一种蜂毒肽的应用及运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用

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一种蜂毒肽的应用及运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用
申请号	CN201710995177.3	申请日	2017-10-23	公开(公告)号	CN109692327A	公开(公告)日	2019-04-30
申请人	华中科技大学; 华中科技大学鄂州工业技术研究院;			发明人	骆清铭; 张智红; 刘征; 范展;
摘要	本发明公开了一种蜂毒肽的应用，涉及生物科学和药物载体技术领域，蜂毒肽用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂。本发明还公开了一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，运载蜂毒肽的纳米颗粒由运载蜂毒肽的多肽和磷脂、胆固醇脂组成，其用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂，可以通过皮肤淋巴系统，蓄积在致敏过的皮肤引流淋巴结，并在其中发挥抑制抗原特异性T细胞增殖和降低过度免疫反应的功效，且毒副作用低。
权利要求	1.一种蜂毒肽的应用，其特征在于：所述蜂毒肽用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂。 2.一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，其特征在于：所述运载蜂毒肽的纳米颗粒由运载蜂毒肽的多肽和磷脂、胆固醇脂组成；所述运载蜂毒肽的多肽由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成；所述运载蜂毒肽的纳米颗粒用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂。 3.如权利要求2所述的一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，其特征在于：所述药剂能够在淋巴结中抑制抗原特异性T细胞增值，抑制细胞炎症因子释放。 4.如权利要求2所述的一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，其特征在于：所述运载蜂毒肽的纳米颗粒还用于制备药物载体，所述药物载体用于装载疾病诊断的染料分子或药物分子。 5.如权利要求2所述的一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，其特征在于：所述磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。 6.如权利要求2所述的一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，其特征在于：所述α螺旋多肽的氨基酸序列为DWFKAFYDKVAEKFKEAF。 7.如权利要求2所述的一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，其特征在于：所述蜂毒肽的氨基酸序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ。 8.如权利要求2所述的一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，其特征在于：所述连接序列的氨基酸序列为GSG。
