유전자 변형된 면역계를 가지는 유제류

유전자 변형된 면역계를 가지는 유제류{UNGULATES WITH GENETICALLY MODIFIED IMMUNE SYSTEMS}

본 출원은 2004년 10월 22일에 출원된 미국 가출원 제 60/621,433호를 우선권으로 주장하며, 이것은 여기에 참조로 전체적으로 인용된다.

본 발명은 기능적 내부 면역글로블린 부위의 발현이 결핍된 유제 동물, 조직 및 기관뿐 아니라 그러한 동물, 조직 및 기관으로부터 유래한 세포 및 세포주를 제공한다. 본 발명은 또한 인간과 같은 이종 면역글로블린 부위를 발현하는 유제 동물, 조직 및 기관뿐 아니라 그러한 동물, 조직 및 기관으로부터 유래한 세포 및 세포주를 제공한다. 본 발명은 나아가 돼지의 중쇄 및 경쇄 면역글로블린의 돼지 게놈 DNA 서열과 같은 유제동물을 제공한다. 그러한 동물, 조직, 기관 및 세포는 연구 및 의학적 치료에서 사용될 수 있다. 추가로, 그러한 동물, 기관, 조직 및 세포를 제조하는 방법을 제공한다.

항원은 생체에서 "외부"로 인식될 수 있는 제제 또는 기질이다. 예를 들면 세균의 세포벽 구성성분과 같이 항원으로 작용하는 것은 종종 큰 외부 물질의 상대적으로 작은 화학적 그룹이다. 탄수화물도 약한 항원으로 작용할 수 있지만, 대부 분의 항원은 단백질이다. 세균, 바이러스 및 다른 미생물이 일반적으로 많은 항원을 포함하며, 화분, 먼지 진드기, 곰팡이, 음식 및 다른 물질들도 그러하다. 생체는 항체를 만듬으로써 항원에 반응한다. 항체 (또한 소위 면역글로블린 (Igs))은 항원 또는 외부 단백질과 결합하는 면역 시스템의 세포에 의해 제조되는 단백질이다. 항체는 혈액의 혈청을 순환하며 외부 항원을 검출하며 혈액 단백질의 감마 글로블린 부분을 구성한다. 이러한 항체들은 조각 그림 맞추기의 두 조각, 항원/항체 복합체, 또는 면역 복합체와 같이 화학적으로 매우 특정한 수단으로 항원과 상호작용한다. 이러한 결합은 항원을 중화시키거나 항원의 파괴를 일으킨다.

척추동물이 항원을 만나면, 초기 체액성 면역 반응이 일어난다. 동물이 몇일 후에 동일한 항원을 만나게 되면, 면역반응은 더욱 빠르고 더 거대해진다. 초기 만남(encounter)은 특정 면역 세포 (B-세포) 클론의 증식 및 분열을 유발한다. 결과(progeny) 림포구는 작동세포 (항체 생성 세포)뿐만 아니라, 최초 항원에 의한 추후의 자극에 작동세포 및 기억세포를 생산할 수 있는 능력을 보유하는 기억세포의 클론 또한 포함한다. 작동세포는 단지 몇일 동안 생존한다. 기억세포는 일생동안 생존하며, 동일한 항원에 대한 두번째 자극에 의해 재활성화될 수 있다. 그러므로, 항원이 두번째 인식되었을 때, 이러한 기억세포가 다량의 항체를 급속하게 생산하는 작동세포를 빠르게 생산한다.

매우 특정한 수단으로 항원과 상호작용하는 항체의 독특한 능력을 이용하여, 항체가 진단 및 치료 용도로 제조 및 이용될 수 있는 분자로 개발되어왔다. 항원 에피토프에 결합할 수 있는 독특한 능력 때문에, 다클론항체 및 단클론항체가 에피 토프를 가지고 있는 분자를 동정하기 위해서 사용될 수 있거나, 그 자체에 의해 또는 다른 부분과 접합하여 진단 또는 치료를 위한 특정 부위를 나타낼 수 있다. 다클론항체 및 단클론항체는 실직적으로 어떤 병원균 또는 생물학적 타겟에 대하여 생산될 수 있다. 용어 다클론항체는 일반적으로 다양한 아이소형 및 특이적 병원균-특이적 항체를 포함하는 면역 혈청을 말한다. 대조적으로, 단클론항체는 하나의 아이소형이 하나의 특이성을 나타내는 단일 면역글로블린 형으로 이루어진다.

1890년에, Shibasaburo Kitazato와 Emil Behring는 면역이 면역 동물의 혈청이 비면역 동물로 전달됨으로써 하나의 동물로부터 다른 동물로 전달될 수 있다는 것을 증명하는 기초적인 실험을 수행하였다. 이 획기적 실험은 수동적 면역법의 임상으로의 도입에 관한 기초를 성립했다. 그러나, 큰 규모 혈청 치료는 1940년대에 이종 혈청의 주입 및 효율적 항생제 화학요법의 도입과 연관된 독성 때문에 포기되었다. 최근에는, 그러한 다클론항체 치료가 면역글로블린-결핍 환자에서 대체 치료, 몇 가지 바이러스 (예를 들면, 공수병, 홍역, A 및 B형 간염, 수두)에 대한 노출 후의 예방, 및 독소 중화 (디프테리아, 파상풍, 및 보툴리누스 중독)와 같은 상대적인 몇몇 상황에서 감염 질병을 치료할 수 있는 것으로 알려져 있다. 혈청 요법의 제한된 용도에도 불구하고, 미국에서는 인간 항체의 16미터톤 이상이 정맥 항체 요법을 위하여 매년 얻어진다. 용도가 비슷한 수준으로 가장 산업화된 국가의 경제에 존재하며, 수요가 개발 국가에서 급속하게 증가할 것으로 예상될 수 있다. 근래에는, 수동적 면역법을 위한 인간 항체가 공급자의 모아진 혈청으로부터 얻어진다. 그러므로, 치료적 및 예방적 요법에 이용가능한 인간 항체의 양에 있어 서 고유의 제한이 있다.

생물학적 교전 제제에 대한 수동적 면역을 위한 항체의 이용은 매우 유망한 방어 전략을 나타낸다. 그러한 제제에 대한 방어의 최종 라인은 노출된 개인의 면역 시스템이다. 생물학적 무기에 대한 최근 방어 전략은 향상된 역학적 감시, 예방접종, 및 항균제와 같은 측정을 포함한다. 생물학적 교전 및 생화학 테러의 잠재적 위협이 반대로 목표화된 인구에서 면역된 사람의 수와 비례하기 때문에, 생물학적 제제는 단지 감염가능한 사람의 실질적인 부분의 인구에 대하여 잠재적인 무기이다.

예방접종은 특정 위협에 대하여 인구의 감수성을 감소시킬 수 있으며, 안전한 백신의 존재는 보호적 반응을 유도할 수 있다. 불행하게도, 예방접종에 의해 유도된 보호적 반응은 노출 및 질병의 발병 사이의 시간보다 긴 시간이 걸린다. 게다가, 많은 백신이 보호적 면역 반응이 발생하기 위하여 다수의 복용이 필요하다. 여기서 보호적 면역 반응은 응급상황에서 공격 후 급속한 예방을 공급하기 위해서 그들의 유용성이 제한된다. 게다가, 모든 백신 수급인이 권고된 면역법 스케쥴을 받은 이후에도 보호적 반응을 달성하지는 못한다.

약물은 어떠한 제제에 노출된 후 주입되었을 때 보호를 공급할 수 있다. 그러나 생물학적 교전의 수많은 잠재적 제제에 대해 이용가능하지는 않다. 근래에는, 어떠한 작은-분자 약물도 미리 형성된 독소에 노출된 결과로 인한 질병을 방지하기에 이용가능하지 못하다. 단지 즉각적인 면역 상태를 제공할 수 있는 근래에 이용가능한 중재는 보호적 항체의 수동적 면역법이다 (Arturo Casadevall "Passive Antibody Administration (Immediate Immunity) as a Specific Defense Aganist Biological Weapons" from Emerging Infectious Disease, Posted 09/12/2002).

보호적 면역을 제공하는 것에 더불어, 최신 항체에 기초한 치료는 새롭게 나타난 병원성 세균, 곰팡이, 바이러스 및 기생충에 대하여 잠재적으로 유용한 옵션을 구성한다 (A. Casadevall and MDScharff, Clinical Infectious Diseases 1995; 150). 악성 종양 및 종양 환자의 치료 (C. Botti et al, Leukemia 1997; Suppl 2:S55-59; B. Bodey, SE Siegel, and HE Kaiser, Anticancer Res 1996; 16(2):661), 자가면역질환 뿐만 아니라 이식된 기관의 스테로이드 저항성 거부반응의 치료는 또한 단클론항체 또는 다클론항체 제제의 이용을 통하여 달성될 수 있다 (N. Bonnefoy-Berard and JPRevillard, J Heart Lung Transplant 1996; 15(5):435-442; C. Colby, et al Ann Pharmacother 1996; 30(10):1164-1174; MJDugan, et al, Ann Hematol 1997; 75(1-2):41 2; W. Cendrowski, Boll Ist Sieroter Milan 1997; 58(4):339-343; LKKastrukoff, et al Can J Neurol Sci 1978; 5(2):175178; JE Walker et al J Neurol Sci 1976; 29(2-4):303309).

항체 생산 기술에 있어서 최근의 진보는 인간 항체 시약을 제조하기 위한 수단을 제공한다. 반면 인간 혈청 용법과 연관된 독성을 피할 수 있다. 항체에 기초한 치료의 이점은 변통성(versatility), 낮은 독성, 병원균 특이성, 면역 기능 증가 및 알맞은 약물동력을 포함한다.

단클론항체 치료의 임상적 용도는 최근에 나타났다. 단클론항체는 현재 장기이식, 종양, 감염성 질병, 심혈관계 질환 및 염증에서 치료로 승인받았다. 다수 의 단클론항체가 넓은 범위의 질병 증상을 치료하기 위한 임상 시도의 마지막 단계에 있다. 결과적으로, 단클론항체는 최근에 개발중인 가장 큰 약물 분류 중 하나를 나타낸다.

치료용으로 단클론항체의 최근 인기에도 불구하고, 그것의 사용에는 몇가지 장애물이 존재한다. 예를 들면, 단클론항체에 대한 많은 치료적 용도는 특별히 자가면역 또는 종양과 같은 만성적 질병에 대한 반복적 주입이 필요하다. 쥐가 면역화에 편리하며 대부분 인간 항원을 외부물로 인식하기 때문에, 인간에 대한 치료적 가능성을 가지는 단클론항체는 뮤린 기원인 것이 전형적이다. 그러나, 뮤린 단클론항체는 인간 치료용으로 고유의 단점이 있다. 예를 들면, 그것은 인간 항체에 비해 인간에서 짧은 순환 반감기 때문에 단클론항체의 치료적 수준을 유지하기 위해서는 더욱 자주 복용할 필요가 있다. 더욱 결정적으로, 뮤린 면역글로블린의 반복적 주입은 인간 면역 시스템이 쥐 단백질을 외부물로 인식하고, 심각한 알러지 반응을 유발할 수 있는 인간 항-마우스 항체 반응을 일으킬 수 있는 가능성을 발생시킨다. 감소된 효용성 및 안정성의 가능성은 뮤린 단클론항체의 면역원을 감소시키기 위하여 수많은 기술의 개발을 유도하였다.

다클론항체는 다수의 항원성 표적에 대하여 매우 강력하다. 그것은 복합적 질병과 연관된 "진화하는 표적"의 과반수를 표적화하고 죽일 수 있는 독특한 능력을 가진다. 또한, 모든 약물 분류에서, 단클로항체는 항원 변이의 경우 활성을 유지할 가장 높은 가능성을 가진다. 게다가, 단클론항체는 감염성 제제에 대하여 제한된 치료적 활성을 가지지만, 다클론항체는 독소를 중화시킬 수 있고 생물학적 교 전 제제뿐 아니라, 병원균을 제거하기 위한 면역 반응을 나타낼 수 있다.

생산력의 미래 수요를 충족시키기 위하여 다클론항체 및 단클론항체 채굴대(production platforms)의 개발은 최근 많은 연구의 주제인 장래성 있는 영역을 나타낸다. 한가지 특별히 장래성 있는 전략은 인간 면역글로블린 유전자를 쥐 또는 다른 가축에 도입하는 것이다. 이 기술의 확장은 그들의 내부 면역글로블린 유전자의 비활성화를 포함한다. 양, 돼지 및 소와 같은 큰 동물은 모두 최근에 인간에 대한 과다면역 혈청 및 응고인자와 같은 혈장 유래물의 생산에 사용된다. 이것은 안정성 및 윤리성에서 그러한 종으로부터 인간 다클론항체의 사용을 지원할 수 있다. 각각의 종은 자연적으로 혈청 및 우유에서 상당한 양의 항체를 생산한다.

면역글로블린을 암호화하는 유전자의 배열

항체 분자는 가변 유전자 요소의 조합으로부터 조립되며, 생식 계열에서 다수의 가변 유전자 요소의 조합으로 인한 가능성은 숙주가 다수의 드문(extraordinary) 항원에 대한 항체를 중합할 수 있게 한다. 각 항체 분자는 경쇄(L) (카파(κ) 경쇄 또는 람다(λ) 경쇄가 될 수 있다) 및 중쇄(H)의 두 분류의 폴리펩타이드 체인으로 이루어진다. 중쇄 및 경쇄는 서로 결합하여 에피토프에 대한 결합 부위를 나타낸다. 단일 항체 분자는 두 개의 동일한 경쇄 및 중쇄를 가진다. 각 쇄는 가변 부위(V) 및 비가변 부위(C)로 구성된다. 가변 부위는 분자의 원 결합 위치로 구성된다. 다양한 항원 인식을 달성하기 위하여, 가변 부위를 암호화하는 DNA는 유전자 재배열을 겪게 된다. 비가변 부위 아미노산 서열은 항체를 생산하는 숙주뿐 아니라 특별한 항체의 아이소형에 대하여 특정적이며, 그러하여 재배열을 겪지 않는다.

비록 단 하나의 결합 현상이 경쇄 유전자를 생산하기 위하여 필요한 반면 두 개의 현상이 완전한 중쇄 유전자를 생산하기 위하여 필요하지만, 재배열 메카니즘은 중쇄 및 경쇄 부위의 가변 부위와 유사하다. 가장 공통적인 재배열 모드는 두 개 유전자 단편 사이에 DNA의 루핑 아웃(looping out) 및 결실과 포함한다. 이것은 두 유전자 단편의 코딩 서열이 DNA에서 동일한 방향일 때 일어난다. 재조합의 두번째 모드는 상반된 전사 방향을 가지는 두 유전자 단편 사이에서 발생할 수 있다. 비록 이러한 재배열이 모든 Vκ와 Jκ 결합의 절반까지 설명할 수 있으나, 이러한 재조합 모드는 덜 공통적이다. 인간 Vκ 유전자 단편의 절반은 전사적 방향이 Jκ 유전자 단편과 반대이다.

완전한 V 부위를 암호화하는 DNA 서열은 각각의 유전자 단편의 체세포적 재조합에 의해 제조된다. 면역글로블린 중쇄 또는 경쇄의 V 부위, 또는 V 영역은 하나 이상의 유전자 단편에 의해 암호화된다. 첫번째 단편은 경쇄의 첫번째 95-101 아미노산을 암호화하며, 이것이 V 영역의 대부분을 암호화하기 때문에 V 유전자 단편이라고 불린다. 두번째 단편은 V 영역의 리마인더(13 아미노산까지)를 암호하며, 결합(joining) 또는 J 유전자 단편이라고 불린다. V 및 J 유전자 단편의 결합은 경쇄 V 부위 전체를 암호화하는 지속적인 엑손을 만든다. 완전한 면역글로블린 경쇄 메신저 RNA를 만들기 위해서, V-부위 엑손이 전사 이후에 RNA 스플라이싱에 의해 C 부위 서열에 결합된다.

중쇄 V 부위는 세 개의 유전자 단편으로 암호화된다. V 및 J 유전자 단편 (경쇄의 V _L 및 J _L 의 그것과 구별하기 위하여 V _H 및 J _H 로 표시하는)에 더하여, V _H 및 J _H 사이에 있는 다이버시티 또는 D _H 유전자 단편으로 불리는 세번째 유전자 단편이 있다. 완전한 중쇄 V 부위를 생산하는 재조합 과정은 두 개의 별개의 단계에서 발생한다. 첫번째로, D _H 유전자 단편이 J _H 유전자 단편에 결합한다. 그 후 V _H 유전자 단편이 DJ _H 유전자 단편에 재배열되어 완전한 V _H 부위 엑손을 만든다. 경쇄 유전자처럼, RNA 스플라이싱은 조합된 V 부위 서열을 이웃의 C 부위 유전자에 결합시킨다.

항체 레퍼토리의 다양화는 두 단계에서 발생한다. 골수에 있는 전구 B 세포에서 Ig V, D 및 J 유전자 단편의 재조합("V(D)J 재조합")에 의하여 최초로, 그 후 체세포적 변이 및 성숙한 B 세포가 활성화되었을 때 재배열된 Ig 유전자의 클래스 스위치 재조합에 의하여 발생한다. 면역글로블린 체세포적 변이 및 클래스 스위칭은 면역 반응의 성숙 및 "기억" 반응의 생성에 중심적이다.

항체의 게놈 부위는 매우 크며, 그것은 다른 염색체에 위치한다. 면역글로블린 유전자 단편은 세 개의 무리 또는 유전적 부위(κ, λ 및 중쇄 부위)로 구성된다. 각각은 약간 다르게 구성된다. 예를 들면, 인간에 있어서 면역글로블린 유전자는 다음과 같이 구성된다. λ 경쇄 부위는 22번 염색체에 위치하며 V _λ 유전자 단편의 무리가 단일 C _λ 유전자에 연결된 J _λ 유전자 단편의 4개 세트가 이어진다. κ 경쇄 부위는 2번 염색체에 위치하며, V _κ 유전자 단편의 무리가 J _λ 유전자 단편의 무리, 그리고 단일 C _κ 유전자에 이어진다. V _H , D _H 및 J _H 유전자 단편의 무리와 C _H 유전자가 있는 14번 염색체 상에서 중쇄 부위의 구성은 κ 부위와 유사하다. 경쇄 부위는 한가지 중요한 방법에서 다르다. 단일 C 부위 대신, 이것은 다른 아이소형과 상응하는 순차적으로 배열된 C 부위 시리즈를 포함한다. 이것은 5개의 면역글로블린 중쇄 아이소형이다: IgM, IgG, IgA, IgE 및 IgD. 일반적으로, 세포는 Ig M으로 시작하여 동시에 단 하나를 발현한다. IgG와 같은 다른 아이소형의 발현은 아이소형 스위칭을 통하여 발생할 수 있다.

다양한 V, D, 및 J 유전자의 결합은 전반적으로 대략적으로 50,000 다른 가능한 VDJ(H) 조합 및 1,000개의 VJ(L)가 발생하는 무작위적인 현상이다. 그 후 중쇄 및 경쇄의 무작위적 페어링은 약 10 ⁷ 수의 항체 특이성을 발생시킨다. 다양성은 다른 유전적 단편의 막연한 결합에 의해 더욱 증가한다. 재배열은 모든 DNA 가닥에서 발생하지만, 단 한 가닥만이 전사된다 (대립유전자 배제로 인하여). DNA에 있어서 비가역적 결실로 인하여 B 세포의 일생에 있어서 단 한번의 재배열이 발생한다. 결과적으로, 각 성숙 B 세포는 하나의 면역적 특이성을 유지하며 자손 또는 클론으로 유지된다. 이것은 클론 선택의 분자적 기초를 구성한다; 예를 들면, 각 항원 결정기가 특이적 수용체 분자를 가지는 B 림프구의 이미 존재하는 클론의 반응을 유발한다. V(D)J 재조합에 의해 설립된 B 세포의 초기 레파토리는 기본적으로 근접하게 연결된 유전자, 재조합 활성화 유전자 (RAG)-1 및 RAG-2에 의해 조절 된다.

지난 10년 동안, Ig 유전자 다양성 및 항체 레파토리 개발에서 척추동물 사이의 상당한 다양성이 알려졌다. 설치류 및 인간은 5 분류의 중쇄, IgM, IgD, IgG, IgE 및 IgA를 가지며, 각각은 IgG의 4개의 소분류를 가지며 IgA의 한 개 또는 두 개의 소분류를 가진다. 반면에 토끼는 단일 IgG 중쇄 유전자를 가지나, 다른 IgA 소분류에 대한 13 유전자를 가진다 (Burnett, RC et al. EMBO J 8:4047; Honjo, In Honjo, T, Alt. FWTH eds, Immunoglobulin Genes p. 123 Academic Press, New York). 돼지는 적어도 6개의 IgG 소분류를 가지며 (Kacskovics, I et al. 1994 J Immunol 153:3565), IgD를 가지지 않는다 (Bulter et al. 1996 Inter. Immunol 8:1897-1904). IgD를 암호화하는 유전자는 단지 설치류 및 영장류에서 개시되어 왔다. 레파토리 메카니즘 개발에서 다양성은 닭, 토끼, 돼지 및 사육된 소에서 보고된 설치류 및 영장류에서 보여진 패턴과 반대로 예시된다. 전자 그룹은 7 내지 10 과(family)에 속하는 다수의 V _H 유전자를 가지는 반면 (Rathbun, G. In Hongo, T. Alt. FW and Rabbitts, TH, eds, Immunoglobulin Genes, p 63, Academic press New York), 후자 그룹의 각 구성의 V _H 유전자는 단일 V _H 유전자 과에 속한다 (Sun, J. et al. 1994 J.Immunol. 1553:56118; Dufour, V et al. 1996, J Immunol. 156:2163). 토끼는 예외로 하여, 이 과는 25 미만의 유전자로 구성된다. 설치류 및 영장류는 4 내지 6 J _H 단편을 이용할 수 있는 반면, 단일 J _H 는 닭에 있어서 레파토리 개발로 이용할 수 있다 (Reynaud et al. 1989 Adv. Immunol. 57:353). 유사하게, Bulter et al (1996 Inter. Immunol 8:1897-1904)는 돼지가 단일 J _H 유전자를 가지는 점에서 닭과 공통점이 있다고 가정하였다. 이러한 종은 일반적으로 적은 수의 V, D 및 J를 가진다; 돼지 및 소에는 20미만의 유전자 단편으로 이루어지는 단일 VH 유전자 과가 존재한다 (Bulter et al, Advances in Swine in Biomedical Research, eds: Tumbleson and Schook, 1996; Sinclair et al, J. Immunol. 159:3883, 1997). 적은 수의 J 및 D 유전자 단편과 함께, 이것은 유전자 재배열에 의해 제조되는 적은 다양성을 중요하게 발생시킨다. 그러나, 이러한 종에서 다수의 경쇄 유전자가 나타난다. 인간 및 쥐와 유사하게, 이러한 종에서 단일 κ 경쇄를 발현하지만, 다수의 λ 경쇄는 발현하지 못한다. 그러나, 이것은 재배열에 의해 달성되는 제한된 다양성에 영향을 주는 것으로 보이지 않는다.

100 이상의 V _H , 20-30 D _H 및 4 내지 6 J _H 유전자 단편의 조합적 결합은 인간에 있어서 항체 레파토리를 생산하는 주된 메카니즘이기 때문에, 적은 V _H , D _H 및 J _H 단편을 가진 종은 적은 레파토리를 생산하거나 레파토르 개발을 위한 대체적인 메카니즘을 이용하여야 한다. 이러한 종에 있어서, 이것은 중요한 2차적 레파토리 개발로 보여지며, 회장 페이어 패취(ileal Peyer's patch)와 같은 매우 특정화된 림프 조직에서 발생한다 (Binns and Licence, Adv. Exp. Med. Biol. 186:661, 1985). 2차적 레파토리 개발은 이러한 종에 있어서 무작위적 및 완전하게 이해되지 않은 과정으로 체세포 변이의 과정에 의해 발생한다. 이러한 레파토리 다양성에 대한 메카니즘은 주형화된 변이, 또는 유전자 전환 (Sun et al, J. Immunol. 153: 5618, 1994) 및 체세포 과다변이로 나타난다.

유전자 전환은 닭, 토끼 및 소와 같은 고등 척추동물에서 항체 다양성에 대해 중요하다. 그러나, 쥐에 있어서는 전환 현상이 내부 항체 유전자 사이에서 드물게 나타난다. 유전자 전환은 공급 항체 V 유전자 단편으로부터 수급 V 유전자 단편까지 상동 서열의 전달에 의해 특징화되는 독특한 다양한 메카니즘이다. 공급 및 수급 단편이 수많은 서열 차이를 가진다면, 유전자 전환이 단일 현상에 의해 V 부위로 서열 변이를 도입할 수 있다. 이러한 종에 있어서, 유전자 전환 현상은 B 세포 분열 동안 항원 노출 전 및/또는 후에 발생할 수 있다 (Tsai et al. International Immunology, Vol. 14, No. 1, 55-64, January 2002).

체세포 과다변이는 모든 고등 척추 동물에서 항체 유전자의 다양성을 달성한다. 항체 V(D)J 단편으로 단일 포인트 변이의 도입에 의해 나타내어 질 수 있다. 일반적으로, 과다변이는 항원성 자극에 의해 B 세포에서 활성화되는 것으로 나타난다.

인간화 면역 시스템을 가진 동물의 생산

인간 치료를 위하여 쥐에서 생산된 항체의 면역성을 감소시키기 위하여, 다양한 시도가 현재 인간화로 알려진 과정에 있어서 쥐 단백질 서열을 인간 단백질 서열로 교체하기 위하여 이루어졌다. 트랜스제닉 마우스가 그 자신의 면역글로블린 유전자가 기능적으로 인간 면역글로블린 유전자로 교체되어 면역법에 의해 인간 항체를 생산할 수 있도록 제작되었다. 마우스 항체 생산의 제거는 마우스 Ig 유전 자 재배열 및 발현 과정에 연관되는 결정적인 시스-활성 서열을 제거하는 유전자-타겟팅 기술을 사용하여 배아 줄기(ES) 세포에서 마우스 Ig 유전자의 비활성화로 달성되었다. 이러한 변이 마우스에 있어서 B 세포 성장은 인간 생식계-구성 H 및 κ L-체인 작은 부분 도입유전자 (transgene)을 포함하는 메가베이스-사이즈 YACs의 도입에 의해 회복될 수 있다. 트랜스제닉 마우스에서 인간 항체의 충분한 발현은 혈액에서 100ug/l 수준으로 우세하다. 이러한 발현 수준은 인간 Ig 유전자를 발현하는 천연형 마우스에서 감지되는 것보다 몇 백배 높은 것이다. 이것은 마우스에 의해 생산되는 인간 항체를 증가시키기 위하여 내부 마우스 Ig 유전자를 비활성화하여야 하는 중요성을 나타낸다.

첫번째 인간화 시도는 재조합 항체를 제작하기 위하여 이용된 분자 생물학 기술을 이용하였다. 예를 들면, 합텐(hapten)에 특이적인 마우스 항체로부터 상보성 결정부위(CDR)이 인간 항체 구조로 이식되었으며, CDR 교체를 나타냈다. 새로운 항체는 CDR 서열에 의해 옮겨지는 결합 특이성을 보유했다 (PT Jones et al. Nature 321: 522-525 (1986)). 인간화의 다음 수준은 전체적인 마우스 VH 부위를 감마와 같은 인간 비가변 부위로 조합하는 것을 포함하였다 (SLMorrison et al., Proc. Natl. Acad. Sci., 81, pp. 6851-6855 (1984)). 그러나, 이러한 30% 이상의 이종 서열을 포함하는 키메릭 항체는 때때로 단지 최저 면역성보다 낮은 총괄적인 이종 항체이다 (M. Bruggemann et al., J. Exp. Med., 170, pp. 2153-2157 (1989)).

결과적으로, 시도는 인간 면역글로블린 유전자를 마우스에 도입하는 것으로 수행되었으며, 그리하여 인간 서열을 가지는 항체를 가지는 항원에 반응할 수 있는 트랜스제닉 마우스를 제조하였다 (Bruggemann et al. Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 86:6709-6713 (1989)). 인간 면역글로블린 게놈 부위의 큰 사이즈 때문에, 이러한 시도는 이용가능한 클로닝 비히클에 의해 안전하게 유지될 수 있는 DNA 양에 의해 제한되는 것으로 생각되었다. 결과적으로, 많은 연구자들이 제한된 수의 V 부위를 포함하는 미니-부위를 생산하고 자연적 또는 생식계 구성과 비교하여 유전자 사이에 변형된 공간적 거리를 가지는 것에 집중하였다 (예를 들어, US Pat. No. 5,569,825). 이러한 연구는 마우스에서 인간 서열 항체의 생산이 가능하지만, 증가하는 항체 요법의 수요를 충족시키기 위하여 이러한 트랜스제닉 동물로부터 다양한 결합 특이성 및 작동 기능 (아이소형)을 얻는 것을 고려할 때 심각한 장애가 남아있다.

추가적인 다양성을 제공하기 위하여, 연구가 인간 Ig 부위의 거대한 생식계 절편을 트랜스제닉 포유동물에 첨가하는 것으로 이루어졌다. 예를 들면, 동일한 간격으로 배열된 인간 V, D 및 J 부위 유전자의 다수는 인간 게놈의 배열되지 않은 생식계에서 발견되며, 인간 Cμ 및 Cδ 비가변 부위가 효모 인공적 염색체 (YAC) 클로닝 벡터를 이용하여 마우스에 도입되었다 (예를 들면, WO 94/02602). 인간 감마-2 비가변 부위 및 클래스-스위치 재조합에 필요한 상류 서열을 암호화하는 서열을 포함하는 22Kb DNA 절편은 나중에 이전의 도입유전자에 부착되었다. 게다가, 또한 인간 게놈의 재배열되지 않은 생식계에 있어서 발견되는 실질적으로 동일한 간격으로 배열된 Vκ, Jκ 및 Cκ 부위 유전자를 포함하는 인간 카파 부위 부분이 YACS를 이용하여 마우스에 도입되었다. 유전자 타겟팅이 뮤린 IgH 및 카파 경쇄 면역글로블린 유전자 부위를 비활성화시키기 위하여 사용되었으며, 그러한 넉아웃 균주는 비활성화된 뮤린 면역글로블린 상황에서 인간 Vκ, Jκ 및 Cκ 부위 유전자뿐 아니라, 인간 V, D, J, Cμ, Cδ 및 Cγ2 비가변 부위를 가지는 마우스 라인을 제조하기 위하여 상기의 트랜스제닉 균주로 사육되었다 (예를 들면, PCT patent application WO94/02602 to Kucherlapati et al.; see also Mendez et al., Nature Genetics 15:146-156 (1997)).

내생 로커스(loci)의 유전자 타겟팅과 컴비네이션된 클로닝 벡터로서의 효모 인공 크로모좀 및 트랜스제닉 마우스 스트레인의 브리딩(breeding)은 항체 다양성의 문제에 대한 한 해결책을 제공한다. 몇 가지의 장점은 상기 접근법으로 인해 얻어진다. 한 가지 장점은 YAC가 DNA의 수백 킬로베이스를 숙주 세포내로 트랜스퍼하는데에 사용될 수 있다는 점이다. 그러므로, YAC 클로닝 전달체의 사용으로 인하여 전체 인간 Ig 해비 및 라이트 체인 부위의 상당 부분이 트랜스제닉 마우스내로 함입(inclusion)되게 함으로써 인간에게 유용한 잠재적 다양성의 레벨에 도달하게 된다. 상기 접근법의 또 다른 장점은 많은 수의 V 유전자들이 뮤린 이뮤노글로불린 생산이 결핍된 마이스에서 풀(full) B 세포의 발달이 복구되는 것으로 나타났다는 점이다. 이는 이러한 개조된 마우스가 임의의 주어진 이뮤노젠에 대해 강화된 인간 항체 반응을 축적하기 위한 필수 세포를 제공하게 한다. (예를 들면, WO 94/02602.; L. Green and A. Jakobovits, J. Exp. Med. 188:483-495 (1998)참조). 또 다른 장점은 효모에서 고빈도 상동재조합(high frequency homologous recombination)을 사용하여 YAC 상에서 서열을 제거하거나 삽입할 수 있다는 점이다. 이는 YAC 트랜스유전자를 손쉽게 엔지니어링할 수 있게 해준다.

덧붙여, Green et al. NaturejGenetics 7:13-21 (1994)에서는, 핵심 가변부 및 불변부를 함유하는 인간 해비 체인 로커스 및 카파 라이트 체인 로커스에 각각 245 kb 및 190 kb-크기의 점라인 배열(germline configuration)을 함유하는 YAC의 발생에 대해 개시하고 있다.

그린 등의 연구에 의하면, 최근 인간 해비 체인 로커스 및 카파 라이트 체인 로커스의 메가베이스 크기의, 점라인 배열 YAC 조각 각각을 도입하여 인간 항체 레퍼토리를 대략 80% 이상 신장시켰으며, XenoMouse™을 생산하였다. 예를 들면, Mendez et al. Nature Genetics 15:146-156 (1997), Green and Jakobovits J. Exp. Med. 188:483-495 (1998), European Patent No. EP 0 463 151 Bl, PCT Publication Nos. WO 94/02602, WO 96/34096 and WO 98/24893 참조.

인간 항체를 생산하는 포유류를 발생시키는 몇 가지 방법이 존재한다. 특히, "미니로커스(minilocus)" 접근법이 있는데, GenPharm International, Inc. 및 Medical Research Council에서 전형화한 방법이며, Abgenix, Inc.(기존의 Cell Genesys)가 전형화한 Ig 로커스의 거대한 실질적으로 점라인인 조각의 YAC 도입이다. 이러한 전제 또는 실질적으로 전체 로커스의 마이크로셀 퓨전을 사용한 도입은 Kirin Beer Kabushiki Kaisha에 의해 전형화되었다.

미니로커스 접근법에 있어서, 외인성 Ig 로커스는 Ig 로커스로부터의 조각들(각각의 유전자)의 함입을 통해 모방된다. 따라서, 하나 이상의 VH 유전자, 하 나 이상의 DH 유전자, 하나 이상의 J _H 유전자, mu 불변부, 및 2차 불변부 (예컨대 감마 불변부)는 동물내로 삽입되기 위한 작재물내에 형성된다. US Patent Nos. 5,545,807, 5,545,806, 5,625,825, 5,625,126, 5,633,425, 5,661,016, 5,770,429, 5,789,650, 5,814,318, 5,591,669, 5,612,205, 5,721,367, 5,789,215, 5,643,763; European Patent No. 0 546 073; PCT Publication Nos. WO 92/03918, WO 92/22645, WO 92/22647, WO 92/22670, WO 93/12227, WO 94/00569, WO 94/25585, WO 96/14436, WO 97/13852, and WO 98/24884; Taylor et al. Nucleic Acids Research 20:6287-6295 (1992), Chen et al. International Immunology 5:647-656 (1993), Tuaillon et al. J. Immunol. 154:6453-6465 (1995), Choi et al. Nature Genetics 4:117-123 (1993), Lonberg et al. Nature 368:856-859 (1994), Taylor et al. International Immunology 6:579-591 (1994), Tuaillon et al. J. Immunol. 154:6453-6465 (1995), and Fishwild et al. Nature Biotech. 14:845-851 (1996) 참조.

마이크로세포 퓨전 접근법에서, 전제 또는 부분적 인간 크로모좀이 마우스내로 도입될 수 있다 (예컨대 European Patent Application No. EP 0 843 961 Al 참조). 이 접근법으로 발생한 인간 Ig 해비 체인 로커스를 함유하는 마우스는 보통 인간 불변부 유전자를 하나 이상, 및 잠재적으로 모두 포함한다. 상기 마우스는 그러므로 다수의 다른 불변부를 갖는 특정 항원에 결합하는 항체를 생산할 것이다.

