蜂毒蛋白的有用特性和编码这种蜂毒蛋白的基因

                    发明领域

本发明涉及克隆和表达在治疗各种疾病，特别是炎症如类风湿性关 节炎时具有治疗功能的蛋白质的领域。更具体地说，本发明涉及一种从 蜜蜂毒液中提纯的称为PX3.101的新型蛋白质和编码该蛋白质的基因。

                    发明背景

免疫系统在对抗感染中起着极其重要的有益作用。但是，在某些情 况下，不适宜的免疫反应可能导致许多残废疾病。自身免疫或免疫系统 介导的疾病或者可以是经B-细胞介导(即经抗体介导)或者可以是经T- 细胞介导。许多自身免疫疾病包括一不希望的炎症反应。这些疾病的例 子包括类风湿性关节炎、慢性肝炎、克罗恩氏病、牛皮癣等。

用于自身免疫疾病，特别是包括一不希望的炎症反应的那些的现有 治疗方法已不适宜。大多数免疫系统介导的疾病为需要延长给药以缓解 该病症的慢性病症。因此，用于治疗这些疾病的药物的一个重要标准是 毒性低。但是，用于治疗自身疾病的许多药物(例如甾类和非甾类消炎 化合物(NSAID))，长时间使用之后证实具有很大的毒副作用。还使用了 各种免疫抑制性药物(例如环孢菌素A和硫唑嘌呤)治疗自身免疫疾病。 但是，这些化合物相对无特异性，并且具有削弱整个免疫系统的副作用， 因此使患者易感传染病。

包括类风湿性关节炎的许多炎症都与白介素8(IL-8)有关。IL-8为 一种启动募集反应和激活中性白细胞并代表几种急性炎症反应的内源性 介导物之一的趋化因子。IL-8还被不同地称之为中性白细胞激活因子、 来自单核细胞的中性白细胞趋化因子、白介素-8(IL-8)和中性白细胞激 活肽。术语IL-8已获得最广泛的接受并将其用于本发明。

炎症和自身免疫反应是为响应化学引诱剂分子而将白细胞从微血管 中移出并移入血管外空间开始的。化学引诱剂可以来自该宿主并包括趋 化因子和激活的补体组分，或者可以从侵入生物体中释放。一旦在血管 中与化学引诱剂接触，白细胞可被激活并能够粘附到内皮上提供形成炎 症的第一步。为响应介导这些细胞朝向化学引诱剂源进入血管外空间的 梯度化学引诱剂，经过刺激的中性白细胞粘附到微血管的内皮上。参见， 例如Anderson等的“临床研究杂志”74:536-551,(1984)；Ley,K等 的“血液”77:2553-2555,(1991)；Paulson,J.C.的“选择蛋白碳水 化合物介导的白细胞粘着”，“粘着：其在炎症中的作用”W.H.Freeman, 1992；Lasky,L.A.的“归巢受体”(LECAM1/L-选择蛋白)，“粘着：其 在炎症中的作用”W.H.Freeman,(1992)。

类风湿性关节炎为一种较普遍自身免疫和炎症。该疾病使总人口中 约1％和仅美国约250万人受折磨。全世界直接处方使用花费估计在56 亿美元。对患类风湿性关节炎的个体而言，个体免疫系统错误地感知自 身关节组织为外来的，并因此开始异常免疫反应。该疾病的特征为慢性 炎症、软骨破坏、以及最终骨糜烂并破坏关节。

就其它炎症而言，用于IL-8介导的疾病和类风湿性关节炎的已知治 疗可以包括使用抑制整个免疫系统的非特异性免疫抑制药物；然而，如 上所述，这些治疗方法使或者冒着接触传染病的危险。长期使用这些药 物还可能导致严重的副作用。而且，免疫抑制药物在除去类风湿性关节 炎症状中仅部分有效，而且这种治疗的效用随时间趋于降低。

目前使用的其它治疗为非甾类消炎药(NSAID)、皮质甾类和各种疾病 减轻的抗风湿性药物(DMARD)。对这些药物的普遍不满在以下两个主要 原因：(ⅰ)负面影响的发生率，这导致每年超过7000000人住院治疗，(ⅱ) 对病程逆转无能为力。

由于通常对炎症和自身免疫疾病的有效治疗很少，并且需要用于治 疗与IL-8有关的疾病尤其是例如类风湿性关节炎的有效组合物，因此 大量需要能够用于治疗这些疾病的新物质。

本发明提供了有效地治疗自身免疫和炎症，特别是类风湿性关节炎 的新型分离蛋白和编码这种蛋白质的核酸。本发明的肽还可以抑制IL-8 与其受体结合并抑制与炎症有关的各种酶。

                    发明概述

本发明提供了含有编码PX3.101多肽或其片段的多核苷酸序列的核 酸分子。当使用字长(W)为3的BLASTP算法和BLOSUM62评分矩阵比较 时，本发明的多肽为与SEQ ID NO:2中残基74-349列出的氨基酸序列 在至少约40个氨基酸长度的区域内至少75％相同的氨基酸序列。当使用 字长(W)为3、M=5和N=-4的BLASTN算法比较时，所述多核苷酸序列优 选与SEQ ID NO:1中残基74-349列出的核酸序列在至少50个核苷酸长 度的区域内至少75％的相同。

本发明的核酸还包括分离核酸分子，该分子含有选自以下基团的核 苷酸序列：(a)与SEQ ID NO:1中核苷酸74-349互补的脱氧核糖核苷酸 序列；(b)与SEQ ID NO:1中核苷酸74-349互补的核糖核苷酸序列；(c) 与(a)的脱氧核糖核苷酸序列或(b)的核糖核苷酸序列互补的核苷酸序 列；(d)能够与SEQ ID NO:1中核苷酸74-349杂交的至少23个保守核 苷酸的核苷酸序列；和(e)能够与(d)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列。 在严格条件下本发明的核酸分子将杂交到由SEQ ID NO:1中核苷酸74- 349组成的多核苷酸序列上。本发明的例证核酸为由SEQ ID NO:1中核 苷酸74-349组成的核酸。本发明的核酸还包括能够用正向引物 5’AAGGATCCACAGTGCAACGTAAGTTC3’(SEQ ID NO:3)和反向引物 5’ACTGATAAAATAATAAC3’(SEQ ID NO:5)扩增的那些。

本发明还提供了当使用字长(W)为3的BLASTP算法和BLOSUM62评分 矩阵比较时具有与SEQ ID NO:2中列出的氨基酸序列在至少40个氨基 酸长度的区域内至少75％相同的氨基酸序列的多肽。本发明的多肽包括 通过在严格条件下与具有SEQ ID NO:1中列出的序列的核酸片段杂交的 核酸片段编码的多肽。多肽还包括具有与含有SEQ ID NO:2中列出的氨 基酸序列的多肽共有抗原决定簇的那些。本发明多肽的一个例子为具有 SEQ ID NO:2中列出的序列的多肽。本发明还提供了含有来自SEQ ID NO:2 的至少12个连续氨基酸的多肽片段。本发明所提供的其它多肽为纯化 多肽，包括单肽、至少3个GGX重复和从最后GGX重复延伸到含至少7 个半胱氨酸残基的C-端的C端片段，其中X为任意氨基酸并且该多肽的 长度低于140个氨基酸。

