブタ、ヒツジ、ウシおよびウマのように、食料、乳または繊維のために飼育された家畜）およびコンパニオンアニマル（例えば、犬、猫）を含む。 「有蹄動物」とはウシ（ウシ属の動物）、水牛、バイソン、ヒツジ、ブタ、シカ、ゾウおよびヤクを含むが、それに限定されるわけではない。 これらはそれぞれ、成体および成長中の形態（例えば、子ウシ、子ブタ、子羊など）の両方を含む。 本発明の細菌は、成体または成長中の哺乳動物、好ましくは家畜、有蹄動物、またはコンパニオンアニマルのいずれにも投与することができる。

哺乳動物（家畜、有蹄動物、またはコンパニオンアニマルのような）に本発明の細菌を送達するための便利な方法は、経口投与（例えば、飼料もしくは飲水中、または餌中）によるものである。 細菌を飼料に追肥する（top-dressing）、または混合することが特に便利である。 典型的には、大動物（例えば、ウシのような家畜／有蹄動物）には、約10 ⁶ cfu、5×10 ⁶ cfu、10 ⁷ cfu、5×10 ⁷ cfu、10 ⁸ cfu、5×10 ⁸ cfu、10 ⁹ cfu、5×10 ⁹ cfu、または10 ¹⁰ cfuで投与され、飼料に追肥する場合、約10 ⁸ cfu、5×10 ⁸ cfu、10 ⁹ cfu、5×10 ⁹ cfuを投与する。 約10 ⁶ cfuから約10 ⁸ cfuの、約2×10 ⁶ cfuから約3×10 ⁸ cfuの、約2.4×10 ⁶ cfuから約2.6×10 ⁸ cfuの、約10 ⁴ cfuから約10 ⁶ cfuの、または約10 ⁴ cfuから約10 ⁹ cfuの用量を与えることができる。 投与量は、ヒツジのようなより小さな家畜／有蹄動物に対しては調節することができる（例えば、約10 ⁴ cfu、5×10 ⁴ cfu、10 ⁵ cfu、5×10 ⁵ cfu、10 ⁶ cfu、5×10 ⁶ cfu、10 ⁷ cfu、5×10 ⁷ cfu、10 ⁸ cfu、5×10 ⁸ cfu）。 類似の投与計画は、コンパニオンアニマルに対して容易に推定することができる。

送達の容易さから、経口経路が好ましいが、他のワクチン接種経路も用いることができる。 これらは、皮下、筋肉内、静脈内、皮内、鼻腔内、気管支内などを、非限定的に含む。 本発明の細菌は、耳の中に移植することができる。 細菌はまた、エアスプレーによって、眼接種によって、または乱刺法によっても投与できる。

トリの処置 「トリ」とは野生のトリ（例えば、狩猟鳥）および飼育されたトリ（例えば、家禽またはペット）を含み、成体および成長中の形態（例えば、ふ化したばかりの幼鳥、ヒヨコ、ヒナなど）の両方を含む。 「家禽」または「家禽のトリ」とは、ニワトリ、七面鳥、ダチョウ、ゲームヘン、ヒナバト、ホロホロチョウ、キジ、ウズラ、カモ、ガチョウおよびエミューを含む、飼われた、捕獲された、または肉もしくは卵のために飼育された全てのトリを含む。

粘膜注射または筋肉内注射を含む、任意の公知技術または標準的な技術によって、本発明の細菌をトリに投与することができる。 孵化場においては、細菌を卵内ワクチン接種(in ovo vaccination)、噴霧ワクチン接種、または皮下ワクチン接種などの技術を用いて投与することができる。 飼育場においては、細菌を乱刺法、噴霧ワクチン接種、点眼ワクチン接種、飲水中ワクチン接種、飼料中ワクチン接種、水かきワクチン接種(wing web vaccination)、皮下ワクチン接種、または筋肉内ワクチン接種などの技術を用いて投与することができる。

有効投与量はトリのサイズに依存する。 投与量には幅があり、かつ、例えば、約10 ² cfu、5×10 ² cfu、10 ³ cfu、5×10 ³ cfu、10 ⁴ cfu、5×10 ⁴ cfu、10 ⁵ cfu、5×10 ⁵ cfu、10 ⁶ cfu、5×10 ⁶ cfu、10 ⁷ cfu、5×10 ⁷ cfu、10 ⁸ cfu、5×10 ⁸ cfu、10 ⁹ cfuから、5×10 ⁹ cfuまで変動しうる。

本開示に引用された全ての特許および特許出願は、参照により明確に本明細書に組み入れられる。 上記の開示は、本発明を概説するものである。 以下の具体的実施例の参照によってより完全な理解を得ることができるが、これらは説明の目的のみに提供されるものであって、本発明の範囲を限定することを意図しない。