마우스는 인간에 있어서, 인간 이뮤노글로불린의 발현을 위한 가장 개발된 동물로 남아있으나, 최근 기술적 진보로 인하여 이러한 기술을 소와 같은 다른 동물에 적용하기 시작하는 등의 진보가 이루어졌다. 마우스에의 통상의 접근법은 마우스의 엠브리오닉 줄기세포를 유전적으로 변형시켜 뮤린 이뮤노글로불린을 녹-아웃시키고, 인간 이뮤노글로불린을 함유하는 YAC을 ES 세포 내로 삽입하는 것이었다. 그러나, ES 세포는 소 또는 다른 큰 동물, 예컨대 양 및 돼지에는 유용하지 않다. 따라서, 이뮤노글로불린 유전자가 녹-아웃된, 인간 항체를 발현하는 거대한 동물을 발생시키기 위한 가능성이 존재하는 몇 가지 기본적인 개발이 이루어졌다. 유전적으로 변형된 동물을 발달시키기 위한 ES 세포 조정(manipulation)에 대한 대안은 유전적으로 변형된 체세포를 이용한 클로닝이다. 핵 트랜스퍼를 위한 유전적으로 변형된 체세포를 이용한 클로닝만이 최근 달성되었다.

1997년 (Wilmut, L, et al (1997) Nature 385: 810-813) 성인 체세포로부터 탄생한 돌리(복제양)이 발표된 이래, 소(cattle)를 포함한 유제동물(ungulates)(Cibelli, J et al 1998 Science 280: 1266-1258; Kubota, C. et al.2000 Proc. Natl. Acad. Sci 97: 990-995), 염소 (Baguisi, A. et al., (1999) Nat. Biotechnology 17: 456-461), 및 돼지 (Polejaeva, IA, et al. 2000 Nature 407: 86-90; Betthauser, J. et al. 2000 Nat. Biotechnology 18: 1055-1059)가 복제되었다.

다음 기술적 진보는 핵 트랜스퍼에 우선하여 세포를 유전적으로 변형시켜 유전적으로 변형된 동물을 생산하는 기술의 개발이다. PPL 치료를 위한 PCT publication No. WO 00/51424에는 핵 트랜스퍼를 위한 체세포의 타겟팅된 유전적 변형이 개시되어 있다.

상기 기본적인 개발에 이어서, 유전자의 단일 및 이중 대립유전자 녹-아웃 및 이러한 변형이 된 살아있는 동물의 탄생이 보고되었다. 2002년과 2004년 사이, 세 가지 독립적 그룹, Immerge Biotherapeutics, Inc.는 the University of Missouri와의 공동연구로 (Lai et al. (Science (2002) 295: 1089-1092) & Kolber-Simonds et al. (PNAS. (2004) 101(19):7335-40)), Alexion Pharmaceuticals (Ramsoondar et al. (Biol Reprod (2003)69: 437-445) 및 Revivicor, Inc. (Dai et al. (Nature Biotechnology (2002) 20: 251-255) & Phelps et al. (Science (2003) Jan 17;299(5605):411-4))는 목표하는 유전적 결손을 가진 체세포로부터 핵을 트랜스퍼하여 알파-1,3-GT 유전자의 한 대립유전자 또는 양 대립유전자가 결핍된 돼지를 생산하였다. 2003년, Sedai et al. (Transplantation (2003) 76:900-902)은 소의 알파-1,3-GT 유전자의 한 대립유전자를 목표로한 파괴(disruption)를 보고하였고, 이어서, 유전적으로 변형된 세포의 핵의 핵 트랜스퍼 및 트랜스제닉 태아의 생산에 성공하였다.

따라서, 거대 동물에서 이뮤노글로불린 유전자의 녹킹-아웃 및 인간 이뮤노글로불린 로커스를 그들의 세포내로 삽입하는 것의 실행가능성은 현재 개발이 시작된 단계이다. 그러나, 이뮤노글로불린 유전자의 복잡성 및 종의 다양성으로 인해, Ig 카파, 람바 및 해비 체인의 유전적 서열 및 배열은 대부분의 종에 있어 그 이해가 부족한 상황이다. 예를 들면, 돼지의 경우, 부분적인 유전적 서열 및 조직(organization)만이 해비 체인 불변 알파, 해비 체인 불변 mu, 및 해비 체인 불 변 델타에서 발견된 상태이다 (Brown and Butler MoI Immunol. 1994 Jun;31(8):633-42, Butler et al Vet Immunol Immunopathol. 1994 Oct;43(l-3):5-12, and Zhao et al J Immunol. 2003 Aug l;171(3):1312-8).

소의 경우, 이뮤노글로불린 해비 체인 로커스가 맵핑되었으며 (Zhao et al. 2003 J. Biol. Chem. 278:35024-32) 소의 카파 유전자에 대한 cDNA 서열이 알려졌다 (예를 들면, US Patent Publication No. 2003/0037347 참조). 또한, 대략 4.6kb의 소의 mu 해비 체인 로커스가 시퀀싱되었고, 소의 mu 해비 체인의 하나의 또는 양 대립유전자가 파괴되어 해비 체인 이뮤노글로불린의 발현이 감소된 트랜스제닉 송아지가 탄생되었다. 또한, 인간 Ig H-체인 및 K L-체인 전체의 비조정된(unarrange) 서열을 포함하는 포유류 인공 크로모좀(MAC) 벡터가 소의 태아상태의 파이브로블라스트 세포의 마이크로셀-매개 크로모좀 트랜스퍼 및 핵 트랜스퍼 기술로 소 (TC 소)내로 도입되었다 (예를 들면, Kuroiwa et al. 2002 Nature Biotechnology 20:889, Kuroiwa et al. 2004 Nat Genet. Jun 6 Epub, US Patent Publication Nos. 2003/0037347, 2003/0056237, 2004/0068760 and PCT Publication No. WO 02/07648 참조).

인간 이뮤노글로불린을 발현하는 소의 생산에 있어서는 현저한 진보가 있었으나, 다른 거대 동물, 예컨대 양, 염소 및 돼지에 있어서는 그 성취정도가 미미하였다. 비록 양, 염소 및 돼지의 이뮤노글로불린 유전자에 대한 cDNA 서열 정보를 GenBANK에서 쉽게 얻을 수 있지만, 광범위하게 재배열 된 이뮤노글로불린 로커스의 유니크한 성질은 mRNA(또는 cDNA)에 존재하는 것으로 알려진 서열을 넘어 특성화될 필요가 있다. 이뮤노글로불린 로커스는 모듈적이고(modular), 코딩 부위는 잉여적이며(redundant), 공지된 코딩 부위의 결손은 로커스의 기능이 변형되는 것을 보증하지 않는다. 예를 들면, 만약 하나가 해비 페인의 가변부의 코딩 부위에서 결손되었다고 한다면, 그 로커스의 기능은 현저하게 변형되지는 않는데, 그 이유는 수백개의 다른 기능성 가변부 유전자가 그 부위에 남아있기 때문이다. 그러므로, 우선 잠재적 "아킬레스 건"을 발견하기 위하여 로커스를 특성화하여야 한다.

소에 있어, 인간 항체를 발현하는 진보에 불구하고, 더 큰 도전이 남아있으며, 이는 내생 소의 Ig 유전자의 불활성화, 인간 항체의 발현 레벨 증가, 및 이뮤노글로불린 유전자의 서열 및 배열에 대해 잘 알려지지 않은 다른 거대 동물, 예컨대 돼지에 있어서 인간 항체 발현과 같은 도전이 남아있다.

따라서, 본원 발명의 목적은 유제동물의 이뮤노글로불린 점라인 유전자 서열의 배열을 제공하는 것이다.

본원 발명의 또 다른 목적은 새로운 유제동물의 이뮤노글로불린 유전 서열을 제공하는 것이다.

본원 발명의 또 다른 목적은 해비 및/또는 라이트 체인 이뮤노글로불린 유전자의 적어도 하나의 대립유전자가 결핍된 세포, 조직 및 동물을 제공하는 것이다.

본원 발명의 또 다른 목적은 인간 이뮤노글로불린을 발현하는 유제동물을 제공하는 것이다.

본원 발명의 또 다른 목적은 새로운 유제동물의 이뮤노글로불린 유전자 서열의 적어도 하나의 대립유전자가 결핍된 세포, 조직 및 동물을 발생시키기 위한 방 법 및/또는 인간 이뮤노글로불린을 발현하는 방법을 제공하는 것이다.

발명의 요약

본원 발명은 처음으로 유제동물의 이뮤노글로불린 점라인 유전자 서열의 배열 뿐만 아니라 그들의 새로운 유전자 서열을 제공한다. 또한, 해비 또는 라이트 체인 이뮤노글로불린 유전자의 적어도 하나의 대립유전자가 결핍된 새로운 유제동물 세포, 조직 및 동물을 제공한다. 이러한 발견에 기초하여, 유제동물은 해비 또는 라이트 체인 이뮤노글로불린 유전자의 적어도 하나의 대립유전자가 완전히 결핍된 새로운 유제동물 세포, 조직 및 동물이 생산될 수 있다. 또한, 이러한 유제동물은 이종의, 예컨대 인간의 이뮤노글로불린 로커스 또는 그의 조각을 발현하기 위해 더욱 변형될 수 있다.

본원 발명의 일면에서, 임의의 기능성 내생 이뮤노글로불린의 발현이 결핍된 트랜스제닉 유제동물이 제공된다. 구체예에서, 유제동물은 임의의 내생 해비 및/또는 라이트 체인 이뮤노글로불린의 발현이 결핍될 수 있다. 라이트 체인 이뮤노글로불린은 카파 및/또는 람다 이뮤노글로불린일 수 있다. 또한 구체예에서, 트랜스제닉 유제동물은 내생 이뮤노글로불린의 적어도 하나의 대립유전자의 발현이 결핍된 것이 제공되며, 여기에서 이뮤노글로불린은 해비 체인, 카파 라이트 체인 및 람다 라이트 체인 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 구체예에서, 기능성 내생 이뮤노글로불린의 발현은 내생 이뮤노글로불린 로커스의 유전적 타겟팅을 통해 성취될 수 있으며 그 결과 내생 이뮤노글로불린의 발현이 방지된 다. 또 다른 구체예에서, 유전적 타겟팅은 상동재조합을 통해 성취될 수 있다. 다른 구체예에서, 트랜스제닉 유제동물은 핵 트랜스퍼를 통해 생산될 수 있다.

다른 구체예에서, 기능성 내생 이뮤노글로불린의 임의의 발현이 결핍된 트랜스제닉 유제동물은 이종 이뮤노글로불린 로커스를 발현하기 위하여 추가로 유전적으로 변형될 수 있다. 구체예에서, 이종 이뮤노글로불린 로커스를 함유하는 돼지과 동물이 제공된다. 구체예에서, 이종 이뮤노글로불린 로커스는 해비 및/또는 라이트 페인 이뮤노글로불린 또는 그의 조각일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이종 이뮤노글로불린 로커스는 카파 체인 로커스 또는 그의 조각 및/또는 람다 체인 로커스 또는 그의 조각일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인공 크로모좀 (AC)는 이종 이뮤노글로불린을 포함할 수 있다. 구체예에서, AC는 효모 AC 또는 포유류 AC 일 수 있다. 구체예에서, 이종 로커스는 인간 이뮤노글로불린 로커스 또는 그의 조각일 수 있다. 구체예에서, 인간 이뮤노글로불린 로커스는 인간 크로모좀 14, 인간 크로모좀 2, 및 인간 크로모좀 22 또는 그의 조각일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인간 이뮤노글로불린 로커스는 재배열될 수 있는 인간 이뮤노글로불린의 임의의 조각을 포함할 수 있다. 구체예에서, 인간 이뮤노글로불린 로커스는 재배열될 수 있는 인간 이뮤노글로불린 해비 체인 및 인간 이뮤노글로불린 라이트 체인의 임의의 조각을 포함할 수 있다. 구체예에서, 인간 이뮤노글로불린 로커스는 항원에 노출되었을 때 항체를 생산할 수 있는 임의의 인간 이뮤노글로불린 로커스 또는 그의 조각을 포함할 수 있따. 특정 구체예에서, 외인성 인간 이뮤노글로불린은 하나 이상의 항원에 노출되어 반응하여 B 세포에 발현되어 이종 이뮤노글로불린을 생산 할 수 있다.

본 발명의 또 하나의 태양에서, 이종 면역 글로부린 유전자 좌 또는 그의 단편을 표현하는 유전자 도입 유제동물이 제공되며, 여기서 면역 글로부린은 내생적 유제동물 염색체 내에서 통합되어 있는 면역 글로부린 유전자 좌로부터 표현할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 이종 변역 글로부린 유전자 좌는 자손에게 유전될 수 있다. 또 하나의 실시태양에서 이종 면역 글로부린 유전자 좌는 자손에 의한 남성 병원균을 통하여 유전될 수 있다. 또 하나의 실시태양에서, 인공 염색체 (AC)는 이종 면역 글로부린을 함유할 수 있다. 하나의 실시태양에서 AC는 효모 AC 또는 포유동물 AC일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 이종 유전자 좌는 인간 면역 글로부린 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 하나의 실시태양에서 인간 면역 글로부린 유전자 좌는 인간 염색체 14, 인간 염색체 2, 및 인간 염색체 22 또는 그의 단편일 수 있다. 또 하나의 실시태양에서 인간 면역 글로부린 유전자 좌는 재배열을 수행할 수 있는 인간 면역 글로부린의 단편을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 인간 면역 글로부린 유전자 좌는 재배열을 수행할 수 있는 인간 면역 글로부린 경쇄 및 인간 면역 글로부린 중쇄의 단편을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 인간 면역 글로부린 유전자 좌는 항원에 대한 노출시 항체를 생산할 수 있는 인간 면역 글로부린 유전자 좌 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특별한 실시태양에서, 외인성 인간 면역 글로부린은 하나 이상의 항원 노출에 대한 반응에서 이종 면역 글로부린을 생산하기 위해 B세포로 표현할 수 있다.

본원 발명의 일면에서, 유제동물의 이뮤노글로불린의 해비 체인 로커스를 코 딩하는 새로운 유전자 서열이 제공된다. 구체예에서, 적어도 하나의 가변부, 두 개의 다양성부(diversity region), 적어도 네 개의 연결부(joining region), 예컨대 mu 불변부를 포함하는 돼지의 해비 체인을 코딩하는 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 예를 들면 서열번호 29로 대표된다. 다른 구체예에서, 돼지의 해비 체인 유전자 서열의 적어도 네 개의 연결부(joining region) 및 적어도 하나의 불변부, 예컨대 mu 불변부를 포함하는 분리된 뉴클레오티드 서열을 제공하며, 예를 들면, 서열번호 4로 대표된다. 구체예에서, 돼지의 해비 체인 유전자 서열의 최초 연결부에 대한 5'플랭킹 서열(flanking sequence)을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 예를 들면, 서열번호 1로 대표된다. 구체예에서, 돼지의 해비 체인 유전자 서열의 최초 연결부에 대한 3'플랭킹 서열(flanking sequence)을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 예를 들면, 서열번호 4의 3' 부위로 대표된다. 구체예에서, 서열번호 1, 4, 또는 29로 정의된 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 핵산 서열은 서열번호 1, 4, 또는 29와 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성이 있는 것이 또한 제공된다. 또한, 서열번호 1, 4, 또는 29에서 적어도 10, 15, 17, 20, 25 또는 30의 연속된 뉴클레오티드(contiguous nucleotides)가 제공된다. 구체예에서, 서열번호 4 또는 서열번호 29의 잔기 1-9,070에서 적어도 17, 20, 25 또는 30의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다. 다른 구체예에서, 서열 29의 잔기 9,070-11039를 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 구체예에서, 임의로 엄격한 조건하에서, 서열번호 1, 4, 또는 29에 대한 하이브리드된 뉴클레오티드 서열, 뿐만 아니라 그와 상동인 뉴클레오티드가 제공된 다.

또 다른 구체예에서, 유제동물의 이뮤노글로불린의 카파 라이트 체인 로커스를 코딩하는 새로운 유전자 서열이 제공된다. 본원 발명은 유제동물의 카파 라이트 체인 부위의 유전자 서열을 최초로 보고하는 것이다. 구체예에서, 돼지의 카파 라이트 체인 로커스를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 또 다른 구체예에서, 카파 라이트 체인의 적어도 하나의 연결부, 하나의 불변부 및/또는 하나의 인헨서 부를 포함할 수 있는 핵산 서열이 제공된다. 구체예에서, 적어도 다섯 개의 연결 부, 하나의 불변부 및 하나의 인헨서 부를 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공될 수 있으며, 예를 들면 서열번호 30으로 대표된다. 구체예에서, 적어도 하나, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개 또는 다섯 개의 연결부 및 돼지의 유전자 카파 라이트 체인의 연결부에 대한 3' 플랜킹 서열을 포함하는 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 예를 들면 서열번호 12로 대표된다. 또 다른 구체예에서, 돼지의 유전자 카파 라이트 체인의 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 최초 연결부에 대한 5' 플랜킹 서열을 포함하고, 예를 들면 서열번호 25로 대표된다. 구체예에서, 돼지의 유전자 카파 라이트 체인의 불변부 및, 임의로, 인헨서 부위의 5' 부분에 대한 3' 플랜킹 서열을 포함하는 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 서열번호 15, 16 및/또는 19로 대표된다.

구체예에서, 서열번호 30, 12, 25, 15, 16 또는 19 인 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 서열번호 30, 12, 25, 15, 16 또는 19에 대해 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성이 있는 핵산 서열이 또한 제공된다. 또한, 서열번호 30, 12, 25, 15, 16 또는 19에서 적어도 10, 15, 17, 20, 25 또는 30 연속한 뉴클레오티드 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 또한, 서열번호 30, 12, 25, 15, 16 또는 19에 대해, 임의로 엄격한 조건하에서, 하이브리드된 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 그에 상동적인 뉴클레오티드가 제공된다.

구체예에서, 유제동물의 이뮤노글로불린의 람다 라이트 체인 로커스를 코딩하는 새로운 유전자 서열이 제공된다. 본원 발명은 최초로 유제동물의 람다 라이트 체인 부위의 유전자 서열을 제공한다. 구체예에서, 돼지의 람자 라이트 체인 뉴클레오티드는 J 내지 C 단위의 연쇄체(concatamer)를 포함한다. 특정 구체예에서, 분리된 돼지의 람다 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 예컨대 서열번호 28과 같은 것이다. 구체예에서, 최초 람다 J/C 부위에 대한 5' 플랜킹 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 예를 들면 서열번호 32로 대표된다. 또한, 돼지의 람다 라이트 체인 유전자 서열의 J/C 클러스터 부위에 대한 3' 플랜킹 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 예를 들면 람다 J/C의 대략 200 염기 쌍 다운스트림에 있는 예컨대 서열번호 33과 같은 것이다. 또한, 돼지의 람다 라이트 체인 유전자 서열의 J/C 클러스터 부위에 대한 3' 플랜킹 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 예를 들면 서열번호 34, 35, 36, 37, 38, 및/또는 39로 대표된다. 구체예에서, 적어도 하나의 연결부-불변부 쌍 및/또는 적어도 하나의 가변부를 포함할 수 있는 소의 람다 라이트 체인 로커스를 코딩하는 핵산 서열이 제공되며, 예를 들면 서열번호 31로 대표된다. 구체예에서, 서열번호 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39로 대표되는 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된 다. 서열번호 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39와 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성이 있는 핵산 서열이 또한 제공된다. 또한, 서열번호 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39에서 적어도 10, 15, 17, 20, 25 또는 30의 연속의 뉴클레오티드를 포함하는 튜클레오티드가 제공된다. 또한, 서열번호 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39에 대해 하이브리드된, 임의로 엄격한 조건하에 하이브리드된 뉴클레오티드 서열 뿐만 아니라 그에 상동적인 뉴클레오티드가 제공된다.

구체예에서, 핵산 타켓팅 벡터 작재물이 제공된다. 타켓팅 벡터는 세포 내에서 상동재조합을 달성하기 위하여 디자인될 수 있다. 이러한 타켓팅 벡터는 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 또는 람다 라이트 체인 유전자를 목표로 상동재조합을 통해 포유류 세포 내로 트랜스폼(transformed)될 수 있다. 구체예에서, 타켓팅 벡터는 3' 재조합 암(arm) 및 5' 재조합 암 (즉, 플랜킹 서열)을 포함할 수 있으며, 이는 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 또는 람다 라이트 체인 유전자 서열에 대해 상동적이고, 예를 들면 상기 언급한 서열번호 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31로 대표된다. 상동성 DNA 서열은 유전자 서열에 대해 상동성 서열의 적어도 15 bp, 20 bp, 25 bp, 50 bp, 100 bp, 500 bp, lkbp, 2 kbp, 4 kbp, 5 kbp, 10 kbp, 15 kbp, 20 kbp, 또는 50 kbp를 포함할 수 있다. 3' 및 5' 재조합 암은 유전자 서열의 적어도 하나의 기능성 가변, 연결, 다양 및/또는 불변부의 3' 및 5' 말단을 플랭크 하는 방식으로 디자인될 수 있다. 기능성 부위의 타켓팅은 그것을 불활성화하게 할 수 있으며, 세포의 불능을 야기하여 기능성 이뮤노글로불린 분자를 생산하게 한다. 다른 구체예에서, 상동성 DNA 서열은 하나 이상의 인트론 및/또는 엑손 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열에 덧붙여, 발현 벡터는 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포에 있어서 작재물의 발현을 위해 제공되는 선택적인 마커 서열, 예컨대, 증진된 그린 형광 단백질 (eGFP) 유전자 서열, 개시 및/또는 인헨서 서열, 폴리 A-테일 서열, 및/또는 핵산 서열을 포함할 수 있다. 선택적인 마커는 5' 및 3' 재조합 암 서열 사이에 위치할 수 있다.

한 특정 구체예에서, 타켓팅 벡터는 돼지의 이뮤노글로불린 해비 체인 로커스의 J6 부위의 3' 및 5' 플랜킹 서열에 대해 상동적인 서열을 함유하는 5' 및 3' 재조합 암을 포함할 수 있다. J6 부위는 돼지 이뮤노글로불린 해비 체인 로커스의 유일한 기능성 연결부이기 때문에, 이는 기능성 돼지 해비 체인 이뮤노글로불린의 발현을 막을 수 있을 것이다. 특정 구체예에서, 타겟팅 벡터는 J 1-4를 포함하는 J6 부위의 유전자 서열 5'과 상동적인 서열을 함유하는 5' 재조합 암 및 mu 불변부를 포함하는 J6 부위의 유전자 서열 3'에 대해 상동적인 서열을 포함하는 3' 재조합 암을 포함할 수 있으며 ("J6 타켓팅 작재물"), 예를 들면, 도1을 참고하면 된다. 또한, 이러한 J6 타겟팅 작재물은 또한 5' 및 3' 재조합 암 사이에 위치한 선택적인 마커 유전자를 포함할 수 있으며 예를 들면 서열번호 5 및 도1을 참고하면 된다. 다른 구체예에서, 타겟팅 벡터는 돼지의 해비 체인 로커스의 다양성부의 유전자 서열 5'에 대해 상동적인 서열을 포함하는 5' 재조합 암 및 다양성부의 유전자 서열 3'에 대해 상동적인 서열을 포함하는 3' 재조합 암을 포함할 수 있다. 구체예에서, 타겟팅 벡터는 돼지의 해비 체인 로커스의 mu 불변부의 유전자 서열 5' 에 대해 상동적인 서열을 포함하는 5' 재조합 암 및 mu 불변부의 유전자 서열 3'에 대해 상동적인 서열을 포함하는 3' 재조합 암을 포함할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 타겟팅 벡터는 돼지의 이뮤노글로불린 해비 체인 로커스의 불변부의 3' 및 5' 프랠ㄴ킹 서열에 대해 상동적인 서열을 포함하는 5' 및 3' 재조합 암을 포함할 수 있다. 본원 발명은 돼지의 이뮤노글로불린 카파 라이트 체인 로커스는 오직 한 불변부가 있음을 발견하였기 때문에, 이는 기능성 돼지의 카파 라이트 체인 이뮤노글로불린의 발현을 막을 수 있다. 특정 구체예에서, 타겟팅 벡터는 불변부, 임의로 연결부의 유전자 서열 5'에 대해 상동적인 서열을 포함하는 5' 재조합 암 및 가변부, 임의로 적어도 인헨서의 부분을 포함하는 유전자 서열 3'에 대해 상동적인 서열을 포함하는 3' 재조합 암을 포함할 수 있으며"카파 불변 타켓팅 작재물"), 예를 들면 도2를 참고하면 된다.

또한, 이러한 카파 불변 타겟팅 작재물은 또한 5' 및 3' 재조합 암 사이에 위치한 선택적인 마커 유전자를 포함할 수 있으며, 예를 들면 서열번호 20 및 도2를 참고하면 된다. 다른 구체예에서, 타겟팅 벡터는 돼지의 카파 라이트 체인 로커스의 연결부의 유전자 서열 5'에 대해 상동적인 서열을 포함하는 5' 재조합 암 및 연결부의 유전자 서열 3'에 대해 상동적인 서열을 포함하는 3' 재조합 암을 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, 타겟팅 벡터의 3' 및 5' 서열을 만들기 위하여 프라이머가 제공된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 돼지의 이뮤노글로불린 유전자 서열, 예컨대 상기 언급된 서열번호 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31 과 하이브리드될 수 있다. 특정 구체예에서, 프라이머는 엄격한 조건하에서, 상기 언급된 서열번호 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31과 하이브리드된다. 또 다른 구체예에서, 돼지의 해비 체인, 카파 라이트 체인 또는 람다 라이트 체인 핵산 서열, 예컨대 상기 언급한 서열번호 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31과 하이브리드된다. 또 다른 구체예에서, 돼지의 해비 체인, 카파 라이트 체인 또는 람다 라이트 체인 핵산 서열, 예컨대 상기 언급된 서열번호 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31과 하이브리드될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브(probe)가 제공된다. 폴리뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 적어도 14 염기, 20 염기, 30 염기 또는 50 염기를 가질 수 있고, 본원 발명의 폴리뉴클레오티드와 하이브리드된다. 프로브 또는 프라이머는 적어도 14 뉴클레오티드의 길이일 수 있고, 특정 구체예에서, 적어도 15, 20, 25, 28, 또는 30 뉴클레오티드 길이일 수 있다.

구체예에서, 기능성 연결부(J6 부위)를 포함하는 돼지의 Ig-해비 체인의 조각을 증폭하기 위한 프라이머가 제공된다. 비한정적 구체예에서, 해비 체인의 증폭된 조각은 서열번호 4에 의해 대표될 수 있고, 프라이머는 상기 조각이 J-부위의 부분, 예컨대 비한정적으로 서열번호 2에 대해 상보적일 수 있는 상기 조각을 증폭하기 위하여 사용되어 5' 재조합 암을 생성하며, Ig-해비 체인 mu 불변부의 부분, 예컨대 비한정적으로 서열번호 3에 대해 상보적일 수 있는 조각을 증폭하기 위하여 사용되느 3' 재조합 암을 생성한다. 또 다른 구체예에서, 돼지의 Ig 해비 체인 (예컨대, 비한정적 예로 서열번호 4)의 부위는 서브 클로닝 될 수 있고, 타겟팅 벡 터 내로 집합될 수 있다.

다른 구체예에서, 불변부를 포함하는 돼지의 Ig 카파 라이트-체인의 조각을 증폭시키기 위한 프라이머가 제공된다. 또 다른 구체예에서, J 부위를 포함하는 돼지의 Ig 카파 라이트-체인의 조각을 증폭시키기 위한 프라이머가 제공된다. 비한정적 예로, 이러한 조각을 증폭하기 위하여 사용되는 프라이머는 J-부위, 예컨대 비한정적 예로 서열번호 21 또는 10의 부분에 대해 상보적일 수 있고, 5' 재조합 암을 생산하며, 불변부의 유전자 서열 3', 예컨대 비한정적 예로 서열번호 14, 24 또는 18에 대해 상보적일 수 있는 조각을 증폭하기 위하여 사용되는 프라이머는 3' 재조합 암을 생산한다. 또 다른 구체예에서, 돼지의 Ig 해비 체인 (예컨대, 비한정적 예로 서열번호 20)의 부위는 서브클로닝될 수 있고, 타겟팅 벡터내로 집합될 수 있다.

본원 발명의 또 다른 일례에서, 여기에 설명된 방법, 서열 및/또는 작재물에 따라 제조된 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 및/또는 람다 라이트 체인 로커스의 기능성 부위의 적어도 하나의 대립유전자가 결핍된 유제동물의 세포가 제공된다. 이러한 세포들은 상동재조합을 통해 얻어질 수 있다. 특히, 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 또는 람타 라이트 체인 유전자의 적어도 하나의 대립유전자를 불활성화시킴으로써 유제동물의 항체의 발현 능력이 감소된 세포가 생산될 수 있다. 다른 구체예에서, 여기에 설명된 과정, 서열 및/또는 작재물에 따라 제조될 수 있는 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 및/또는 람다 라이트 체인 유전자의 양 대립유전자가 결핍된 포유류 세포가 제공된다. 구체예에서, 여기 에 설명된 과정, 서열 및/또는 작재물에 따라 생산된 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 및/또는 람다 라이트 체인 유전자의 적어도 하나의 대립유전자에 있어서, 유전적 타겟팅 이벤트를 경유하여 불활성화된 돼지과 동물이 제공된다. 본원 발명의 또 다른 일면에서, 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 및/또는 람다 라이트 체인 유전자의 양 대립 유전자에 있어서, 유전적 타겟팅 이벤트를 경유하여 불활성화된 돼지과 동물이 제공된다. 유전자는 상동재조합을 통해 타겟팅될 수 있다.

다른 구체예에서, 유전자를 파괴될 수 있는데, 즉, 유전적 코드의 부분이 변형될 수 있고, 그럼으로써 유전자의 그 부분의 전사 및/또는 해독에 영향을 준다. 예를 들면, 유전자의 파괴는 치환, 결손("녹-아웃") 또는 삽입 ("녹-인") 기술을 통해 일어날 수 있다. 목적하는 단백질을 위한 부가적 유전자 또는 존재하는 서열의 전사를 조절하는 조절 서열이 삽입될 수 있다. 구체예에서, 유제동물의 이뮤노글로불린 유전자의 다중 유전적 변형을 달성하기 위하여, 세포를 순차적으로 변형시킬 수 있으며, 그 결과 다중의 유전적 변형을 포함하게 된다. 다른 구체예에서, 동물은 함께 자랄 수 있고, 이뮤노글로불린 유전자의 다중의 유전적 변형을 포함하는 동물이 생산된다. 예시로서, 유제동물의 해비 체인 유전자의 적어도 하나의 대립유전자의 발현이 결핍된 동물이 추가로 유전적으로 변형되거나 카파 라이트 체인 유전자의 적어도 하나의 대립 유전자가 결핍된 동물과 함께 사육될 수 있다.

본원 발명의 구체예에서, 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 또는 람다 라이트 체인 유전자의 대립 유전자가 여기에 설명된 과정, 서열 및/또는 작재물 에 따라 불활성화될 수 있다. 구체예에서, 목표하는 이뮤노글로불린 유전자는 RNA 로 전사될 수 있으나, 단백질로 해독 되지는 않는다. 또 다른 구체예에서, 목표하는 이뮤노글로불린 유전자는 불활성화된 절단된 형태로 전사될 수 있다. 이러한 절단된 RNA는 비기능성 단백질로 해독되거나 전사되지 않을 수 있다. 구체예에서, 목표하는 이뮤노글로불린 유전자는 유전자의 전사가 일어나지 않는 방법으로 불활성화될 수 있다. 구체예에서, 목표하는 이뮤노글로불린 유전자는 전사된 후 비기능성 단백질로 해독될 수 있다.

본원 발명의 일면에서, 유제동물, 예컨대 돼지 또는 소의 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 및/도는 람다 라이트 체인 유전자의 하나의 대립유전자, 임의로 양 대립유전자가 수령자 세포내로 핵을 프랜스퍼하기 위한 공여체 세포로 사용될 수 있으며, 복제된 트랜스제닉 동물을 생산한다. 선택적으로, 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 및/또는 람다 라이트 체인 유전자 녹아웃은 엠브리오닉 줄기세포에서 생성될 수 있고, 그 후 자손을 생산하는데 사용할 수 있다. 여기에 설명된 과정, 서열 및/또는 작재물에 따라 생산된 기능적 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 및/도는 람타 라이트 체인 유전자의 단일 대립유전자가 결핍된 자손이 멘델 타입 유전을 통해 양 대립유전자에 있어 기능성이 결핍된 자손을 생산하기 위하여 또한 사육될 수 있다.

본원 발명의 일면에서, 유제동물의 이뮤노글로불린 유전자의 발현을 막기 위한 방법이 제공되며, (i) 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 또는 람다 라이트 체인 유전자 로커스의 점라인 구조를 분석; (ii) 로커스의 적어도 하나의 기능 성 부위의 5' 말단 및 3' 말단을 플랜크하는 뉴클레오티드 서열의 부위를 결정; 및 (iii) 플랜킹 서열을 갖는 타겟팅 작재물을 세포내로 감염시킴, 여기에서 성공적인 상동재조합인 경우, 이뮤노글로불린 로커스의 적어도 하나의 기능성 부위가 파괴되고, 그럼으로써 이뮤노글로불린 유전자의 발현이 감소 또는 방해된다. 구체예에서, 돼지의 해비 체인 로커스의 점라인 구조가 제공된다. 돼지의 해비 체인 로커스는 적어도 네 개의 가변부, 두 개의 다양성부, 여섯 개의 연결 부 및 다섯 개의 불변부를 포함하며, 예를 들면 도1에 도시되어 있다. 특정 구체예에서, 여섯 개의 연결 부 중 오직 하나인, J6이 기능성이 있다. 또 다른 구체예에서, 돼지의 카파 라이트 체인 로커스는 적어도 여섯 개의 가변부, 여섯 개의 연결부, 하나의 불변부 및 하나의 인헨서 부위를 포함하며, 예를 들면 도2에 도시되어 있다. 구체예에서, 돼지의 람다 라이트 체인 로커스의 점라인 구조가 제공된다.

본원 발명의 일면에서, 여기에 성명된 과정, 서열 및/또는 작재물에 따라 생산된 유제동물의 해비 체인, 카파 라이트 체인 및/또는 람다 라이트 체인 로커스의 기능성 부위의 적어도 하나의 대립유전자가 결핍된 유제동물 및 유제동물세포라 제공되며, 이들은 적어도 인간 항체(즉, 이뮤노글로불린(Ig))의 부분을 발현하기 위하여 더 변형된다. 추가적 구체예에서, 이종 이뮤노글로불린을 발현하는 돼지과 동물이 제공된다. 이러한 인간 로커스는 유제동물에서, 인간 항체 분자의 다양한 파퓰레이션을 발현하거나 재배열될 수 있다. 이러한 복제된, 트랜스제닉 유제동물은 인간 항체(예컨대, 폴리클로날 항체)의 채워지는, 이론상 무한한 공급을 제공하며, 치료, 진단, 정제 및 다른 임상적 관련 목적에 사용될 수 있다. 특정 구체예 에서, 인공 크로모좀(ACs), 예컨대 효모 또는 포유류 인공 크로모좀(YACS 또는 MACS)이 인간 이뮤노글로불린 유전자가 유제동물의 세포 및 동물내에서 발현할 수 있게 하기 위하여 사용될 수 있다. 인간 이뮤노글로불린 유전자의 전체 또는 부분, 예컨대 Ig 해비 체인 유전자 (인간 크로모좀 414), Ig 카파 체인 유전자 (인간 크로모좀 #2) 및/또는 Ig 람다 체인 유전자 (크로모좀 #22)는 인공 크로모좀내로 삽입될 수 있드며, 그 후 유제동물 세포내로 삽입될 수 있다. 구체예에서, 인간 항체 분자의 다양한 파퓰레이션을 발현하고 재배열되는 적어도 하나의 인간 항체 유전자 로커스의 전체 또는 부분을 함유하는 유제동물 및 유제동물 세포가 제공된다.