本发明还包括含有含本发明核酸的载体的细胞。例如，本发明提供 了具有含一启动子的重组表达盒的细胞，该启动子可操纵地与编码本发 明所述多肽的多核苷酸序列相连。还提供了表达本发明多肽的原核细胞 和真核细胞。

本发明还提供了生产含有SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其片段的多 肽的方法。这些方法通常包括：在适宜表达所述多肽的条件下培养含有 重组表达盒的宿主细胞，然后从宿主细胞培养物中回收所述多肽。

本发明还提供了对本发明多肽和多肽片段特异的抗体。

本发明提供了许多药用组合物。这些组合物典型地含有本发明所述 的多肽和药用上可接受的赋形剂。在某些情况下，这些组合物还包括已 知对治疗炎症有效的互补试剂。可以使用不同组合物治疗不同疾病，包 括例如炎症、癌症、自身免疫疾病、疼痛和与趋化因子失调相关的疾病。 这些方法通常包括向患病患者给予治疗用有效剂量的一种本发明的药用 组合物。

本发明还提供了抑制某些趋化因子与其受体之间相互作用或者抑制 与炎症相关的酶的方法。这些方法通常包括将本发明的多肽与含趋化因 子及其受体的溶液或含有与炎症有关的酶的溶液混合。

                    附图简述

图1显示了通过Sephadex G-50分级柱洗脱的蜜蜂毒液悬浮液的洗 脱图。将1ml蜜蜂毒液悬浮液(约0.5g固体材料)稀释在10ml柱缓冲 液(甲酸铵缓冲液，0.1M,pH4.6)中，离心并通过0.45μm过滤器过滤。 将所得溶液加样到用柱缓冲液预平衡的Sephadex G-50柱(两个相连的 柱，每个1.5×170cm(直径x高度))。以约0.6ml/min将该柱洗脱并收集 100滴馏份(约4.0ml)。

图2显示了用于提纯PX3.101蛋白的三个HPLC提纯步骤的洗脱图。

图2A为从G-50分级柱获得的馏分的HPLC洗脱图。通过SDS-PAGE 测定例如显示在图1中的来自G-50分级柱的馏分中PX3.101的存在。 收集阳性馏分并将其加样到反相(RP)HPLC柱(半预制C-18柱)。用乙睛 梯度将该柱洗脱(详细信息参见实施例Ⅰ中反相HPLC部分)。将含有 PX3.101的馏分收集并冷冻干燥。

图2B为显示通过离子交换HPLC进一步提纯PX3.101的洗脱图，其中将 来自第一次RP-HPLC色谱提纯步骤的PX3.101粉末溶于0.1M甲酸铵(pH5.8) 中并将其加样到离子交换HPLC柱上(详细内容参见实施例Ⅰ)。

图2C为使用第二个RP-HPLC柱的PX3.101最后提纯步骤的洗脱图的 例子。将示于图2B中的来自该离子交换HPLC提纯的PX3.101馏分收集 并加样到另一RP-HPLC柱上。显示来自2g干蜂毒的PX3.101的提纯的 色谱。PX3.101馏分(Puri#1、Puri#2和Puri#3)示于该图中。将Puri- 1、Puri-2和Puri-3的混合物用于动物研究和机理研究。在本文中讨论 了PX3.101馏分Puri-#1、Puri-#2和Puri-#3之间的差异。

图3A显示了编码全长PX3.101的cDNA的全长核苷酸序列(SEQ ID NO:1) 和PX3.101的推断蛋白序列(SEQ ID NO:2)。该核苷酸序列按常规在左 边列出了编号；序列从PX3.101cDNA的第一个核苷酸开始。在右边以 斜体字计算出了氨基酸的数量。以星号表示符合读框的终止密码子。在 从肽测序获得的4个肽序列下划线。

图3B为显示信号肽区域、含有Gly Gly Xaa(其中Xaa=任意氨基酸 并且Gly=甘氨酸)重复单元的区域和富含半胱氨酸区域的PX3.101蛋白 质结构的略图。

图3C为PX3.101蛋白质及其潜在同系物的结构的略图。包括氨基酸 的编码和登记号。

图4为显示PX3.101在CIA(胶原诱导的关节炎)小鼠动物模型中控制 炎症效果的图。消炎痛和蜂毒用作阳性对照。PBS用作阴性对照。严格 测定在每个处理组中测定的发炎程度(详细内容参见实施例Ⅴ)。

图5包括来自不同处理组的小鼠的典型关节组织的照片。图5A(正常对 照)显示了没有注射诱导类风湿性关节炎的胶原但注射了在常规生理盐 水中的磷酸盐缓冲液(PBS)的小鼠的关节。图5B(负对照)为注射了诱导 类风湿性关节炎的胶原还注射了PBS的小鼠的关节的照片。图5C为注 射了诱导类风温性关节炎的胶原还注射了含PX3.101(200μg/kg)的溶液 的小鼠关节的照片。其它详细内容提供在实施例Ⅴ中。

图6为显示不同浓度的PX3.101在CIA(胶原诱导的关节炎)小鼠模型 中控制炎症效果的图。测定三种剂量的PX3.101(8μg/kg、40μg/kg和 200μg/kg)。严格测定在每个处理组中测定的发炎程度(其它详细内容参 见实施例Ⅴ)。

图7A为显示在从蜜蜂毒液中提纯的不同浓度的PX3.101下抑制趋化 因子IL-8与其受体CXCR2之间结合的图。将提纯PX3.101添加到0.2ml 反应溶液中，使得最终PX3.101浓度为0、0.01、0.1、1.0和10μM(分 别相应于柱1-5)。反应混合物还含有0.15mg/ml表达CXCR2的人重组CHO 细胞的膜制品、0.015nM125I IL-8和10nM未标记的IL-8，并在室温下 将其培养60分钟。将结合的放射性配体与未结合的放射性配体分离并 在γ计数器上计数放射性。将该结合的配体标准化并计算在没有PX3.101 的溶液中结合的配体的百分比。还显示了提纯PX3.101对IL-8与其受 体CXCR1结合(柱6:0μM；和柱7:10μM)以及TNF-α与TNF-α受体结合 的影响(柱8:0μM；和柱9:10μM)。详细的测定方法描述在实施例Ⅵ 中。结果为2次测定的平均数。