実施例1
無莢膜hyaE欠失パスツレラ・ムルトシダ変異体の作製 菌株1059（トリ、血清型A:3）および菌株1062（ウシ、血清型A:3）のパスツレラ・ムルトシダ変異体は、それらのhyaE遺伝子のコード領域を欠失させることによって作製され、これは莢膜の構築ブロックであるN-アセチル-D-グルコサミンの合成を阻止した。 1059および1062のhyaE遺伝子のコード領域（それぞれ、SEQ ID NO: 5およびSEQ ID NO: 6）は、フォワードプライマー

を用いたPCR増幅によって得られた。 全てのプライマーは、Integrated DNA Technologies, Inc., Coralville, IAにより、オリゴヌクレオチド合成機(Applied Biosystems Inc.)を用いて合成された。 PCR反応は、GeneAmp LX PCR kit(PE Applied Biosystems, Foster City, CA)を用いて、Perkin Elmer GeneAmp 9600 thermocyclerで実行された。 反応条件は、1サイクルあたり95℃で30秒、48℃で45秒、および72℃で60秒を30サイクルであった。

PCRで作製された二つのhyaE断片は、それらの開始メチオニンコドンで開始して、それらの終始コドンで終了した。 PCR断片は、pCR2.1(Invitrogen Inc., LaJolla, CA)にライゲーションされ、大腸菌(E. coli)DH11S株 (Life Technologies, Rockville, MD)内にエレクトロポレーションされて、これによってプラスミドpCR2.1hyaE1059およびpCR2.1hyaE1062を生じた。 二つのプラスミド構築物は、アルカリSDS法によって単離され、その後、標準法を用いたCsCl遠心分離法によって精製された。 両方のhyaE遺伝子の両鎖は、PE Applied Biosystems社のDye Terminator Chemistryキットを用いて配列決定された。 試料を、Nucleic Acid Facility, Iowa State University, Ames, IAによって、ABI Prism 377 DNA シークエンサーにかけた。

各菌株の構造hyaE遺伝子は、長さ1869 bpであった。 主としてコード領域の3'末端に認められる配列バリエーションのため、パスツレラ・ムルトシダの変異菌株を二つ設計するために、各菌株に対して特有のhyaE置換プラスミドを構築した。 プラスミドpCR2.1hyaE1059およびpCR2.1hyaE1062上に含まれる各hyaE遺伝子内の正確な欠失は、欠失プライマー

得られたPCR断片を、その末端から特異的配列を除去するため、 EcoRV制限酵素消化に供した。 その後、715位から1082位までのヌクレオチドを切除したインフレーム欠失を作製するために、各断片をライゲーションした。 変異により、無莢膜表現形がもたらされることを確実にするため、8塩基対のSmaIリンカー（5'-CCCCGGGG-3'）をパスツレラ・ムルトシダ1062のEcoRV欠失部位に挿入した。

1059および1062の変異hyaE断片のヌクレオチド配列は、それぞれSEQ ID NO: 7および8に示されている。 1059および1062の両方において、hyaEタンパク質のアミノ酸239から359までが欠失した。 さらに、両菌株において、以前の位置360のアミノ酸がロイシンからイソロイシンに変化した。 菌株1062は、以前の位置360のすぐ上流の欠失部位に、付加的な8アミノ酸を得た（Pro Arg Gly Pro Gly Ala Pro Gly；SEQ ID NO: 9）。

変異hyaE断片を、プラスミドpBCSK(Stratagene Inc.)の複数クローニング部位内のEcoRI部位にサブクローニングし、つづいて、隣接するBamHI部位にそれぞれTn903カナマイシン耐性要素を挿入して、pBCSKΔhyaEkan ^r 1059およびpBCSKΔhyaEkan ^r 1062を作製した。 置換プラスミドの構築は、1059 および1062のBssH2作製ΔhyaEkan ^r断片を、pBCSK(Stratagene Inc.) のBssH2部位から切りだしたpBB192の1.2kb温度感受性複製起点とライゲーションすることにより完成した。 米国特許第5,840,556号参照。 ColE1起点はパスツレラ・ムルトシダにおいては不活性であるので、プラスミドp192oriΔhyaEkan ^r 1059またはp192oriΔhyaEkan ^r 1062を作製するライゲーション産物のみが、宿主中で複製可能であった。

置換プラスミドを、エレクトロポレーションによって適当なパスツレラ・ムルトシダ株に導入した。 細胞をコロンビアブロス中で増殖させ、その後、以下の工程によって、エレクトロポレーションのための調製を行なった。 増殖物を、5000×gで15分間の遠心分離によってペレット状にし、0℃の272 mMショ糖 100 mlで一回洗浄した。 細胞ペレットを氷上で再懸濁した（1：3 濃縮細菌：272 mMショ糖）。 コンピテント細菌(100μl)を、0.1 cmエレクトロポレーションキュベット(Bio-Rad)中で、HhaIによりインビトロでメチル化されたまたはメチル化されていないプラスミドDNA（200 ng）と混合した。 DNAの添加後すぐに、18,000 V/cm、800オーム(ohm)、および25 mFdで、結果として生じる（resultant）時間定数が11 msecから15 msecの範囲で、細胞をエレクトロポレーションした(Gene pulser, Bio-Rad)。