추가적 구체예에서, 이종 항체를 생산하는 방법이 제공되며, 여기에서 상기 방법은 (a) 하나 이상의 대상 항체를 유제동물, 그 세포가 하나 이상의 인공 크로모좀을 함유하며 기능성 내생 이뮤노글로불린의 임의의 발현이 결핍되었으며, 각각의 인공 크로모좀은 하나 이상의 재배열된 이종 이뮤노글로불린 로커스를 포함하는 유제동물에 도입하여, 하나 이상의 항체에 대항하는 이종 항체를 생산하고, (b) 유제동물로부터 이종 항체를 회복하는 것을 포함할 수 있다. 구체예에서, 이뮤노글로불린 로커스는 B 세포 내에서 재배열될 수 있다.

본원 발명의 일면에서, 예컨대 돼지 또는 소와 같은 유제동물이 본원 발명의 임의의 일면에 따른 방법에 따라 제공될 수 있다. 이러한 복제된 트랜스제닉 유제동물 (예를 들면 돼지 및 소과 동물)은 인간 폴리클로날 항체의 채워지는, 이론상 무한한 공급을 제공하며, 치료, 진단 및 정제 목적으로 사용될 수 있다. 예를 들 면, 혈류에서 폴리클로날 인간 항체를 생산하는 여기에 설명된 과정, 서열 및/또는 작재물에 따라 생산된 트랜스제닉 동물은 목적하는 항체에 특이적인 다른 항체의 어레이를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 폴리클로날 항체가 거대량 입수가능한 경우, 감염성 질환의 치료 및 예방 목적, 생물학적 전투제, 면역계의 변형, 원치 않는 인간 세포, 예컨대 암세포의 제거, 및 특정 인간 분자의 변형에 대항한 백신으로 사용될 수 있다.

다른 구체예에서, 여기에 개시된 과정, 서열 및/도는 작재물에 따라 생산된 기능성 이뮤노글로불린의 발현이 결힙된 동물 또는 세포는 이종항원의 발현을 제거하기 위하여 추가적 유전적 변형을 포함할 수 있다. 상기 동물은 알파-1,3-갈락토실트랜스퍼라제 유전자, CMP-Neu5Ac 하이드록실라제 유전자 (USSN 10/863,116 참조), iGb3 합성 유전자 (US Patent Application 60/517,524 참조), 및/또는 포스만 합성 유전자 (US Patent Application 60/568,922 참조)의 적어도 하나의 대립유전자의 발현을 제거하기 위하여 변형될 수 있다. 추가적 구체예에서, 본원 명세서에 개시된 동물은 또한 푸코실트랜스퍼라제 및/도는 시알릴트랜스퍼라제를 발현하기 위한 유전적 변형을 포함할 수도 있다. 이러한 추가적 유전적 변형을 위해, 구체예에서, 세포는 변형될 수 있고, 그 결과 다중 유전적 변형을 포함하게 된다. 다른 구체예에서, 동물을 함께 사육하여 다중 유전적 변형을 시킬 수 있다. 특정 구체예에서, 본원 명세서에 개시된 과정, 서열 및/또는 작재물에 따라 생산된 기능성 이뮤노글로불린의 발현이 결핍된 예컨대 돼지와 같은 동물을 알파-1,3-갈락토실 트랜스터라제의 발현이 결핍된 돼지와 같은 동물과 함께 사육할 수 있다 (WO 04/028243 참조).

도면의 간단한 설명

도1은 돼지의 해비 체인 이뮤노글로불린 유전자의 연결부의 발현을 방해하는 타겟팅 벡터의 디자인을 도시한 것이다.

도2는 돼지의 카파 라이트 체인 이뮤노글로불린 유전자의 불변부의 발현을 방해하는 타겟팅 벡터의 디자인을 도시한 것이다.

도3은 JC 서열의 연쇄체 뿐만 아니라 JC 부위에 대한 가변부 5'를 포함하는 프랜킹 부위를 포함하는 돼지의 람다 이뮤노글로불린 로커스의 유전적 조직화를 도시한 것이다. 세균성 인공 크로모좀 (BAC1 및 BAC2)는 BAC 라이브러리로부터 얻어질 수 있는 돼지의 이뮤노글로불린 유전자의 조각을 나타낸다.

도4는 돼지의 람다 라이트 체인 이뮤노글로불린 유전자의 JC 클러스터 부위의 발현을 방해하는 타겟팅 유전자의 디자인을 나타낸 것이다. "SM"은 선택적인 마커 유전자를 나타내며, 타겟팅 벡터에서 사용될 수 있다.

도5는 사이트 특이성 리콤비나제 타겟 또는 인식 사이트를 돼지 람다 이뮤노글로불린 로커스의 JC 클러스터 부위의 부위 5'내로 삽입하기 위한 타겟팅 전략을 도시한 것이다. "SM"은 선택적인 마커 유전자를 나타내며, 타겟팅 벡터에서 사용될 수 있다. "SSRRS"는 특이성 리콤비나제 타겟 또는 인식 사이트를 나타낸다.

도6은 사이트 특이성 리콤비나제 타겟 또는 인식 사이트를 돼지 람다 이뮤노글로불린 로커스의 JC 클러스터 부위의 부위 3'내로 삽입하기 위한 타겟팅 전략을 도시한 것이다. "SM"은 선택적인 마커 유전자를 나타내며, 타겟팅 벡터에서 사용될 수 있다. "SSRRS"는 특이성 리콤비나제 타겟 또는 인식 사이트를 나타낸다.

도7은 사이트 특이성 리콤비나제가 매개된 YAC의 숙주 유전자내로의 트랜스퍼를 도시한 것이다. "SSRRS"는 특이성 리콤비나제 타겟 또는 인식 사이트를 나타낸다.

발명의 상세한 설명

본원 발명은 유제동물의 점라인 유전자 서열 배열 뿐만 아니라 새로운 그의 새로운 유전자 서열을 최초로 제공한다. 또한, 해비 또는 라이트 체인 이뮤노글로불린 유전자의 적어도 한 대립유전자가 결핍된 새로운 유제동물 세포, 조직 및 동물이 제공된다. 이러한 발견에 기초하여, 해비 및/또는 라이트 체인 이뮤노글로불린 유전자의 적어도 하나의 대립유전자가 완전히 결핍된 유제동물이 제공될 수 있다. 또한, 이러한 유제동물은 추가로 변형되어 이종, 예컨대 인간, 이뮤노글로불린 로커스 또는 그의 조각을 발현할 수 있다.

본원 발명의 일면에서, 기능성 내생 이뮤노글로불린의 임의의 발현이 결핍된 트랜스제닉 유제동물이 제공된다. 구체예에서, 유제동물은 내생 해비 및/또는 라이트 체인 이뮤노글로불린의 임의의 발현이 결핍될 수 있다. 라이트 체인 이뮤노글로불린은 카파 및/또는 람다 이뮤노글로불린일 수 있다. 추가적 구체예에서, 내생 이뮤노글로불린의 적어도 한 대립유전자의 발현이 결핍된 트랜스제닉 유제동물이 제공되며, 여기에서 이뮤노글로불린은 해비 체인, 카파 라이트 체인 및 람다 라 이트 체인 또는 그의 임의의 조합으로 이루어진 그룹에서 선택된다. 구체예예서, 기능성 내생 이뮤노글로불린의 발현은 내생 이뮤노글로불린 로커스의 유전적 타겟팅에 의해 성취될 수 있으며, 이는 내생 이뮤노글로불린의 발현을 막는다. 구체예에서, 유전적 타겟팅은 상동재조합을 경유하여 성취될 수 있다. 구체예에서, 핵 트랜스퍼를 통해 트랜스제닉 유제동물이 제공될 수 있다.

다른 실시태양에서, 작용 내생적 면역 글로빈의 발현이 부족한 유전자 도입 유제동물은 이종 면역 글로불린 유전자 좌를 표현하기 위해 추가로 유전적으로 변형시킬 수 있다. 다른 실시태양에서, 이종 면역 글로불린 유전자 좌를 함유하는 돼지 같은 동물이 제공된다. 하나의 실시태양에서, 이종 면역 글로불린 유전자좌는 중쇄 및/또는 경쇄 면역 글로불린 또는 그의 단편일 수 있다. 또 하나의 실시태양에서, 이종 면역 글로불린 유전자좌는 케파 체인 유전자좌 또는 그의 분절 및/또는 람다 체인 유전자좌 또는 그의 단편일 수 있다. 또 다른 실시태양에서, 인공 염색체(AC)는 이종 면역 글로부린을 함유할 수 있다. 하나의 실시태양에서, AC는 효모AC 또는 포유동물 AC일 수 있다. 다른 실시태양에서, 이종 유전자 좌는 인간 면역글로부린 염색체좌 또는 그의 단편일 수 있다. 하나의 실시태양에서, 인간 면역글로부린 유전자 좌는 인간 염색체 14, 인간 염색체 2, 및 인간 염색체 22 또는 그의 단편일 수 있다. 또 하나의 실시태양에서긴간 면역 글로부린 유전자 좌는 재배열을 수행할 수 있는 인간 면역 글로부린의 단편을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 인간 면역 글로부린 염색체좌는 재배열을 수행할 수 있는 인간 면역글로부릴 중쇄 및 인간 면역글로부린 경쇄를 포함할 수 있다. 또 하나의 실시태양에서, 인간 면역글로부린 염색체좌는 항원에 노출시 항체를 생산할 수 있는 특정한 인간 면역 글로부린 염색체좌 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특별한 실시태양에서, 외인성 인간 면역 글로부린은 하나 이상의 항원에 노출에 대한 반응에서 이종 면역 글로불린을 생산하기 위하여 B세포로 표현할 수 있다.

본 발명의 또 하나의 태양에서, 이종 면역 글로부린 유전자 좌 또는 그의 단편을 표현하는 유전자 도입 유제동물이 제공되며, 여기서 면역 글로부린은 내생적 유제동물 염색체 내에서 통합되어 있는 면역 글로부린 유전자 좌로부터 표현할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 이종 변역 글로부린 유전자 좌는 자손에게 유전될 수 있다. 또 하나의 실시태양에서 이종 면역 글로부린 유전자 좌는 자손에 의한 남성 병원균을 통하여 유전될 수 있다. 또 하나의 실시태양에서, 인공 염색체 (AC)는 이종 면역 글로부린을 함유할 수 있다. 하나의 실시태양에서 AC는 효모 AC 또는 포유동물 AC일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 이종 유전자 좌는 인간 면역 글로부린 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 하나의 실시태양에서 인간 면역 글로부린 유전자 좌는 인간 염색체 14, 인간 염색체 2, 및 인간 염색체 22 또는 그의 단편일 수 있다. 또 하나의 실시태양에서 인간 면역 글로부린 유전자 좌는 재배열을 수행할 수 있는 인간 면역 글로부린의 단편을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 인간 면역 글로부린 유전자 좌는 재배열을 수행할 수 있는 인간 면역 글로부린 경쇄 및 인간 면역 글로부린 중쇄의 단편을 포함할 수 있다. 추가의 실시태양에서, 인간 면역 글로부린 유전자 좌는 항원에 대한 노출시 항체를 생산할 수 있는 인간 면역 글로부린 유전자 좌 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특별한 실시태양에서, 외인성 인간 면역 글로부린은 하나 이상의 항원 노출에 대한 반응에서 이종 면역 글로부린을 생산하기 위해 B세포로 표현할 수 있다.

정의

용어 "재조합 DNA 기술", "DNA 클로닝", "분자 클로닝", 또는 "유전자 클로닝"은 DNA 서열을 세포 또는 유기물로 전환하는 방법을 일컫는다. DNA 단편으로의 전환은 하나의 유기물로부터, 자기 복제 유전 인자 (예, 박테리아 플라스미드) 많은 다른 것들 중에서 선택되며 또한 무제한된 양으로 생산되는 DNA (또는 RNA)서열의 특정한 부분을 복제하는 자기 복제 유전 인자 (예, 박테리아 플라스미드)까지 일 수 있다. 플라스미드 및 다른 유형의 클로닝 벡터 예를 들어 인공 염색체는 추가의 연구를 위해 충분한 동일 물질을 발생시키기 위해 유전자 및 다른 편의 염색체를 복제하는데 사용할 수 있다. 20kg까지의 외래 DNA를 가질 수 있는 박테리아 플라스미드 외외에, 다른 클로닝 벡테는 바이러스, 코스미드, 및 인공 염색체 (예, 박테리아 인공 염색체 (BACs) 또는 효모 인공 염색체 (YACs))를 포함한다. 염색체 DNA의 단편이 궁극적으로 실험실에서 그의 클로닝 벡터로 조합하는 경우, "재조합 DNA 분자"로 부른다. 재조합 플라스미드가 적합한 숙주 세포내에 도입된 직후에, 새로 삽입된 단편은 숙주 세포 DNA와 함께 재생될 것이다.

"코스미드"는 45kg까지의 외래 DNA를 가질 수 있는 인공적으로 건축된 클로닝 벡터이다. 이들은 이 콜라이 세포내에 감염을 위한 램브다파지 입자 내에 패키지 화 될 수 있다.

여기서 사용되는 용어 "포유동물" ("유전적으로 변형된 (또는 변화된) 포유 동물에서와 같이)은 인간이 아닌 포유동물을 포함하며, 예를 들어 제한되지 않지만 돼지, 양, 염소, 소 (솟과 동물), 사슴, 노새, 말, 원숭이, 개, 고양이, 쥐, 마이스, 새, 닭, 파충류 동물, 어류, 및 곤충을 포함한다. 본 발명의 하나의 실시태양에서, 유전적으로 변화된 돼지 및 그의 생산방법이 제공된다.

용어 "유제동물"(ungulate)는 발굽을 가진 동물을 일컫는다. 우제류는 영양, 낙타, 젖소, 사슴, 염소, 돼지, 및 양을 포함하는 균일한 발톱 (갈라진 발굽) 유제동물이다. 기제류는 한짝 발가락 유제동물이며, 말, 얼룩말, 무소, 및 맥을 포함한다. 여기서 사용되는 용어 "유제동물"은 성인, 태아 또는 태아 유제동물을 일컫는다.

여기서 사용되는 용어 "돼지 류" "돼지 같은 동물". "새끼 돼지" 및 "돼지"는 성, 크기 또는 잡종에 상관없이 동일 유형의 동물을 언급하는 유전학적 용어이다.

"상동 DNA 서열 또는 상동 DNA"는 참조 DNA 서열과 동일한 적어도 약 80%, 85%, 90%, 98% 또는 99%인 DNA서열이다. 상동 서열은 목표 서열에 대한 엄격한 조건하에 혼성화하며, 엄격한 혼성화는 서열 간에 적어도 85, 적어도 95% 또는 98%인 경우에 혼성화가 발생하는 것을 포함한다.

"동질유전자형 또는 실질적으로 동질유전자형 DNA 서열"은 참조 DNA 서열과 동일하거나 또는 거의 동일한 DNA 서열이다. 용어 "실질적으로 동질유전자형"은 참조 DNA 서열과 동일한 적어도 약 97-99%이거나 또는 참조 DNA 서열과 동일한 적어도 약 99.5-99.9%이며, 또한 특정한 경우에 참조 DNA 서열과 동일한 100%를 사용하 는 DNA 서열을 일컫는다.

"상동 재조합"은 서열 상동성을 기본으로 하는 DNA 재조합의 과정을 일컫는다.

"유전자 표적화"는 두개의 DNA 서열 사이의 상동 재조합을 일컬으며, 이의 하나는 염색체에 위치하며 또한 다른 것은 그러하지 않다.

"비-상동성 또는 불균일 통합"은 상동 재조합을 포함하지 않는 게놈 내에 DNA를 삽입하는 방법을 일컫는다.

"선택 가능한 표시 유전자"는 그의 표현이 유전자 함유 세포를 식별시키는 유전자이다. 선택 가능한 표시는 유전자 없이 세포의 성장을 방지하거나 느리게 하는 매체 상에 세포를 증식시키는 것일 수 있다. 이의 예는 항생제 저항 유전자 및 유기물을 선택된 대사물에 성장시키는 유전자를 포함한다. 이와는 달리, 유전자는 용이하게 식별되는 표현형을 세포위에 부여함으로써 변이체의 시각적 스크리닝을 촉진할 수 있다. 이러한 식별 가능한 표현형은 예를 들어 발광의 생성 및 착색된 화합물의 생산, 또는 세포를 둘러싸는 매체중에 탐지 가능한 변화의 발생일 수 있다.

용어 "인접한"은 방해 없이 또는 방해받지 않고 표준 의미로 여기서 사용된다.

"엄격한 조건"은 (1) 낮은 이온 강도 및 높은 세척 온도, 예를 들어 50℃에서 0.015M NaCl/0.0015M 구연산 나트륨/0.1% SDS를 사용하거나, 또는 (2) 혼성화 도중에 변성제, 예를 들어 포름아미드를 사용하는 조건을 일컫는다. 당 업자들은 분명하고 탐색 가능한 혼성화 신호를 얻기 위해 대략적으로 엄격한 조건을 결정하고 변화시킬 수 있다. 예를 들어, 엄격함은 일반적으로 혼성화 도중에 존재하는 염 함량을 증가시키고, 세척하고, 온도 또는 그의 조합을 저하시켜 줄일 수 있다. 참조, 예를 들어 삼부르크 등, 분자 크로닝,: 실험 매뉴얼, 콜드 스프링 하버 레보레토리 프레스, 콜드 스프링 하버, 뉴욕 (1989).

I. 면역 글로부린 유전자

본 발명의 한 태양에서, 작용 내생적 면역 글로부린의 표현이 부족한 작용 유전자 도입 유제동물이 제공된다. 하나의 실시태양에서 유제동물은 내생적 중쇄 및/또는 경쇄 면역 글로부린의 발현이 부족할 수 있다. 경쇄 면역 글로부린은 카파 및/또는 램다 면역 글로부린일 수 있다. 추가의 실시태양에서, 내생적 면역 글로부린 유제동물의 적어도 하나의 대립유전자의 표현이 부족한 유전자 도입 유제동물이 제공되며, 여기서 면역 글로부린은 중쇄, 캅파 경쇄 및 람다 경쇄 또는 그의 조합으로 이루어진 그룹으로부터 선택된다. 하나의 실시태양에서, 작용 내생적 면역 글로부린의 표현은 내생적 면역 글로부린의 표현을 방지하기 위해 내생적 면역 글로부린 유전자좌의 유전 표적화의 표현을 방지하기 위해 내생적 면역 글로부린 유전자 좌의 유전 표적화에 의해 달성할 수 있다. 하나의 실시태양에서, 유전 표적화는 상동성 재조합에 의해 달성할 수 있다. 또 하나의 실시태양에서 유전자 도임 유제동물은 핵 전이에 의해 생산할 수 있다.

본 발명의 또 하나의 실시태양에서, (i) 유제동물 중쇄, 캅파 경쇄 또는 람다 경쇄 게놈 유전자 좌의 생식계열 윤곽을 분석함으로써, (ii) 유전자좌의 적어도 하나의 작용 영역의 5번 단부 및 3번 단부의 측면에 위치하는 뉴클레오타이드 서열의 발견을 결정하고, 및 (iii) 프랭킹 서열을 함유하는 표적화 구조물을 세포내에 트랜스팩트 함으로써 유제동물 면역 글로부린 유전자의 표현을 방해하는 방법이 제공되며, 여기서 성공적인 상동성 재조합 시, 유전자 좌의 적어도 하나의 작용 영역이 붕괴되어 면역글로불린의 감소시키거나 방지된다.

일 구체예에서, 돼지의 중쇄 유전자 자리(locus)의 배자 계열 배열이 제공된다. 돼지 중쇄 유전자 자리는 예를 들어 도 1에 도시한 바, 적어도 네개의 가변 부위, 두개의 다양성 부위, 여섯개의 접합 부위 및 다섯개의 불변 부위를 포함한다. 특정 구체예에서, 여섯개의 접합 부위 중 오직 하나, J6가 기능적이다.

다른 구체예에서, 돼지 카파 경쇄 유전자 자리의 배자 계열 배열이 제공된다. 돼지 카파 경쇄 유전자 자리는 예를 들어, 도 2에서 제시된 바, 적어도 여섯개의 가변 부위, 여섯개의 접합 부위, 하나의 불변 부위 및 하나의 인핸서(enhancer) 부위를 포함한다.

다른 구체예에서, 돼지 람다(lambda) 경쇄 유전자 부위의 배자 계열 배열이 제공된다.

서열 번호 : 1-39에 나타낸 바, 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 서열 번호 : 1-39 중 임의의 하나에 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 상동성있는 핵산 서열 또한 제공된다. 덧붙여, 서열 번호 : 1-39 중 임의의 하나에서 10, 15, 17, 20, 25 또는 30개의 연속된 뉴클레오티드를 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 더욱이, 임의의 엄격한 환경(stringent condition) 하에서, 서열 번호 : 1-39, 뿐만 아니라, 여기에 상동성을 갖는 뉴클레오티드에 하이브리드(hybridize)하는 뉴클레오티드 서열을 제공한다.

뉴클레오티드 또는 아미노산 서열 레벨에서 상동성 또는 동일성은 서열 유사성 검색을 위하여 만들어진 blastp, blastn, blastx, tblastn 및 tblastx (예를 들어, Altschul, SF et al (1 997) Nucleic Acids Res 25:3389-3402 and Karlin et al , (1 900) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 87, 2264- 2268 참고) 프로그램에 사용된 알고리즘을 이용한 BLAST (Basic Local Alignment Search Tool)에 의하여 측정될 수 있다. BLAST 프로그램에 이용된 접근은 첫번째, a-의문 서열 및 데이터베이스 서열 사이의 갭의 유무와 함께 유사-단편을 고려하는 것이며, 그 다음, 확인된 모든 매치(match)의 통계적 유의를 평가하는 것이고, 마지막으로 기선택된 유의의 역치를 만족시키는 매치만을 요약하는 것이다. 예를 들어, Altschul et aL, (1994) (Nature Genetics 6, 119-129)를 참조한다.

히스토그램(histogram), 설명(descriptions), 정렬(alignments), 기대(expect)(예를 들어, 데이터베이서 서열에 대한 매치를 기록하기 위한 통계적 유의 역치), 컷오프(cutoff), 매트릭스(matrix) 및 필터(filter (low coM'plexity))를 위한 검색 파라미터는 디폴팅 세팅에 있다. blastp, blastx, tblastn, 및 tblastx에 이용되는 디폴트 기록 매트릭스(default scoring matrix)는 BLOSUM62 매트릭스(Henikoff et aL, (1 992) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 89, 10915-10919)이며, 이는 길이가 85(뉴클레오티드 염기 또는 핵산)를 넘는 의문 서열을 위하여 추천된다.

돼지 중쇄(Porcine Heavy Chain)

본 발명의 또다른 국면에서, 유제의(ungulate) 면역글로블린의 중쇄 유전자 자리를 암호화하는 새로운 유전자 서열이 제공된다. 일 구체예에서, 돼지 중쇄를 암호화하는 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공되는데, 이는 예를 들어 서열 번호 : 29에 나타낸 바, 적어도 하나의 가변 부위, 두개의 다양성 부위, 적어도 네개의 접합 부위 및 mu 불변 부위와 같은 적어도 하나의 불변 부위를 함유한다. 다른 구체예에서, 예를 들어 서열 번호 : 4에 나타낸 대로, 돼지의 중쇄 유전자 서열에서 적어도 네개의 접합 부위 및 mu 불변 부위와 같은 적어도 하나의 불변 부위를 함유하는 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 다른 구체예에서, 예를 들면 서열 번호 : 1에 나타낸 대로, 돼지 중쇄 유전자 서열의 첫번째 접합 부위에 5' 프랭킹 서열(5' flanking sequence)을 함유하는 뉴클레오티드 서열은 제공된다. 게다가, 예를 들면 서열 번호 : 4의 3' 부위에 나타낸 대로, 돼지 중쇄 유전자 서열의 첫번째 접합 부위에 3' 프랭킹 서열(5' flanking sequence)을 함유하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 다른 구체예에서, 서열 번호 : 1, 4, 29에 나타낸 대로, 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 서열 번호 : 1, 4, 29에 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99%의 상동성을 갖는 핵산 서열 또한 제공된다. 또한, 임의의 엄격한 환경(stringent condition) 하에서, 서열 번호 : 1, 4, 29, 뿐만 아니라, 이에 상동성을 갖는 뉴클레오티드에 하이브리드(hybridize)하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.

덧붙여, 서열 번호 1, 4, 29에서 적어도 10, 15, 17, 20, 25 또는 30의 연속된 뉴클레오티드를 함유하는 핵산 서열이 제공된다. 일구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 4에 적어도 17, 20, 25 또는 30의 연속된 뉴클레오티드를 함유하거나 서열 번호 29의 1-9,070 잔기를 함유한다. 다른 구체예에서, 서열 번호 29에 적어도 50, 100, 1,000, 2,500, 4,000, 4,500, 5,000, 7,000, 8,000, 8,500, 9,000, 10,000 또는 15,000의 연속된 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 또다른 구체예에서, 뉴클레오티드 서열은 서열 번호 29의 9,070-11039 잔기를 함유한다.

다른 구체예에서, 서열 번호 1, 4, 29에 나타낸 바, 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 서열 번호 1, 4, 29에 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성이 있는 핵산 서열 또한 제공된다. 덧붙여, 서열 번호 1, 4, 29에서 적어도 10, 15, 17, 20, 25 또는 30의 연속된 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 또한, 임의의 엄격한 환경(stringent condition) 하에서 서열 번호 1, 4 또는 29, 뿐만 아니라, 이에 상동성있는 뉴클레오티드에 하이브리드하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다.

일 구체예에서, 돼지 중쇄를 암호화하는 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공되며, 이는 예를 들어 서열 번호 29에 나타낸 바, 적어도 하나의 가변 부위, 두개의 다양성 부위, 적어도 네개의 접합 부위 및 mu 불변 부위와 같은 적어도 하나의 불변 부위를 함유한다. 서열 번호 29에서 중쇄의 다양성 부위는 예를 들어, 잔기 1089-1099 (D(pseudo))에 의해 나타냈으며, 중쇄의 접합 부위는 예를 들어, 잔기 1887-3352 (예를 들면, J(psuedo): 1887-1931, J(psuedo): 2364-2411, J(psuedo): 2756-2804, J (functional J): 3296-3352)에 의해 나타냈으며, 재조합 신호는 예를 들어 잔기 3001-3261 (노나머 (Nonamer)), 3292-3298 (헵타머 (Heptamer))에 의해 나타냈으며, 불변 부위는 다음 잔기들: 3353-9070 (J to C mu 인트론), 5522-8700 (Switch region), 9071-9388 (Mu 엑손 1), 9389-9469 (Mu 인트론 A), 9470-9802 (Mu 엑손 2), 9830- 10069 (Mu 인트론 B), 10070-10387 (Mu 엑손 3), 10388-10517 (Mu 인트론 C), 10815-11052 (Mu 엑손 4), 11034-11039 (폴리(A) 신호)에 의해 나타냈다.

돼지 카파 경쇄

다른 구체예로, 유제류 면역글로불린의 카파 경쇄 부위를 코딩하는 새로운 게놈 서열이 제공된다. 본 발명은 유제류 카파 경쇄 영역의 최초 보고된 게놈 서열을 제공한다. 일 구체예로, 돼지 카파 경쇄 부위를 코딩하는 핵산 서열이 제공된다. 다른 구체예로, 핵산 서열은 카파 경쇄의 적어도 하나의 연결 영역, 하나의 불변 영역 및/또는 하나의 인핸서 영역을 함유할 수 있다. 또 다른 구체예로, 뉴클레오티드 서열은 예를 들어 Seq ID No. 30에 나타낸 바와 같이 적어도 다섯 개의 연결 영역, 하나의 불변 영역 및 하나의 인핸서 영역을 포함할 수도 있다. 또 다른 구체예로, 예를 들어 Seq ID No. 12에 나타낸 바와 같이, 적어도 하나의, 적어도 두 개, 적어도 세 개, 적어도 네 개 또는 다섯 개의 연결 영역 및 돼지 게놈 카파 경쇄의 연결 영역에 3' 인접 서열을 함유하는 단리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 다른 구체예로, 예를 들어 Seq ID No. 25에 나타낸 바와 같이, 제 1 연결 영역에 5' 인접 서열을 함유하는 돼지 게놈 카파 경쇄의 단리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 다른 구체예로, 예를 들어 Seq ID No. 15, 16 및/또는 19에 나타낸 바와 같이, 돼지 게놈 카파 경쇄의 불변 영역에 3' 인접 서열 및 임의로 인핸서 영역의 5' 부분을 함유하는 단리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다.

또 다른 구체예로, Seq ID No. 30, 12, 25, 15, 16 또는 19로 나타내어지는 단리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. Seq ID No. 30, 12, 25, 15, 16 또는 19과 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동성인 핵산 서열이 제공된다. 또한, Seq ID No. 30, 12, 25, 15, 16 또는 19의 적어도 10, 15, 17, 20, 25 또는 30개의 근접 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 또한, Seq ID No. 1, 4 또는 29의 적어도 10, 15, 17, 20, 25 또는 30개의 근접 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 다른 구체예로, Seq ID No. 30의 적어도 50, 100, 1,000, 2,500, 5,000, 7,000, 8,000, 8,500, 9,000, 10,000 또는 15,000개의 근접 뉴클레오티드를 함유하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 임의로 엄격한 조건하에서 Seq ED Nos 30, 12, 25, 15, 16 또는 19에 하이브리드화하는 뉴클레오티드 서열 및 그의 동종 뉴클레오티드 동종도 제공된다.

일 구체예로, 예를 들어, Seq ID No. 30로 나타낸 바와 같이 적어도 다섯 개 의 연결 영역, 하나의 불변 영역 및 하나의 인핸서 영역을 함유하는 카파 경쇄를 코딩하는 단리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. Seq ID No. 30에 카파 경쇄의 코딩 영역이, 예를 들어 잔기 1-549 및 10026-10549로 나타내진 반면, 인트론 서열은, 예를 들어 잔기 550-10025으로 나타내어지고, 카파 경쇄의 연결 영역은, 예를 들어 잔기 5822-7207로 나타내어지며(예: J1:5822-5859, J2:6180-6218, J3:6486-6523, J4:6826-6863, J5:7170-7207), 불변 영역은 하기 잔기로 나타내어진다: 10026-10549(C 엑손) 및 10026-10354(C 코딩), 10524-10529(폴리(A) 시그널) 및 11160-11264(SINE 요소).

돼지 람다 경쇄

다른 구체예에서, 유제 동물 면역글로불린의 람다 경쇄 좌(locus)를 코딩하는 신규 게놈 서열이 제공된다. 본 발명은 유제 동물 람다 겸쇄 부위의 처음 기록된 게놈 서열을 제공한다. 일 구체예에서, 돼지 람다 경쇄 뉴클레오티드는 J 내지 C 유니트의 콘카타머(concatamer)를 포함한다. 특정 구체예에서, 서열 28번으로 제시된, 분리된 돼지 람다 뉴클레오티드 서열이 제공된다.

일 구체예에서, 예를 들어, 서열 32번으로 표시된, 돼지 람다 경쇄 게놈 서열의 제 1 람다 J/C 부위에 대한 5' 플랭킹(flanking) 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 추가로, 돼지 람다 경쇄 게놈 서열의 J/C 클러스터 부위에 대한 3' 플랭킹 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 람다 J/C의 하류에서 약 200개 염기쌍, 이를테면 서열 33번으로 표시된 것이 제공된다. 별도로, 돼지 람다 경쇄 게놈 서열의 J/C 클러스터 부위에 대한 3' 플랭킹 서열을 포함하는 뉴클레오티드 서열, 예를 들어 인핸서 부위(이를테면 서열 35번으로 표시된 것), 람다 하류에서 약 17.6 Kb(서열 36번으로 표시된 것), 람다 하류에서 약 19.1 Kb(서열 37번으로 표시된 것), 람다 하류에서 약 21.3 Kb(서열 38번으로 표시된 것), 및/또는 람다 하류에서 약 27 Kb(서열 39번으로 표시된 것)를 비롯하여, 람다 하류에서 약 12 Kb, 인핸서(서열 34번으로 표시된 것) 근처의, J/C 클러스터의 하류에서 약 11.8 Kb가 제공된다.

추가 구체예에서, 서열 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39번으로 표시된 분리된 뉴클레오티드 서열이 제공된다. 서열 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39번에 적어도 80, 85, 90, 95, 98 또는 99% 상동인 핵산 서열이 또한 제공된다. 또한, 서열 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39번의 적어도 10, 15, 17, 20, 25, 30, 40, 50, 75, 100, 150, 200, 250, 500 또는 1,000개 연속 뉴클레오티드가 제공된다. 서열 28, 31, 32, 33, 34, 35, 36, 37, 38, 또는 39번의 상동 뉴클레오티드뿐 아니라, 임의로 가혹한 조건하에, 이들에 혼성화하는 뉴클레오티드 서열이 추가로 제공된다.

소 람다 경쇄

추가 구체예에서, 소 람다 경쇄 좌를 코딩하는 핵산 서열이 제공되며, 이들 은 적어도 하나의 연결 부위-불변 부위 쌍 및/또는 적어도 하나의 가변 부위, 예를 들어 서열 31번으로 표시된 것을 포함할 수 있다. 서열 31번에서, 소 람다 C는 잔기 999-1333에서 발견될 수 있으며, J 내지 C 쌍은 C가 33848-34328의 보체이고 J가 35599-35628의 보체인 잔기 33848-35628의 보체에서 발견될 수 있고, V 부위는 잔기 10676-10728, 11092-11446, 15088-15381. 25239-25528, 29784-30228, 및 51718-52357에서(또는 이들의 보체에서) 발견될 수 있다. 서열 31번은 Genbank ACCESSION No. ACl 17274에서 발견될 수 있다. 분쇄된 소 람다 유전자를 함유하는 세포 및 동물뿐 아니라 서열 31번의 전부 또는 일부, 예를 들어 적어도 100, 250, 500, 1000, 2000, 5000, 10000, 20000, 500000, 75000 또는 100000개 연속 뉴클레오티드를 함유하는 벡터 및/또는 표적화 구성체가 추가로 제공된다.

프라이머

또 다른 구체예에서, 표적화 벡터의 3' 및 5' 서열을 생성하는 프라이머가 제공된다. 올리고뉴클레오티드 프라이머는 돼지 면역글로불린 게놈 서열, 이를테면 상기에 기재된, 서열 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31번에 혼성화될 수 있다. 특정 구체예에서, 프라이머는 가혹한 조건하에 상기에 기재된, 서열 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31번에 혼성화된다. 또 다른 구체예는 돼지 중쇄, 카파 경쇄 또는 람다 경쇄 핵산 서열, 이를테면 상기에 기재한, 서열 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31번에 혼성화될 수 있는 올리고뉴클레오티드 프로브를 제공한다. 폴리뉴클레오티드 프라이머 또는 프로브는 본 발명의 폴리뉴클레오티드에 혼성화되는 적어도 14 염기, 20 염기, 30 염기, 또는 50 염기를 가질 수 있다. 프로브 또는 프라이머는 길이가 적어도 14개인 뉴클레오티드일 수 있으며, 특정 구체예에서, 길이가 적어도 14, 20, 25, 28, 또는 30 개의 뉴클레오티드이다.