图7B显示了说明通过重组PX3.101蛋白质(●)和来自蜜蜂毒液的天 然PX3.101蛋白质(▲)抑制IL-8/CXCR2相互作用的抑制图。

图8为表达构建以生产重组PX3.101蛋白质的载体的简图。

                      定义

术语“核酸”是指单链或者双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷 酸聚合物，除非有其它限制，包括以与天然存在的核苷酸相似的方式杂 交到核酸上的天然核苷酸的已知类似物。除非另有说明，一个特定的核 酸序列包括其互补序列。“亚序列”是指分别包括一部分较长核苷酸或 氨基酸(例如多肽)的核苷酸或氨基酸序列。

“探针”是能够通过一种或多种化学键，经常是通过互补碱基对， 经常是通过形成氢键，因此形成双链结构结合到互补序列的靶核酸的核 酸。该探针结合或杂交到“探针结合部位”。探针可以包括天然(即A、G、 C或T)或修饰碱基(7-脱氮鸟苷、肌甙等)。探针可以是一为单链DNA的 低聚核苷酸。低聚核苷酸探针可以是由天然存在的多核苷酸合成或生产 的。此外，探针中的碱基可以通过除磷酸二酯键之外的键连接，只要它 不干扰杂交。因此，探针可以是组成碱基通过肽键而不是磷酸二酯键连 接的肽核酸(参见例如，Nielsen等的“科学”254,1497-1500(1991))。 有些探针可以具有非互补地侧连一互补区的前导序列和/或尾随序列。

术语“多肽”、“肽”和“蛋白质”可互换地使用，是指氨基酸残基 的聚合物。该术语还适用于氨基酸聚合物，其中一个或多个氨基酸为相 应天然存在的氨基酸的化学类似物。

术语“可操纵地相连”是指核酸表达控制序列(例如启动子、信号序 列、或一批转录因子结合部位)和二级多核苷酸之间的功能键，其中该 表达控制序列影响该二级多核苷酸的转录和/或翻译。

本文中所用的“异源序列”或“异源核酸”是一种来源于特定宿主 细胞之外的源，或者，如果来自相同源，为由其原始形式经过修饰的。 因此，尽管相对该特定宿主细胞为内源的，但是原核宿主细胞中的异源 基因包括已经过修饰的基因。例如可以通过用限制酶处理该DNA，以便 产生能够可操纵地连接到启动子上的DNA片段，这样进行异源序列的修 饰。例如定点诱变的技术对修饰异源核酸也是有用的。

术语“重组”当针对细胞使用时，是指细胞复制异源核酸，或表达 由异源核酸编码的肽或蛋白质。重组细胞可以含有在天然形式(非重组) 的细胞中未发现的基因。重组细胞还可以含有在天然形式的细胞中发现 的基因，其中这些基因通过人工方式被修饰或再导入细胞中。该术语还 包括含有相对在没有从细胞中移走核酸的情况下已被修饰的细胞为内源 的核酸的细胞；这些修饰包括通过基因置换、定点突变和相关技术获得 的那些。

“重组表达盒”或简单地“表达盒”为一核酸构建体，通过重组或 合成产生，具有能够影响构建基因表达的控制单元，所述构建基因在可与 这些序列相容的宿主中可操纵地连接到所述控制单元上。表达盒至少包 括启动子，以及任选地转录终止信号。典型地，该重组表达盒至少包括 一待转录的核酸(例如编码所需多肽的核酸)和启动子。正如本文所述 的，还可以影响表达所需或有用的其它因子。例如，表达盒还可以包括 编码信号序列的核苷酸序列，该信号序列介导从所述宿主细胞中分泌表 达蛋白。在表达盒中还可以包括转录终止信号、增强子和影响基因表达 的其它核酸序列。

术语“分离”、“提纯”或“相当纯”意思是物质类型(例如PX3.101 多肽或其片段，或核酸片段)主要以大分子类型存在(即以摩尔计它比组 合物中任意其它单个种都多)，并且优选该物质类型含有至少50％(以摩 尔计)的所有大分子种类。通常，分离、提纯或相当纯的组合物将含有 存在于组合物中的多于80-90％的所有大分子种。最优选，将该物质类型 提纯至基本上匀质(即通过传统鉴定方法检测不到污染物种)，其中该组 合物主要由单一大分子种组成。

术语“互补”意思是一核酸与另一核酸分子相同，或者选择地杂交 到另一核酸分子上。当杂交时存在杂交选择性，它比总体上缺乏特异性 的分子更具选择性。典型地，当在一段至少14-25个核苷酸内存在至少 约55％，优选至少65％，更优选至少75％，并最优选至少90％相同性时， 将进行选择性杂交。。优选地，一核酸特异性地杂交到另一核酸上。参 见M.Kanehisa的“核酸研究”12:203(1984)。

术语“相同”或百分比“相同性”，在本文的两个或多个核酸或多肽 中是指两个或多个相同或具有特定百分比核苷酸或氨基酸残基的序列或 亚序列，当比较和对比最大对应时，使用序列比较算法如下面所述的那 些，或者例如通过目测测定所述核苷酸或氨基酸残基是相同的。

短语“基本上相同”，在本文的两个核酸或多肽中是指当比较和对比 最大对应时，使用序列比较算法如下面所述的那些，或者例如通过目测 测定，两个或多个序列或亚序列具有至少75％，优选至少85％，更优选 至少90％、95％或更高的核苷酸或氨基酸残基相同性。优选地，该基本上相 同性存在于长为至少约40-50个残基的这些序列的区域内，优选存在于 大于50个氨基酸，更优选至少约90-100个残基的更长区域内，并且最 优选这些序列在比较的序列的全长，例如核苷酸的编码区内基本上相 同。

为了比较序列，典型地一个序列起参考序列的作用，测定序列与其 相比。当使用序列比较算法时，将测定序列和参考序列输入计算机中， 如果需要的话，指定亚序列坐标，并指定序列算法程序参数。然后以指 定的程序参数为基础，该序列比较算法计算相对参考序列的测定序列的 百分比序列相同性。

例如可以通过Smith和Waterman在“高级应用数学”2:482(1981) 中的局部同源性算法、Needleman和Wunsch在“分子生物学杂志” 48:443(1970)中的同源性对比算法、Person和Lipman在“美国国家科 学院院报”85:2444(1988)中的相似性检索法、计算机化进行这些算法 (GAP、BESTFIT、FASTA和TFASTA，于威斯康星基因组软件包中，基因 组计算机集团，575理科博士Madison,WI)、或者通过目测(通常参见 Ausubel等人，见上面)进行序列比较的最佳对比。