说明书全文	一种蜂毒肽的应用及运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用技术领域 [0001] 本发明涉及生物科学和药物载体技术领域，具体涉及一种蜂毒肽的应用及运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用。背景技术 [0002] 过敏性皮炎是最为常见的免疫性皮肤疾病。目前基于过敏性皮炎的治疗主要是激素类药物，然而激素在治疗过程中存在着诱发骨质疏松、高血糖和皮肤萎缩等一系列副作用，长期使用还会诱发激素性皮炎。开发新的应用于治疗过敏性皮炎的药物具有很大的应用前景。 [0003] 天然蜂毒在传统医学中运用广泛，其中之一便是天然蜂毒的免疫抑制效果。目前，蜂针疗法已有效应用于抑制多发性硬化、过敏性鼻炎、关节炎等免疫性疾病。过敏性皮炎也是一种免疫反应介导的皮肤学疾病。因此，运用传统医药-蜂毒治疗过敏性皮炎具有巨大潜力。然而，运用蜂毒全部成分来治疗免疫性疾病的医学证据并不充分。特别的是，蜂毒成分复杂，作为一种自然状态下蜜蜂体内的提取的混合物，难以直接研究以及应用于临床的特性。蜂毒肽(melittin)是一种两亲性的α螺旋结构的多肽，为蜂毒中的主要活性成分，占其干重的40％-60％。蜂毒肽对于细胞膜结构具有非常高效的破坏性，包括质膜以及胞内一些细胞器的膜结构。其作用机制主要有通过其两亲性的结构嵌入至磷脂膜结构中，然后在膜上打孔，致使膜结构发生破裂，膜内外环境的变化最终导致细胞的死亡；也可以通过影响细胞内介导肿瘤增殖的多条信号通路中的关键蛋白，进而引起细胞凋亡。同时，蜂毒肽还具有广谱的抗菌功能和抗艾滋病的功能。 [0004] 同时，由于蜂毒肽毒性的特点，难以将其直接应用于活体的疾病治疗中。因为蜂毒肽在注入血管后会迅速与红细胞结合，破坏细胞膜，以致产生强烈的溶血反应。而且直接将蜂毒肽应用于活体治疗，会对机体正常细胞造成破坏，带来极大的毒副作用。另外，蜂毒肽在机体内的半衰期很短，代谢速度很快，并不利于临床的疾病治疗。 [0005] 因此，亟需一种蜂毒肽治疗过敏性皮肤疾病并探索其在免疫系统中的调控机制的技术方案，为过敏性皮肤疾病治疗药剂提供新的方向。发明内容 [0006] 针对现有技术中存在的缺陷，本发明的目的在于提供一种蜂毒肽的应用，用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂，可有效抑制抗原特异性T细胞增值，抑制细胞炎症因子释放。 [0007] 为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：一种蜂毒肽的应用，所述蜂毒肽用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂。 [0008] 与现有技术相比，本发明的优点在于： [0009] 本发明中蜂毒肽用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂，能有效抑制过敏引起的炎症肿胀程度，其抑制炎症程度与临床常用激素药物-地塞米松具有类似效果，可有效抑制抗原特异性T细胞增值，抑制细胞炎症因子释放。 [0010] 本发明的目的还在于提供一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂，治疗效果好，毒副作用低。 [0011] 为达到以上目的，本发明采取的技术方案是：所述运载蜂毒肽的纳米颗粒由运载蜂毒肽的多肽和磷脂、胆固醇脂组成；所述运载蜂毒肽的多肽由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成；所述运载蜂毒肽的纳米颗粒用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂。 [0012] 在上述方案的基础上，所述药剂能够在淋巴结中抑制抗原特异性T细胞增值，抑制细胞炎症因子释放。 [0013] 在上述方案的基础上，所述运载蜂毒肽的纳米颗粒还用于制备药物载体，所述药物载体用于装载疾病诊断的染料分子或药物分子。 [0014] 在上述方案的基础上，所述磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)。 [0015] 在上述方案的基础上，所述α螺旋多肽的氨基酸序列为DWFKAFYDKVAEKFKEAF。 [0016] 在上述方案的基础上，所述蜂毒肽的氨基酸序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ。 [0017] 在上述方案的基础上，所述连接序列的氨基酸序列为GSG。 [0018] 与现有技术相比，具有以下优点： [0019] (1)治疗效果好 [0020] 该运载蜂毒肽的纳米颗粒制备的治疗过敏性皮肤疾病的药剂可以通过皮肤淋巴系统，蓄积在致敏过的皮肤引流淋巴结，并在其中发挥抑制抗原特异性T细胞增殖，降低过度免疫反应的功效，起到良好的抗过敏治疗效果。 [0021] (2)毒副作用低 [0022] 该运载蜂毒肽的纳米颗粒制备的治疗过敏性皮肤疾病的药剂，由于增加了蜂毒肽与磷脂之间的相互作用，使蜂毒肽埋藏在单层磷脂层当中，从而避免了蜂毒肽与血细胞和正常细胞的直接接触，皮内给药的毒副作用低。 [0023] (3)功能可拓展 [0024] 该运载蜂毒肽的纳米颗粒还可以用于制备药物载体，该药物载体可在其核心装载用于疾病治疗药物分子如类固醇甾体类激素等，也可同时装载其它类型的靶向性多肽或治疗性多肽，实现疾病的协同靶向或协同治疗的功效。附图说明 [0025] 图1为不同剂量的蜂毒肽治疗接触性过敏性皮炎的评价； [0026] 图2为蜂毒肽治疗慢性接触性过敏性皮炎的评价； [0027] 图3为应用蜂毒肽的纳米颗粒尾根部皮内注射，治疗C57BL/6小鼠慢性过敏性皮肤疾病的耳朵切片HE染色图； [0028] 图4为运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽分别在活体腹部皮内注射后将对比小鼠皮肤损伤实物图； [0029] 图5为运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽活体耳朵皮内注射肿胀实验比较曲线图； [0030] 图6为运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽尾根部皮内注射治疗C57BL/6小鼠慢性过敏性皮肤疾病模型的时间-肿胀厚度曲线图； [0031] 图7为运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽以及PBS尾根部皮内注射治疗C57BL/6小鼠慢性过敏性皮肤疾病的耳朵切片HE染色图； [0032] 图8为运载蜂毒肽的纳米颗粒核心装载荧光染料DiR-BOA，C57BL/6小鼠活体内检测纳米颗粒在皮肤引流淋巴结和组织器官的分布及浸润情况的整体荧光成像图； [0033] 图9为运载蜂毒肽的纳米颗粒与半抗原刺激的淋巴细胞体外孵育共培养检测细胞增殖实验的结果示意图； [0034] 图10为运载蜂毒肽的纳米颗粒与半抗原刺激的淋巴细胞体外孵育共培养检测细胞增殖实验的结果统计图； [0035] 图11为运载蜂毒肽的纳米颗粒与过敏原刺激的淋巴细胞共孵育培养抑制IFN-γ的表达； [0036] 图12为运载蜂毒肽的纳米颗粒能有效降低血清中促炎相关细胞因子IFN-γ和IL-4表达水平。具体实施方式 [0037] 以下结合附图及实施例对本发明作进一步详细说明。 [0038] 实施例1：蜂毒肽的应用 [0039] 本发明实施例公开了一种蜂毒肽的应用，蜂毒肽用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂。 [0040] 实施例2：运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用 [0041] 本发明实施例公开了一种运载蜂毒肽的纳米颗粒的应用，运载蜂毒肽的纳米颗粒用于制备治疗过敏性皮肤疾病的药剂。该药剂能够在淋巴结中抑制抗原特异性T细胞增值，抑制细胞炎症因子释放。运载蜂毒肽的纳米颗粒还用于制备药物载体，该药物载体用于装载疾病诊断的染料分子或药物分子。 [0042] 其中，运载蜂毒肽的纳米颗粒由运载蜂毒肽的多肽和磷脂、胆固醇脂组成。磷脂为二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC，1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine)。运载蜂毒肽的多肽由α螺旋多肽、连接序列和蜂毒肽以共价键的形式串连而成。α螺旋多肽的氨基酸序列为DWFKAFYDKVAEKFKEAF。α螺旋多肽的氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.1所示。蜂毒肽的氨基酸序列为GIGAVLKVLTTGLPALISWIKRKRQQ，其氨基酸序列为序列表中SEQ ID NO.2所示。连接序列的氨基酸序列为GSG。 [0043] 实施例3游离蜂毒肽运用于活体治疗慢性过敏性皮肤疾病的研究 [0044] 实施例1中的蜂毒肽运用于活体治疗过敏性皮肤疾病及慢性过敏性皮肤疾病的研究参见图1、图2、图3。图1中显示了游离蜂毒肽真皮注射，在一个C57/BL6小鼠单次半抗原诱导的过敏性皮肤疾病模型中，能有效抑制过敏引起的炎症肿胀程度，其抑制炎症程度与临床常用激素药物-地塞米松具有类似效果。图2中显示了游离蜂毒肽真皮注射，在一个C57/BL6小鼠多次半抗原诱导的慢性过敏性皮肤疾病模型中，能有效抑制过敏引起的炎症肿胀程度。图3耳朵皮肤切片HE染色结果显示了蜂毒肽真皮注射能有效抑制过敏性皮肤疾病所引起的肿胀、炎症细胞浸润、表皮组织异常增生。 [0045] 实施例4运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽应用于活体的毒性研究对比[0046] 实施例2的运载蜂毒肽的纳米颗粒与实施例1的游离蜂毒肽应用于活体的毒性研究对比参见图4、图5。图4为皮肤内注射1mg/mL运载蜂毒肽的纳米颗粒和游离的蜂毒肽组织切片HE染色结果对比，游离的蜂毒肽会造成更严重的炎症细胞浸润，组织及细胞结构损失，而运载蜂毒肽的纳米颗粒只有少量炎症细胞浸润，且没有破坏组织细胞。图5中显示运载蜂毒肽的纳米颗粒和游离的蜂毒肽在蜂毒肽的浓度均达到1mg/mL情况下小鼠耳朵皮内注射12h后肿胀程度对比：运载蜂毒肽的纳米颗粒耳内注射1mg/mL浓度剂量时，会造成50μm左右的肿胀；而游离的蜂毒肽耳内注射1mg/mL浓度剂量时，会造成150μm左右的肿胀。图4为运载蜂毒肽的纳米颗粒与游离蜂毒肽分别在活体腹部皮内注射后将对比小鼠皮肤损伤实物图。游离的蜂毒肽会造成肉眼可见的皮肤损伤和持续的肿胀，而运载蜂毒肽的纳米颗粒无可见皮损。 [0047] 实施例5：运载蜂毒肽的纳米颗粒用于活体治疗慢性过敏性皮肤疾病的研究[0048] 实施例2中的运载蜂毒肽的纳米颗粒安全应用于活体治疗慢性过敏性皮肤疾病的研究，参见图5及图6。图7耳朵皮肤切片HE染色结果显示了蜂毒肽的纳米颗粒能有效抑制过敏性皮肤疾病所引起的肿胀、炎症细胞浸润、表皮组织异常增生。图12显示了运载蜂毒肽的纳米颗粒能有效降低血清中促炎相关细胞因子IFN-γ和IL-4表达水平。 [0049] 实施例6：运载蜂毒肽的纳米颗粒能有效在皮肤引流淋巴结中蓄积以及抑制半抗原特异性CD8+T细胞增殖并且抑制细胞炎症因子的释放的研究 [0050] 实施例2的运载蜂毒肽的纳米颗粒能有效在皮肤引流淋巴结中蓄积以及抑制半抗原特异性CD8+T细胞增殖并且抑制细胞炎症因子的释放的研究参见图8、图9、图10和图11。如图8所示，尾根部两侧皮内注射运载蜂毒肽的纳米颗粒并且核心装载荧光染料DIR-BOA，结果显示12h时，皮肤引流淋巴结中蓄积大量荧光染料信号，且解剖小鼠发现仅在小鼠皮肤的腹股沟和腋下引流淋巴结，以及肝脏中发现较强的荧光信号，说明了运载蜂毒肽的纳米颗粒能进入淋巴系统调节免疫反应，并且对脏器负担较小。图9和图10显示了运载蜂毒肽的纳米颗粒能有效抑制淋巴结中过敏原特异性的CD8+T细胞增殖；图11显示了运载蜂毒肽的纳米颗粒与过敏原刺激的淋巴细胞共孵育培养，检测细胞上清，其有效抑制了炎症相关细胞因子IFN-γ的表达。 [0051] 实施例7：运载蜂毒肽的纳米颗粒的三类组成物质(磷脂、胆固醇酯、多肽)在临床上的应用 [0052] 实施例2的运载蜂毒肽的纳米颗粒的三类组成物质(磷脂、胆固醇油酸酯、多肽)都已经在临床上有应用。 [0053] 磷脂类物质已经应用于临床治疗，脂质体就是一个很好的例子。Doxil是一种用脂质体包裹阿霉素用来治疗卡波济氏肉瘤的药物，美国FDA已经批准Doxil用于卵巢癌和多发性骨髓瘤的治疗。 [0054] 胆固醇是人机体内本身存在的物质，具有很好的生物安全性。 [0055] 多肽类物质也有许多应用于临床治疗，例如：鹿瓜多肽就是一种很好的治疗骨折的药物。作为该药物主要成分的骨诱导多肽类生物因子可有效促进机体内影响骨形成和吸收的骨源性生长因子的合成。鹿瓜多肽注射液能明显促进骨愈合及新骨的形成，调节骨代谢，具有抗炎镇痛等作用，对骨折不愈合骨质疏松症疗效确切，无明显不良反应，对类风湿性关节炎软组织损伤疗效优良。 [0056] 本发明不局限于上述实施方式，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围之内。本说明书中未作详细描述的内容属于本领域专业技术人员公知的现有技术。