일 구체예에서, 작용성 연결 부위(J6 부위)을 포함하는 돼지 Ig 중쇄의 단편을 확대하는 프라이머가 제공된다. 비제한적인 일 구체예에서, 확대된 중쇄 단편은 서열 4번으로 표시될 수 있으며 이 단편을 확대하는데 사용된 프라이머는 5' 재조합 암(arm)을 생성하도록, 서열 2번과 같으나, 이에 한정되지 않는, J-부위의 일부에 상보적일 수 있으며 3' 재조합 암을 생성하도록, 서열 3번과 같으나, 이에 한정되지 않는 Ig 중쇄 mu 불변 부위의 일부에 상보적일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 돼지 Ig 중쇄 부위(서열 4번과 같으나, 이에 한정되지 않음)은 표적화 벡터로 서브클로닝되고 조합될 수 있다.

다른 구체예에서, 불변 부위를 포함하는 돼지 Ig 카파 경쇄의 단편을 확대하는 프라이머가 제공된다. 또 다른 구체예에서, J 부위를 포함하는 돼지 Ig 카파 경쇄의 단편을 확대하는 프라이머가 제공된다. 비제한적인 일 구체예에서, 이 단편을 확대하는데 사용된 프라이머는 5' 재조합 암을 생성하도록, 서열 21 또는 10번과 같으나, 이들에 한정되지 않는, J-부위의 일부에 상보적일 수 있고 3' 재조합 암을 생성하도록, 서열 14, 24 또는 18과 같으나 이들에 한정되지 않는, 불변 부위의 게놈 서열 3'에 상보적일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 돼지 Ig 중쇄의 부위(서열 20과 같으나, 이에 한정되지 않음)은 표적화 벡터에 서브클로닝되고 결합될 수 있다.

II. 면역글로불린 유전자의 유전학적 표적화

본 발명은 면역글로불린 유전자, 예를 들어 상기에 기재된 면역글로불린 유전자를 유전학적으로 변형시켜 비활성화시킨 세포를 제공한다. 유전학적으로 변형될 수 있는 동물 세포는 피부, 중간엽, 폐, 췌장, 심장, 장, 위, 방광, 혈관, 신장, 요도, 재생 기관, 및 배아, 태아, 또는 성체 동물의 전체 또는 일부의 분리된 제제와 같으나, 이들에 한정되지 않는, 다양한 서로 다른 기관과 조직으로부터 얻어질 수 있다. 본 발명의 일 구체예에서, 세포는 상피 세포, 섬유아세포, 신경 세포, 케라티노사이트, 조혈 세포, 멜라니사이트, 콘드로사이트, 림프구(B 및 T), 매크로파지, 모노사이트, 단핵 세포, 심근 세포, 다른 근 세포, 과립층 세포, 난포 세포, 표피 세포, 내피 세포, 랑게르한스섬 세포, 혈액 세포, 혈액 전구체 세포, 골 세포, 골 전구체 세포, 신경 줄기 세포, 원시 줄기 세포, 간세포, 케라티노사이트, 배꼽정맥 내피 세포, 대동맥 내피 세포, 미세혈관 내피 세포, 섬유아세포, 간 별세포, 대동맥 평활근 세포, 심근 세포, 뉴런, 쿠퍼 세포, 평활근 세포, 쉬완 세포, 및 상피 세포, 적혈구, 혈소판, 뉴로필, 림프구, 모노사이트, 에오시노필, 바소필, 아디포사이트, 콘드로사이트, 췌장 섬 세포, 갑상선 세포, 부갑상선 세포, 이하선 세포, 종양 세포, 아교 세포, 별아교 세포, � ��혈구 세포, 백혈구 세포, 매크로파지, 상피 세포, 체세포, 뇌하수체 세포, 부신 세포, 모세포, 방광 세포, 신장 세포, 망막 세포, 간상 세포, 원추 세포, 심장 세포, 박동조절 세포, 지라 세포, 항원 표시 세포, 기억 세포, T 세포, B 세포, 플라즈마 세포, 근육 세포, 난소 세포, 자궁 세포, 전립선 세포, 질 상피 세포, 정자 세포, 고환 세포, 생식 세포, 난 세포, 레이디히 세포, 관주위 세포, 써토리 세포, 루테인 세포, 경부 세포, 자궁내막 세포, 유방 세포, 소포 세포, 점막 세포, 섬모 세포, 비각질 상피 세포, 각질 상피 세포, 폐 세포, 배상 세포, 원주 상피 세포, 편평 상피 세포, 골세포, 골아세포, 및 파골세포로 구성되나, 이들에 한정되지 않는 그룹 중에서 선택될 수 있다. 별도의 일 구체예에서, 배아 줄기 세포가 사용될 수 있다. 배아 줄기 세포주가 이용될 수 있거나 배아 중기 세포가 숙주, 이를테면 돼지로부터 새로 얻을 수 있다. 세포를 적합한 섬유아세포-영양 세포층 상에 성장시키거나 백혈병 억제 인자(LIF)의 존재하에 성장시킬 수 있다.

특정 구체예에서, 세포는 섬유아세포일 수 있으며; 특정 일 구체예에서, 세포는 태아 섬유아세포일 수 있다. 섬유아세포는 적합한 체세포형이다. 왜냐하면 이들은 발생 태아 및 성체 동물로부터 많은 양으로 얻을 수 있기 때문이다. 이들 세포는 급속 배가 시간으로 시험관에 쉽게 전달될 수 있으며 유전자 표적화 방법에 사용하는데 클론으로 전달될 수 있다.

표적화 구성체

상동적 재조합

일 구체예에서, 면역글로불린 유전자는 상동적 조환을 통해 세포에 유전학적으로 표적화될 수 있다. 상동적 재조합은 내인성 유전자에서 부위-특이 변형을 허용하며 따라서 새로운 변형이 게놈으로 설계될 수 있다. 상동적 재조합에서, 들어오는 DNA는 실질적으로 상동적인 DNA 서열을 함유하는 게놈에서 한 부위와 상호작용하고 일체화된다. 비-상동적("랜덤" 또는 "부정") 일체화에서, 들어오는 DNA는 게놈 내 상동적 서열에서 발견되지 않으며 많은 수의 포텐셜 위치 중 하나에서, 어느 곳에 일체화된다. 일반적으로, 더 많은 진핵 세포에 의한 연구에서 상동적 재조합의 빈도가 랜덤 합체의 빈도보다 훨씬 적다는 것이 나타났다. 이들 빈도의 비율은 상동적 재조합(즉, 게놈에서 외인성 "표적화 DNA"와 상응하는 "표적 DNA" 사이의 재조합)을 통한 일체화에 좌우되는 "유전자 표적화"에 대한 직접적 해석이다.

많은 논문에서 포유류 세포에서 상동적 재조합의 이용을 기재하고 있다. 이들 논문의 예는 Kucherlapati et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81:3153-3157, 1984; Kucherlapati et al., MoI. Cell. Bio. 5:714-720, 1985; Smithies et al, Nature 317:230-234, 1985; Wake et al., MoI. Cell. Bio. 8:2080-2089, 1985; Ayares et al., Genetics 111:375-388, 1985; Ayares et al., MoI. Cell. Bio. 7:1656-1662, 1986; Song et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 84:6820-6824, 1987; Thomas et al. Cell 44:419-428, 1986; Thomas and Capecchi, Cell 51: 503- 512, 1987; Nandi et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 85:3845-3849, 1988; and Mansour et al., Nature 336:348-352, 1988. Evans and Kaufinan, Nature 294:146-154, 1981; Doetschman et al., Nature 330:576-578, 1987; Thoma and Capecchi, Cell 51:503-512,4987; Thompson et al., Cell 56:316-321, 1989이다.

본 발명은 상기에 기재한 세포들과 같은, 세포에서 면역글로불린 유전자를 비활성화하는데 상동적 재조합을 이용할 수 있다. DNA는 작용성 면역글로불린의 발현을 방지하도록, 선천 유전자의 적어도 하나, 임의로 양쪽 카피로 변경의 도입과 함께, 특정 위치에 유전자의 적어도 일부를 포함할 수 있다. 변경은 삽입, 결실, 치환 또는 이들의 조합일 수 있다. 변경이 비활성화되는 단 하나의 카피로 도입될 때, 표적 유전자의 단일 비돌연변이 카피를 가진 세포가 증폭되고 제 2 표적화 단계로 처리될 수 있으며, 여기서 변경은 제 1 변경과 동일하거나 다를 수 있으며, 통상 다르고, 결실, 또는 치환이 관련될 때, 최초 도입된 변경의 적어도 일부가 겹칠 수 있다. 이러한 제 2 표적화 단계에서, 동일한 암의 상동성을 가지나, 서로 다른 포유류 선택성 마커를 함유한 표적화 벡터가 사용될 수 있다. 생성된 형질전환주를 작용성 표적 항원의 부존재에 대해 스크리닝하고 세포의 DNA를 추가로 스크리닝하여 야생형 표적 유전자의 부존재를 확인할 수 있다. 별도로, 표현형에 관해 동종접합성은 돌연변이에 대한 이종접합체 숙주를 번식시켜 얻을 수 있다.

표적화 벡터

다른 구체예에서, 핵산 표적화 벡터 구성체가 또한 제공된다. 표적화 벡터는 세포에서 상동적 재조합을 완성하도록 설계될 수 있다. 이들 표적화 벡터를 포유류 세포로 형질전환하여 상동적 재조합을 통해 유제 동물 중쇄, 카파 경쇄 또는 람다 경쇄 유전자를 표적화할 수 있다. 일 구체예에서, 표적화 벡터는 유제 동물 중쇄, 카파 경쇄 또는 람다 경쇄 게놈 서열의 게놈 서열에 상동인 3' 재조합 암 및 5' 재조합 암(즉, 플랭킹 서열), 예를 들어, 상기에 기재한, 서열 1, 4, 29, 30, 12, 25, 15, 16, 19, 28 또는 31번으로 표시된 서열을 함유할 수 있다. 상동 DNA 서열은 적어도 15 bp, 20 bp, 25 bp, 50 bp, 100 bp, 500 bp, l kbp, 2 kbp, 4 kbp, 5 kbp, 10 kbp, 15 kbp, 20 kbp, 또는 50 kbp의 서열, 특히 게놈 서열에 상동인, 연속 서열을 포함할 수 있다. 3' 및 5' 재조합 암은 이들이 게놈 서열의 적어도 하나의 작용성 가변체, 연결, 다양성, 및/또는 불변 부위의 3' 및 5' 말단을 플랭킹하도록 설계될 수 있다. 작용성 부위의 표적화는 작용성 부위에 비활성화를 부여할 수 있으며, 이것은 세포의 비활성화를 초래하여 작용성 면역글로불린 분자를 생성한다. 다른 구체예에서, 상동 DNA 서열은 하나 이상의 인트론 및/또는 엑손 서열을 포함할 수 있다. 핵산 서열에 더해, 발현 벡터는 선택성 마커 서열,이를테면 향상된 그린 플루오레슨트 프로테인(eGFP) 유전자 서열, 개시 및/또는 인핸서 서열, 폴리 A-테일 서열, 및/또는 원핵 및/또는 진핵 숙주 세포에서 구성체의 발현을 제공하는 핵산 서열을 함유할 수 있다. 선택성 마커는 5' 및 3' 재조합 암 서열 사이에 위치할 수 있다.

세포의 표적 좌는 DNA를 세포로 도입함으로써 변형될 수 있으며, 여기서 DNA는 표적 좌에 상동성이 있고 마커 유전자를 포함하여, 합체된 구성체를 포함하는 세포의 선택을 가능하게 한다. 표적 벡터에서 상동 DNA는 표적 좌에서 염색체 DNA와 재조합할 것이다. 마커 유전자는 상동 DNA 서열, 3' 재조합 암 및 5' 재조합 암에 의해 양측 상에 플랭킹될 수 있다. 표적화 벡터의 구성방법은 본 기술에 기재된 바 있다(참조예, Dai et al., Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002; WO 00/51424).

다양한 구성체가 표적 좌에서 상동 재조합을 위해 제조될 수 있다. 구성체는 표적 좌와 상동인 적어도 50 bp, 100 bp, 500 bp, l kbp, 2 kbp, 4 kbp, 5 kbp, 10 kbp, 15 kbp, 20 kbp, 또는 50 kbp의 서열을 포함할 수 있다. 서열은 면역글로불린 유전자의 연속 서열을 포함할 수 있다.

표적 DNA 서열의 상동성 정도를 측정하는데 다양한 고려사항, 이를테면 표적 좌의 크기, 서열의 이용성, 표적 좌에서 이중 교차 이벤트의 상대 효능 및 다른 서열과 표적 서열의 유사성이 관련될 수 있다.

표적화 DNA는 DNA가 변형될 게놈에서 상응하는 표적 서열과 원하는 서열 변형을 실질적으로 동종으로 플랭킹하는 서열을 포함할 수 있다. 실질적으로 동종 서열은 상응하는 표적 서열(원하는 서열 변형 제외)에 적어도 약 95%, 97-98%, 99.0-99.5%, 99.6-99.9%, 또는 100% 동일할 수 있다. 특정 구체예에서, 표적화 DNA와 표적 DNA는 DNA 스트레치(stretch)를 100% 동일한 적어도 약 75, 150 또는 500 염기쌍으로 공유할 수 있다. 따라서, 표적화 DNA는 표적화되는 세포주에 밀접한 세포로부터 유래될 수 있거나; 표적화 DNA는 표적화되는 세포와 동일한 세포주 또는 동물의 세포로부터 유래될 수 있다.

돼지 중쇄 표적화

본 발명의 특정 구체예에서, 돼지 중쇄 좌를 표적화하는 표적화 벡터가 제공된다. 특정 일 구체예에서, 표적화 벡터는 돼지 면역글로불린 중쇄 좌의 J6 부위의 3' 및 5' 플랭킹 서열에 상동인 서열을 함유하는 5' 및 3' 재조합 암을 함유할 수 있다. J6 부위가 돼지 면역글로불린 중쇄 좌의 유일한 작용성 연결 부위가므로, 이 부위는 작용성 돼지 중쇄 면역글로불린의 발현을 방지할 것이다. 특정 구체예에서, 표적화 벡터는 임의로 J1-4를 포함하여, J6 부위의 게놈 서열 5'에 상동인 서열을 함유하는 5' 재조합 암 및 mu 불변 부위("J6 표적화 구성체")을 포함하여, J6 부위의 게놈 서열 3'에 상동인 서열을 함유하는 3' 재조합 암을 함유할 수 있다(참조예, 서열 5번 및 도 1). 다른 특정 구체예에서, 5' 표적화 암은 J1의 서열 5', 이를테면 서열 1번 및/또는 서열 4번에 제시된 것을 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 5' 표적화 암은 J1, J2 및/또는 J3의 서열 5', 예를 들어 대략 잔기 1-300, 1-500, 1-750, 1-1000 및/또는 1-1500 서열 4번에 제시된 것을 함유할 수 있다. 추가 구체예에서, 5' 표적화 암은 불변 부위의 서열 5', 예를 들어 서열 4번의 대략 잔기 1-300, 1-500, 1- 750, 1-1000, 1-1500 및/또는 1-2000 또는 그의 단편 및/또는 서열 5의 연속 서열 또는 그의 단편을 함유할 수 있다. 다른 구체예 에서, 3' 표적화 암은 불변 부위의 서열 3'을 함유할 수 있고/있거나 불변 부위, 예를 들어 서열 4번의 잔기 7000-8000 및/또는 8000-9000 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 다른 구체예에서, 표적화 벡터는 서열 4번의 연속 서열 또는 그의 단편을 함유할 수 있다. 다른 구체예에서, 표적화 벡터는 다양성 부위의 게놈 서열 5'에 상동인 서열을 함유하는 5' 재조합 암, 및 돼지 중쇄 좌의 다양성 부위의 게놈 서열 3'에 상동인 서열을 함유하는 3' 재조합 암을 함유할 수 있다. 추가 구체예에서, 표적화 벡터는 mu 불변 부위의 게놈 서열 5'에 상동인 서열을 함유하는 5' 재조합 암 및 돼지 중쇄 좌의 mu 불변 부위의 게놈 서열 3'에 상동인 서열을 함유하는 3' 재조합 암을 함유할 수 있다.

추가 구체예에서, 표적화 벡터는 다음 서열의 어느 하나를 포함할 수 있으나, 이에 한정되지 않는다: 예를 들어 서열 29번의 잔기 1089-1099(D(슈도))으로 표시되는 중쇄의 다양성 부위, 예를 들어 서열 29번의 잔기 1887-3352(예를 들어: J(슈도): 서열 29번의 1887-1931, J(슈도): 서열 29번의 2364-2411, J(슈도: 서열 29번의 2756-2804, J(작용성 J): 서열 29번의 3296-3352)로 표시되는 중쇄의 연결 부위, 예를 들어 서열 29번의 잔기 3001-3261(노나머), 서열 29번의 3292-3298(헵타머)로 표시되는 재조합 시그널, 다음 잔기로 표시되는 불변 부위: 서열 29번의 3353-9070(J 내지 C mu 인트론), 서열 29번의 5522-8700(스위치 부위), 서열 29번의 9071-9388(Mu 엑손 1), 서열 29번의 9389-9469(Mu 인트론 A), 서열 29번의 9470-9802(Mu 엑손 2), 서열 29번의 9830-10069(Mu 인트론 B), 서열 29번의 10070-10387(Mu 엑손 3), 서열 29번의 10 388-10517(Mu 인트론 C), 서열 29번의 10815- 11052(Mu 엑손 4), 서열 29번의 11034-11039(PoIy(A) 시그널) 또는 그의 단편 또는 조합물. 추가로, 서열 29번의 적어도 약 17, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 또는 300 뉴클로티드의 연속 서열 또는 그의 단편 및/또는 조합물이 중쇄 표적화 벡터에 대한 표적화 서열로서 사용될 수 있다. 일반적으로 표적화 구성체를 설계할 때 하나의 표적화 암은 다른 표적화 암의 5'일 것으로 이해된다.

다른 구체예에서, 돼지 중쇄 유전자의 발현을 중단하도록 설계된 표적화 벡터는 중쇄의 불변 부위를 표적화하는 재조합 암, 예를 들어 3' 또는 5' 재조합 암을 함유할 수 있다. 일 구체예에서, 재조합 암은 mu 불변 부위, 예를 들어 상기에 기재되거나 문헌[Sun & Butler Immunogenetics (1997) 46: 452-460]에 개시된 C mu 서열을 표적화할 수 있다. 다른 구체예에서, 재조합 암은 델타 불변 부위, 이를테면 문헌[Zhao et al. (2003) J imunol 171: 1312-1318]에 roto된 서열, 또는 알파 불변 부위, 이를테면 문헌[Brown & Butler (1994) Molec Immunol 31: 633-642]에 기재된 서열을 표적화할 수 있다.

돼지 카파쇄 표적화

본 발명의 특정 구체예에서, 돼지 카파쇄 부위를 표적으로 하는 표적 벡터가 제공된다. 일 특정 구체예로, 표적 벡터는 돼지 면역글로불린 카파쇄 부위 불변 영역의 3' 및 5' 인접 서열에 상동 서열을 함유하는 5' 및 3' 재조합 팔을 함유할 수 있다. 본 발명은 돼지 면역글로불린 카파 경쇄 부위에 하나의 불변 영역만이 있음을 알아냈기 때문에, 기능성 돼지 카파 경쇄 면역글로불린의 발현을 저지할 것이다. 특정 구체예로, 표적 벡터는 임의로 연결 영역을 포함하는, 불변 영역의 게놈 서열 5'에 상동 서열을 함유하는 5' 재조합 팔, 및 불변 영역의 게놈 서열 3'에 상동 서열을 함유하는 3' 재조합 팔을 포함한다[도 2 참조]. 또한, 이러한 카파 불변 표적 작제물은 5' 및 3' 재조합 팔 사이에 위치한 선택 마커 유전자를 함유할 수도 있다[예를 들어, Seq ID No 20 및 도 2 참조]. 다른 구체예로, 표적 벡터는 돼지 카파 경쇄 부위에 있는 연결 영역의 게놈 서열 5'에 상동 서열을 함유하는 5' 재조합 팔, 및 연결 영역의 게놈 서열 3'에 상동 서열을 함유하는 3' 재조합 팔을 함유할 수도 있다. 다른 구체예로, 표적 벡터의 5' 팔은 Seq ID No 12 및/또는 Seq DD No 25 또는 임의의 근접 서열 또는 이들의 단편을 포함할 수 있다. 다른 구체예로, 표적 벡터의 3' 팔은 Seq ID No 15, 16 및/또는 19 또는 임의의 근접 서열 또는이들의 단편을 포함할 수 있다.

또 다른 구체예로, 표적 벡터는 하기 서열이 예시되나 이들에 한정되지 않는 서열들을 포함할 수도 있다: 카파 경쇄의 코딩 영역은 예를 들어 Seq ID No 30의 잔기 1-549 및 Seq ID No 30의 10026-10549로 나타내어지는 반면, 인트론 서열은, 예를 들어, Seq ID No 30의 잔기 550-10025로 나타내어지고, 카파 경쇄의 연결 영역은, 예를 들어 Seq ID No 30의 잔기 5822- 7207로 나타내어지며(예를 들어, Seq ID No 30의 J1:5822-5859, Seq ID No 30의 J2:6180-6218, Seq ID No 30의 J3:6486-6523, Seq ID No 30의 J4:6826-6863, Seq ID No 30의 J5:7170-7207), 불변 영역은 하기 잔기로 나타내어진다: Seq ID No 30의 10026-10549(C 엑손) 및 Seq ID No 30의 10026-10354(C 코딩), Seq ID No 30의 10524-10529(폴리(A) 시그널) 및 Seq ID No 30의 11160-11264(SINE 요소) 또는 이들의 임의 단편 또는 조합. 또한, Seq ID No 30의 임의의 근접 서열 적어도 약 17, 20, 30, 40, 50, 100, 150, 200 또는 300개의 뉴클레오티드 또는 이들의 단편 및/또는 조합이 중쇄 표적 벡터에 대한 표적 서열로 사용될 수도 있다. 일반적으로, 표적 작제물을 설계하는 경우, 하나의 표적 팔은 다른 표적 팔의 5'일 것으로 이해하여야 한다.

돼지 람다 사슬 표적화(Porcine Lambda Chain Targeting)

본 발명의 특정 구체예에서, 돼지 중쇄 유전자 부위를 표적화하기 위한 표적화 벡터가 제공된다. 일 구체예에서, 5' 암(5' arm)을 함유하는 첫번째 JC 클러스터(cluster) 5'에 위치한 서열 및 3' 암(3' arm)을 함유하는 마지막 JC 클러스터(cluster) 3' 서열을 함유하고, 이에 따라, 람다 유전자 부위의 기능적 발현을 방지하는 표적화 컨스트럭트(construct)를 설계함으로써 람다는 표적화될 수 있다(도 3-4 참조). 일구체예에서, 표적화 벡터는 임의의 연속된 서열(연속된 서열의 대략 17, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300 또는 5000와 같이) 또는 서열 번호 28의 단편을 함유할 수 있다. 일구체예에서, 5' 표적화 암은 서열 번호 32를 함유할 수 있으며, 이는 돼지 람다 경쇄 유전자 서열의 첫번째 람다 J/C 부위에 5' 프랭킹 서열 또는 임의의 연속된 서열(연속된 서열의 대략 17, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300 또는 5000 뉴클레오티드와 같이) 또는 이들의 단편을 함유한다(예를 들어 도 5 참조). 다른 구체예에서, 3' 표적화 암은: 람다 J/C의 거의 200 염기쌍 다운스트림(downstream)으로부터, 돼지 경쇄 유전자 서열의 J/C 클러스터 영역에 3' 프랭킹 서열을 함유하는 서열 번호. 33; 인핸서 근처, J/C 클러스터의 거의 11.8Kb 다운스트림에서, 돼지 경쇄 유전자 서열의 J/C 클러스터 부분에 3' 프랭킹 서열을 함유하는 서열 번호. 34; 람다의 거의 12Kb 다운스트림을 함유하고, 인핸서 부분을 함유하는 서열 번호. 35; 람다의 거의 17.6Kb 다운스트림을 함유하는 서열 번호. 36;람다의 거의 19.1Kb 다운스트림을 함유하는 서열 번호. 37; 람다의 거의 21.3Kb 다운스트림을 함유하는 서열 번호. 38; 람다의 거의 27Kb 다운스트림을 함유하는 서열 번호. 39; 또는 임의의 연속된 서열(연속된 서열의 대략 17, 20, 30, 40, 50, 75, 100, 200, 300 또는 5000 뉴클레오티드와 같은) 또는 서열 번호. 32-39의 단편(예를 들어, 도 6 참조)을 함유할 수 있으나, 이 중 하나 또는 그 이상에 한정되지 않는다. 일반적으로 표적화 컨스트럭트를 설계할 때, 하나의 표적화 암(arm)은 다른 표적화 암(arm)의 5'일 것으로 이해된다.

추가적인 구체예에서, 람다 유전자 부위를 위한 표적화 컨스트럭트는 예를 들면, lox와 같은 부위 특이적 재조합효소(recombinase) 부위를 함유할 수 있다. 일 구체예에서, 표적화 암은 표적화 영역에 부위 특이적 재조합효소 부위를 삽입할 수 있다. 그 다음, 부위 특이적 재조합효소는 두개의 부위 특이적 재조합효소 부위 사이에 끼여있는 뉴클레오티드가 제거되도록 활성화되고/거나, 세포에 적용된다.(예를 들어, 도 6 참조).

선택가능한 마커 유전자(Selectable Marker Genes)

DNA 컨스트럭트는 내인성(endogenous) 표적 면역글로블린 유전자를 변형하도록 설계될 수 있다. 컨스트럭트를 표적화하기 위한 상동성 서열은 하나 또는 그 이상의 결실, 삽입, 치환 또는 이의 조합들을 가질 수 있다. 변형은 표적 유전자의 업스트림 서열을 갖는 리딩 프레임(reading frame)에 융합된 선택가능한 마커 유전자의 삽입일 수 있다.

적합한 선택가능한 마커 유전자는: HAT 배지(하이포잔틴, 아미노프테린 및 티미딘(hypoxanthine, aminopterin 및 thymidine))에서 자랄 수 있는 능력을 부여하는 tk 유전자(티미딘 키나아제(thymidine kinase)) 또는 hprt 유전자(하이포잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제(hypoxanthine phosphoribosyltransferase))와 같이, 특정 배지 기질에서 자랄 수 있는 능력을 부여하는 유전자; MAX 배지(마이코페놀릭산, 아데닌 및 잔틴(mycophenolic acid, adenine, 및 xanthine))에서의 성장을 허용하는 박테리아 gpt 유전자(구아닌/잔틴 포스포리보실트랜스퍼라제(guanine/xanthine phosphoribosyltransferase))를 포함하나, 이에 한정되지 않는다. 예를 들어, Song, KY., et al. Proc. Nat'l Acad. Sci. USA 84:6820-6824 (1987); Sambrook, J., et al., Molecular Cloning A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY (1989), Chapter 16을 참고한다. 선택가능한 마커의 다른 예들은: 항생제와 같은 화합물에 저항성을 부여하는 유전자, 선택된 기질에서 자랄 수 있는 능력을 부여하는 유전자, 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein), 증강된 녹색 형광 단백질(enhanced green fluorescent protein, eGFP)과 같이 형광성을 감지할 수 있는 신호를 생산하는 단백질을 암호화하는 유전자를 함유한다. 상기의 마커의 넓은 다양성은 알려져 있으고, 유용하며, 이는 예를 들어, 네오마이신(neomycin) 저항성 유전자(neo)(Southern, P., and P. Berg, J. MoI. Appl. Genet. 1:327-341 (1982)); 및 히그로마이신(hygromycin) 저항성 유전자(hyg)(Nucleic Acids Research 11:6895-6911 (1983), and Te Riele, H., et al., Nature 348:649-651 (1990))와 같은 항생제 저항성 유전자를 함유한다. 다른 선택가능한 마커 유전자는: 아세토히드록시산 신타아제(acetohydroxyacid synthase(AHAS)), 알카라인 포스파타제(alkaline phosphatase (AP)), 베타 갈락토시다제(beta galactosidase (LacZ)), 베타 글루코로니다제(beta glucoronidase (GUS)), 클로람페니콜 아세틸트랜스퍼라제(chloramphenicol acetyltransferase (CAT)), 녹색 형광 단백질(green fluorescent protein (GFP)), 적색 형광 단백질(red fluorescent protein (RFP)), 노란색 형광 단백질(yellow fluorescent protein (YFP)), 청록 형광 단백질(cyan fluorescent protein (CFP)), 당근과산화수소(horseradish peroxidase (HRP)), 루시퍼라제(luciferase (Luc)), 노팔린 신타아제(nopaline synthase (NOS), 옥토파인 신타아제(octopine synthase (OCS)), 및 이의 유도체를 함유한다. 앰피실 린(ampicillin), 블레오마이신(bleomycin), 클로람페니콜(chloramphenicol), 젠타마이신(gentamycin), 히그로마이신(hygromycin), 카나마이� ��(kanamycin), 리노마이신(lincomycin), 메쏘트렉세이트(methotrexate), 포스포이노트리신(phosphinothricin), 푸로마이신(puromycin) 및 테트라사이클린(tetracycline)에 저항성을 부여하는 다양한 선택가능한 마커가 유용하다.

항생제 저항성 유전자와 음성 선택 요소(negative selection factor)를 병합시키는 방법은 종래의 보통 기술의 그것과 유사할 것이다(see, eg, WO 99/15650; US Patent No. 6,080,576; US Patent No. 6,136,566; Niwa et al., J. Biochem. 113:343-349 (1993); and Yoshida et al., Transgenic Research 4:277-287 (1995)).

선택가능한 마커의 조합 또한 이용될 수 있다. 예를 들어, 면역글로블린 유전자를 표적화하기 위하여, neo 유전자(상기에서 언급된 바, 그것 자신의 프로모터와 함께, 또는, 그것 자신의 프로모터 없이)를 면역글로블린 유전자에 상동성을 갖는 DNA 서열에 클로닝할 수 있다. 마커의 조합체를 이용하기 위하여, HSV-tk 유전자는 표적화 DNA의 바깥쪽에 있도록 클론될 수 있다(필요하다면, 다른 선택가능한 마커는 반대 프랭크(flank)에 위치할 수 있다). DNA 컨스트럭트를 타겟된 세포에 도입시킨 후, 세포를 적합한 항생제에서 선택할 수 있다. 이러한 특정 실시예에서, G418 및 간시클로버(gancyclovir)에 저항성이 있는 세포들은 대부분 neo 유전자가 면역글로블린 유전자에 재결합되는 동종의 재조합에 의하여 발생할 것이며, tk 유전자는 그것이 이중 크로스오버(double crossover) 부분의 바깥쪽에 위치하기 때문 에 결실된다. 결실은 적어도 약 50bp, 더욱 일반적으로 적어도 약 100bp, 일반적으로 약 20kbp를 넘지 않을 수 있으며, 여기서, 결실은 적어도 하나 또는 그 이상의 엑손의 일부분, 하나 또는 그 이상의 인트론의 일부분을 함유하는 코딩 영역(coding region)의 적어도 한 부분을 일반적으로 함유할 수 있으며, 프랭킹 비-코딩 영역의 일부분(flanking non-coding region), 특히 5'-비-코딩 영역(전사적 조절 부분)을 함유할 수 있거나, 함유하지 않을 수 있다. 이에 따라, 동종 부분은 코딩 영역 하에서, 5'-비-코딩 부분으로 또는 대체적으로 3'-비-코딩 부분으로 확대될 수 있다. 삽입은 일반적으로 10kbp를 넘지 않으며, 보통은 5kbp를 넘지 않으며, 일반적으로 적어도 50bp이며, 더욱 일반적으로 적어도 200bp이다.

동종의 부분은 프레임 이동(frame shift) 또는 주요 아미노산 변화 또는 기능 장애가 있는 대립형질(allele)을 수정할 수 있는 돌연변이를 위해 제공된 것에서, 표적 유전자를 비활성화할 수 있는 돌연변이를 포함할 수 있다. 돌연변이는 동종 프랭킹 서열의 약 5%를 넘지 않는 포착하기 어려운 변화일 수 있다. 마커 유전자는 유전자의 돌연변이를 원하는 곳의 인트론 또는 액손으로 삽입될 수 있다.

컨스트럭트는 종래에 알려진 방법들에 따라 준비될 수 있으며, 다양한 단편들을 접촉시킬 수 있으며, 적합한 벡터에로 도입, 클론, 분석되며, 그 다음, 원하는 컨스트럭트를 얻을 때까지 조작된다. 제한 분석(restriction analysis), 절제(excision), 프로브의 확인(identification of probe) 등을 허용하기 위한, 다양한 변형이 서열에 만들어질 수 있다. 침묵 돌연변이는 바람직하게 도입될 수 있다. 양한 단계에서, 제한 분석(restriction analysis), 시퀀싱(sequencing), 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction)으로 증폭, 프라이머 수선(primer repair), 실험상 돌연변이유발(mutagenesis) 등이 채용될 수 있다.

컨스트럭트는 컨스트럭트가 클론되고 분석될 수 있는 각 단계에서, 예를 들어, E.coli 에 의하여 인지될 수 있는 기점(origin)을 포함하는 원핵생물 복제 시스템을 포함하는 박테리아 벡터를 이용하여 준비될 수 있다. 삽입에 이용되는 마커와 동일하거나 다른 마커가 이용될 수 있으며, 이는 표적 세포에 도입되기 전에 제거될 수 있다. 벡터를 함유하는 컨스트럭트가 한번 완전하게 되면, 박테리아 서열의 제거, 선형화(linearization), 동종 서열에서 짧은 결실의 도입과 같은 것에 의하여, 조작될 수 있다. 마지막 조작 후에, 컨스트럭트는 세포에 도입될 수 있다.