适宜测定百分比序列相同性和序列相似性的另一算法例子为BLAST 算法，该算法在Altschul等的“分子生物学杂志”215:403-410(1990) 中有描述。进行BLAST分析的软件可以公众名义从国家生物技术信息中 心(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)获得。该算法包括首先在该怀疑序 列中通过鉴定长W的短字来鉴定高评分序列对(HSP)，当与数据库序列 中相同长度的字对比时它或者符合或者满足某些正值阈值评分T。T被 认为是相邻字评分阈值(Altschul等人，见上面)。这些最初相邻的字标 的起开始搜索发现含有它们的更长的HSP的种子的作用。然后这些字标 的从两个方向沿每个序列延伸，直至可以增加累积对比得分。使用参数 M(一对匹配残基的奖赏得分，总是＞0)和N(不匹配残基的惩罚得分；总 是＜0)计算核苷酸序列的累积得分。对氨基酸序列而言，使用评分矩阵 计算累积得分。当：累积对比得分从其最大达到值下降到数X；由于一 种或多种负得分残基排列的累积使该累积得分达到零或以下；或者到达 序列任一端时，停止字标在每个方向的延伸。为了鉴定核酸或多肽是否 在本发明的范围内，BLAST程序的缺席参数是适宜的。该BLASTN程序(对 核苷酸序列而言)用作缺席字长(W)为11，期望值(E)为10,M=5,N=-4， 并且比较两条链。对氨基酸序列而言，该BLASTP程序用作缺席字长(W) 为3，期望值(E)为10，以及该BLOSUM62评分矩阵。该TBLATN程序(使 用用于核苷酸序列的蛋白质序列)用作缺席字长(W)为3，期望值(E)为 10，以及BLOSUM 62评分矩阵。(参见Henikoff和Henikoff的“美国 国家科学院院报”89:10915(1989))。

除了计算百分比序列相同性之外，该BLAST算法还进行两个序列之 间相似性的统计分析(参见例如，Karlin和Altschul的“美国国家科学 院院报”90:5873-5787(1993))。通过该BLAST算法提供的一种相似性 测定是最小总概率(P(N))，它提供了该概率的指标，由此通过变更进行 两个核苷酸或氨基酸序列之间的匹配。例如，如果测定核酸与参考核酸 比较的最小总概率低于约0.1，更优选低于约0.01，并且最优选低于约 0.001，那么该核酸被认为与该参考序列相似。

两个核酸序列基本上相同的另一指标是在严格条件下将两个分子彼 此杂交。“基本上结合”是指在探针核酸和靶核酸之间互补杂交并且包 含较少的不匹配，这种不匹配可以通过降低杂交介质的严格度来调节， 从而实现靶多核苷酸序列的所需测定。短语“特异性地杂交到”是指当 序列存在于复杂混合物(例如全部细胞)DNA或RNA中时一分子在严格条 件下仅结合、形成双螺旋或杂交到特定核苷酸序列上。

术语“严格条件”是指探针将杂交到其靶亚序列，但不杂交到其它 序列上的条件。严格条件是序列依赖型，并且随环境的不同而有差异。 温度越高，序列特异性杂交得越长。通常，将严格条件选择为比定义离 子强度和pH下特定序列的加热熔点(Tm)低约5℃。该Tm为在平衡状态 下与靶序列互补的探针50％杂交到靶序列上的温度(在定义离子强度、pH 和核酸浓度下)。(通常当靶序列过量存在时，在Tm下50％探针占据平衡 状态)。典型地，严格条件是那些：在pH7.0-8.3下盐浓度低于约1.0MNa离子，典型地约0.01-1.0M Na离子浓度(或其它盐)，对短探针(例如 10-50个核苷酸)而言温度至少为约30℃，对长探针(例如大于50个核 苷酸)而言至少为约60℃。还可以添加去稳定剂如甲酰胺来达到严格条 件。

如下所述，两个核酸序列或多肽基本上相同的另一指标是由第一核 酸编码的多肽可以免疫地与第二核酸编码的多肽交叉反应。短语“特异 性地结合到蛋白质上”或“特异性地免疫反应”当指的是抗体时是指在 有异源污染蛋白质和其它生物制剂的情况下鉴定所述蛋白质存在的结合 反应。因此，在指定的免疫测定条件下，特定抗体优先结合到特定蛋白 质上，而不是大量结合到存在于样品中的其它蛋白质上。在这些条件下 的蛋白质的特异性结合需要选择对特定蛋白质专一的抗体。许多免疫测 定制剂可以用于选择与特定蛋白质专一地免疫反应的抗体。例如，通常 将固相ELISA免疫测定法用于选择与一蛋白质专一地免疫反应的单克隆 抗体。参见例如，Harlow和Lane(1988)的“抗体，实验室手则”，冷泉 港出版社，纽约，描述了可用于测定专一免疫反应性的免疫测定制剂和 条件。

特定多核苷酸序列的“保守修饰的变体”是指编码相同或大致相同 的氨基酸序列的那些多核苷酸，或者其中所述多核苷酸不将一氨基酸序 列编码到大致相同的序列上。由于遗传密码的简并性，大量功能上相同 的核酸编码任意所给多肽。例如，密码子CGU、CGC、CGA、CGG、AGA和 AGG都编码氨基酸精氨酸。因此，在由密码子指定精氨酸的每一位置， 可以在没有变更所编码的多肽的情况下将该密码子变更为任意所述相应 密码子。这些核酸变体为“沉默变体”，它是一种“保守修饰的变体”。 本文中所述的编码多肽的每个多核苷酸序列还描述了每种可能的沉默变 体，除非另有说明。本领域技术人员应意识到，可以通过标准技术修饰 核酸中的每个密码子(除AUG之外，它通常是蛋氨酸的唯一密码子)，从 而产生功能上相同的分子。因此，编码多肽的核酸的每种“沉默变体” 暗示在每种所述序列中。

一个多肽典型地与第二种多肽基本上相同，例如，其中所述两个肽 仅通过保守置换有差异。当描述蛋白质时，“保守置换”是指基本上不 改变蛋白质活性的蛋白质的氨基酸组成的变更。因此，特定氨基酸序列 的“保守修饰的变体”是指对蛋白质活性不是至关重要的氨基酸的氨基 酸置换或者用具有相似性能(例如酸性、碱性、正电荷或负电荷、极性 或非极性等)的其它氨基酸置换氨基酸，以便甚至关键氨基酸的置换几 乎不改变活性。提供功能上相似氨基酸的的保守置换表在本领域中为公 知。参见例如，Creighton(1984)的“蛋白质”，W.H.Freeman和Company。 此外，在所编码的序列中变更、添加或缺失单个氨基酸或少量氨基酸的 单个置换、缺失或添加也为“保守修饰的变体”。

对一物质所用的术语“天然存在的”是指物质可以在自然界找到的 事实。例如，存在于生物体中并可以从天然源分离出来且未经人在实验 室中有意修饰的多肽或多核苷酸为天然存在的。