コロンビアブロス(1 ml、0 ℃)を、エレクトロポレーションされた細胞に添加し、再懸濁物を25 ℃で約25分間インキュベーションした。 30 ℃で2時間、細胞を回復させ、その後50 μg/mlのカナマイシンを含むコロンビア寒天プレート上に蒔いた。 コロニーは、30 ℃で24時間インキュベーションした後、目で見ることができた。 形質転換細胞を、カナマイシンを含むブロス中、30 ℃で一晩増殖させた。 その後、細胞を、50 μg/mlのカナマイシンを含むブドウ糖スターチ寒天プレートに蒔き、3 ℃で24時間増殖させた。

組み込まれたプラスミドを保有する細胞は、プラスミド複製に対する非許容温度での抗生物質選択を生き残り、置換プラスミドの組み込みにより無莢膜形質がもたらされたことから、同定されることができた。 ブドウ糖スターチ寒天プレート上で増殖した菌株1059および1062の莢膜および無莢膜のパスツレラ・ムルトシダコロニーの間の区別が、容易に成し遂げられた。 二つの菌株の野生型莢膜コロニーは、主要莢膜成分であるヒアルロン酸を保有するが、これは、コロニーを外見上粘液性にする。 斜角透過光下で見ると、これらのコロニーは真珠のような玉虫色を呈する。 対して、無莢膜の一重交叉（single-crossover）変異体は非粘液性であり、かつ玉虫色ではない。

一重交叉変異体を、抗生物質非添加コロンビアブロス5 mlに移し、染色体からプラスミドを分離するために、30 ℃で一晩培養した。 増殖物を、抗生物質非添加のブドウ糖スターチ寒天プレートに移し、38 ℃で12時間培養した。 二重交叉変異体を同定するための初期試験は、無莢膜と考えられた細胞の、抗生物質含有または非含有いずれかのブドウ糖スターチ寒天プレート上でのレプリカ平板アレイ、および38 ℃での細胞増殖を含んでいた。 抗生物質プレート上で増殖できなかった無莢膜コロニーを、hyaEのフォワードプライマーおよびリバースプライマーを用いたPCR解析に供した。 アガロースゲル電気泳動を用いて、PCR産物のサイズを野生型親株のサイズと比較した。

パスツレラ・ムルトシダ1059および1062hyaE欠失変異体候補はまた、カナマイシン耐性遺伝子の存在についても分析された。 「完全な」hyaE欠失を保有すると推定される変異体は、抗生物質耐性配列を欠いていた。 二つのhyaE変異体が無莢膜形質を保有することを確認するために、ディスク拡散酵素アッセイ法(Kirby-Bauer試験、Bauerら、Am. J. Clin. Path. 45, 493-96, 1966)およびインディアンインク染色アッセイ法(Collins および Lyne, MICROBIOLOGICAL METHODS, Butterworths, Boston, Mass., 1976, p.110) が用いられた。

実施例2
1059ΔhyaEパスツレラ・ムルトシダ株による七面鳥ヒナのワクチン接種
1059ΔhyaEパスツレラ・ムルトシダ株の弱毒化を、3週齢の七面鳥ブロードブレステッドホワイト（broad-breasted white）のヒナにおいて評価した。 トリプチカーゼ(trypticase)ブロス中（0.1 ml）に懸濁した、野生型または不莢膜変異体の対数増殖期の培養物の10倍段階希釈液を、4羽のヒナからなる群に筋肉内注射した。 ヒナを、接種後7日間観察した。

LD ₅₀値（すなわち、半数のヒナを殺すのに必要な細菌の量）は、野生型菌株を注射したヒナに対しては微生物数10 ³未満であり、hyaE変異体を注射したヒナに対しては微生物数10 ⁷を上回った。

実施例3
1062ΔhyaEパスツレラ・ムルトシダ株による去勢子牛のワクチン接種 約500ポンドのホルスタイン去勢子牛6頭を、1062ΔhyaEパスツレラ・ムルトシダ無莢膜変異体に曝露した。 菌株は、首内への皮下注射(10 ⁸ cfu)または試料の追肥(10 ⁹ cfu)のいずれかによって投与された。

いずれの曝露に対しても副作用は観察されなかった。 粘膜ワクチン接種群では、試験の残り期間 (5週間)内に、口蓋扁桃中でコロニー形成した。 病原性親株 (15 ml中に総投与量10 ¹⁰ cfu) による気管内接種は、対照群の子牛において一過性（1〜2日）の発熱を誘発したが、対照群またはワクチン接種群においては、接種後10日間に肺炎性の変化をほとんどまたは全く誘起しなかった。