본 발명은 또한, 면역글로블린 유전자의 서열을 함유하는 재조합 컨스트럭트를 함유한다. 컨스트럭트는 본 발명의 서열에 정방향 또는 역방향으로 삽입된, 플라스미드 또는 바이러스 벡터와 같은 벡터를 포함한다. 컨스트럭트는 또한, 예를 들어, 서열에 사용가능하게 링크된 프로모터를 함포함하는 조절 서열을 함유할 수 있다. 많은 수의 적합한 벡터 및 프로모터는 본 분야의 기술자에게 알려져 있으며, 상업적으로 입수가능하다. 다음 벡터들은 예로써 제공된다. 박테리아의: pBs, pQE-9 (Qiagen), phagescript, PsiX174, pBluescript SK, pBsKS, pNH8a, pNH16a, pNH18a, pNH46a (Stratagene); pTrc99A, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRⅠT5 (Pharmacia). 진핵생물의: pWLneo, pSv2cat, pOG44, pXTl, pSG (Stratagene) pSVK3, pBPv, pMSG, pSVL (Pharmiacia), 바이러스 오리진 벡터(viral origin vectors)(M13 벡터, 박테리아 파지 1 벡터, 아데노바이러스 벡터 및 레트로바이러 스 벡터), 높은, 낮은 그리고 조절가능한 카피 수(copy number) 벡터, 단일 호스트에서 조합의 이용을 위해 적합한 레플리콘(replicon)을 갖는 벡터(pACYC184 및 pBR322) 및 진핵생물 에피솜 복제 벡터(eukaryotic episomal replication vectors (pCDM8))를 함유한다. 다른 벡터들은 pcDNA II, pSL301, pSE280, pSE380, pSE420, pTrcHisA, B, 및 C, pRSET A, B, 및 C (Invitrogen, Corp.), pGEMEX-1, 및 pGEMEX-2 (Promega, Inc.), pET 벡터 (Novagen, Inc.), pTrc99A, pKK223-3, pGEX 벡터, pEZZ18, pRIT2T, 및 pMC1871 (Pharmacia, Inc.), pKK233-2 및 pKK388-l (Clontech, Inc.), 및 pProEx-HT (Invitrogen, Corp.) 및 변형체 및 이의 유도체와 같은 원핵생물 발현 벡터를 함유한다. 다른 벡터들은 pFastBac, pFastBacHT, pFastBacDUAL, pSFV, 및 pTet- Splice (Invitrogen), pEUK-Cl, pPUR, pMAM, pMAMneo, pBIlOl, pBI121, pDR2, pCMVEBNA, 및 pYACneo (Clontech), pSVK3, pSVL, pMSG, pCHllO, 및 pKK232-8 (Pharmacia, Inc.), p3'SS, pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, 및 pOG44 (Stratagene, Inc.), 및 pYES2, pAC360, pBlueBacHis A, B, 및 C, pVL1392, pBlueBacⅢ, pCDM8, pcDNAl, pZeoSV, pcDNA3 pREP4, pCEP4, 및 pEBVHis (Invitrogen, Corp.) 및 변형체 및 이의 유도체와 같은 진핵생물 발현 벡터를 함유한다. 이용될 수 있는 추가적인 벡터는 pUC18, pUC19, pBlueScript, pSPORT, 코스미드(cosmid), 파지미드(phagemid), YACs (이스트 인공 염색체), BACs (박테리아 인공 염색체), Pl (Escherichia coli phage), pQE70, pQE60, pQE9 (quagan), pBS 벡터, PhageScript 벡터, BlueScript 벡터, pNH8A, pNH16A, pNH18A, pNH46A (Stratagene), pcDNA3 (Invitrogen), pGEX, pTrsfus, pTrc99A, pET-5, pET-9, pKK223-3, pKK233-3, pDR540, pRIT5 (Pharmacia), pSPORTl, pSPORT2, pCMVSPORT2.0 및 pSV-SPORTl (Invitrogen), Invitrogen으로 부터의 pTrxFus, pThioHis, pLEX, pTrcHis, pTrcHis2, pRSET, pBlueBacHis2, pcDNA3.1/His, pcDNA3.1(-)/Myc-His, pSecTag, pEBVHis, pPIC9K, pPIC3.5K, pAO815, pPICZ, pPICZD, pGAPZ, pGAPZD, pBlueBac4.5, pBlueBacHis2, pMelBac, pSinRep5, pSinHis, pIND, pIND(SPl), pVgRXR, pcDNA2.1, pYES2, pZErOl.l, pZErO-2.1, pCR-Blunt, pSE280, pSE380, pSE420, pVL1392, pVL1393, pCDM8, pcDNAl.l, pcDNAl.I/Amp, pcDNA3.1, pcDNA3.1/Zeo, pSe, SV2, pRc/CMV2, pRc/RSV, pREP4, pREP7, pREP8, pREP9, pREP 10, pCEP4, pEBVHis, ρCR3.1, pCR2.1, pCR3.1-Uni, 및 pCRBac; Pharmacia로 부터의 D ExCeIl, D gtl1, pTrc99A, pKK223-3, pGEX-1 DT, pGEX-2T, pGEX-2TK, pGEX-4T-l, pGEX- 4T-2, pGEX-4T-3, pGEX-3X, pGEX-5X-l, pGEX-5X-2, pGEX-5X-3, pEZZ18, pRIT2T, pMC1871, pSVK3, pSVL, pMSG, pCH11O, pKK232-8, pSL1180, pNEO, 및 pUC4K; Novagen으로 부터의 pSCREEN-lb(+), pT7Blue(R), pT7Blue-2, pCITE-4abc(+), pOCUS-2, pTAg, pET- 32LIC, pET-30LIC, pBAC-2cp LIC, pBACgus-2cp LIC, pT7Blue-2 LIC, pT7Blue-2, DSCREEN-I, DBlueSTAR, pET-3abcd, pET-7abc, pET9abcd, pETllabcd, pET12abc, pET- 14b, pET-15b, pET-16b, pET-17b-pET-17xb, pET-19b, pET-20b(+), pET-21abcd(+), pET-22b(+), pET-23abcd(+), pET-24abcd(+),pET-25b(+), pET-26b(+), pET-27b(+), pET-28abc(+), pET-29abc(+), pET-30abc(+), pET-31b(+), pET-32abc(+), pET-33b(+), pBAC-1, pBACgus-1, pBAC4x-l, pBACgus4x-l, pBAC-3cp, pBACgus-2cp, pBACsurf-1, plg, Signal plg, pYX, Selecta Vecta-Neo, Selecta Vecta-Hyg, 및 Selecta Vecta-Gpt; Clontech로 부터의 pLexA, pB42AD, pGBT9, pAS2-l, pGAD424, pACT2, pGAD GL, pGAD GH, pGAD1O, pGilda, pEZM3, pEGFP, pEGFP-1, pEGFP-N, pEGFP-C, pEBFP, pGFPuv, pGFP, p6xHis-GFP, pSEAP2-Basic, pSEAP2-Contral, pSEAP2-프로모터, pSEAP2-인핸서, pD gal-Basic, pDgal-Control, pDgal-프로모터, pDgal-인핸서, pCMVD, pTet-Off, pTet-On, pTK-Hyg, pRetro-Off, pRetro-On, pIRESlneo, pIRESlhyg, pLXSN, pLNCX, pLAPSN, pMAMneo, pMAMneo-CAT, pMAMneo- LUC, pPUR, pSV2neo, pYEX4T-l/2/3, pYEX-Sl, pBacPAK-His, pBacPAK8/9, pAcUW31, BacPAK6, pTriplEx, DgtlO, Dgtll, pWE15, 및 DTriplEx; Stratagene으로 부터의 람다 ZAP Ⅱ, pBK-CMV, pBK-RSV, pBluescript II KS +/-, pBluescript II SK +/-, pAD-GAL4, pBD-GAL4 Cam, pSurfscript, 람다 FIX II, 람다 DASH, 람다 EMBL3, 람다 EMBL4, SuperCos, pCR-Scrigt Amp, pCR-Script Cam, pCR-Script Direct, pBS +/-, pBC KS +/-, pBC SK +/-, Phagescript, pCAL-n-EK, pCAL-n, pCAL-c, pCAL-kc, pET-3abcd, pET-llabcd, pSPUTK, pESP-1, pCMVLacI, pOPRSVI/MCS, pOPI3 CAT,pXTl, pSG5, pPbac, pMbac, pMClneo, pMClneo Poly A, pOG44, pOG45, pFRTDGAL, pNEODGAL, pRS403, pRS404, pRS405, pRS406, pRS413, pRS414, ρRS415, 및 pRS416 및 변형체 또는 이의 유도체를 함유한다. 예를 들어, pPC86, pDBLeu, pDBTrp, pPC97, p2.5, pGADl-3, pGADIO, pACt, pACT2, pGADGL, pGADGH, pAS2-l, pGAD424, pGBT8, pGBT9, pGAD-GAL4, pLexA, pBD-GAL4, pHISi, pHISi-1, placZi, pB42AD, pDG202, pJK202, pJG4-5, pNLexA, pYESTrp 및 변형체 또는 이의 유도체와 같은 투-하이브리드(two-hybrid) 및 반전 투-하이브리드(reverse two-hybrid vector) 벡터 또한 이용될 수 있다. 임의의 다른 플라스미드 및 벡터는 그들이 숙주 내에서 복제가능하고 생존가능한 한, 이용될 수 있다.

DNA 컨스트럭트가 숙주 세포에 들어가도록 허용하는 것에 이용가능한 기술은 예를 들어, 인산 칼슘/DNA 동시 침전, 핵으로 DNA의 마이크로인젝션, 일렉트로포레이션(electroporation), 완전한 세포와 박테리아 원형질체의 융합, 형질 감염 또는 본 분야의 숙련자에게 알려진 임의의 다른 기술을 포함한다. DNA는 단일 또는 이중 사슬, 선형 또는 원형, 느슨한 또는 슈퍼코일(supercoil)된 DNA일 수 있다. 포유 동물 세포를 형질 감염시키기 위한 다양한 기술은, 예를 들어, Keown et al., Methods in Enzymology Vol. 185, pp. 527-537 (1990)를 참고한다.

일 특정 구체예에서, 이형접합(heterozygous) 또는 동형접합 낙아웃(knockout) 세포는, 유사유전자형(isogenic)DNA로 부터 분리된 면역글로블린 유전자 서열을 함유하는 낙아웃 벡터와 함께 1차 태아 섬유모세포(primary fetal fibroblast)의 형질 감염에 의하여 제조될 수 있다. 다른 구체예에서, 벡터는 예를 들어, Neor 유전자의 번역을 개시하기 위한, IRES (내부 리보좀 개시 부위)를 이용하는 프로모터 트랩 전략(promoter trap strategy)을 병합할 수 있다.

부위 특이적 재조합효소(Site Specific Recombinases)

추가적인 구체예에서, 표적 컨스트럭트는 예를 들어, lox와 같은 부위 특이적 재조합효소 부위를 함유할 수 있다. 일 구체예에서, 표적화 영역에 하나의 부위 특이적 재조합효소 표적 부위가 두번째 부위 특이적 재조합효소 부위의 5'에 위치하도록 표적 암(arm)은 부위 특이적 재조합효소 표적 부위를 삽입할 수 있다. 그 다음, 두개의 부위 특이적 재조합효소 부위 사이에 끼여있는 뉴클레오티드 서열이 제거되도록, 부위 특이적 재조합효소는 활성화되고/거나 세포에 적용될 수 있다.

부위-특이적 재조합효소는 짧은 핵산 부위 또는 서열-특이 재조합효소 표적 부위, 예를 들면, 재조합효소 인지 부위를 인지하고 결합하는 효소 또는 재조합효소를 포함하며, 이러한 부위에 관련된 핵산의 재조합을 촉매화한다. 이러한 효소는 재조합효소, 전이효소 및 인테그라제(integrase)를 함유한다. 부위-특이적 재조합효소 표적 부위의 예는 lox 부위, art 부위, dif 부위 및 fit 부위를 함유하나, 이에 한정되지 않는다. 부위-특이적 재조합효소의 비-제한적 예는 박테리오파지 P1 Cre 재조합효소, 이스트 FLP 재조합효소, nti 인테그라제, 박테리오파지 λ, 파이(phi) 80, P22, P2, 186, 및 P4 재조합효소, Tn3 리졸바제(resolvase), Hin 재조합효소(recombinase), 및 Cin 재조합효소, E. coli xerC 및 xerD 재조합효소, Bacillus thuringiensis 재조합효소, Tpnl 및 β-락타마제 전이효소(β-lactamase transposons), 및 면역글로블린 재조합효소를 함유하나 이에 한정되지 않는다.

일 구체예에서, 재조합 부위는 박테리오파지 Pl의 Cre 재조합효소에 의하여 인지되는 lox 부위일 수 있다. 박테리오파지 P!의 cre 유전자의 산물 및 Cre 재조합효소인 lox 부위는 부위 특이적 재조합 사건을 촉매할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 언급한다. lox 부위의 다양성은 종래에 알려져 있으며, 자연적으로 발생하는 loxP, loxB, loxL 및 loxR, 뿐만 아니라, 다수의 돌연변이 또는 변형체, loxP511, loxP514, lox.DELTA.86, lox.DELTA.117, loxC2, loxP2, loxP3 및 lox P23와 같은 lox 부위를 함유한다. 추가적인 lox의 예는 loxB, loxL, loxR, loxP, loxP3, loxP23, loxΔ86, loxΔl17, loxP511, 및 loxC2를 포함하나 이에 한정되지 않는다.

다른 구체예에서, 재조합 부위는 Cre를 제외한 재조합효소에 의하여 인지되는 재조합 부위이다. 일 구체예에서, 재조합효소 부위는 S accharomyces cerevisiae 의 2 pi 플라스미드의 FLP 재조합효소에 의하여 인지되는 FRT 부위일 수 있다. FRT 부위는 이스트 2 마이크론 플라스미드의 FLP 유전자의 산물, FLP 재조합효소가 부위-특이적 재조합을 촉매할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 언급한다. 추가적으로 비-Cre 재조합효소의 예는: 박테리오 파지 λ의 Int 재조합효소에 의하여 인지되는 att 부위(예를 들어, attl, att2, att3, attP, attB, attL, 및 attR), 레솔바제(resolvase) 과(family)에 의하여 인지되는 재조합 부위, 및 Bacillus thruingiensis 의 전이 효소(transposase)에 의하여 인지되는 재조합 부위를 포함하는 부위-특이적 재조합효소를 함유하나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명의 특정 구체예에서, 표적 컨스트럭트는: 본 발명에서 개시된 바, 돼지의 면역글로블린 유전자에 상동성있는 서열, 선택가능한 마커 유전자 및/또는 부위 특이적 재조합 표적 부위를 함유할 수 있다.

동종적으로 재결합된 세포의 선택

그 다음, 적합한 통합을 제공하는 세포를 확인하기 위하여, 세포는 적합하게-선택된 배지에서 자라도록 할 수 있다. 면역글로블린 유전자에 삽입된 선택가능한 마커 유전자의 존재는 숙주 유전자에 표적 컨스트럭트의 도입을 확실하게 한다. 그 다음, 원하는 표현형(phenotype)을 나타내는 이러한 세포는 동종의 또는 비-동종의 재조합이 발생하였는지 여부를 확실히 하기 위한 DNA를 분석하기 위하여, 제한 분석(restriction analysis), 일렉트로포리시스(electrophoresis), 서던 분석(Southern analysis), 중합효소 연쇄 반응(polymerase chain reaction) 등에 의하여 분석될 수 있다. 이는 삽입을 위해 프로브를 사용하고, 그 후, 삽입에 인접한 5' 및 3' 영역을 서열 분석하고, 면역글로불린 유전자의 존재에 대하여, 구성의 인접 영역을 넘어 확장하거나, 또는 결손의 존재를 확인하여, 이러한 결손이 도입될 때, 결정할 수 있다. 시동 물질은 또한, 구성내에서 서열에 보완적이고, 구성외에서 서열에 보완적이며, 표적 유전자자리에서 사용될 수 있다. 이러한 방법으로, 실험자는 상동 재조합이 발생한다면, 상보적 사슬에 존재하는 시동 물질 모두를 가지는 DNA 두가닥을 얻을 수 있다. 시동 물질 서열, 또는 기대되는 크기의 서열의 존재를 나타냄으로서, 상동 재조합의 발생이 지지된다.

상동 재조합 이벤트를 스크리닝하도록 사용하는 중합 연쇄 반응은 예를 들어, Kim and Smithies, Nucleic Acids Res. 16:8887-8903, 1988; 및 Joyner et al., Nature 338:153-156, 1989에 알려져 있다. 네오마이신 유전자를 유도하기 위한돌연변이 폴리오마 증강인자 및 티미딘 키나제 촉진인자의 특정한 조합은 배아 줄기 세포 및 EC 세포 모두에서 활성인 것으로, Thomas and Capecchi, supra, 1987; Nicholas and Berg (1983) in Teratocarcinoma Stem Cell, eds. Siver, Martin and Strikland (Cold Spring Harbor Lab., Cold Spring Harbor, NY (pp. 469-497); and Linney and Donerly, Cell 35:693-699, 1983에서 나타내었다. .

표적화의 제 1 라운드에서 수득한 세포주는 표적화한 대립 유전자에 이종접합성일 수 있다. 두개의 대립 유전자가 변형된 동종접합성은 많은 방법으로 달성될 수 있다. 하나의 접근은 하나의 카피가 변형된 후, 이들 세포를 다른 선택가능 마커를 사용하는 다른 라운드의 표적화를 겪게 되는 세포 수를 증대시키는 것이다. 택일적으로, 동종접합체는 동물을 변형된 대립 유전자에 대하여, 전통적인 멘델의 유전학에 따라 이종접합적으로 번식시켜 수득할 수 있다. 어떤 경우, 두개의 다른 변형된 대립 유전자를 갖는 것이 바람직할 수 있다. 이는 유전자 표적화의 연속적인 라운드 또는 이형접합체 번식으로 달성될 수 있고, 이들 각각은 원하는 변형된 대립 유전자의 하나를 운반한다.

상동 재조합을 겪은 세포의 확인

일 구체예에서, 선택 방법은 상동 재조합에 의해 면역글로불린 유전자의 표적화된 녹아웃으로, 또는 비기능 또는 비발현 면역글로불린을 야기하는 유전자중 돌연변이에 의해 면역글로불린 유전자의 결핍을 직접적으로 검출할 수 있다. 항생제 내성을 통한 선택은 스크리닝에서 가장 흔히 사용되어 왔다 (상기 참조). 이 방법은 표적화 벡터에 대한 내성 유전자의 존재를 검출할 수 있으나, 통합이 표적화된 재조합 이벤트인지 또는 임의의 통합인지를 직접적으로 나타내지는 않는다. 특정 기술, 예를 들어 폴리 A 및 촉진제 트랩 기술은 표적화 이벤트의 확률을 증가시키지만, 다시, 원하는 표현형, 면역글로불린 유전자 발현중 세포 결핍이 달성되었다는 직접적인 증거를 나타내지는 않는다. 게다가, 선택의 네거티브 형태는 표적화 통합에 대한 선택에 사용될 수 있다; 이 경우, 세포에 치명적인 인자를 위한 유전자는 사멸을 피하기 위해 세포를 오직 표적화된 이벤트에만 허용하는 방법으로 삽입한다. 이들 방법으로 선택한 세포를, 그 후, 유전자 파열, 벡터 통합 및, 최종적으로, 면역글로불린 유전자 소모에 대하여 분석할 수 있다. 이들 경우에, 선택은 표적화한 벡터 통합의 검출에 기초하기 때문에, 변형된 표현형에서가 아니라, 오직 표적화된 녹아웃, 점 돌연변이가 아닌, 유전자 재배열 또는 절단 또는 다른 이러한 변형을 검출할 수 있다.

기능성 면역글로불린 유전자의 발현이 부족한 것으로 생각되는 동물 세포를 추가로 분석할 수 있다. 이러한 분석은 하기를 포함하는 기술로 달성될 수 있으나, 제한하는 것은 아니다: PCR 분석, 서던 블롯 분석, 노던 블롯 분석, 특정 렉틴 결합 분석, 및/또는 서열 분석.

해당 분야에서 기술된 PCR 분석은 표적화 벡터의 통합을 결정하는데 사용될 수 있다. 일구체예에서, 앰플리머 (amplimer)는 항생제 내성 유전자에서 기원하여 벡터 서열 외부 영역으로 확장할 수 있다. 서던 분석을 또한 유전자자리에서 큰 변형, 예를 들어 면역글로불린 유전자자리로의 표적화 벡터의 통합을 분석하는데 사용할 수 있다. 한편, 노던 분석을 각각의 대립 유전자로부터 제조되는 전사물을 분석하는데 사용할 수 있다.

추가로, RNA 전사물로부터 제조되는 cDNA의 서열 분석을 또한, 면역글로불린 대립 유전자중 임의의 돌연변이의 정확한 위치를 결정하는데 사용할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, 본 발명에 기술된 방법, 순서 및/또는 구성에 따 라 제조된 유제류 중쇄, 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 유전자자리의 기능 영역의 적어도 하나의 대립 유전자가 없는 유제류 세포를 제공하였다. 이들 세포는 상동 재조합의 결과로 수득할 수 있다. 특히, 유제류 중쇄, 카파 경쇄 또는 람다 경쇄 유전자의 적어도 하나의 대립 유전자를 불활성화시킴으로서, 돼지 항체의 발현에 대하여 감소한 능력을 갖는 세포를 제조할 수 있다. 다른 구체예에서, 유제류 중쇄, 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 유전자의 두 대립 유전자가 모두 없는 포유류 세포를 본원에 기술된 방법, 순서 및/또는 구성에 따라 제조할 수 있다. 추가 구체예에서, 유제류 중쇄, 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 유전자의 적어도 하나의 대립 유전자가 본 발명에 기술된 방법, 순서 및/또는 구성에 따라 제조된 본 발명의 유전자 표적화 이벤트를 통해 비활성화된 돼지류 동물을 제공한다. 본 발명의 다른 측면에서, 유제류 중쇄, 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 유전자가 유전자 표적화 이벤트를 통해 불활성화된 돼지류 동물을 제공한다. 유전자는 상동 재조합을 통해 표적화할 수 있다. 다른 구체예에서, 유전자는 파열될 수 있고, 즉, 일부의 유전자 코드는 변형될 수 있고, 따라서 유전자의 분절의 전사 및/또는 유전암호해독에 영향을 줄 수 있다. 예를 들어, 유전자 파열은 치환, 결손 ("녹아웃, knock-out") 또는 삽입("녹인, knock-in") 기술을 통해 발생할 수 있다. 존재하는 서열의 전사를 조정하는, 원하는 단백질 또는 조절 서열에 대한 부가적인 유전자를 삽입할 수 있다.

본 발명의 일구체예에서, 유제류 중쇄, 카파 경쇄 또는 람다 경쇄 유전자의 대립 유전자는 본 발명에 기술된 방법, 순서 및/또는 구성에 따라 불활성이 되고, 기능성 유제류 면역글로불린을 더이상 제조할 수 없다. 일구체예에서, 표적화된 면 역글로불린 유전자는 RNA로 전사될 수 없지만, 단백질로 번역되지는 않는다. 다른 구체예에서, 표적화된 면역글로불린 유전자는 불활성 절단 형태로 전사될 수 있다. 이러한 절단된 RNA는 번역되지 않거나, 또는 비기능성 단백질로 번역될 수 있다. 택일적인 구체예에서, 표적화된 면역글로불린 유전자는 유전자의 전사가 발생하지 않는 방식으로 불활성화될 수 있다. 추가 구체예에서, 표적화된 면역글로불린 유전자는 전사될 수 있고, 그 후, 비기능성 단백질로 번역될 수 있다.

III. 인간 면역글로불린 유전자 함유 인공 염색체의 삽입

인공 염색체

본 발명의 일면은 본원에 기술된 방법, 순서 및/또는 구성에 따라 제조되는 유제류 중쇄, 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 유전자자리의 적어도 하나의 대립 유전자가 없는 유제류 및 유제류 세포를 제공하고, 이는 적어도 일부의 인간 항체 (즉, 면역글로불린 (Ig)) 유전자자리를 발현하도록 추가로 변형하였다. 이 인간 유전자자리는 재배열을 겪을 수 있고, 유제류중 다양한 집단(population)의 인간 항체 분자를 발현할 수 있다. 이들 복제된, 트랜스제닉 (트랜스제닉) 유제류는 공급될 수 있는, 이론적으로는 인간 항체(예를 들어, 다클론 항체)의 무한한 공급을 제공하고, 이는 치료, 진단, 정제, 및 다른 임상적으로 연관된 목적을 위해 사용될 수 있다.

특정한 일구체예에서, 인공 염색체 (ACs)는 인간 면역글로불린 유전자의 유제류 세포 및 동물로의 전이를 달성할 수 있다. ACs는 단일 또는 복수의 유전자를 함유한 메가베이스 크기 DNA 조각의 표적화된 통합을 허용한다. 따라서, ACs는 이 종유래 DNA에 의해 코딩된 유전자 산물의 제조를 위해 이종유래 DNA를 선택된 세포내로 도입할 수 있다. 일구체예에서, 통합 인간 면역글로불린 DNA를 가진 하나 이상의 ACs는 인간 Ig 유전자를 유제류(예를 들어 돼지)에 도입하기 위한 벡터로서 사용될 수 있다.

1983년에 효모중 최초로 구성된, ACs는 천연 염색체의 적절한 복제 및 분배에 대하여 책임이 있는 필수적인 시스-작용 DNA 서열 원소로부터 구성되는 인공 선형 DNA 분자이다 (Murray et al. (1983), Nature 301:189-193). 염색체는 기능하기 위해 적어도 3개의 원소가 필요하다. 구체적으로, 인공 염색체의 원소는 적어도: (1) 자율 복제 서열 (ARS) (DNA 복제가 시작되는 부위인 복제 기원의 특성을 가짐), (2) 동원체 (유사분열 및 감수분열에서 복제된 염색체의 적절한 분포에 책임이 있는 동원체 어셈블리(kinetochore assembly)의 부위), 및 (3) 종말체 (종단을 안정화시키고, DNA 분자의 최종단의 완전한 복제를 쉽게하는 기능을 하는 선형 염색체의 종단에서 특수화된 구조).

일구체예에서, 인간 Ig는 유제류 염색체 DNA와는 별개로 독립적 단위 (에피솜)로 유지될 수 있다. 예를 들어, 에피솜 벡터는 세포내에서 DNA 복제 및 벡터의 유지에 필요한 DNA 서열 원소를 함유한다. 에피솜 벡터는 상업적으로 입수할 수 있다 (참고, 예를 들어, Maniatis, T. et al., Molecular 클로닝, A Laboratory Manual (1982) pp. 368-369). ACs는 내부 염색체에 따라 안정적으로 복제 및 분리가 가능하다. 택일적인 구체예에서, 인간 IgG DNA 서열은 유제류 세포의 염색체로 통합될 수 있고, 그리하여 새로운 정보를 복제하고, 천연 염색체의 일부로서 세포 의 자손에게 분할하는 것을 허용한다 (참고, 예를 들어, Wigler et al. (1977), Cell 11:223). ACs를 유제류 세포의 내부 염색체로 전위시키거나, 또는 삽입시킬 수 있다. 둘 이상의 ACs는 숙주 세포로 동시에 또는 연속적으로 도입될 수 있다.

추가로, ACs는 단일 또는 복수 유전자를 함유한 메가베이스 크기 DNA 조각의 표적화된 통합을 위해, 엑스트라-게노믹 (extra-genomic) 유전자자리를 제공할 수 있고, 하나의 촉진제 또는 각각의 카피 또는 분리된 촉진제와 연관된 몇개의 카피에 영향을 미치는 단일 유전자의 복수 카피를 포함한다. ACs는 단일 또는 복수 인간 면역글로불린 유전자를 함유한 메가베이스 크기 DNA 조각의 표적화 통합을 허용할 수 있다. ACs는 이동원체성 염색체 (즉, 두개의 동원체를 가진 염색체)를 해당분야의 기술자에게 알려져 있는 조건하에서 배양함으로서 생성할 수 있고, 이렇게 하여 염색체는 찢어져서 이전에는 이동원체성 염색체였던, 미니염색체를 형성할 수 있다.

ACs는 인간 (인간 인공 염색체: "HACs"), 효모 (효모 인공 염색체: 'YACs"), 박테리아 (박테리아 인공 염색체: "BACs"), 박테리오파지 Pl-유발 인공 염색체: "PACs") 및 다른 포유류 (포유류 인공 염색체: "MACs")로부터 구성될 수 있다. ACs는 이들의 이름(예를 들어, YAC, BAC, PAC, MAC, HAC)을 동원체의 기원에 기초하여 유발하였다. 예를 들어, YAC는, S. 세레비시아에 ( S. cerevisiae )로부터 그의 동원체를 유발하였다. MACs는 활성 포유류 동원체를 포함하는 한편, HACs는 인간 동원체를 포함하는 염색체를 의미한다. 게다가, 식물 인공 염색체 ("PLACs") 및 곤충 인공 염색체도 또한 구성될 수 있다. ACs는 복제 및 유지 모두에 책임이 있는 염색 체로부터 유래한 원소를 포함할 수 있다. 따라서, ACs는 큰 게노믹 DNA 조각, 예를 들어 인간 Ig DNA를 안정적으로 유지할 수 있다.

일 구체예에서, YACs를 함유한 유제류를 제공하였다. YACs는 효모 염색체로부터의 원소, 예를 들어 S. 세레비시아에를 함유하고, 통상적인 클로닝 벡터(예: 플라스미드, 코스미드)에 의해 수용되는 것보다 훨씬 클 수 있는 외부 DNA(외부 DNA)의 분절을 함유하는 유전공학적 고리 염색체이다. YACs는 매우 큰 외인 DNA의 분절(Schlessinger, D. (1990), Trends in Genetics 6:248-253)의 포유류 세포 및 동물(Choi et al. (1993), Nature Gen 4:117-123)로의 전파를 허용한다. YAC 트랜스제닉 접근은 매우 강력하며, 클론화된 DNA를 효과적으로 조작하는 능력에 의해 매우 증진된다. 효모의 주요 기술적 장점은 이와 함께 DNA-중재 전환 and 상동 재조합을 통해 만들어지는 특정한 게놈 변형이 쉽다는 것이다 (Ramsay, M. (1994), MoI Biotech 1:181-201). 일구체예에서, 통합 인간 Ig DNA를 가진 하나 이상의 YACs는 인간 Ig 유전자를 유제류(예를 들어, 돼지)로 도입하는 벡터로서 사용될 수 있다.

효모에서, 복제에 대한 특정한 구조적 성분을 함유한 YAC 벡터는 다음을 포함한다: 동원체, 종말체, 자율 복제 서열 (ARS), 효모 선택가능 마커 (예를 들어, TRPl , URA3 , 및 SUP4 ), 및 외인 DNA의 50 kb 보다 더 큰 분절의 삽입을 위한 클로닝 부위. 마커 유전자는 YAC를 운반하는 세포의 선택을 허용하며, 특정 제한 엔도누클레아제의 합성에 대한 부위로서 수행할 수 있다. 예를 들어, TRPl 및 URA3 유전자는 이중 선택가능 마커로 사용되어, 완전한 인공 염색체가 유지되는지를 보장 할 수 있다. 효모 선택가능 마커는 동원체의 양면에서 및, 생체내 시드 종말체 형성을 분리하는 두개의 서열에서 수행될 수 있다. 효모 세포의 전체 DAN의 1%의 일분획만 복제에 필요하지만, 염색체 중심 (동원체, 이는 유사분열중 자매 염색분체간의 부착 부위로, 및 방추섬유 부착 부위로 수행됨), 염색체의 종단 (종말체, 이는 진핵 염색체의 종단을 유지하기 위해 필요한 서열로 수행됨), 및 이중나선이 풀리고, 스스로 카피하기 시작하는 DNA분절로 수행하는 ARS로 불리우는 DNA의 다른 짧은 신장을 포함한다.

일구체예에서, YACs는 면역글로불린 DNA의 약 1, 2, 또는 3 Mb으로 복제되는데 사용될 수 있다. 다른 구체예에서, 적어도 25, 30, 40, 50, 60, 70, 75, 80, 85, 90, 또는 95 킬로베이스(kilobases)이다.

효모 통합 플라스미드, 복제 벡터 (이는 YACs의 조각)는 또한, 인간 Ig 발현에 사용될 수 있다. 효모 통합 플라스미드는 박테리아 (예를 들어, E. coli )에서 성장을 위한 복제 기원 및 약물-내성 유전자, 효모중 형질전환주의 선택을 위한 효모 마커 유전자, 및 Ig 서열을 삽입하기 위한 제한 부위를 제공하는 박테리아 플라스미드 서열을 함유할 수 있다. 숙주 세포는 염색체내로 직접적으로 통합됨으로서 이 플라스미드를 안정적으로 획득할 수 있다. 효모 복제 벡터를 또한, 효모중 유리 플라스미드 환으로 인간 Ig를 발현하는데 사용할 수 있다. 효모 또는 ARS-함유 벡터는 동원체 서열의 첨가로 안정화시킬 수 있다. YACs는 동원체성 및 종단 (telomeric) 영역 모두를 가질 수 있으며, 재조합체가 효모 염색체로서 필수적으로 유지되기 때문에, 매우 큰 조각의 DNA를 클로닝하는데 사용될 수 있다.

YACs는 예를 들어, 미국 특허 6,692,954, 6,495,318, 6,391,642, 6,287,853, 6,221,588, 6,166,288, 6,096,878, 6,015,708, 5,981,175, 5,939,255, 5,843,671, 5,783,385, 5,776,745, 5,578,461, 및 4,889,806; 유럽 특허 1 356 062 및 0 648 265; PCT 공개번호 WO 03/025222, WO 02/057437, WO 02/101044, WO 02/057437, WO 98/36082, WO 98/12335, WO 98/01573, WO 96/01276, WO 95/14769, WO 95/05847, WO 94/23049, 및 WO 94/00569에 기술되었듯이 제공된다.

다른 구체예에서, BACs를 함유한 유제류를 제공하였다. BACs는 박테리아, 예를 들어 E. Coli 에서 발견되는 F-베이스(F-based) 플라스미드이고, 이는 약 300 kb의 외부 DNA에서 숙주 세포로 전이할 수 있다. Ig DNA가 숙주 세포내로 클론화되면, 새롭게 삽입되는 분절은 나머지 플라스미드를 따라 복제할 수 있다. 결과적으로, 외부 DNA의 수십억개의 카피가 매우 짧은 시간에 만들어질 수 있다. 특정한 구체예에서, 인간 Ig DNA와 통합된 인간 Ig DNA는 인간 Ig 유전자를 유제류 (예를 들어 돼지)로 도입하는 벡터로서 사용된다.

BAC 클로닝 시스템은 E. coli F-인자에 기초하고, 이의 복제는 엄격하게 규제되며, 따라서 큰 구조의 안정적인 유지를 보장한다 (Willets, N., and R. Skurray (1987), Structure and function of the F-factor and mechanism of conjugation. In Escherichia coli and Salmonella Typhimurium: Cellular and Molecular Biology (FC Neidhardt, Ed) Vol.2 pp 1110-1133, Am. Soc. Microbiol., Washington, DC). BACs는 다양한 진핵 종으로부터의 DNA 클로닝에 폭넓게 사용되었다 (Cai et al. (1995), Genomics 29:413-425; Kim et al. (1996), Genomics 34:213-218; Misumi et al. (1997), Genomics 40:147-150; Woo et al. (1994), Nucleic Acids Res 22:4922-4931; Zimmer, R. and Gibbins, AMV (1997), Genomics 42:217- 226). F-플라스미드의 낮은 발생은 DNA 조각간의 재조합 가능성을 감소시키고, 클론화된 박테리아 유전자의 치명적인 과도한 발현을 피할 수 있게 한다. BACs는 숙주 세포에서, 단일 카피 벡터중 인간 면역글로불린 유전자를 100회 또는 그 이상의 연속적인 성장의 발생 이후라도, 안정적으로 유지한다. BAC (또는 pBAC) 벡터는 약 30 - 300 kb 쌍의 범위내에서 삽입물을 수용할 수 있다. BAC 벡터의 하나의 특정 유형인, pBeloBacl1은 lacZ 유전자의 상보성을 이용하여, BAC 벡터를 운반하는 집락으로부터 삽입물-함유 재조합체 분자를 구분할 수 있다. DNA 조각이 pBeloBacl1의 lacZ 유전자로 클론화될 때, 삽입 활성은 전환 후 X-Gal/IPTG 플레이트에 대한 백색 집락 (white colony)를 야기하여(Kim et al. (1996), Genomics 34:213-218) 양성 클론의 확인을 쉽게 한다.

예를 들어, BACs는 예를 들어 미국 특허 6,713,281, 6,703,198, 6,649,347, 6,638,722, 6,586,184, 6,573,090, 6,548,256, 6,534,262, 6,492,577, 6,492,506, 6,485,912, 6,472,177, 6,455,254, 6,383,756, 6,277,621, 6,183,957, 6,156,574, 6,127,171, 5,874,259, 5,707,811, 및 5,597,694; 유럽 특허 0 805 851; PCT 공개번호 WO 03/087330, WO 02/00916, WO 01/39797, WO 01/04302, WO 00/79001, WO 99/54487, WO 99/27118, 및 WO 96/21725에서 개시되었듯이 제공될 수 있다.

다른 구체예에서, 박테리오파지 PAC를 함유한 유제류가 제공되었다. 특별한 구체예에서, 인간 Ig DNA와 통합된 하나 이상의 박테리오파지 PACs는 인간 Ig 유전 자를 유제류 (예를 들어, 돼지)내로 도입하기 위한 벡터로 사용된다. 예를 들어, PACs는 예를 들어 미국 특허 6,743,906, 6,730,500, 6,689,606, 6,673,909, 6,642,207, 6,632,934, 6,573,090, 6,544,768, 6,489,458, 6,485,912, 6,469,144, 6,462,176, 6,413,776, 6,399,312, 6,340,595, 6,287,854, 6,284,882, 6,277,621, 6,271,008, 6,187,533, 6,156,574, 6,153,740, 6,143,949, 6,017,755, alc 5,973,133; 유럽 특허 0 814 156; PCT 공개번호 WO 03/091426, WO 03/076573, WO 03/020898, WO 02/101022, WO 02/070696, WO 02/061073, WO 02/31202, WO 01/44486, WO 01/07478, WO 01/05962, 및 WO 99/63103에서 개시되었듯이 제공될 수 있다.