术语“抗体”是指由一种或多种主要由免疫球蛋白基因或免疫球蛋 白基因片段编码的多肽组成的蛋白质。已识别的免疫球蛋白基因包括κ、 λ、α、γ、δ、ε和μ恒定区基因，以及无数免疫球蛋白可变区基因。轻链 被分为κ或λ。重链被分为γ、μ、α、δ或ε，依次分别将免疫球蛋白类型 定义为IgG、IgM、IgAI、gD和IgE。

典型的免疫球蛋白(抗体)构建单元包括一四聚体。每个四聚体由两 对相同的多肽链组成，每对具有一“轻”链(约25kD)和一“重”链(约 50-70kD)。每一链的N-端定义主要响应抗原识别的约100-110或更多氨 基酸的可变区。术语“可变轻链”(VL)和“可变重链”(VH)分别是指那 些轻和重的链。

抗体以完整免疫球蛋白或以通过不同肽酶消化生产的许多良好鉴定 的片段存在。因此，例如，胃蛋白酶在铰链区消化通过二硫键连接的抗 体，从而产生F(ab)’2，一Fab的二聚物，其本身为通过二硫键连接到 VH-CH1上的轻链。可以在温和条件下将该F(ab)’2还原，从而断裂铰链 区中的二硫键，由此将该F(ab)’2二聚物转变成一Fab’单体。该Fab’单 体主要为具有部分铰链区的Fab(参见，“基础免疫学”W.E.Paul编辑， Raven出版社，纽约(1993)，更详细地描述了其它抗体片段)。尽管根据 完整抗体的消化定义了不同抗体片段，但是本领域技术人员应意识到， 这些Fab’片段可以经过化学或者利用重组DNA方法学重新合成。因此， 本文中所用的术语“抗体”还包括或者通过修饰整个抗体生产或者使用 重组DNA方法学重新合成的抗体片段。优选抗体包括单链抗体，更优选 单链Fv(scFv)抗体，其中可变重链和可变轻链连接在一起(直接或通过 肽接头)，从而形成连续的多肽。

单链Fv(“scFv”或“scFv”)多肽为共价连接的VH::VL异二聚体，它可 以由含有直接连接或通过肽编码接头连接的VH-和VL-编码序列的核酸 表达。Huston等的“美国国家科学院院报”85:5879-5883(1988)。用于 将天然聚集-但经化学分离的轻和重多肽链从抗体V区转变成折叠成三 维结构的scFv分子的许多结构与抗原结合部位的结构基本上相似。参 见例如US5091513和5132405和4956778。

“抗原结合部位”或“结合部分”是指参与抗原结合的免疫球蛋白 分子部分。所述抗原结合部位是由重(“H”)和轻(“L”)链的N-末端可 变(“V”)区的氨基酸残基形成的。在重和轻链的V区中的三个高度趋 异段被称之为“超可变区”，它被插入已知为“构架区”或“FR”的更 保守的侧翼段中。因此，术语“FR”是指天然发现在免疫球蛋白中在超 可变区之间和与之相邻的氨基酸序列。在一抗体分子中，轻链的三个超 可变区和重链的三个超可变区彼此相对排列在三维空间中形成抗原结合 “表面”。该表面介导靶抗原的识别和结合。重和轻链各自的三个超可 变区被称之为“互补性决定区”或“CDR”并被鉴定，例如通过Kabat 等的“免疫学重要性的蛋白序列”第4版，美国卫生部和人类事业、公 共卫生署，Bethesda医学博士(1987)。

术语“抗原决定簇”是指赋予抗原特异性的分子的特定化学基团。

术语“表位”通常是指与抗体相互作用的抗原部分。更具体地说， 术语表位包括能够特异地结合到免疫球蛋白或T-细胞受体的任意蛋白决 定簇。当抗体结合到抗原上的解离常数为≤1μM，优选≤100nM并且最优 选≤1nM时存在特异性结合。表位决定簇通常由分子的化学活性表面基团 如氨基酸组成，并且典型地具有特定的三维结构特性，以及特定电荷特 性。

术语“患者”包括人和兽医受治疗者。

                    发明详述

本发明提供了一种新型提纯的蛋白质，本发明人称之为PX3.101，它 能有效地治疗各种疾病，特别是例如类风湿性关节炎的炎症。本发明还 提供了编码PX3.101的核酸，以及表达盒、表达载体和含有它们且用于 通过重组法生产PX3.101多肽及其片段的细胞。本发明还提供了特异地 结合到所述蛋白质上的抗体。本发明还提供了含有本发明蛋白质的药用 组合物和使用这些药用组合物治疗各种疾病的方法。本发明还提供了抑 制趋化因子和其受体结合的方法和抑制与各种炎症有关的某些酶的方 法。

本发明所提供的蛋白质除了在治疗例如炎症的各种疾病中有用外， 它在研究趋化因子和其受体之间的相互作用中以及涉及例如已包含在各 种炎症的环氧合酶、磷脂酶和蛋白酶的酶的动力学和抑制研究中有用。 本发明所提供的核苷酸和肽序列还可用于产生引物和/或探针，从而筛 选不同种，特别是人中的PX3.101同系物。 Ⅰ、蛋白质

在一实施方式中，本发明提供了基本上纯的PX3.101多肽，它是从 天然源中分离的，和/或根据重组法制备的，和/或通过化学合成制备的， 和/或使用重组法和化学合成的组合制备的。通过图3和SEQ ID NO:2 中所示的氨基酸序列例证了PX3.101多肽。如果由天然源分离，PX3.101 优选从昆虫，特别是蜜蜂毒液中分离。全长PX3.101具有约7700道尔 顿的分子量，并在氨基端具有由5个Gly-Gly-Xaa重复表征的结构(Gly= 甘氨酸，Xaa=任意氨基酸；有时简称为GGX)，在羧基端具有富含半胱氨 酸的基序。本文中所用的术语“PX3.101”包括SEQ ID NO:2中所列的 全长分子和具有相似活性的其它多肽。该术语还包括缺少信号序列(SEQ ID NO:2的残基1-19)的蛋白质。还包括例如具有由SEQ ID NO:2的残 基22-92、SEQ ID NO:2的残基24-92和SEQ ID NO:2的残基26-92的 氨基酸序列的多肽。

本发明还包括与SEQ ID NO:2所列的氨基酸序列具有至少约75％相同 性的氨基酸序列的分离多肽。更具体地说，本发明的多肽为与SEQ ID NO:2 的氨基酸序列具有至少80-85相同性，直到更优选至少90％或95％的相 同性。PX3.101和感兴趣多肽之间的相似区典型地延续至少40个氨基酸 长的区域，更优选大于40个氨基酸例如50、60、70或80个氨基酸的 更长区，最优选全长多肽。用于比较多肽和PX3.101氨基酸序列的算法 的一个例子为BLASTP算法；适宜的参数包括字长(W)为3，和BLOSUM62 评分矩阵。

除基本上全长多肽之外，本发明提供了所述多肽的生物活性片段。 生物活性可以包括多肽在减轻各种炎症(例如类风湿性关节炎)症状，和 /或抑制趋化因子(例如IL8)与其受体结合，和/或抑制与炎症有关的酶 (这些蛋白质包括，为了说明并非限制性，环氧合酶、磷脂酶、脂氧合 酶、和蛋白酶如胰蛋白酶和组织蛋白酶G)中的效率。重要生物活性的其 它例子包括抗体结合(例如，所述片段与SEQ ID NO:2所列的全长PX3.101 竞争)和免疫原性(即具有刺激B-或T-细胞抗所述片段反应的表位)。

本发明还提供了一般含有至少5个连续氨基酸，典型地至少6或7 个连续氨基酸，更典型地8或9个连续氨基酸，通常至少10、11或12 个连续氨基酸，优选至少13或14个连续氨基酸，更优选至少16个连 续氨基酸，最优选至少20、40、60或80个连续氨基酸的亚序列。本发 明提供的亚序列的其它例子为从PX3.101的N-末端移走1-10个氨基酸 (即SEQ ID NO:2的残基1-10)的氨基酸序列。这些多肽的例子列于下表 Ⅱ中，其中在全长PX3.101的N-末端缺少2、4或6个氨基酸。

本发明的多肽还包括SEQ ID NO:2中所列氨基酸序列的结构域的特 定区。例如，本发明的多肽包括信号区(SEQ ID NO:2的残基1-19)、含 GGX重复的区域(SEQ ID NO:2的残基20-34；也称之为GGX蛋白质或肽) 和在C-端富含半胱氨酸的区域(SEQ ID NO:2的残基35-92)，该富含半 胱氨酸的区域由特异半胱氨酸模式CXCXXG(C=半胱氨酸，G=甘氨酸，以 及X=任意氨基酸)。

本发明的多肽典型地由基本上与SEQ ID NO:1中所列和图3A中所示 的核苷酸序列相同的核苷酸序列编码。编码本发明多肽的核苷酸还典型 地与SEQ ID NO:1中所列的多核苷酸序列杂交。

通常本发明的多肽将共用至少一个与SEQ ID NO:2中所列氨基酸序 列一样的抗原决定簇。通过该变体蛋白质与抗PX3.101多肽制备的任意 抗体的交叉反应性证实了这种相同决定簇。可以使用抗PX3.101的多克 隆血清进行交叉反应性试验，但是还可以使用一种或多种抗PX3.101的 单克隆抗体进行试验。

本发明还包括本文所述的多肽，其中多肽包括经过修饰的多肽主链。 这些修饰的说明性例子包括多肽的化学衍生物，例如乙酰化和羧化。修 饰还包括典型多肽的糖基化修饰和加工变体。这些加工步骤具体地包括 酶修饰，例如遍在蛋白化和磷酸化。参见例如Hershko和Ciechanover 的“生化年鉴”51:335-364(1982)。

本发明提供的多肽还包括含有信号肽的分离多肽、含有多个GGX重 复的片段(其中G为甘氨酸，X为任意氨基酸)、和从最后GGX重复延伸 到含有多个半胱氨酸残基的C-端的C-端片段。正如本文所用的，信号 肽或序列为能够介导多肽转移到细胞表面或胞内膜外部的序列。所述多 肽的氨基酸长度典型地为至少50、60、70、80或90个，或者其中的任 意长度。所述多肽一般不长于150、140、130、120、110或100个氨基 酸，或者其中任意长度。尽管可以含有多个重复，但是含多个GGX重复 的片段典型地含有至少3个或4个重复，另外例如含有5个重复。在C- 端片段中的半胱氨酸的数量典型地为至少5，但是可以是6、7、8、9、 10、11或12。在该片段中还可以含有大于此的半胱氨酸。在一个特定 的多肽中，所述多肽包括信号序列、含有5个GGX重复的片段和含有10 个半胱氨酸的C-端片段。 Ⅱ、核酸

本发明还提供了编码整个PX3.101蛋白(SEQ ID NO:2)或其具有 PX3.101活性的亚序列的分离和/或重组核酸。本发明的核酸可以包括天 然存在、合成和有意操作的多核苷酸序列(例如，介导诱变或使用交替 启动子用于RNA转录的部位)。用于PX3.101的所述多核苷酸序列包括 反义序列。本发明的核酸还包括遗传密码的简并所致的为简并的序列。

编码PX3.101的多核苷酸包括SEQ ID NO:1中所列的核苷酸序列和 与该序列互补的核酸序列。本发明还提供了上述核酸序列的亚序列。这 些亚序列包括，例如SEQ ID NO:1的编码区(核苷酸74-349)，以及长至 少为17、18、19、20、21、22、23、24或25个核苷酸且特异性地与编 码PX3.101的核酸杂交的亚序列。因此，本发明还包括含有选自如下核 苷酸序列的分离核酸分子：(a)与SEQ ID NO:1中核苷酸74-349互补的 脱氧核糖核苷酸序列；(b)与SEQ ID NO:1中核苷酸74-349互补的核糖 核苷酸序列；(c)与(a)的脱氧核糖核苷酸序列或(b)的核糖核苷酸序列 互补的核苷酸序列；(d)能够与SEQ ID NO:1中核苷酸74-349杂交的至 少23个保守核苷酸的核苷酸序列；和(e)能够与(d)的核苷酸序列杂交 的核苷酸序列。

本发明还提供了含有多核苷酸序列的核酸分子，该多核苷酸序列编 码具有与SEQ ID NO:2中所列氨基酸序列基本上相同的氨基酸序列的多 肽。例如，本发明包括编码多肽的多核苷酸序列，该多肽在至少40个 氨基酸长度内具有与SEQ ID NO:2中所列氨基酸序列有至少75％相同性 的氨基序列。更优选地，由本发明的核酸编码的多肽与SEQ ID NO:2的 氨基酸序列有至少80-85％的相同性，并且更优选在至少40个氨基酸的 区域内与SEQ ID NO:2的氨基酸序列有至少90-95％的相同性。在某些情 况下，该百分比相同性区域延续一50、60、70或80个氨基酸的区域， 更优选SEQ ID NO:2中所列氨基酸序列的全长。可以通过肉眼或用比较 算法进行由本发明的核酸编码的蛋白质的序列比较。一个这种算法为使 用字长(W)为3和BLOSUM62评分矩阵的BLASTP算法。

所述多核苷酸序列典型地基本上与例如SEQ ID NO:1的残基74-349 的多核苷酸序列相同。例如，本发明包括在至少约50个核苷酸长的区 域内与核酸SEQ ID NO:1有至少约75％的相同性。更优选地，本发明的 核酸与SEQ ID NO:1中所示的核酸序列有至少80-85％的相同性，并且更 优选在至少50个氨基酸的区域内与SEQ ID NO:1中所示的核酸序列有 至少90-95％的相同性。在某些情况下，该百分比相同性区域延续一大于 50个核苷酸的较长区域，例如75、100、125、150、175、200、225或 250个核苷酸，或者延续全长编码区(SEQ ID NO:1的残基74-349)。