추가 구체예에서, MACs를 함유한 유제류를 제공하였다. MACs는 높은 유사분열 안정성, 일관되고 조정되는 유전자 발현, 높은 클로닝 능력, 및 비-면역원성을 가진다. 포유류 염색체는 약 50 - 250 Mb 범위의 크기인 DNA의 연속적인 선형 가닥으로 구성될 수 있다. DNA 구성은 추가로, DNA 구성이 효모 세포중 증식하는데 필요한 하나 이상의 서열을 함유할 수 있다. DNA 구성은 또한, 선택가능 마커 유전자를 코딩한 서열을 함유할 수 있다. DNA 구성은 DNA 구성과 전환된 세포에서 염색체로 유지될 수 있다. MACs는 예를 들어, 전체 대사 경로를 코딩한 유전자, 매우 큰 유전자 [예를 들어, 낭성섬유증 (CF) 유전자 (~ 600 kb)], 또는 몇몇 유전자 [예를 들어, 다가백신의 제조를 위한 일련의 항원]가 세포내로 안정적으로 도입될 수 있도록 중요한 단백질을 인코딩한 유전자의 도입을 위한 엑스트라-게노믹 특정 통합 부위를 제공한다.

포유류 인공 염색체 [MACs]를 제공한다. 또한 제공하는 것은, 본원에서 제공한 MACS를 사용하여 제조한, 다른 고등의 진핵 종, 예를 들어 곤충 및 어류에 대한 인공 염색체이다. 이러한 염색체의 제조 및 분리 방법. MACs를 사용하여 다른 종, 예를 들어 곤충 및 어류 종으로부터 인공 염색체를 구성하는 방법을 또한 제공하였다. 인공 염색체는 전적으로 기능적으로 안정한 염색체이다. 두가지 유형의 인공 염색체를 제공하였다. 하나의 유형은, 본원에서 SATACs [위성 인공 염색체]로 나타낸 안정한 이염색질 염색체이고, 다른 유형은 진염색질의 증폭에 기초한 미니염색체이다. 여기에서, 이전의 이동원체성 염색체는 이동원체성 염색체 조각이 새 종말체를 얻을 때 제조되는 염색체이고, 각각 하나의 동원체를 가진 두 염색체가 제조된다. 각각의 조각은 복제할 수 있는 염색체이다.

또한 제공하는 것은 본원에서 제공한 MACS를 사용하는, 다른 고등한 진핵종, 예를 들어 곤충 및 어류에 대한 인공 염색체이다. 일구체예에서, SATACs [위성 인공 염색체]를 제공하였다. SATACs는 안정한 이염색질 염색체이다. 다른 구체예에서, 미니염색체는 진염색질의 증폭에 기초하는 미니염색체를 제공한다.

일구체예에서, 인공 염색체는 이동원체성 염색체로 세포를 배양함으로서 생성할 수 있고, 그에 따라 염색체는 분리되어 미니염색체 및 이전의 이동원체성 염색체를 형성한다. 일구체예에서, SATACs는 미니염색체 조각으로부터 제조될 수 있고, 예를 들어 미국 특허 5,288,625를 참조한다. 다른 구체예에서, SATACs는 이전의 이동원체성 염색체의 조각으로부터 제조될 수 있다. SATACs는 짧은 위성 DNA의 반복 단위로 구성될 수 있고, 완전히 이염색질일 수 있다. 일구체예에서, 이종유래 또는 외부 DNA의 결여 삽입 (absent insertion)은 SATACs가 유전적 정보를 함유하지 않은 것이다. 다른 구체예에서, 다양한 크기의 SATACs를 제공하고, 이는 선택적인 조건하에서 반복적으로 배양되고, 이전의 이동원체성 염색체로부터 제조된 염색체를 함유한 세포의 서브클로닝으로 형성된다. 이들 염색체는 크기가 7.5 - 10 Mb인 반복 단위, 또는 메가레플리콘(megareplicon)에 기초할 수 있다. 이들 메가레플리카온스칸 (megareplicaonscan)은 이종유래 비-위성 DNA가 인접한 위성 DNA의 직렬 블록 (tandem block)일 수 있다. 증폭은 이종유래 ["외부(foreign)"] DNA로 인접한 두개의 역 메가레플리콘을 함유하는, 동일한 염색체 분절 [각각은 앰플리콘이라 함]의 직렬 배열을 제조할 수 있다. 반복되는 세포 융합, 선택적인 배지상에서의 성장 및/또는 BrdU [5-브로모데옥시유리딘] 치료 또는 다른 게놈 불안정화 시약 또는 약제, 예를 들어 X-선을 포함하는 이온화 방사선, 및 서브클로닝은 150-200 Mb "소세지(sausage)" 염색체, 500-1000 Mb 기가염색체, 안정한 250-400 Mb 메가염색체 및 이로부터 유래하는 다양한 더 작고 안정한 염색체를 포함하는, 안정한 이염색질 또는 부분 이염색질 염색체를 운반하는 세포주를 야기할 수 있다. 이들 염색체는 이러한 반복 단위에 기초하고, 발현하는 인간 면역글로불린 DNA을 포함할 수 있다 (미국 특허 6,743,967 참조).

다른 구체예에서, MACs를 예를 들어, 미국 특허 6,743,967, 6,682,729, 6,569,643, 6,558,902, 6,548,287, 6,410,722, 6,348,353, 6,297,029, 6,265,211, 6,207,648, 6,150,170, 6,150,160, 6,133,503, 6,077,697, 6,025,155, 5,997,881, 5,985,846, 5,981,225, 5,877,159, 5,851,760, 및 5,721,118; PCT 공개번호 WO 04/066945, WO 04/044129, WO 04/035729, WO 04/033668, WO 04/027075, WO 04/016791, WO 04/009788, WO 04/007750, WO 03/083054, WO 03/068910, WO 03/068909, WO 03/064613, WO 03/052050, WO 03/027315, WO 03/023029, WO 03/012126, WO 03/006610, WO 03/000921, WO 02/103032, WO 02/097059, WO 02/096923, WO 02/095003, WO 02/092615, WO 02/081710, WO 02/059330, WO 02/059296, WO 00/18941, WO 97/16533, 및 WO 96/40965에 개시되었듯이, 제공할 수 있다.

본 발명의 다른 측면에서, HACs를 함유한 유제류 및 유제류 세포를 제공한다. 특정한 구체예에서, 인간 Ig DNA와 통합한 하나 이상의 HACs를 인간 Ig 유전자를 유제류 (예를 들어 돼지)에 도입하기 위한 벡터로 사용하였다. 특정한 구체예에서, 인간 Ig DNA와 통합한 하나 이상의 HACs를 면역에 반응하여 인간 Igs를 발현하고, 친화성 성숙을 겪는 핵전이로 유제류를 제조하도록 사용하였다.

인간 항체 ("인간 Ig")를 발현하는 유제류를 제조하는데 다양한 접근법을 사용할 수 있다. 이러한 접근법은, 예를 들어, 태아 단계 또는 출생 후, 중쇄 및 경쇄 Ig 유전자 모두를 함유하는 HAC를 유제류에 삽입하거나, 또는 인간 B-세포 또는 B-세포 전구체를 유제류에 삽입하는 것을 포함한다 (예를 들어, 면역 결핍 또는 면역 억제 유제류)(예를 들어, 2000년 11월 17일자 출원된 WO 01/35735 및 2002년 3월 20일자 출원된 US Ser. No. 02/08645 참조). 또 다른 경우에, 인간 항체 생성 세포 및 유제 동물 항체-생성 B-세포 둘다 유제 동물에 존재할 수 있다. HAC를 포함하는 유제 동물에서 단일 B-세포는 유제 동물과 인간의 중쇄 및 경쇄 단백질의 조합을 포함하는 항체를 생성할 수 있다. 또 다른 구체예에서, HAC의 총 길이는 적어도 대략 1, 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9 또는 10 Mb이다.

예를 들어, HACs 는 US Pat. Nos. 6,642,207, 6,590,089, 6,566,066, 6,524,799, 6,500,642, 6,485,910, 6,475,752, 6,458,561, 6,455,026, 6,448,041, 6,410,722, 6,358,523, 6,277,621, 6,265,211, 6,146,827, 6,143,566, 6,077,697,. 6,025,155, 6,020,142, and 5,972,649; US Pat. Application No. 2003/0037347; PCT Publication Nos. WO 04/050704, WO 04/044156, WO 04/031385, WO 04/016791, WO 03/101396, WO 03/097812, WO 03/093469, WO 03/091426, WO 03/057923, WO 03/057849, WO 03/027638, WO 03/020898, WO 02/092812, 및 WO 98/27200에 개시된 바와 같이 제공될 수 있다.

본 발명에서의 사용을 위하여 인간 면역글로불린 서열이 삽입될 수 있는 ACs의 추가 예는 예를 들어, BACs (pBeloBAC11 또는 pBAC108L; Shizuya et al. (1992), Proc Natl Acad Sci USA 89(18):8794-8797; Wang et al. (1997), Biotechniques 23(6):992-994 참조), 박테리오파지 PACs, YACs (Burke (1990), Genet Anal Tech Appl 7(5):94-99 참조), 및 MACs (Vos (1997), Nat. Biotechnol. 15(12):1257-1259; Ascenzioni et al. (1997), Cancer Lett 118(2):135-142 참조), 예를 들어 HACs, US Pat. Nos. 6,743,967, 6,716,608, 6,692,954, 6,670,154, 6,642,207, 6,638,722, 6,573,090, 6,492,506, 6,348,353, 6,287,853, 6,277,621, 6,183,957, 6,156,953, 6,133,503, 6,090,584, 6,077,697, 6,025,155, 6,015,708, 5,981,175, 5,874,259, 5,721,118, 및 5,270,201; European Patent Nos. 1 437 400, 1 234 024, 1 356 062, 0 959 134, 1 056 878, 0 986 648, 0 648 265, 및 0 338 266; PCT Publication Nos. WO 04/013299, WO 01/07478, WO 00/06715, WO 99/43842, WO 99/27118, WO 98/55637, WO 94/00569, 및 WO 89/09219 참조. 추가 실시예는 예를 들어, PCT Publication No. WO 02/076508, WO 03/093469, WO 02/097059; WO 02/096923; US Publication Nos US 2003/0113917 및 US 2003/003435; 및 US Pat. No. 6,025,155에서 제공된 AC를 포함한다.

본 발명의 다른 구체예에서, ACs는 각 세대에서 수컷 배우자 형성(gametogeneis)을 통해 전달된다. AC는 통합(integrating) 비통합될 수 있다. 한 구체예에서, AC는 실질적으로 모든 분할 세포에서 유사분열(mitosis)을 통하여 전달될 수 있다. 또 다른 구체예에서, AC는 인간 면역글로불린 핵산 서열의 위치 독립적인 발현을 제공할 수 있다. 특정 구체예에서, AC는 수컷 및 암컷 각각의 배우자 형성을 통하여 적어도 10%의 전달 효율을 가질 수 있다. 하나의 특정 구체예에서 AC는 환형일 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, 비통합된 AC는 기탁번호 LMBP 5473 CB로 2000년 3월 27일자로 the Belgian Coordinated Collections of Microorganisms--BCCM에 기탁된 것일 수 있다. 추가의 구체예에서, 수컷 배우자 형성을 통해 전달된 외인성 핵산을 포함하는 유사분열적으로 안정한 유닛을 동정하고, 유사분열적으로 안정한 유닛에서의 입구 부위를 이용하여 인간 면역글로불린 유전자를 유닛 안으로 통합시키는 AC 생성 방법이 제공된다.

다른 구체예에서, 기능적 동원체(centromere), 선택적인 마커 및/또는 단일의 클로닝 부위를 포함하는 ACs가 제공된다. 다른 구체예에서, AC는 하나 이상의 하기 성질을 나타낼 수 있다: 독립적인 염색체로서 안정하게 분리할 수 있다, 면역글로불린 서열을 조절된 방식으로 삽입하고 AC로부터 발현할 수 있다, 수컷 및 암컷 생식 계열을 통해 효율적으로 전달될 수 있다, 및/또는 트랜스제닉 동물은 염색체를 세포의 약 30, 40, 50, 60, 70, 80 또는 90% 이상으로 가질 수 있다.

특정 구체예에서, AC는 유사분열적으로 안정한 섬유아세포 (예를 들어 포유동물 또는 인간의 섬유아세포)로부터 분리될 수 있다. AC를 햄스터 세포로 전달한 후에, lox (예를 들어 loxP) 부위 및 선택적인 마커 부위를 삽입할 수 있다. 다른 구체예에서 AC는, 예를 들어, 선택의 부재하에 유사분열당 약 5, 2, 1, 0.5 또는 0.25 퍼센트 미만의 손실을 나타내는 유사분열적 안정성을 유지할 수 있다 (US 2003/0064509 및 WO 01/77357 참조).

이종 면역글로불린 유전자(Xenogenous 면역글로불린 유전자)

본 발명의 또 다른 측면에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌(locus) 또는 그의 단편을 발현하며, 여기서 면역글로불린이 내인성 유제 동물 염색체 안에 통합된 면역글로불린 유전자 좌로부터 발현될 수 있는 트랜스제닉 유제 동물이 제공된다. 한 구체예에서, 트랜스제닉 동물 유래의 유제 동물 세포가 제공된다. 한 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌가 자손에 의해 유전될 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌가 자손에 의해 수컷 생식계를 통해 유전될 수 있다. 또 다른 추가의 구체예에서, 인공 염색체(AC)는 이종 면역글로불린을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, AC는 이스트 AC 또는 포유동물 AC일 수 있다. 추가의 구체예에서, 이종 유전자 좌는 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 한 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 인간 염색체 14, 인간 염색체 2, 및 인간 염색체 22 또는 그의 단편일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 전위될 수 있는 인간 면역글로불린의 어느 단편을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 전위될 수 있는 인간 면역글로불린 중쇄 및 인간 면역글로불린 경쇄의 어느 단편을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 항원에 노출되었을 때 항체를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 외인성 인간 면역글로불린은 하나 이상의 항원에 노출되는 것에 반응하여 이종 면역글로불린을 생성하기 위하여 B 세포에서 발현될 수 있다.

다른 구체예에서, 기능적 내인성 면역글로불린의 발현이 결여된 트랜스제닉 유제 동물은 이종 면역글로불린 유전자 좌를 발현시키기 위하여 유전적으로 추가 변형될 수 있다. 대체적인(alternative) 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌를 포함하는 돼지가 제공된다. 한 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 또는 그의 단편일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌는 카파 체인 유전자 좌 또는 그의 단편 및/또는 람다 체인 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 추가의 구체예에서, 인공 염색체(AC)는 이종 면역글로불린을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, AC는 이스트 AC 또는 포유동물 AC일 수 있다. 추가의 구체예에서, 이종 유전자 좌는 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 한 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 인간 염색체 14, 인간 염색체 2, 및 인간 염색체 22 또는 그의 단편일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 전위될 수 있는 인간 면역글로불린의 어느 단편을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 전위될 수 있는 인간 면역글로불린 중쇄 및 인간 면역글로불린 경쇄의 어느 단편을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 항원에 노출되었을 때 항체를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 외인성 인간 면역글로불린은 하나 이상의 항원에 노출되는 것에 반응하여 이종 면역글로불린을 생성하기 위하여 B 세포에서 발현될 수 있다.

다른 구체예에서, 기능적 내인성 면역글로불린의 발현이 결여된 트랜스제닉 유제 동물은 이종 면역글로불린 유전자 좌를 발현시키기 위하여 유전적으로 추가 변형될 수 있다. 대체적인(alternative) 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌를 포함하는 돼지가 제공된다. 한 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 또는 그의 단편일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌는 카파 체인 유전자 좌 또는 그의 단편 및/또는 람다 체인 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 추가의 구체예에서, 인공 염색체(AC)는 이종 면역글로불린을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, AC는 이스트 AC 또는 포유동물 AC일 수 있다. 추가의 구체예에서, 이종 유전자 좌는 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 한 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 인간 염색체 14, 인간 염색체 2, 및 인간 염색체 22 또는 그의 단편일 수 있 다. 또 다른 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 전위될 수 있는 인간 면역글로불린의 어느 단편을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 전위될 수 있는 인간 면역글로불린 중쇄 및 인간 면역글로불린 경쇄의 어느 단편을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 항원에 노출되었을 때 항체를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 외인성 인간 면역글로불린은 하나 이상의 항원에 노출되는 것에 반응하여 이종 면역글로불린을 생성하기 위하여 B 세포에서 발현될 수 있다.

또 다른 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌를 포함하는 돼지가 제공된다. 한 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌는 중쇄 및/또는 경쇄 면역글로불린 또는 그의 단편일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이종 면역글로불린 유전자 좌는 카파 체인 유전자 좌 또는 그의 단편 및/또는 람다 체인 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 추가의 구체예에서, 인공 염색체(AC)는 이종 면역글로불린을 포함할 수 있다. 한 구체예에서, AC는 이스트 AC 또는 포유동물 AC일 수 있다. 추가의 구체예에서, 이종 유전자 좌는 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편일 수 있다. 한 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 인간 염색체 14, 인간 염색체 2, 및 인간 염색체 22 또는 그의 단편일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 전위될 수 있는 인간 면역글로불린의 어느 단편을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 전위될 수 있는 인간 면역글로불린 중쇄 및 인간 면역글로불린 경쇄의 어느 단편을 포함할 수 있다. 추가의 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 좌는 항원에 노출되었을 때 항체를 생성할 수 있는 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편을 포함할 수 있다. 특정 구체예에서, 외인성 인간 면역글로불린은 하나 이상의 항원에 노출되는 것에 반응하여 이종 면역글로불린을 생성하기 위하여 B 세포에서 발현될 수 있다.

인간 면역글로불린 유전자, 예를 들어 Ig 중쇄 유전자(인간 염색체 414), Ig 카파 체인 유전자(인간 염색체 #2) 및/또는 Ig 람다 체인 유전자(염색체 #22)가 상기 언급된 Acs 내로 삽입될 수 있다. 특정 구체예에서, 인간 중쇄, 카파 체인 및/또는 람다 체인 Ig 유전자의 어느 부위가 ACs 내로 삽입될 수 있다. 한 구체예에서, 핵산은 인간의 자연-발생적 핵산의 상응하는 영역과 적어도 70, 80, 90, 95, 또는 99% 동일할 수 있다. 다른 구체예에서, 인간 항체의 1 클래스 초과가 유제 동물에 의해 생성된다. 다양한 구체예에서 하나 초과의 상이한 인간 Ig 또는 항체가 유제 동물에 의해 생성된다. 한 구체예에서, 인간 Ig 중쇄 유전자 및 Ig 경쇄 유전자를 둘다 포함하는 AC, 예를 들어 자동 인간 인공 염색체((“AHAC,” a circular recombinant nucleic acid molecule that is converted to a linear 인간 chromosome in vivo by an endogenously expressed restriction endonuclease: 내부적으로 발현된 제한 엔도뉴클레아제에 의해 생체내에서 선형 인간 염색체로 전환되는 환형 재조합 핵산 분자)가 도입될 수 있다. 한 구체예에서, 인간 중쇄 유전자 좌 및 경쇄 유전자 좌가 상이한 염색체 팔(즉, 동원체의 다른 쪽) 위에 위치한다. 한 구체예에서, 중쇄는 mu 중쇄를 포함할 수 있고, 경쇄는 람다 또는 카파 경 쇄일 수 있다. Ig 유전자는 하나 이상의 ACs에서 동시에 또는 순차적으로 도입될 수 있다.

특정 구체예에서, 유제 동물 또는 유제 동물 세포는, 전위되며 하나 초과의 인간 Ig 분자, 예를 들어 인간 항체 단백질을 발현하는 인간 Ig 유전자의 전부 또는 일부를 암호화하는 하나 이상의 핵산을 발현한다. 따라서 인간 Ig 체인 또는 항체를 암호화하는 핵산이 전위되지 않은 형태로 존재한다(즉, 핵산은 V(D)J 재조합되지 않았다). 특정 구체예에서, 항체 경쇄의 V 유전자 세그먼트를 암호화하는 핵산 세그먼트의 전부가 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 J 유전자 세그먼트를 암호화하는 핵산 세그먼트의 전부로부터 분리될 수 있다. 특정 구체예에서, 항체 중쇄의 V 유전자 세그먼트를 암호화하는 핵산 세그먼트의 전부가 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 D 유전자 세그먼트를 암호화하는 핵산 세그먼트의 전부로부터 분리될 수 있고/있거나, 항체 중쇄의 D 유전자 세그먼트를 암호화하는 핵산 세그먼트의 전부가 하나 이상의 뉴클레오타이드에 의해 J 유전자 세그먼트를 암호화하는 핵산 세그먼트의 전부로부터 분리될 수 있다. 전위되지 않은 인간 Ig 유전자를 포함하는 트랜스제닉 유제 동물에 항원을 투여하면 인간 Ig 유전자 좌에서 핵산 세그먼트의 전위가 이루어지고 항원에 반응성인 인간 항체가 생성된다.

한 구체예에서, AC는 면역글로불린 유전자를 포함하는 인간 염색체의 일부 또는 단편을 발현할 수 있다. 한 구체예에서, AC는 문헌(Davies et al. 1993 Biotechnology 11: 911-914)에 기재된 바와 같이 인간 경쇄 유전자 좌의 적어도 300 또는 1300 kb를 발현할 수 있다.

또 다른 구체예에서, AC는 V _λ 유전자 세그먼트, J _λ 유전자 세그먼트 및 단일 C _λ 유전자를 포함하는 λ 경쇄 유전자 좌를 적어도 포함하는 인간 염색체 22의 일부를 발현할 수 있다. 또 다른 구체예에서, AC는 적어도 하나의 V _λ 유전자 세그먼트, 적어도 하나의 J _λ 유전자 세그먼트 및 C _λ 유전자를 발현할 수 있다. 다른 구체예에서, ACs는 문헌(Popov et al. J Exp Med. 1999 May 17;189(10):1611-20)에 기재된 바와 같이 람다 유전자 좌의 일부를 포함할 수 있다.

또 다른 구체예에서, AC는 V _κ 유전자 세그먼트, J _κ 유전자 세그먼트 및 단일 C _κ 유전자를 포함하는 κ 경쇄 유전자 좌를 적어도 포함하는 인간 염색체 2의 일부를 발현할 수 있다. 또 다른 구체예에서, AC는 적어도 하나의 V _κ 유전자 세그먼트, 적어도 하나의 J _κ 유전자 세그먼트 및 C _κ 유전자를 발현할 수 있다. 다른 구체예에서, 카파 경쇄 유전자 좌의 일부를 포함하는 AC는 예를 들어 문헌(Li et al. 2000 J Immunol 164: 812-824 and Li S Proc Natl Acad Sci USA. June 1987;84(12):4229-33)에 기재된 것일 수 있다. 또 다른 구체예에서, 대략 1.3 Mb의 인간 카파 유전자 좌를 포함하는 AC가 문헌(Zou et al FASEB J. August 1996;10(10):1227-32)에 기재된 바와 같이 제공된다. .

추가의 구체예에서, AC는 V _H , D _H , J _H 및 C _H 유전자 세그먼트를 포함하는 인간 중쇄 유전자 좌를 적어도 포함하는 인간 염색체 14의 일부를 발현할 수 있다. 또 다른 구체예에서, AC는 적어도 하나의 V _H 유전자 세그먼트, 적어도 하나의 D _H 유전자 세그먼트, 적어도 하나의 J _H 유전자 세그먼트 및 적어도 하나의 C _H 유전자 세그먼트를 발현할 수 있다. 다른 구체예에서, AC는 예를 들어 문헌(Choi et al. 1993 Nat Gen 4:117-123 and/or Zou et al. 1996 PNAS 96: 14100-14105)에 기재된 적어도 85 kb의 인간 중쇄 유전자 좌를 발현할 수 있다.

다른 구체예에서, AC는 예를 들어 문헌(Green et al. 1994 Nat Gen 7:13-22; Mendez et al 1995 Genomics 26: 294-307; Mendez et al. 1997 Nat Gen 15: 146-156; Green et al. 1998 J Exp Med 188: 483-495 and/or Fishwild et al. 1996 Nat Biotech 14: 845-851)에 개시된 바와 같은, 적어도 220, 170, 800 또는 1020 kb의 중쇄 및 경쇄 유전자 좌 둘다의 일부를 발현할 수 있다. 또 다른 구체예에서, AC는 문헌(Nicholson J Immunol. Dec. 15, 1999;163(12):6898-906 and Popov Gene. Oct. 24, 1996;177(1-2):195-201)에 기재된 바와 같은 인간 면역글로불린의 메가베이스(megabase) 양을 발현할 수 있다. 추가로, 한 특정 구체예에서, 인간 염색체 #14 (Ig 중쇄 유전자 함유), 인간 염색체 #2 (Ig 카파 체인 유전자 함유) 및 인간 염색체 #22 (Ig 람다 체인 유전자 함유) 유래의 MACs가 문헌(US Patent Publication No. 2004/0068760 to Robl et al.)에 기재된 바와 같이 동시에 또는 연속적으로 도입될 수 있다. 또 다른 구체예에서, MAC의 총 길이는 대략 10, 9, 8, 또는 7 메가베이스 보다 작거나 같다.

특정 구체예에서, 생식계 구성(configuration)에서 인간 면역글로불린의 인 간 Vh, 인간 Dh, 인간 Jh 세그먼트 및 인간 mu 세그먼트는 AC, 예를 들어, YAC 내로 Vh, Dh, Jh 및 mu DNA 세그먼트가 인간 DNA 세그먼트에 상응하는 부분들을 포함하는 면역글로불린 레퍼토리를 형성하는 방식으로 삽입될 수 있다(US Pat. No. 5,545,807 to the Babraham Insttitute 참조). 유제 동물 세포 내로의 삽입 및 유제 동물의 세대교번(generation) 후에 이러한 ACs는 중쇄 면역글로불린을 생성할 수 있다. 한 구체예에서, 이들 면역글로불린은 기능적 중쇄-경쇄 면역글로불린을 형성할 수 있다. 또 다른 구체예에서, 이들 면역글로불린은 유제 동물의 적당한 세포 또는 체액으로부터 회수될 수 있는 양으로 발현될 수 있다. 이러한 면역글로불린은 문헌(Burke, DT, Carle, GF and Olson, MV (1987) “Cloning of large segments of exogenous DNA into yeast by means of artifical chromosome vectors” Science, 236, 806-812)에 기재된 바와 같이 이스트 인공 염색체 벡터에 삽입되거나, 염색체 단편의 도입에 의해 삽입될 수 있다(Richer, J and Lo, CW (1989) “Introduction of 인간 DNA into mouse eggs by injection of dissected 인간 chromosome fragments” Science 245, 175-177 참조).

인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 특이적 ACs에 대한 추가의 정보는 문헌(recent reviews by Giraldo & Montoliu (2001) Transgenic Research 10: 83-103 and Peterson (2003) Expert Reviews in Molecular Medicine 5: 1-25)을 참조할 수 있다.

AC 전달 방법

인간 면역글로불린 유전자가 먼저 ACs로 삽입된 다음 인간 면역글로불린-함 유 ACs가 유제 동물 세포 내로 삽입될 수 있다. 또는, ACs가 유제 동물 세포 내로 삽입되기 전에 예를 들어 CHO 세포와 같은 매개적 포유동물 세포내로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 매개적 포유동물 세포도 AC를 포함할 수 있으며, 첫번째 AC는 포유동물 세포의 AC 내로 삽입될 수 있다. 특히, 이스트 세포 내의 인간 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 YAC가 MAC를 가지는 포유동물 세포내로 전달될 수 있다. YAC는 MAC 내로 삽입될 수 있다. MAC는 그 후 유제 동물 세포로 전달될 수 있다. 인간 Ig 유전자는 동종(homologous) 재조합에 의해 ACs로 삽입될 수 있다. 생성된 인간 Ig 유전자 함유 AC는 유제 동물 세포 내로 도입될 수 있다. 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 방법에 의해 인간 Ig 함유 AC를 포함하는 하나 이상의 유제 동물 세포를 선택할 수 있다.

ACs의 도입에 적당한 숙주가 본 명세서에 의해 제공되나, 어떤 동물 또는 식물, 세포 또는 그의 조직으로 한정되지 않으며, 포유동물, 조류, 파충류, 양서류, 곤충, 어류, 거미류, 담배, 토마토, 밀, 외떡잎 식물, 쌍떡잎 식물 및 해조류를 포함하나 이에 한정되지는 않는다. 한 구체예에서, ACs는 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리리신을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지 시약을 사용하여 세포 내로 도입되기 전에 축합시킬 수 있다. ACs는 다이렉트 DNA 전달, 일렉트로포레이션, 핵 전달, 마이크로세포 융합, 세포 융합, 스페로플라스트 융합, 지질-매개된 전달, 리포펙션, 리포솜, 마이크로프로젝타일 폭격, 마이크로인젝션, 칼슘 포스페이트 침전 및/또는 다른 적당한 방법을 포함하지만 이에 제한되지는 않는 당업계의 공지 방법에 의해 분리된 후 세포 융합 또는 마이크로세포 융합에 의해 도입될 수 있다. DNA를 세포 내로 도입하기 위한 다른 방법으로는 핵 마이크로인젝션, 일렉트로포레이션, 온전한 세포와의 박테리아 원형질체 융합을 들 수 있다. 폴리브렌 및 폴리오르니틴과 같은 폴리양이온이 또한 사용될 수 있다. 포유동물 세포를 전달하기 위한 다양한 기술에 대하여 문헌(Keown et al. Methods in Enzymology (1990) Vol.185, pp. 527-537; and Mansour et al. (1988) Nature 336:348-352)을 참조할 수 있다.

다이렉트 DNA 전달; 세포 또는 태아 내로의 마이크로인젝션, 식물을 위한 원형질체 재생, 일렉트로포레이션, 마이크로프로젝타일 총 및 당업계에 공지된 다른 방법을 사용하여 ACs를 도입할 수 있다(참조: Weissbach et al. (1988) Methods for Plant Molecular Biology, Academic Press, NY, Section VIII, pp. 421-463; Grierson et al. (1988) Plant Molecular Biology, 2d Ed., Blackie, London, Ch. 7-9; see, also US Pat. Nos. 5,491,075; 5,482,928; and 5,424,409; see, also, eg, US Pat. No. 5,470,708,).

특정 구체예에서, 인간 Ig 유전자를 포함하는 하나 이상의 분리된 YACs를 사용할 수 있다. 분리된 YACs는 스퍼민, 스퍼미딘, 폴리에틸렌이민 및/또는 폴리리신을 포함하나 이에 제한되지는 않는 공지 시약을 사용하여 축합시킬 수 있다 (Marschall et al Gene Ther. September 1999;6(9):1634-7 참조). 축합된 YACs는 당업계에 공지된 방법(예를 들어, 마이크로인젝션, 일렉트로포레이션, 지질 매개된 트랜스펙션 등)에 의해 돼지 세포로 전달될 수 있다. 또는, 축합된 YAC는 정자-매개된 유전자 전달 또는 세포질내 정자 인젝션(ICSI) 매개된 유전자 전달을 통해 난 모 세포로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 스페로플라스트 융합을 사용하여 인간 Ig 유전자를 포함하는 YACs를 돼지 세포로 전달할 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 인간 Ig를 포함하는 AC를 성인, 태아(fetal), 또는 엠브리오닉(embryonic) 유제 동물 세포 내로 삽입할 수 있다. 유제 동물 세포의 추가 실시예는 미분화된 세포, 예를 들어 엠브리오닉 세포 (즉, 엠브리오닉 줄기 세포), 분화세포 또는 체세포, 예를 들어 상피 세포, 신경 세포 표피 세포, 각질세포, 조혈세포, 멜라닌세포, 연골세포, B-림프구, T-림프구, 적혈구, 마크로파지, 단핵세포, 섬유아세포, 근육세포, 암컷 생식 시스템, 예를 들어, 젖샘, 난소 더미(ovarian cumulus), 과립층의 세포, 또는 난관 세포, 생식 세포, 태반 세포, 또는 조직, 예를 들어, 방광, 뇌, 식도, 나팔관, 심장, 소장, 쓸개, 신장, 간, 폐, 난소, 이자, 전립선, 척수, 비장, 위, 고환, 흉선, 갑상선, 도관, 수뇨관, 요도, 및 자궁 유래의 세포, 또는 본 명세서에 언급된 다른 세포 타입을 포함한다.

부위 특이적 재조합효소 매개된 전달

본 발명의 특정 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자를 포함하는 ACs를 본 명세서에 언급되거나 당업계에 공지된 세포, 예를 들어, 돼지 세포로 전달하는 것은 부위 특이적 재조합효소 매개된 전달을 통해 달성될 수 있다. 하나의 특정 구체예에서, ACs는 돼지 섬유아세포 내로 전달될 수 있다. 또 다른 특정 구체예에서, ACs는 YACs일 수 있다.

본 발명의 다른 구체예에서, 부위 특이적 재조합 효소 표적 부위를 포함하는 고리화된 DNA, 예를 들어 AC는 게놈 내에 부위 특이적 재조합 효소 표적 부위를 갖 는 세포주 내로 전달될 수 있다. 한 구체예에서, 세포의 부위 특이적 재조합 효소 표적 부위는 외인성 염색체 내에 위치할 수 있다. 외인성 염색체는 숙주의 내인성 염색체 내로 통합되지 않는 인공 염색체일 수 있다. 한 구체예에서, AC는 자손으로의 생식계 유전을 통해 전달될 수 있다. 하나의 특정 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 YAC는 부위 특이적 재조합 효소를 통해 환형으로 된 다음 부위 특이적 재조합 효소 부위를 포함하는 MAC를 함유 숙주 세포 내로 전달될 수 있다. 이제 인간 면역글로불린 유전자 좌 또는 그의 단편을 포함하는 MAC는 섬유아세포로 예시되지만 이에 제한되지는 않는 돼지 세포와 융합될 수 있다. 그 후, 돼지 세포는 핵 전달을 목적으로 사용될 수 있다.

본 발명의 특정 구체예에서, 인간 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편을 포함하는 AC가 유제류 세포 삽입전에 포유동물 세포, 예컨대 CHO 세포에 이입될 수 있다. 일례로, 중간 포유동물 세포는 또한 AC를 포함할 수 있으며, 제 1 AC가 포유동물 세포의 AC에 삽입될 수 있다. 특히, 효모 세포내 인간 면역글로불린 유전자 또는 그의 단편을 함유하는 YAC가 MAC를 보유한 포유동물 세포로 전달될 수 있다. YAC는 MAC에 삽입될 수 있다. 이어서, MAC는 유제류 세포에 이입될 수 있다. 특정 구체예로, 인간 Ig 유전자 또는 그의 단편을 보유한 YAC는 부위 특이적 재조합효소 표적 부위를 함유할 수 있다. YAC를 먼저 적절한 부위 특이적 재조합효소를 통해 적용하여 환화시킨 후, 자체에 부위 특이적 재조합효소 표적 부위를 가지는 포유동물 세포에 삽입시킬 수 있다. 이어서, 부위 특이적 재조합효소를 YAC를 중간 포유동물 세포내 MAC에 통합하는 과정에 적용할 수 있다. 특이적 재조합효 소를 시스 또는 트랜스로 적용할 수 있다. 특히, 부위 특이적 재조합효소는 트랜스로 적용될 수 있다. 일례로, 부위 특이적 재조합효소는 특이적 재조합효소 발현 플라스미드, 예컨대 Cre 발현 플라스미드 형질감염으로 발현될 수 있다. 또한, YAC의 한 텔로미어 영역을 선택성 표지, 예컨대 본 원에 개시되었거나 당업계에 공지된 선택성 표지로 레트로피팅(retrofitted)할 수 있다. 그 다음에, 중간 포유동물 세포의 MAC내 인간 Ig 유전자 또는 그의 단편을 유제류 세포, 예를 들어 섬유모세포에 전달할 수 있다.