为了鉴定本发明的核酸，本领域技术人员可以使用例如它们已知的 核苷酸序列比较算法。例如，可以使用BLASTN算法。用于BLASTN的适 宜参数为字长(W)11、M=5和N=-4。本发明核酸的一个例子包括SEQ ID NO:1中所列的多核苷酸序列，特别是从例如蜜蜂的昆虫中获得的。

或者，可以通过在严格条件下将感兴趣的核酸杂交到含有SEQ ID NO:1 的多核苷酸序列的核酸上来鉴定本发明的核酸。本发明还包括编码多肽 的核酸，该多肽在免疫学上可与PX3.101或其亚序列交叉反应。

可以通过本领域中已知的任意适宜方法获得本发明的核酸序列，包 括，例如，1)将基因组或cDNA库与探针杂交，以测定同源核苷酸序列； 2)表达文库的抗体筛选，以测定具有共享结构特征的克隆DNA片段；3) 各种扩增步骤，例如使用能够退火到感兴趣的核酸上的引物的聚合酶链 反应(PCR)；4)介导化学合成。

在一个实施方式中，通过常规克隆法分离本发明的核酸。使用编码 本文提供的PX3.101的基因或cDNA的核苷酸序列提供特异性地杂交到 cDNA文库中PX3.101 cDNA、基因组DNA样品中的PX3.101基因上、或 者杂交到总RNA样品中PX3.101 mRNA(例如以Southern或Northern印 迹)上的探针。一旦鉴定了靶核酸，可以根据本领域技术人员已知的标 准方法分离。

还可以使用众所周知的扩增技术克隆所需核酸。足够指导技术人员 通过体外扩增法的方案的例子，包括聚合酶链反应(PCR)、连接酶链反 应(LCR)、Qβ-复制酶扩增和其它RNA聚合酶介导技术，参见Berger、 Sambrook、和Ausubel、以及Mullis等(1987)的US4683202；PCR方法， 方法和应用指南(Innis等编辑)Academic Press Inc.San Diego, CA(1990)(Innis)；Arnheim和Levinson(1990年10月1日)C&EN36-47； “NIH研究杂志”(1991)3:81-94；Kwoh等(1989)“美国国家科学院院 报”86:1173；Guatelli等(1990)“美国国家科学院院报”87:1874；Lomell 等(1989)“临床化学杂志”35:1826；Landegren等(1988)“科学” 241:1077-1080；Van Brunt(1990)“生物技术”8:291-294；Wu和 Wallace(1989)“基因”4:560；和Barringer等(1990)“基因”89:117。 在Wallace等的US5426039中描述了克隆体外扩增的核酸的改进方法。 用于扩增本发明的核酸的适宜引物包括，例如，正向引物ASEQ10:5’ AAGGATCCACAGTGCAACGTAAGTTC 3’(SEQ ID NO:3)、正向引物ASEQ11:5’ AAGGATCCGGAGGATTTGGAGGATTTGGAGGATTTGGAGGACTTGGAGGACGTGG 3’(SEQ ID NO:4)、反向引物ASEQ13:5’ACTGATAAAATAATAAC 3’(SEQ ID NO:5)、 反向引物ASEQ14:5’ATGAATGATAAAATAC 3’(SEQ ID NO:6)、反向引物 ASEQ15:5’TTATAAAAGTCATCCGC 3’(SEQ ID NO:7)。

作为克隆核酸的一种选择，可以化学地合成适宜核酸。直接化学合 成法包括，例如，Narang等(1979)酶学方法68:90-99的磷酸三酯法； Brown等(1979)酶学方法68:109-151的磷酸二酯法；Beaucage等(1981) Tetra.Lett.22:1859-1862的二乙基磷酰胺化物法；和US4458066的 固体载体法。化学合成生产单链低聚核苷酸。可以通过与互补序列杂交， 或者使用所述单链作模板通过与聚合酶聚合将其转变成双链DNA。技术 人员应意识到，尽管DNA的化学合成经常被限制在约100个碱基的序列 中，但是可以通过连接较短序列获得更长的序列。或者，可以克隆亚序 列并使用适当的限制酶裂解适当亚序列。然后可以将所述片段连接产生 所需DNA序列。

在一些实施方式中，对本发明的核酸进行修饰可能是最理想的。技 术人员应意识到，有许多途径可以在给定核酸构建体中产生变化。这些 众所周知的方法包括位点介导诱变、使用简并低聚核苷酸的PCR扩增、 将含有所述核酸的细胞与诱变剂接触或暴露于射线中、所需低聚核苷酸 的化学合成(例如，伴随着连接和/克隆产生大的核酸)和其它众所周知 的技术。参见例如Giliman和Smith(1979)“基因”8:81-97、Roberts 等(1987)“自然”328:731-734。 Ⅲ、制备或分离蛋白质的方法

A、重组技术

1、常规

SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2分别所示的PX3.101核苷酸和核酸序列， 以及如上所述其它变体的相应序列，使其生产全长PX3.101多肽及其片 段。这些多肽可以在原核或真核宿主细胞中通过编码PX3.101或其片段 的多核苷酸的表达来生产。在所述序列已可操纵地连接到表达载体中的 表达控制序列上之后，所述克隆DNA序列在宿主中表达。表达载体典型 地可在宿主生物体中或者以游离基因或者以宿主染色体DNA的整个部分 复制。一般来说，表达载体含有选择标记，例如四环素抗性或潮霉素抗 性，从而允许检测和/或选择用所需DNA序列转化的那些细胞(参见例如 US4704362)。

2、用于表达多肽的表达盒和宿主细胞

典型地，在所需宿主细胞中对产生大量本发明多肽起作用的启动子 的控制下放置编码本发明多肽的多核苷酸。大量的启动子为众所周知， 并可将其用于本发明的表达载体中，这取决于具体的应用。通常，所选 的启动子取决于所述启动子在其中具有活性的细胞。还选择性地包括其 它表达控制序列如核糖体结合部位、转录终止部位等。含有一种或多种 这些控制序列的构建体被称为“表达盒”。因此，本发明提供了编码本 文中所述的多肽的核酸以高水平表达加入所需宿主细胞中的表达盒。