또한, 인간 Ig 유전자 또는 그의 단편을 보유하는 AC, 예컨대 YAC는 임의로 각 텔로미어 근처에 위치한 부위 특이적 재조합효소 표적 효소를 함유할 수 있다. YAC를 먼저 부위 특이적 재조합효소에 적용하여 환화시킨 후, 자체로 게놈내에 부위 특이적 재조합효소 표적 효소를 직접 함유하는 유제류 세포로 도입할 수 있다. 또한, 유제류 세포는 그 자체로 특이적 재조합효소 표적 효소를 가지는 MAC를 함유할 수도 있다. 이 구체예에서, YAC는 유제류 세포의 내인성 게놈에 직접 삽입될 수 있다. 특정 구체예로, 유제류 세포는 섬유모세포 또는 핵이입을 위해 사용될 수 있는 임의의 다른 적합한 세포일 수 있다. 참조예: 도 7; Call et al., Hum Mol Genet. Jul. 22, 2000;9(12):1745-51.

다른 예에서, 적어도 100 kb의 DNA를 원형화하여 위치 특이적 리컴비나아제에 의해 숙주 게놈 내로 통합시키는 방법이 제공된다. 일 예에서, 적어도 100, 200, 300, 400, 500, 1000, 2000, 5000, 10,000 kb의 DNA를 원형화할 수 있다. 다른 예에서, 적어도 1000, 2000, 5000, 10,000, 또는 20,000 메가베이스의 DNA를 원 형화할 수 있다. 일 예에서, DNA의 원형화는 위치 특이적 리컴비나아제 표적 위치를 DNA 서열의 각 말단에 부착시킴으로써 이루어질 수 있으며, 이후 위치 특이적 리컴비나아제를 적용시켜 DNA의 원형화를 가져온다. 일 예에서, 위치 특이적 리컴비나아제 표적 위치는 lox일 수 있다. 다른 예에서, 위치 특이적 리컴비나아제 표적 위치는 Flt일 수 있다. 구체예에서, DNA는 YAC 또는 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 AC와 같은 인공 염색체일 수 있다. 다른 예에서, AC는 인간 면역글로불린 loci 또는 그의 단편을 포함할 수 있다.

다른 바람직한 예에서, YAC는 인공 포유류 염색체로 전환되거나 그것에 통합될 수 있다. 포유류 인공 염색체는 돼지 세포 내로 전달되거나 삽입(harbor)될 수 있다. 인공 염색체는 중기(metaphase) 염색체의 직접 주사, 지질 매개된 유전자 전달, 또는 마이크로셀 융합을 포함하나 이에 제한되지는 않는 당업계에 공지된 방법을 통해 돼지 게놈 내로 도입될 수 있다.

위치-특이적 리컴비나아제는 짧은 핵산 위치 또는 서열-특이적 리컴비나아제 표적 위치, 즉 리컴비나아제 인식 위치를 인식하여 결합하고, 상기 위치들에 관련된 핵산의 리컴비네이션을 촉매하는 효소 또는 리컴비나아제를 포함한다. 이러한 효소는 리컴비나아제, 트랜스포자아제(transposases) 및 인테그라아제를 포함한다. 서열-특이적 리컴비나아제 표적 위치의 예로서 lox 위치, att 위치, dif 위치 및 frt 위치를 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 서열-특이적 리컴비나아제의 비제한적인 예로서 박테리오파지 P1 Cre 리컴비나아제, 효모 FLP 리컴비나아제, Inti 인테그라아제, 박테리오파지 λ, phi 80, P22, P2, 186, 및 P4 리컴비나아제, Tn3 리졸바아제(resolvase), Hin 리컴비나아제, 및 Cin 리컴비나아제, E. coli xerC 및 xerD 리컴비나아제, Bacillus thuringiensis 리컴비나아제, TpnI 및 β-락탐아제 트랜스포존, 및 면역글로불린 리컴비나아제를 포함하나 이에 제한되지는 않는다.

일 예에서, 리컴비네이션 위치는 박테리오파지 P1의 Cre 리컴비나아제에 의해 인식되는 lox 위치일 수 있다. Lox 위치는 박테리오파지 P1의 cre 유전자의 산물인, Cre 리컴비나아제가 위치-특이적 리컴비네이션 반응을 촉매할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. loxP514, lox.DELTA.86, lox.DELTA.117, loxC2, loxP2, loxP3 및 lox P23과 같은 다수의 돌연변이 또는 변형 lox 위치뿐만 아니라 자연적으로 발생하는 loxP, loxB, loxL 및 loxR를 포함하는 다양한 lox 위치가 당업계에 공지되어 있다. lox 위치의 추가적인 예로는 loxB, loxL, loxR, loxP, loxP3, loxP23, loxΔ86, loxΔ117, loxP511, 및 loxC2를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.

다른 예에서, 리컴비네이션 위치는 Cre 이외의 다른 리컴비나아제에 의해 인식되는 리컴비네이션 위치이다. 일 예에서, 리컴비나아제 위치는 Saccharomyces cerevisiae 의 2 pi 플라스미드의 FLP 리컴비나아제에 의해 인식되는 FRT 위치일 수 있다. FRT 위치는 효모 2 미크론 플라스미드의 FLP 유전자 산물인, FLP 리컴비나아제가 위치-특이적 리컴비네이션을 촉매할 수 있는 뉴클레오티드 서열을 지칭한다. 비-Cre 리컴비나아제의 추가적인 예로는, 박테리오파지 λ의 Int 리컴비나아제에 의해 인식되는 att 위치(예를 들어, att1, att2, att3, attP, attB, attL, 및 attR), 리졸바아제 패밀리에 의해 인식되는 리컴비네이션 위치, 및 Bacillus thruingiensis 의 트랜스포자아제에 의해 인식되는 리컴비네이션 위치를 포함하는 위치-특이적 리컴비나아제를 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.

IV. 유전적 변형 동물의 생산

본 발명의 추가적 측면에서, 본원에 기재된 유전적 변형을 포함하는 유제동물은 당업자에게 공지된 어떠한 방법에 의해서도 생산될 수 있다. 그러한 방법으로는 핵 전달, 세포질간 정액 주사, 접합자의 직접적인 변형 및 정액 매개된 유전자 전달을 포함하며, 이에 제한되지는 않는다.

다른 예에서, 그러한 동물, 예를 들어, 돼지를 복제하는 방법은, 난모세포의 핵을 적출하고, 상기 난모세포를 적어도 하나의 면역글로불린 유전자의 적어도 하나의 대립 유전자가 불활성화된 세포로부터의 공여 핵과 융합한 후, 상기 핵 전달-유도된 배아를 대리모에게 이식하는 것을 포함한다.

다르게는, 배아줄기세포 내 면역글로불린 유전자의 대립 유전자 모두를 불활성화시킴으로써 기능적 면역글로불린의 발현이 없는 생육가능한 동물을 생산하는 방법이 제공되며, 이 방법은 이후에 자손을 생산하는데 이용될 수 있다.

다른 측면에서, 본 발명은 면역글로불린 유전자의 대립 유전자 모두가 불활성화된, 돼지와 같은 생육가능한 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 일 예에서, 면역글로불린 유전자의 대립 유전자 모두가 불활성화된 세포로부터의 공여 핵을 이용하여 복제함으로써 동물을 생산한다. 일 예에서, 면역글로불린 유전자의 대립 유전자 모두가 유전적 표적화 반응에 의해 불활성화된다.

접합자를 직접적으로 변형시킴으로써 유전적으로 변형된 동물을 만들어낼 수 있다. 포유동물에서는, 상기 변형된 접합자를 출산시까지 동물을 보유할 수 있는 상상임신된 암컷의 자궁에 도입할 수 있다. 예를 들어, 면역글로불린 유전자를 전혀 포함하고 있지 않는 동물을 목적으로 하는 경우, 상기 동물로부터 유래된 배아줄기세포을 타겟으로 하여, 변형된 세포를 키메릭 동물로 성장시키기 위하여 낭포세로내로 도입한다. 배아줄기세포로는, 배아줄기세포주 또는 새로 수득한 줄기세포가 이용될 수 있다.

본 발명의 적절한 예에서, 분화 전능성(totipotent) 세포는 배아줄기(ES) 세포이다. 낭포세포로부터 ES 세포의 분리, ES 세포주의 수립 및 그들의 연속적 배양은, 예를 들어, Doetchmann et al., J. Embryol. Exp. Morph. 87:27-45 (1985); Li et al., Cell 69:915-926 (1992); Robertson, EJ "Tetracarcinomas and Embryonic Stem Cells: A Practical Approach," ed. EJ Robertson, IRL Press, Oxford, England (1987); Wurst and Joyner, "Gene Targeting: A Practical Approach," ed. AL Joyner, IRL Press, Oxford, England (1993); Hogen et al., "Manipulating the Mouse Embryo: A Laboratory Manual," eds. Hogan, Beddington, Costantini and Lacy, Cold Spring Harbor Laboratory Press, New York (1994); 및 Wang et al., Nature 336:741-744 (1992)에 기재된 공지된 방법에 따라 수행된다. 본 발명의 다른 적절한 예에서, 분화 전능성 세포는 배아생식(EG) 세포이다. 배아생식세포는 ES 세포와 기능적으로 균등한 비분화된 세포로서, 이들은 시험관내에서 배양되고 형질전환되어, 키메라의 체세포 및 생식세포주로 수립될 수 있 다(Stewart et al., Dev. Biol. 161:626-628 (1994)). EG 세포는 원시 생식세포, 생식체의 자손을 성장 인자, 즉 백혈병 저해 인자, 스틸 인자 및 기본 섬유아세포 성장 인자((Matsui et al., Cell 70:841-847 (1992); Resnick et al., Nature 359:550-551 (1992))와 조합하여 배양함으로써 유도된다. EG 세포의 배양은 Donovan et al., "Transgenic Animals, Generation and Use," Ed. LM Houdebine, Harwood Academic Publishers (1997), 및 거기에 인용된 원본 문서에 기재된 방법을 이용하여 수행될 수 있다.

본 발명에 사용하기 위한 4배체 낭포는 천연의 접합자 생산 및 발생에 의해, 또는 2-세포 배아의 전기융합 및 예를 들어, James et al., Genet. Res. Camb. 60:185-194 (1992); Nagy and Rossant, "Gene Targeting: A Practical Approach," ed. AL Joyner, IRL Press, Oxford, England (1993); 또는 Kubiak and Tarkowski, Exp. Cell Res. 157:561-566 (1985)에 기재된 방법에 따라 연속적으로 배양되는 공지된 방법에 의해 수득될 수 있다.

ES 세포 또는 EG 세포의 낭포로의 도입은 당업계에 공지된 어떠한 방법에 의해서도 수행될 수 있다. 본 발명의 목적을 위해 적절한 방법은 Wang et al., EMBO J. 10:2437-2450 (1991)에 기재된 마이크로주사 방법이다.

다르게는, 변형된 배아줄기세포에 의해 형질전환 동물이 생산될 수 있다. 유전적으로 변형된 배아줄기세포를 낭포에 주사하고 통상적인 기술에 따라 암컷 숙주 포유동물에서 출산시까지 보유한다. 이후, PCR 또는 서던 블랏팅과 같은 기술을 이용하여 헤테로접합자 자손을 스크리닝함으로써 타겟 locus 위치에서의 변형의 존재여부를 알아낸다. 동종의 야생형 숙주와 교배한 후, 얻어지는 키메릭 자손을 교차 교배함으로써 호모접합자 숙주를 얻는다.

배아줄기세포를 표적화 벡터로 형질전환하여 면역글로불린 유전자를 변형시킨 후, 세포를 적절한 배지, 예를 들어, 우태아혈청이 증진된 DMEM 내의 피더 층에 평판 배양할 수 있다. 선택적 배지를 사용하여, 콜로니가 생성될 수 있는 충분한 시간 후에, 콜로니를 골라 상동 리컴비네이션의 발생여부를 분석함으로써, 작제물을 포함하는 세포를 검출할 수 있다. 작제물 서열없이 표적 locus에서 프라이머를 사용하여 중합효소 연쇄 반응을 이용할 수 있다. 상동 리컴비네이션을 나타내는 이러한 콜로니들은 배아 작업 및 낭포 주사에 이용될 수 있다. 낭포는 과잉 배란된 암컷으로부터 얻을 수 있다. 이후, 배아줄기세포를 트립신화하고, 변형된 세포를 낭포를 포함하는 드롭플렛에 첨가한다. 적어도 하나의 변형된 배아줄기세포를 낭포의 난할에 주사할 수 있다. 주사 후, 적어도 하나의 낭포가 상상임신한 암컷의 각 자궁 돌기로 되돌아갈 수 있다. 이후, 암컷은 출산을 하고, 얻어진 한배의 새끼들은 작제물을 가진 돌연변이 세포를 위해 스크리닝된다. 형질전환된 ES 세포와 다른 혈통을 가지는 낭포가 선택된다. 낭포 및 ES 세포의 상이한 표현형을 제공함으로써, 키메릭 자손을 용이하게 검출할 수 있고, 변형된 면역글로불린 유전자의 존재를 탐침하기 위해 유전자형이 수행될 수 있다.

다른 예에서, 정자 매개된 유전자 전달을 사용함으로써 본원에 기재된 유전적으로 변형된 유제동물을 생산할 수 있다. 내생적 면역글로불린 유전자의 발현을 제거하거나 외생적 면역글로불린 유전자를 삽입하는 본원에 기재된 방법 및 조성물 을 이용함으로써 본원에 기재되거나 당업계에 공지된 기술을 통해 정자 세포를 유전적으로 변형시킬 수 있다. 유전적으로 변형된 정자는 인공 수정, 세포질간 정액 주사 또는 공지된 다른 기술을 통해 암컷 수령자를 임신시키는데 이용될 수 있다. 한 예에서, 정자 및/또는 정자 두부는 충분한 시간 동안 외생적 핵산과 함께 인큐베이션될 수 있다. 충분한 시간은 예를 들어, 약 30초 내지 약 5분, 전형적으로 약 45초 내지 약 3분, 보다 전형적으로 약 1분 내지 약 2분을 포함한다. 일 구체 예에서, 본원에 기재된 유제동물내 외생적, 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자의 발현은 세포질간 정자 주사에 의해 이루어질 수 있다.

유전자 전달용 벡터로서의 정자 세포의 사용 가능성은 Brackett et al., ProcL, Natl. Acad. Sci. USA 68:353-357 (1971)에 의해 최초로 제안되었다. 이후에, 네이키드 DNA에 의해 인큐베이션된 난모세포와 정자의 시험관내 수정후 형질전환된 쥐 및 돼지의 생산에 관한 보고서들이 발표되었다(예를 들어, Lavitrano et al., Cell 57:717-723 (1989) 및 Gandolfi et al. Journal of Reproduction and Fertility Abstract Series 4, 10 (1989)를 참고하라). 다만, 다른 실험실에서는 이들 시험을 반복하는데 실패하였다(예를 들어, Brinster et al. Cell 59:239-241 (1989) 및 Gavora et al., Canadian Journal of Animal Science 71:287-291 (1991)를 참조하라). 이후에, 성공적인 정자 매개된 유전자 전달에 관한 몇몇 보고서들이 발표되었으며, 이에는 닭(예를 들어, Nakanishi and Iritani, Mol. Reprod. Dev. 36:258-261 (1993)를 참조하라); 쥐(예를 들어, Maione, Mol. Reprod. Dev. 59:406 (1998)를 참조하라); 및 돼지(예를 들어, Lavitrano et al. Transplant. Proc. 29:3508-3509 (1997); Lavitrano et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 99:14230-5 (2002); Lavitrano et al., Mol. Reprod. Dev. 64-284-91 (2003)를 참조하라). 유사한 기술이 또한 2002. 4. 23. 특허된 미국특허 제6,376,743호; 2001. 11. 22. 공개된 미국특허공개 제20010044937호 및 2002. 8. 8. 공개된 제20020108132호에 기재되어 있다.

다른 예에서, 세포질간 정자 주사를 이용함으로써 본원에 기재된 유전적으로 변형된 유제동물을 생산할 수 있다. 이 방법은 외생적 핵산 및 정자를 수정되지 않은 난모세포의 세포질내로 공삽입함으로써 달성될 수 있으며, 형질전환 배아 및, 원한다면, 살아있는 자손으로 발생시킬 수 있다. 정자는 세포막-파열된 정자 두부 또는 세포막이 없는 정자 두부일 수 있다. 공삽입 단계는 정자를 외생적 핵산과 함께 충분한 시간 동안, 예를 들어, 약 30초 내지 약 5분, 전형적으로 약 45초 내지 약 3분, 보다 전형적으로 약 1분 내지 약 2분간, 전인큐베이션하는 서브단계를 포함할 수 있다. 정자 및 외생적 핵산의 난모세포로의 공삽입은 마이크로주사를 통해 이루어질 수 있다. 정자와 혼합된 외생적 핵산은 하나 이상의 트랜스진을 포함하여, 본원에 기재된 하나 이상의 트랜스진에 대해 형질전환된 배아를 생산할 수 있다. 세포질간 정자 주사는 당업계에 공지된 기술, 예를 들어, 미국특허 제6,376,743호에 의해 달성될 수 있다. 구체예에서, 본원에 기재된 유제동물 내 외생적, 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자는 세포질간 정자 주사에 의해 달성될 수 있다.

당업계에 공지된 추가적 기술을 이용하여 동물내로 트랜스진을 도입할 수 있 다. 그러한 기술은 전핵(pronuclear) 마이크로주사(예를 들어, Hoppe, PC and Wagner, TE, 1989, US Pat. No. 4,873,191를 참고하라); 레트로바이러스 매개된 생식 세포주로의 유전자 전달(예를 들어, Van der Putten et al., 1985, Proc. Natl. Acad. Sci., USA 82:6148-6152를 참고하라); 배아줄기세포에서의 유전자 표적화(예를 들어, Thompson et al., 1989, Cell 56:313-321; Wheeler, MB, 1994, WO 94/26884를 참조하라); 배아의 전기천공법(예를 들어, Lo, 1983, MoI Cell. Biol. 3:1803-1814를 참조하라); 셀 건; 트랜스펙션; 트랜스덕션; 레트로바이러스 감염; 아데노바이러스 감염; 아데노-수반 바이러스 감염; 리포좀-매개된 유전자 ㅈ전달; 네이키드 DNA 전달; 및 정자-매개된 유전자 전달(예를 들어, Lavitrano et al., 1989, Cell 57:717-723를 참고하라); 등을 포함하나 이에 제한되지는 않는다. 그러한 기술의 검토를 위해, 예를 들어, Gordon, 1989, Transgenic Animals, Intl. Rev. Cytol. 115:171-229를 참고하라. 구체예에서, 본원에 기재된 유제동물 내 외생적, 예를 들어, 인간 면역글로불린 유전자는 이러한 기술에 의해 달성될 수 있다.

복제된, 형질전환 자손을 생산하기 위한 체세포 핵 전달

본 발명의 또 다른 측면에서, 돼지 또는 소와 같은 유제동물에서, 유제동물 중쇄, 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 유전자의 대립 유전자의 하나, 임의로 양자 모두가 없는 세포를 수령 세포로의 핵 전달을 위한 공여 세포로 이용함으로써 복제된, 형질전환 동물을 생산할 수 있다. 다르게는, 유제동물 중쇄, 카파 경쇄 및/또 는 람다 경쇄 유전자 넉아웃을 배아줄기세포내에서 만들어낼 수 있으며, 이는 자손을 생산하는데 이용될 수 있다. 본원에 기재된 방법, 서열 및/또는 작제물에 따라 생산된 유제동물 중쇄, 카파 경쇄 및/또는 람다 경쇄 유전자의 단일 대립 유전자가 없는 자손을 사육시킴으로써 멘델형 유전을 통해 대립 유전자 양자가 기능적으로 상실된 자손을 추가로 생산할 수 있다.

다른 예에서, 본 발명은 알파-1,3-GT 유전자로서 수컷 돼지 헤테로접합자를 알파-1,3-GT 유전자로서 암컷 돼지 헤테로접합자와 함께 사육함으로써 기능적 알파-1,3-GT의 발현이 없는 생육가능한 돼지를 생산하는 방법을 제공한다. 일 예에서, 돼지는 알파-1,3-GT 유전자의 하나의 대립 유전자의 유전적 변형으로 인한 헤테로접합자이며, 이는 상기 대립 유전자의 발현을 막기 위함이다. 다른 예에서, 돼지는 알파-1,3-GT 유전자의 하나의 대립 유전자의 점 돌연변이의 존재로 인한 헤테로접합자이다. 다른 예에서, 점 돌연변이는 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 두번째 염기에서 T-에서-G로의 점 돌연변이일 수 있다. 일 구체예에서, 기능적 알파-1,3-GT 발현이 전혀 없는 돼지 동물을 생산하는 방법이 제공되며, 여기서는 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 두번째 염기에서 T-에서-G로의 점 돌연변이를 포함하는 수컷 돼지가 알파-1,3-GT 유전자의 엑손 9의 두번째 염기에서 T-에서-G로의 점 돌연변이를 포함하는 암컷 돼지와 사육되며, 그 반대일수도 있다.

본 발명은 체세포 핵 전달을 통하여 기능성 면역글로불린 유전자가 없는 돼지와 같은 동물을 복제하는 방법을 제공한다. 일반적으로, 공여 핵의 소스로 이용될 목적하는 분화된 세포를 수득하고; 동물로부터 난모세포를 수득하고; 상기 난모 세포로부터 핵을 적출하고; 목적하는 분화된 세포 또는 세포 핵을 상기 핵이 적출된 난모세포에, 예를 들어, 융합 또는 주사에 의해 전달함으로써 NT 유닛을 형성하고; 얻어진 NT 유닛을 활성화하고; 배양된 NT 유닛을 숙주 동물로 전달하여 NT 유닛이 태아로 발생하도록 하는 단계를 포함하는 핵 전달 과정에 의해 동물을 생산할 수 있다.

핵 전달 기술 또는 핵 이식 기술은 당업계에 공지되어 있다(Dai et al. Nature Biotechnology 20:251-255; Polejaeva et al Nature 407:86-90 (2000); Campbell et al, Theriogenology, 43:181 (1995); Collas et al, MoI. Report Dev., 38:264-267 (1994); Keefer et al, Biol. Reprod., 50:935-939 (1994); Sims et al, Proc. Natl. Acad. Sci., USA, 90:6143-6147 (1993); WO 94/26884; WO 94/24274, 및 WO 90/03432, US Pat. Nos. 4,944,384 및 5,057,420).

면역글로불린 유전자를 변경하도록 변형된 공여 세포 핵은 수령 난모세포로 전달된다. 이 방법의 사용은 특정 공여 세포 형에만 제한되는 것은 아니다. 공여 세포는 본원에 기재된 것이며, 또한 예를 들어 Wilmut et al Nature 385 810 (1997); Campbell et al Nature 380 64-66 (1996); Dai et al., Nature Biotechnology 20:251-255, 2002 또는 Cibelli et al Science 280 1256-1258 (1998)를 참조하라. 핵 전달에 성공적으로 이용될 수 있는 배아, 태아 및 성인 체세포를 포함하는 정상 핵형의 모든 세포가 채택될 수 있다. 태아 섬유아세포는 공여 세포로서 특히 유용한 부류이다. 핵 전달의 일반적으로 적절한 방법이 Campbell et al Theriogenology 43 181 (1995), Dai et al. Nature Biotechnology 20:251-255, Polejaeva et al Nature 407:86-90 (2000), Collas et al Mol. Reprod. Dev. 38 264-267 (1994), Keefer et al Biol. Reprod. 50 935-939 (1994), Sims et al Proc. Nat'l. Acad. Sci. USA 90 6143-6147 (1993), WO-A-9426884, WO-A- 9424274, WO-A-9807841, WO-A-9003432, US Pat. No. 4,994,384 및 US Pat. No. 5,057,420에 기재되어 있다. 분화되거나 적어도 부분적으로 분화된 공여 세포 또한 이용될 수 있다. 공여 세포는 또한 배양될 수 있으며, 다만 반드시 배양될 필요는 없으며, 휴지(quiescent)일 수도 있다. 휴지인 핵 공여 세포는 생체내에서 휴지기에 진입하거나 휴지 상태로 존재하도록 유도될 수 있는 세포이다. 선행 기술의 방법 또한 복제 과정에서 배아세포형을 이용하였다(Campbell et al (Nature, 380:64-68, 1996) and Stice et al (Biol. Reprod., 20 54:100-110, 1996)).

핵 공여 체세포는 다양한 상이한 기관 및 조직으로부터 얻을 수 있으며, 이에는 피부, 중간엽, 폐, 췌장, 심장, 장, 위, 방광, 혈관, 신장, 요도, 생식기관, 및 배아, 태아, 또는 성인 동물의 전체 또는 부분적 분해된 제제가 포함되며, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 적절한 예에서, 핵 공여 세포는 상피세포, 섬유아세포, 신경세포, 케라티노사이트, 조혈세포, 멜라노사이트, 연골세포, 림프구(B 및 T), 마크로파지, 모노사이트, 단핵세포, 심근세포, 다른 근세포, 퇴적세포(cumulus cells), 표피세포 또는 내피세포로 구성된 그룹 중에서 선택된다. 다른 예에서, 핵 공여 세포는 배아줄기세포이다. 구체예에서, 섬유아세포가 공여 세포로 이용될 수 있다.

본 발명의 다른 예에서, 본 발명의 핵 공여 세포는 동물의 생식세포이다. 배아, 태아, 또는 성인 단계의 동물 종의 모든 생식세포가 핵 공여 세포로 이용될 수 있다. 적절한 예에서, 핵 공여 세포는 배아줄기세포이다.

핵 공여 세포는 수령 세포와의 정합을 보장할 수 있도록, 세포 주기(GO, G1, G2, S, M)의 어느 단계에서도 취할 수 있다. 이 기술분야에 공지된 임의의 방법이 세포 주기 상을 조절하기 위하여 사용될 수 있다. 세포 주기상을 조절하기 위한 방법의 비한정적 예로, 배양 세포의 접촉성 저해에 의해 유도되는 G0 정지, 혈청 또는 다른 필수 영양분을 제거함에 의해 유도되는 G0 정지, 노화(senescence)에 의해 유도되는 G0 정지, 특정 성장요소를 첨가하여 유도되는 G0 정지; 물리적 또는 화학적 수단, 예컨대 열충격, 고압의 압력 또는 다른 화학적, 호르몬, 성장요소 또는 다른 물질로의 처치에 의해 유도되는 G0 또는 G1 정지; 복제 과정의 임의의 지점을 방해하는 화학제제로의 처치를 통한 S-상의 조절; 형광 활성된 세포 소팅을 사용한 선택, 유사분열의 쉐이크 오프, 마이크로튜불 방해 제제 또는 유사분열의 과정을 방해하는 임의의 화학물질을 경유한 M-상의 조절 (Freshney, R. I,. "Culture of Animal Cells: A Manual of Basic Technique," Alan R. Liss, Inc, New York (1983)참조)을 포함한다.

난모세포를 분리하는 방법은 이 기술분야에 잘 알려져 있다. 본질적으로, 동물의 단소 또는 생식성 트랙으로부터 난모세포를 분리하는 것이 포함될 수 있다. 난모세포를 쉽게 얻을 수 있는 소스는 도살장 물질로부터 이다. 예컨대 유전적 엔지니어링, 핵 트랜스퍼 및 복제와 같은 기술을 혼합하는데 있어, 이러한 세포들을 핵 트랜스퍼를 위한 수령하는 세포로서 사용할 수 있기 전에 및 그들이 정자 세포 에 의해 수정되어 엠브리오가 되기 전에 난모세포는 시험관내에서 성숙시켜야 한다. 이러한 과정에는 보통 미성숙(전기 I) 난모세포를 포유류 난소, 예컨대 도살장에서 얻어진 소의 난소에서 수집하는 것이 필요하며, 수정 또는 핵의 제거에 우선하여 난모세포가 중기 II 상태가 되기까지 성숙 배지중에서 난모세포를 성숙시키는 것이 필요하며, 소의 난모세포의 경우 보통 약 18-24 시간의 포스트-아스퍼레이션이 수행된다. 이러한 기간은 "성숙기간"으로 알려져 있다. 구체예에서, 난모세포는 암퇘지(gilt)에서 얻어진다. "암퇘지"는 출산한 적이 없는 암 돼지를 말한다. 다른 구체예에서, 난모세포는 성숙한 암퇘지에서 얻어진다. "성숙한 암퇘지"는 출산경력이 있는 암 돼지를 말한다.

중기 II 단계의 난모세포는 수령 난모세포가 될 수 있고, 이 상태에서는 정자가 수정됨에 따라 도입된 난모세포의 핵을 처리하기 위해 충분히 "활성화"되거나 활성화될 수 있다고 여겨진다. 생체내에서 성숙된 중기 II 단계의 난모세포는 핵 프랜스퍼 기술에 있어 성공적으로 사용되어 왔다. 본질적으로, 성숙한 중기 II 난모세포는 발정기의 발현이 지난 시간 또는 인간 코리오닉 고나도트로핀(hCG) 또는 유사 호르몬을 주사후 35 내지 48, 또는 39-41시간 후의 비-과배란성 또는 과배란된 동물 외과적으로 수집될 수 있다. 난모세포는 히알유로다제 용액과 같은 적절한 배지에 위치할 수 있다.

약 10 내지 40 시간, 약 16-18, 약 40-42, 약 39-41 시간의 범위인 고정된 시간의 성숙기 후, 난모세포의 핵을 제거할 수 있다. 핵제거에 앞서, 난모세포가 제거될 수 있고, 적절한 배지 예컨대 누적된 세포의 제거에 앞서 히알유로니다제를 밀리리터당 1 밀리그람 함유하는 HECM에 위치할 수 있다. 제거된 난모세포는 그 후 극성체가 스크리닝 될 수 있고, 극성 체의 존재에 의해 결정되는 선택된 중기 II 난모세포가 핵 트랜스퍼에 이용된다. 그 후 핵이 제거된다.

핵제거는 공지의 방법, 예컨대, US Pat. No. 4,994,384의 방법으로 수행될 수 있다. 예를 들면, 중기 II 난모세포는 즉각적인 핵제거를 위해 HECM, 임의로 시토찰라신 B (cytochalasin B)을 밀리리터당 7.5 마이크로그람 함유하는 HECM에 위치할 수 있거나, 또는 적절한 배지, 예를 들면 엠브리오 컬쳐 배지, 예컨대 CRl aa, 플러스 10% 발정기 소 혈청에 위치할 수 있고, 그 후 핵이 제거되며, 24시간 후 또는 16-18시간 후를 넘지않는 시간 후에 제거된다.

핵제거는 극성체 및 인접 사이토플라즘을 제거하기 위하여 마이크로피펫을 사용한 마이크로외과적 방법으로 수행될 수 있다. 난모세포는 성공적으로 핵이 제거된 것들을 선별하기 위하여 스크리닝될 수 있다. 난모세포를 스크린하기 위한 한 방법은 난모세포를 HECM 중에서 33342 Hoechst 염색제 밀리리터당 1 마이크로그람으로 난모세포를 염색한 후, 난모세포를 10초 내로 UV 이레디에이션하에서 관찰하는 것이다. 성공적으로 핵이 제거된 난모세포는 적절한 컬쳐 배지중에 위치할 수 있고, 예를 들면 CRl aa 플러스 10% 혈청이다.

같은 종의 단일 표유류의 세포는 핵이 제거된 난모세포로서 NT 단위를 생산하기 위하여 사용되는 핵이 제거된 난모세포의 난황주(perivitelline)내로 트랜스퍼된다. 포유류의 세포 및 핵이 제거된 난모세포는 이 기술분야에 공지된 방법에 따라 NT 단위를 생산하기 위하여 사용될 수 있다. 예를 들면, 세포는 일렉트로퓨 전에 의해 퓨전될 수 있다. 일렉트로퓨전은 플라스마 멤브레인의 일시적 브레이크다운을 야기하기에 충분한 전기의 펄스를 제공함에 의해 수행된다. 이 플람스마 멤브레인의 브레이크다운은 매우 짧고, 왜냐하면, 멤브레인이 급속히 재형성되기 때문이다. 그러므로, 만약 브레이크다운을 위해 두 인접 멤브레인이 유도되고, 재형성될 때 지방 이중층이 혼합되면 작은 채널이 두 세포 사이에서 열릴 수 있다. 상기 작은 오프닝의 열역학적 불안정성에 기인하여, 두 세포가 하나가 되기까지 커지게 된다. 예를 들면, US Pat. No. 4,997,384 by Prather et al을 참조하면 된다. 다양한 일렉트로퓨전 배지는 예를 들면 수크로즈, 만니톨, 소비톨 및 인산완충액을 포함한 것이 사용될 수 있다. 퓨전은 푸소제닉 제제로서 센다이 바이러스를 사용하여 수행될 수도 있다 (Graham, Wister Inot. Symp. Monogr., 9, 19, 1969). 또한, 일렉트로포레이션 퓨전을 사용하기보다는 핵을 직접 난소내로 주사할 수 있다. 예를 들면 Collas and Barnes, MoI. Reprod. Dev., 38:264-267 (1994)을 참조하면 된다. 퓨전 후, 그 결과 생기는 퓨전된 NT 단위는 활성화될 때 까지 적절한 배지, 예컨대 CRl aa 배지중에 위치한다. 전형적으로 활성화는 그 후 짧게 영향을 줄 수 있고, 예를 들면 퓨전 24시간 이하 후, 또는 약 4-9시간이하 후 이하, 또는 최적으로는 1-2시간 이하 후에 영향을 줄 수 있다. 특정 구체예에서, 활성화는 퓨전 후 적어도 한 시간 및 성숙후 40-41시간에 일어날 수 있다.

NT 단위는 공지된 방법으로 활성화될 수 있다. 상기 방법은 예를 들면, 서브-생리학적 온도, 본질적으로 저온 또는 실제로 저온의 온도 쇼크를 NT 단위에 적용하여 NT 단위를 배양하는 것을 포함한다. 이는 NT 단위를 엠브리오가 보통 노 출되는 생리학적 온도 조건과 비교하여 저온인 실온에서 배양함으로써 가장 편리하게 수행할 수 있게 한다. 선택적으로, 공지된 활성화제를 적용하여 활성화를 수행할 수 있다. 예를 들면, 수정되는 동안 난모세포에 정자가 침투하면, 전퓨전 난모세포가 활성화되는 것이 나타나고, 더 많은 수의 생존 가능한 임신 및 다중의 유전적으로 동일한 송아지들이 핵 트랜스퍼후에 생성된다. 또한, 예컨대 전기적 및 화학적 쇼크와 같은 처리가 퓨전 후 NT 엠브리오를 활성화시키기 위해 사용될 수 있다. 예를 들면, US Pat. No. 5,496,720, to Susko-Parrish et al를 참고하면 된다. 퓨전 및 활성화는 ECM2001 Electrocell Manipulator (BTX Inc., San Diego, CA)로 5V의 AC 펄스를 5초간 준 후, 1.5 kV/cm의 DC 펄스를 60 μs동안 각각 두번 줌으로써 유도될 수 있다. 또한, 난모세포의 2가 양이온의 레벨이 증가하고, 난모세포의 세포성 단백질의 인산화가 감소하면서 동시에 또는 순차적으로 활성화에 영향을 줄 수 있다. 이는 보통 난모세포 세포질내로 들어오는 2가 양이온, 예컨대, 마그네슘, 스트론티움, 바륨 또는 칼슘이 도입되면서 영향을 받을 수 있으며, 예를 들면 이온포어를 형성하여 들어올 수 있다. 2가 양이온의 레벨을 증가시키는 다른 방법으로는 전기 쇼크를 사용하는 법, 에탄올 처리 및 케이쥐드 킬레이터(caged chelator) 처리를 포함한다. 인산화는 공지의 방법, 예를 들면 키나제 저해제, 예컨대 세린-트레오닌 키나제 저해제, 예컨대 6-디메틸-아미노퓨린, 스타우로스포린, 2-아미노퓨린, 및 스핀고신을 첨가하여 감소시킬 수 있다. 또한, 세포성 단백질의 인산화는 난모세포내로 예컨대 포스파타제 2A 및 포스파타제 2B와 같은 포스파타제를 도입하여 저해될 수 있다.

그 다음에, 활성화된 NT 유닛, 또는 "융합 엠브리오"는 세포 콜로니가 발생될 때까지 적절한 시험관내 배지에서 배양될 수 있다. 엠브리오의 배양 및 성숙에 적합한 배지는 당업계에 공지되어 있다. 엠브리오 배양 및 유지에 사용될 수 있는 공지된 배지의 예로는 Ham's F-10+10% 소 태아 혈청 (FCS), 조직 배지-199 (TCM- 199)+ 10% 소 태아 혈청, 디로데스-알부민-락테이트-피루베니트 (Tyrodes-Albumin-Lactate-Pyruvate) (TALP), 둘베코 인산 완충생리식염수 (PBS), 이글 및 화이튼 (Whitten) 배지를 들 수 있고, 하나의 구체예에서, 활성화된 NT 유닛은 5% CO ₂ 습윤 분위기 중에서 약 38.6℃에서 약 1 내지 4 시간 동안 NCSU-23 배지에서 배양될 수 있다.

그 후에, 배양된 NT 유닛 또는 유닛들은 세정된 다음, 적절한 융합성 피더 층을 함유할 수 있는 적절한 배지 중에 배치될 수 있다. 적절한 피더 층은 일례로서 섬유아세포 및 상피세포를 포함한다. NT 유닛은 NT 유닛이 수용 암컷으로 이송하거나, 세포 콜로니를 생성하는데 사용될 수 있는 세포를 얻기에 적합한 사이즈에 이를 때까지 피더 층에 배양된다. 이들 NT 유닛은 적어도 약 2 내지 400개의 세포, 약 4 내지 128개의 세포, 적어도 약 50 세포에 이를 때까지 배양될 수 있다.

그 다음에, 활성화된 NT 유닛은 피그 암컷의 난관에 이송될 수 있다 (엠브리오 트랜스퍼). 일실시형태에 있어서, 피그 암컷은 발정 동기화된 수용 길트 (gilt)일 수 있다. 교배종 길트 (large white/Duroc/Landrace) (280-400 lbs)가 사용될 수 있다. 길트는 피드에 혼합된 18 내지 20 mg 레구-메이트 (Regu-Mate) (Altrenogest, Hoechst, Warren, NJ)를 경구 투여하여 수용 동물로서 동조될 수 있다. 레구-메이트는 14일간 연속해서 공급될 수 있다. 그 다음에, 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG, Intervet America, Millsboro, DE)의 1천개의 유닛은 최종 레구-메이트 처리 후에 약 105 시간 근육내 투여될 수 있다. 엠브리오 트랜스퍼는 hCG 주사 후에 약 22 내지 26 시간 행해질 수 있다. 일실시형태에 있어서, 수태 기간이 끝나서, 새끼가 태어날 수 있다. 또 하나의 실시형태에 있어서는, 수태는 초기에 종료되어, 엠브리오 세포가 수확될 수 있다.

원하는 호모접합형 녹아웃 동물의 브리딩:

또 하나의 측면에 있어서, 본 발명은 면역 글로불린 유전자의 발현 부족이 면역 글로불린 유전자에 대하여 헤테로접합성을 나타내는 피메일로 기능성 면역 글로불린 유전자에 대하여 헤테로접합성을 나타내는 메일을 브리딩함으로써 제공되는 생존 동물을 생산하는 방법을 제공한다. 일실시형태에 있어서, 동물은 대립 유전자의 발현을 방지하도록 면역 글로불린 유전자의 한 대립 유전자의 유전자 변형으로 인해 헤테로접합성을 나타낸다. 다른 실시형태에 있어서, 동물은 알파-면역 글로불린 유전자의 대립 유전자의 점 돌연변이의 존재로 인해 헤테로접합성을 나타낸다. 또 다른 실시형태에 있어서, 이러한 헤테로접합형 녹아웃은 인간 등의 이종 면역글로불린을 발현하는 유제동물로 브리드될 수 있다. 일실시형태에 있어서, 동물은 내인성 면역글로불린의 적어도 하나의 대립 유전자의 발현을 필요로 하는 트랜스제닉 유제동물을 브리딩함으로써 얻어질 수 있고, 면역글로불린은 이종 면역글로불린을 발현하는 유제동물과 함께, 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄 또는 이들의 조합물 중에서 선택된다. 또 하나의 실시형태에 있어서, 동물은 인간 등의 이종 면역글로불린을 발현하는 또 하나의 유제동물과 함께, 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄 중 하나의 대립 유전자의 발현을 필요로 하는 트랜스제닉 유제동물을 브리딩함으로써 얻어질 수 있다. 또 다른 실시형태에 있어서, 동물은 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄의 대립 유전자의 발현 및 인간 등의 이종 면역글로불린을 발현하는 또 하나의 유제동물과 함께, 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄 중 하나의 대립 유전자의 발현을 필요로 하는 호모접합형 트랜스제닉 유제동물을 생산하도록 유제동물과 함께 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄의 하나의 대립 유전자의 발현 및 인간 등의 이종 면역글로불린의 발현을 필요로 하는 또 하나의 트랜스제닉 유제동물과 함께, 중쇄, 카파 경쇄 및 람다 경쇄의 하나의 대립 유전자의 발현을 필요로하고 인간 등의 이종 면역글로불린을 발현하는 트랜스제닉 유제동물을 브리딩함으로써 얻어질 수 있다. 이러한 동물을 생산하는 방법도 제공된다.

일실시형태에 있어서, 면역 글로불린 유전자의 이중 녹아웃을 지니는 도너 세포로부터 생상된 성적으로 성숙한 동물은 브리딩되어, 이들의 새끼는 호모접합형 녹아웃에 대하여 테스트한다. 그 다음에, 이들 호모접합형 녹아웃 동물은 브리딩되어 더 많은 동물을 생산할 수 있다.

또 하나의 실시형태에 있어서, 성적으로 성숙한 이중 녹아웃으로부터의 난모세포는 2개의 유전자적으로 상이한 피그 라인 및 적당한 대리모로 이식된 엠브리오로부터 와일드형 정자를 이용하여 시험관내에서 수정될 수 있다. 이러한 교배로부터의 새끼는 녹아웃의 존재하에 테스트될 수 있는데, 예를 들면, 이들은 cDNA 시퀀 싱 및/또는 PCR에 의해 테스트될 수 있다. 그 다음에, 성적 성숙기에서, 이들 산란기의 각 동물은 교배될 수 있다. 본 발명의 상기 측면에 따른 특정 방법에 있어서, 수태는 태아 섬유아세포가 분리되어, 표현형으로 및/또는 유전자형으로 특징을 나타낼 수 있다. 그 다음에, 면역 글로불린 유전자의 발현을 필요로 하는 섬유아세포는 본 명세서에 기재된 방법에 따라 핵 이식에 사용되어, 다태임신 및 원하는 이중 녹아웃을 지니는 새끼를 생산할 수 있다.

부가적인 유전자 변형:

다른 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 프로세스, 시퀀스 또는 콘스트럭트에 따라 생산된 기능성 면역글로불린의 발현을 필요로 하는 동물 또는 세포는부가적인 유전자 변형을 포함하여, 이종 항원의 발현을 제거시킬 수 있다. 부가적인 유전자 변형은 본 명세서에 기재된 트랜스제닉 세포 및 동물로부터 얻어진 세포를 유전자적으로 변형하거나, 본 명세서에 기재된 동물을 추가로 유전자적으로 변형된 동물로 브리딩함으로써 이뤄질 수 있다. 이러한 동물은 알파-1,3-갈락토실트란스페라제 유전자, CMP-Neu5Ac 하이드록실라제 유전자 (예를 들면, USSN 10/863,116 참조), iGb3 신타제 유전자 (예를 들면, 미국 특허출원 제60/517,524호), 및/또는 포스만 (Forssman) 신타제 유전자 (예를 들면, 미국 특허출원 제60/568,922호)의 적어도 하나의 대립 유전자의 발현을 제거하도록 변형될 수 있다. 추가의 실시형태에 있어서, 동물은 또한 푸코실트란스페라제, 시알리트란스페라제 및/또는 글루코실트란스페라제 패밀리의 멤버를 발현하도록 유전자 변형을 포함할 수 있다. 이들 부가적인 유전자 변형을 달성하기 위해, 일실시형태에 있어서, 세 포는 다중 유전자 변형을 포함하도록 변형될 수 있다. 다른 실시형태에 있어서, 동물은 다중 유전자 변형을 이루도록 함께 브리딩될 수 있다. 하나의 구체적인 실시형태에 있어서, 본 명세서에 기재된 프로세스, 시퀀스 또는 콘스트럭트에 따라 생산된 기능성 면역글로불린의 발현을 필요로 하는 피그 등의 동물은 알파-1,3-갈락토실트란스페라제의 발현을 필요로 하는 피그 드의 동물로 브리딩될 수 있다 (예를 들면, WO 04/028243).

또 하나의 실시형태에 있어서, 이종 이식 거절반응의 원인이 되는 부가적인 유전자의 발현은 제거되거나 감소될 수 있다. 이러한 유전자는 CMP-NEUAc 하이드록실라제 유전자, 이소글로보시드 3 신타제 유전자 및 포스만 신타제 유전자를 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다. 또한, 보체 매개 용해의 억제의 원인이 되는 유전자 또는 cDNA 인코딩 보체 관련 단백질은 또한 본 발명의 동물 및 조직에서 발현될 수 있다. 이러한 유전자는 CD59, DAF, MCP 및 CD46을 들 수 있지만, 이들에 한정되지 않는다 (예를 들면, WO 99/53042; Chen et al. Xenotransplantation, Volume 6 Issue 3 Page 194 - August 1999, which describes pigs that express CD59/DAF transgenes; Costa C et al, Xenotransplantation. 2002 Jan;9(1):45-57, which describes transgenic pigs that express human CD59 and H-transferase; Zhao L et al.; Diamond LE et al. Transplantation. 2001 Jan 15;71(1):132-42, which describes a human CD46 transgenic pigs 참조).

부가적인 변형은 문헌 [참조: WO 98/42850 and US Patent No. 6,423,316, entitled "Anticoagulant fusion protein anchored to cell membrane"]에 기재된 바와 같은 조직 인자 경로 저해제 (TFPI), 헤파린, 안티트롬빈, 히루딘, TFPI, 틱 (tick) 항응고 펩티드, 또는 문헌 [참조: WO 00/31126, entitled "Suppression of 이종 이식 거절반응 by down regulation of a cell adhesion molecules"]에 기재된 바와 같은 세포에 의해 세포 접착 분자의 발현을 하방 제어하는 항체 등의 화합물 및 예를 들면, 문헌 [참조: WO 99/57266, entitled "Immunosuppression by blocking T cell 부자극 signal 2 (B7/CD28 interaction)"]에 기재된 바와 같은 이종 유전자 도너 유기체로부터의 CTLA-4 의 가용성 형태의 기관 수용체에 투여함으로써 시그널 2에 의한 부자극을 방지하는 화합물 등의 뱀 독인자의 발현을 포함할 수 있다.

본 발명의 특정 측면은 하기의 비한정적인 실시예에서 더욱더 상세히 설명된다.

실시예 1: 중쇄의 발현을 필요로 하는 포사인 (포사인) 동물의 포사인 중쇄 타겟팅 및 발생

일부의 포사인 Ig 중쇄 로커스를 3X 리던던드 (리던던트) 포사인 BAC 라이브러리로부터 분리하였다. 일반적으로, BAC 라이브러는 피그 전체 게놈 DNA를 프래그먼트함으로써 발생된 다음에, 전체 동물의 게놈의 적어도 3배를 나타내는 BAC 라이브러리를 유도할 수 있다. 그 후에, 포사인 중쇄 면역글로불린을 포함하는 BAC는 본 명세서에 기재된 바와 같이 포사인 중쇄 면역글로불린에 선택적인 프로브의 하이브리다이제이션을 통해 선택될 수 있다.

클론 (Seq ID 1)의 시퀀스를 사용하여, J-영역 (프라이머는 Seq ID No. 2로 나타냄)의 일부를 발생시켰다. 별도로, Ig 중쇄 mu 불변 영역 (프라이머는 Seq ID No. 3로 나타냄)의 일부에 상보적이도록 프라이머를 디자인하였다. 이들 프라이머를 사용하여, 기능성 결합 영역 (J-영역) 및 충분한 플래킹 (flanking) 영역이 타겟팅 벡터를 디자인하고 형성하는 포사인 Ig 중쇄 (Seq ID No. 4로 나타냄)의 단편을 증폭시켰다. 이 단편 및 이 단편의 서브클론을 그대로 유지하기 위해서는, 이들 단편을 하버하는 대장균 (Stable 2, Invitrogen cat #1026-019)을 3O℃로 유지시켰다. Seq. ID No. 4의 영역을 서브클론하여, Seq. ID No. 5에 나타낸 바와 같은 타겟팅 벡터를 어셈블하는데 사용하였다. 이 벡터를 포사인 태아 섬유아세포에 트랜스펙션하고, 이어서 G418로 선택하였다. 얻어진 콜로니를 PCR로 스크린하여, 가능한 타겟팅 이벤트를 검출하였다 (Seq ID No. 6 및 Seq ID No.7, 5' 스크린 프라이머; 및 Seq ID No. 8 및 Seq ID No. 9, 3' 스크린 프라이머). 타겟팅을 개략적으로 예시하는 도 1을 참조한다. 타겟팅은 서던 블로팅으로 확인하였다. 핵 도너로서 타겟된 태아 섬유아세포를 사용하여, 핵 이식에 의해 새끼 돼지를 생산하였다.

핵 이식:

타겟된 태아 섬유아세포를 핵 도너 세포로서 사용하였다. 핵 이식을 당업계에 공지된 방법으로 행하였다 (예를 들면, Dai et al., Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002; and Polejaeva et al., Nature 407:86-90, 2000 참조).

난모 세포를, 소 혈청 알부민 (BSA; 4 gl ^-1 )을 함유하는 예열된 둘베코 인산 완충생리식염수 (PBS)를 사용하여 난관의 역분류에 의해 hCG 주사 후에 46 내지 54 시간 수집하였다 (Polejaeva, IA, et al (Nature 407, 86-90 (2000)에 기재). 시험관내에서 성숙된 난모세포 (BioMed, Madison, WI)의 적출을 성숙 후 40 내지 42 시간에 개시하였다 (Polejaeva, IA, et al. (Nature 407, 86-90 (2000)에 기재). 회수된 난모세포를 38℃에서 4 gl ^-1 BSA를 함유하는 PBS로 세정하고, 38℃에서 실험실로의 운반을 위해 칼슘 비함유 인산 완충액 NCSU-23 배지에 이송하였다. 적출을 위해, 본 발명자들은 난모세포를 38℃에서 5 ㎍ ml ^-1 사이토칼라신 (cytochalasin) B (Sigma) 및 7.5 ㎍ ml ^-1 훽스트 (Hoehst) 33342 (Sigma)를 함유하는 칼슘 비함유 인산 완충액 NCSU-23 배지에서 20 분간 배양하였다. 18 μM 글래스 피펫 (Humagen, Charlottesville, Vir ginia)을 사용하여, 제 1 극체 바로 밑의 소량의 세포질을 흡인하였다. 본 발명자들은 흡인된 핵질을 자외선에 노출시켜, 중기판의 존재를 확인하였다.

핵 이식을 위해, 단일 섬유아세포를 각각 적출된 난모 세포와 접촉하여 투명대 아래에 두었다. 융합 및 활성화를 5 V의 AV 펄스를 5 초 동안 가하고, 각각 ECM2001 일렉트로셀 매니풀레이터 (BTX Inc., San Diego, CA)를 사용하는 1.5 kV/cm의 2개의 DC 펄스를 60 ㎲간 가함으로써 유도하였다. 융합된 엠브리오를 38.6℃에서 5% CO ₂ 습윤 분위기 중에서 1 내지 4 시간 배양한 다음, 발정 동기화된 수용 길트의 난관에 이송하였다. 교배종 길트 (large white/Duroc/landrace) (280-400 lbs)를 피드에 혼합된 18 내지 20 mg 레구-메이트 (Altrenogest, Hoechst, Warren, NJ)를 경구 투여하여 수용 동물로서 동조될 수 있다. 레구-메이트는 14일간 연속해서 공급될 수 있다. 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG, 1,000 유닛; Intervet America, Millsboro, DE)을 최종 레구-메이트 처리 후에 약 105 시간 근육내 투여될 수 있다. 엠브리오 트랜스퍼는 hCG 주사 후에 약 22 내지 26 시간 행해질 수 있다. 핵 이식에 의해, 4개의 리터로부터 18개의 건강한 돼지 새끼를 생산하였다. 이들 동물은 하나의 기능성 와일드형 Ig 중쇄 로커스 및 하나의 디스럽스트된 Ig 중쇄 로커스를 갖는다.

세포 및 피그 조직 샘플의 서던 블롯 분석. 세포 또는 조직 샘플을 6O℃에서 용해 완충액 (1O mM Tris, pH 7.5, 1O mM EDTA, 1OmM NaCl, 0.5% (w/v) 사르코실, 1 mg/ml 프로테이나제 K)에서 용해하여, DNA를 에탄올로 침전시켰다. 그 다음에, DNA를 사용되는 프로브에 따라 Ncol 또는 Xbal로 소화시켜, 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 전기영동 후에, DNA를 나일론막에 이송하여, 디곡시게닌 표지된 프로브로 프로브하였다 (Ncol 소화에 관해서는 SEQ ID No 41, Xbal 소화에 관해서는 SEQ ID No 40). 밴드를 화학 발광 기질계 (Roche Molecular Biochemicals)를이용하여 검출하였다.

중쇄 서던에 대한 프로브:

HC J 프로브 (Xba I 소화 이용)

HC Mu 프로브 (Ncol 소화 이용)

실시예 2: 포사인 카파 경쇄 타겟팅 및 카파 경쇄의 발현을 필요로 하는 포 사인의 생산

일부의 포사인 Ig 카파-쇄 로커스를 3X 리던던드 (리던던트) 포사인 BAC 라이브러리로부터 분리하였다. 일반적으로, BAC 라이브러는 피그 전체 게놈 DNA를 프래그먼트함으로써 발생된 다음에, 전체 동물의 게놈의 적어도 3배를 나타내는 BAC 라이브러리를 유도할 수 있다. 그 후에, 포사인 카파 쇄 면역글로불린을 포함하는 BAC는 본 명세서에 기재된 바와 같이 포사인 카파 쇄 면역글로불린에 선택적인 프로브의 하이브리다이제이션을 통해 선택될 수 있다.

포사인 Ig 경쇄 카파의 프래그먼트를 일부의 J-영역 (프라이머는 Seq ID No. 10로 나타냄)에 상보적인 프라이머 및 카파 C-영역 (Seq ID No. 11로 나타냄)에 상보적인 프라이머를 사용하여 증폭하였다. 얻어진 앰플라이머를 프라스미드 벡터로 클론하여, 30℃에서 스테이블 2 세포에서 유지하였다 (Seq ID No. 12). 개략적인 예시를 위해 도 2를 참조한다.

별도로, 포사인 Ig 경쇄 카파의 단편을 일부의 C-영역 (Seq ID No. 13)에 상보적인 프라이머 및 카파 인핸서 영역 (Seq ID No. 14)에 상보적인 프라이머를 이용하여, 증폭하였다. 얻어진 앰플라이머를 제한효소 및 DNA 단편에 의해 프래그먼트하고, 생산, 클론하여, 30℃에서 스테이블 2 세포에서 유지하였다. 이러한 시퀀싱의 결과로서, 2개의 비오버래핑 코티그를 어셈블하였다 (Seq ID No. 15, 앰플라이머의 5' 부분; 및 Seq ID No. 16, 앰플라이머의 3' 부분). 다운스트림 코티그의 시퀀스 (Seq ID No. 16)를 이용하여, 프라이머 세트 (Seq ID No. 17 및 Seq ID No. 18)를 디자인하여, 인핸서 (Seq ID No. 19) 주변의 인접 단편을 증폭하였다. Seq ID No. 12 및 Seq ID No. 19 각각의 서브클론을 사용하여, 타겟팅 벡터 (Seq ID No. 20)를 형성하였다. 이 벡터를 포사인 태아 섬유아세포로 트랜스펙션하고, 이어서 G418로 선택하였다. 얻어진 콜로니를 PCR로 스크린하여, 가능한 타겟팅 이벤트를 검출하였다 (Seq ID No. 21 및 Seq ID No. 22, 5' 스크린 프라이머; 및 Seq ID No. 23 및 Seq Id No 43, 3' 스크린 프라이머, 및 Seq ID No. 24 및 Seq Id No 24, 내인성 스크린 프라이머). 서던 블로팅에 의해 타겟팅을 확인하였다. 부가적인 카파 시퀀스를 클로닝함으로써 서던 블롯 전략 설계를 용이하게 하는데, 이는 생식 계열 카파 전사용 주형 (Seq ID No. 25)과 일치한다. 태아 피그를 핵 이식에 의해 생산하였다.

핵 이식:

타겟된 태아 섬유아세포를 핵 도너 세포로서 사용하였다. 핵 이식을 당업계에 공지된 방법으로 행하였다 (예를 들면, Dai et al., Nature Biotechnology 20: 251-255, 2002; and Polejaeva et al., Nature 407:86-90, 2000 참조).

난모 세포를, 소 혈청 알부민 (BSA; 4 gl ^-1 )을 함유하는 예열된 둘베코 인산 완충생리식염수 (PBS)를 사용하여 난관의 역분류에 의해 hCG 주사 후에 46 내지 54 시간 수집하였다 (Polejaeva, IA, et al (Nature 407, 86-90 (2000)에 기재). 시험관내에서 성숙된 난모세포 (BioMed, Madison, WI)의 적출을 성숙 후 40 내지 42 시간에 개시하였다 (Polejaeva, IA, et al. (Nature 407, 86-90 (2000)에 기재). 회수된 난모세포를 38℃에서 4 gl ^-1 BSA를 함유하는 PBS로 세정하고, 38℃에 서 실험실로의 운반을 위해 칼슘 비함유 인산 완충액 NCSU-23 배지에 이송하였다. 적출을 위해, 본 발명자들은 난모세포를 38℃에서 5 ㎍ ml ^-1 사이토칼라신 (cytochalasin) B (Sigma) 및 7.5 ㎍ ml ^-1 훽스트 (Hoehst) 33342 (Sigma)를 함유하는 칼슘 비함유 인산 완충액 NCSU-23 배지에서 20 분간 배양하였다. 18 μM 글래스 피펫 (Humagen, Charlottesville, Vi rginia)을 사용하여, 제 1 극체 바로 밑의 소량의 세포질을 흡인하였다. 본 발명자들은 흡인된 핵질을 자외선에 노출시켜, 중기판의 존재를 확인하였다.

핵 이식을 위해, 단일 섬유아세포를 각각 적출된 난모 세포와 접촉하여 투명대 아래에 두었다. 융합 및 활성화를 5 V의 AV 펄스를 5 초 동안 가하고, 각각 ECM2001 일렉트로셀 매니풀레이터 (BTX Inc., San Diego, CA)를 사용하는 1.5 kV/cm의 2개의 DC 펄스를 60 ㎲간 가함으로써 유도하였다. 융합된 엠브리오를 38.6℃에서 5% CO ₂ 습윤 분위기 중에서 1 내지 4 시간 배양한 다음, 발정 동기화된 수용 길트의 난관에 이송하였다. 교배종 길트 (large white/Duroc/landrace) (280-400 lbs)를 피드에 혼합된 18 내지 20 mg 레구-메이트 (Altrenogest, Hoechst, Warren, NJ)를 경구 투여하여 수용 동물로서 동조될 수 있다. 레구-메이트는 14일간 연속해서 공급될 수 있다. 인간 융모성 고나도트로핀 (hCG, 1,000 유닛; Intervet America, Millsboro, DE)을 최종 레구-메이트 처리 후에 약 105 시간 근육내 투여될 수 있다. 엠브리오 트랜스퍼는 hCG 주사 후에 약 22 내지 26 시간 행해질 수 있다.

카파 타겟된 세포를 이용하는 핵 이식에 의해, 5개의 리터로부터 33개의 건강한 피그를 생산하였다. 이들 피그는 포사인 Ig 경쇄카파의 하나의 기능성 와일드형 대립 유전자 및 하나의 디스럽스트된 Ig 경쇄 카파 대립 유전자를 갖는다.

세포 및 피그 조직 샘플의 서던 블롯 분석. 세포 또는 조직 샘플을 6O℃에서 용해 완충액 (1O mM Tris, pH 7.5, 1O mM EDTA, 1O mM NaCl, 0.5% (w/v) 사르코실, 1 mg/ml 프로테이나제 K)에서 용해하여, DNA를 에탄올로 침전시켰다. 그 다음에, DNA를 SacI로 소화시켜, 1% 아가로스 겔 상에서 분리하였다. 전기영동 후에, DNA를 나일론막에 이송하여, 디곡시게닌 표지된 프로브로 프로브하였다 (SEQ ID No 42). 밴드를 화학 발광 기질계 (Roche Molecular Biochemicals)를이용하여 검출하였다.

카파 서던용 프로브:

실시예 3:

포사인 람다 유전자 로커스의 특성화

포사인 람다를 디스랍트 또는 무능하게 하기 위해, 타겟팅 전략을 고안하여, J 내지 C 발현 카세트의 콘카타머 (concatamer)를 포함하는 람다 로커스의 영역의 제거 또는 디스럽션하였다. 일부의 포사인 게놈을 포함하는 BAC 클론을 생성할 수 있다. 일부의 포사인 Ig 람다-쇄 로커스를 3X 리던던트 포사인 BAC 라이브러리로부터 분리하였다. 일반적으로, BAC 라이브러는 피그 전체 게놈 DNA를 프래그먼트함으로써 발생된 다음에, 전체 동물의 게놈의 적어도 3배를 나타내는 BAC 라이브러리를 유도할 수 있다. 그 후에, 포사인 람다 쇄 면역글로불린을 포함하는 BAC는 본 명세서에 기재된 바와 같이 포사인 람다 쇄 면역글로불린에 선택적인 프로브의 하이브리다이제이션을 통해 선택될 수 있다.

람다 JC 플래킹 영역 (도 3 참조)을 포함하는 BAC 클론은 독립적으로 프래 그먼트되어, 플라스미드 벡터로 서브클론될 수 있다. J 내지 C 인트론의 존재를 위해 개개의 서브클론을 PCR로 스크린하였다. 본 발명자들은 하나의 C 영역 내지 다음 C 영역으로 증폭함으로써 다수의 카세트를 클론하였다. 이러한 증폭은 임의의 C 영역 (Seq ID 26 및 Seq ID 27) 내에서 발산 익스텐션을 허용하도록 배향되는 프라이머를 사용하여 달성되었다. 성공적인 증폭을 얻기 위해, 익스텐드된 생성물을 인접 C 영역 (동일한 C 영역과 반대측)으로부터 생성되는 익스텐드된 생성물에 수속한다. 이러한 전략은 주로 한 C 영역으로부터 인접 C 영역으로 연장되는 주로 앰플라이머를 생산한다. 그러나, 일부의 앰플라이머는 인접 C를 가로질러 다음 C로의 증폭의 결과로, 인접 C를 넘어서 위치한다. 이들 멀티 유전자 앰플라이머는 일부의 C, 다음의 JC 유닛의 J 및 C 영역, 제 3 JC 유닛의 J 영역, 및 제 3 JC 유닛의 C 영역 일부를 포함한다. Seq ID 28은 이러한 하나의 앰플라이머이고, 제거되거나 디스럽트되어야 하는 시퀀스를 나타낸다.

클론된 다른 포사인 람다 시퀀스는 포사인 람다 경쇄 게놈 시퀀스의 제 1 람다 J/C 영역에 대한 5' 플래킹 시퀀스를 포함하는 Seq ID No. 32; 람다 J/C의 약 200개의 염기쌍 다운스트림으로부터, 포사인 람다 경쇄 게놈 시퀀스의 /C 클러스터 영역에 대한 3' 플래킹 시퀀스를 포함하는 Seq ID No. 33; 인핸서에 인접하는 J/C 클러스터의 약 11.8 Kb 다운스트림인 포사인 람다 경쇄 게놈 시퀀스의 J/C 클러스터 영역에 대한 3' 플래킹 시퀀스를 포함하는 Seq ID No. 34; 인핸서 영역을 포함하는 람다의 약 12 Kb 다운스트림을 포함하는 Seq ID No. 35; 람다의 약 17.6 Kb 다운스트림을 포함하는 Seq ID No. 36; 람다의 약 19.1 Kb 다운스트림을 포함하는 Seq ID No. 37; 람다의 약 21.3 Kb 다운스트림을 포함하는 Seq ID No. 38; 및 람다의 약 27 Kb 다운스트림을 포함하는 Seq ID No. 39를 포함한다.

실시예 4: 람다 유전자용 타겟팅 벡터의 생산

일례에서, J1의 영역 업스트림에 일치하는 하나의 타겟팅 암 및 최종 C의 다운스트림인 영역에 일치하는 다른 암으로 벡터를 디자인하여 형성하였다 (도 4 참조). 하나의 타겟팅 벡터를 J1의 업스트림을 타겟하도록 디자인한다. 이러한 타겟팅 벡터는 선택될 수 있는 선택가능한 마커를 이용한다. 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 포지티브 및 네가티브 선택가능한 마커를 사용할 수 있다. 헤르페스 심플렉스 티미딘 키나제 (TK) 및 Tn5 아미노글리코시드 포스포토트란스페라제 (Neo 내성) 유전자의 코딩 영역으로 구성되는 융합 유전자를 사용한다. 이러한 융합 유전자를 록스 부위 등의 본 명세서에 기재되거나 당업계에 공지된 부위 특이성 리콤비나제 (SSRRS)의 인지 부위에 의해 플랭크한다. G418 선택의 사용을 통해 타겟된 세포의 분리시에, Cre를 트란스로 공급되어, 마커 유전자를 검출한다 (도 5 참조). 마커 유전자를, TK에 의해 검출한 세포를 간시클로비르 등의 독성물로 대 사될 수 있는 당업계엥 공지된 약물의 첨가에 의해 선택한다. 그 다음에, 얻어진 유전자형은 제 2 벡터로 타겟된다. 제 2 타겟팅 벡터 (도 6)를 디자인하여, 최종 C의 다운스트림을 타겟하고, 특이성 재조합 부위 (lox)에 의해 한 부위에만 플랭크되는 포지티브/네가티브 선택계를 이용한다. 재조합 부위를 제 1 타겟팅 이벤트에 관하여 말단에 위치시킨다. 타겟된 유전자형의 분리시에, Cre를 다시 트란스로 공급하여, 제 2 타겟팅 이벤트에 운반된 재조합 부위에 대한 제 1 타겟팅 이벤트에 제공된 재조합 부위로부의 제거를 조절한다. 전체의 J 내지 C 클러스터가 제거될 것이다. 적절한 유전자형을 간시클로비르의 투여에 의해 다시 선택한다.

다른 예에서, 삽입 타겟팅 벡터를 사용하여, 각각 C 영역을 독립적으로 디스럽트한다. 삽입 타겟팅 벡터는 각각의 C 영역 유전자를 디스랍트하도록 디자인되어 어셈블될 것이다. JC 클러스터에는 적어도 3 J 내지 C 영역이 존재한다. 본 발명자들은 제 1 및 최종 C 영역을 타겟하도록 벡터를 디자인함으로써 프로세스를 시작하고, 타겟팅 벡터 부위 특이성 재조합 부위에 포함할 것이다. 일단 삽입이 이뤄지면, 개재 영역은 부위 특이성 리콤비나제로 제거될 것이다.

실시예 5: 이종 교배 of 중쇄 단일 녹아웃과 카파 단일 녹아웃 피그의 이중 교배

하나의 디스럽트된 Ig 중쇄 로커스 및 하나의 디스럽트된 Ig 경쇄 카파 대립 유전자를 갖는 피그를 생산하도록, 단일 녹아웃 동물을 이종 교배하였다. 제 1 수태로 4개의 태아를 얻었는데, 2개는 중쇄 및 카파 타겟팅 이벤트에 대한 PCR 및 서던에 의해 포지티브하게 스크린되었다 (프라이머에 대해서는 실시예 1 및 2 참조 ). 태아 섬유아세포를 분리하여, 확대하고 냉동시켰다. 카파 단일 녹아웃과 중쇄 단일 녹아웃의 교배에 의한 제 2 수태로, 건강한 돼지 새끼를 생산하였다.

중쇄 단일 녹아웃 및 카파 쇄 단일 녹아웃을 포함하는 태아 섬유아세포는 추가의 타겟팅을 위해 사용될 것이다. 이러한 세포는 본 명세서에 기재된 방법 및 조성물을 통해 람다 로커스를 타겟하는데 사용될 것이다. 얻어진 새끼는 중쇄, 카파 쇄 및 람다 쇄용 헤테로접합형 녹아웃일 것이다. 이들 동물은 본 명세서에 기재된 인간 Ig 유전자를 함유하는 동물과 크로스된 다음에, 다른 단일 Ig 녹아웃 동물과 교배하여, 인간 Ig 치환 유전자를 갖는 포사인 Ig 이중 녹아웃 동물을 생산할 것이다.

본 발명은 이의 바람직한 실시예에 관해 기술되었지만, 본 발명의 변형 및 변경은 당업자에 의해 본 발명의 상술한 상세한 설명으로부터 명백할 것이다.

SEQUENCE LISTING <110> Revivicor, Inc. Ayares, David Wells, Kevin <120> Ungulates with Genetically Modified Immune Systems <130> 10758.105020 REV 1012 US <140> PCT/US2005/038582 <141> 2005-10-24 <150> US 60/621,433 <151> 2004-10-22 <160> 43 <170> PatentIn version 3.3 <210> 1 <211> 666 <212> DNA <213> Sus scrofa <400> 1 tctagaagac gctggagaga ggccagactt cctcggaaca gctcaaagag ctctgtcaaa 60 gccagatccc atcacacgtg ggcaccaata ggccatgcca gcctccaagg gccgaactgg 120 gttctccacg gcgcacatga agcctgcagc ctggcttatc ctcttccgtg gtgaagaggc 180 aggcccggga ctggacgagg ggctagcagg gtgtggtagg caccttgcgc cccccacccc 240 ggcaggaacc agagaccctg gggctgagag tgagcctcca aacaggatgc cccacccttc 300 aggccacctt tcaatccagc tacactccac ctgccattct cctctgggca cagggcccag 360 cccctggatc ttggccttgg ctcgacttgc acccacgcgc acacacacac ttcctaacgt 420 gctgtccgct cacccctccc cagcgtggtc catgggcagc acggcagtgc gcgtccggcg 480 gtagtgagtg cagaggtccc ttcccctccc ccaggagccc caggggtgtg tgcagatctg 540 ggggctcctg tcccttacac cttcatgccc ctcccctcat acccaccctc caggcgggag 600 gcagcgagac ctttgccc 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