在一优选实施方式中，所述表达盒对本发明的多肽在真核宿主细胞 中的表达是有用的。常规使用的真核控制序列，本文将其定义为含有转 录开始的启动子，选择性地带有操纵子，与核糖体结合部位序列一起， 含有常用启动子，例如β-内酰胺酶(青霉素酶)和乳糖(lac)启动子体系 (Chang等(1977)“自然”198:1056)、色氨酸(trp)启动子体系(Goeddel 等(1980)“核酸研究”8:4057)、tac启动子(DeBoer等(1983)“美国国 家科学院院报”80:21-25)；和λ-衍生的PL启动子和N-基因核糖体结合 部位(Shimatake等(1981)“自然”292:128)。特定启动子体系对本发明 不是重要的，可以使用在真核细胞中起作用的任意可获得的启动子。

就多肽在除大肠杆菌之外的真核细胞中的表达而言，需要一种在特 定真核种中起作用的启动子。这些启动子可以从已由这些种克隆的基因 获得，或者可以使用异源启动子。例如，杂合trp-lac启动子在除大肠 杆菌之外的杆菌属中起作用。

就所述多肽在酵母中的表达而言，适宜的启动子包括GAL1- 10(Johnson和Davies(1984)“分子细胞生物学”4:1440-1448)、 ADH2(Russell等(1983)“生物化学杂志”258:2674-2682)、PHO5(EMBO J. (1982)6:675-680)、和MFα(Herskowitz和Oshima(1982)“酵母属的 分子生物学”(Strathern、Jones和Broach编辑)冷泉港实验室，冷泉 港，纽约，第181-209页)。用于酵母中的另一适宜启动子为ADH2/GAPDH 杂合启动子，如Cousens等在“基因”61:265-275(1987)中所述。适宜 用于真核宿主细胞中的其它启动子对本领域技术人员来说为公知。

就所述多肽在哺乳动物细胞中的表达而言，适宜启动子包括CMV启 动子(Miller等“生物技术”7:980)、SV40启动子(de la Luma等(1998) “基因”62:121)、RSV启动子(Yates等(1985)“自然”313:812)、MMTV 启动子(Lee等(1981)“自然”294:228)。

就所述多肽在昆虫细胞中的表达而言，适宜启动子来自杆状病毒苜 蓿银纹夜蛾多核型多角体病毒(NcMNPV)(Kitts等(1993)“核酸研究” 18:5667)。

在本发明中可以使用组成型或者可调型启动子。可调型启动子可能 是有益的，这是因为在所述多肽的表达被诱导之前宿主细胞可以生长至 高密度。在某些情况下异源蛋白质的高水平表达使细胞生长减慢。诱导 型启动子为介导基因表达的启动子，其中表达水平可以通过环境或成长 因子来改变，这些因子例如有温度、pH、厌氧或需氧条件、光、转录因 子和化学物质。这些启动子在本文中被称之为“诱导型”启动子，并且 使得人们可以控制所述多肽表达的时间。就大肠杆菌和其它细菌宿主细 胞而言，诱导型启动子对本领域技术人员为已知。这些包括，例如，lac 启动子、噬菌体λPL启动子、杂合trp-lac启动子(Amann等(1983)“基 因”25:167；de Boer等(1983)“美国国家科学院院报”80:21)、和噬 菌体T7启动子(Studier等(1986)“分子生物学杂志”；Tabor等(1985) “美国国家科学院院报”82:1074-8)。这些启动子及其用途在Sambrook 等人中有讨论，如上所述。用于在原核细胞中表达的特别优选的诱导型 启动子为一双重启动子，它包括连接到从基因获得的启动子组分上的tac 启动子组分(例如来自UDP半乳糖4-差向异构酶基因(galE)的启动子)， 所述基因编码半乳糖代谢中涉及的酶。该双重tac-gal启动子，在PCT 专利申请W098/20111中有描述，提供了比仅通过两者任一启动子提供 的表达水平大的表达水平。

用于其它生物体的诱导型启动子对本领域技术人员也为公知。这些 包括，例如，阿拉伯糖启动子、lacZ启动子、金属硫蛋白和热激启动子、 以及许多其它的。

核糖体结合部位(RBS)通常包含在打算用于真核宿主细胞的本发明的 表达盒中。例如大肠杆菌的RBS由位于启动密码子上游3-11个核苷酸 的核苷酸相连3-9个核苷酸长组成(Shine和Dalgarno(1975)“自然” 254:34；Steitz在“生物调节和发育：基因表达”(R.F.Goldberger编 辑)第1卷第349页1979年，纽约Plenum出版社)。

通常将选择标记掺入用于表达本发明多核苷酸的表达载体中。这些 基因可以编码基因产品，如蛋白质，它对在选择性培养基中生长的转化 宿主细胞的存活或生长是必不可少的。未被含有所述选择基因的载体转 化的宿主细胞将在所述培养基中不能存活。典型的选择基因编码具有抗 生素或其它毒素抗性的蛋白质，如氨苄青霉素、新霉素、卡那霉素、氯 霉素或四环素。或者，选择标记可以编码补充营养缺陷的缺乏和供应从 复合培养基中不能得到的关键营养素的蛋白质，例如编码用于杆菌的D- 丙氨酸消旋酶的基因。通常，该载体将具有一种选择标记，该选择标记 在例如大肠杆菌或其它细胞中起作用，在这些细胞中所述载体在被引入 宿主细胞之前被复制。大量选择标记对本领域技术人员来说为已知，并 描述在例如Sambrook等中，如上所述。用于细菌细胞中的优选的选择 标记为卡那霉素抗性标记(Vieira和Messing“基因”19:259(1982))。 使用卡那霉素选择比例如氨苄青霉素有利，这是因为氨苄青霉素在培养 基中被β-内酰胺酶快速降解，因此降低选择压并使培养物长满不含所述 载体的细胞。

使用上面引证的参考文献中所述的标准连接技术构建含有一种或多 种上面所列组分的适宜载体。分离质粒或DNA片段经裂解、剪切并以所 需形式再连接，从而产生所需质粒。为了证实所构建的质粒中的序列的 正确性，可以通过标准技术如通过限制性内切核酸酶消化，和/或根据 已知方法测序分析这些质粒。适宜构建重组核酸的广泛克隆和体外扩增 方法对技术人员为公知。通过许多克隆试验足够指导技术人员的这些技 术和说明的例子可以在Berger和Kimmel的“分子克隆技术指南，酶学 法”第152卷加拿大San Diego学术出版公司(Berger)和“现代分子生 物学方法”F.M.Ausubel等人编辑“现代方法”Greene出版联合公司 与John Wiley和Sons公司的合资企业(1998年补编))(Ausubel)中找 到。

适宜用作构建本发明的表达载体的起始材料的许多常规载体在本领 域中为公知。就在细菌中克隆而言，常规载体包括得自pBR322的载体 如pBLUESCRIPTTM、pUC18/19，和得自λ-噬菌体的载体。在酵母中，可 以使用的载体包括酵母整合质粒(例如YIp5)和酵母复制质粒(YRp系列 质粒)，例如pYES系列和pGPD-2。例如可以使用许多可常规获得的质粒， 包括pSV2、pBC12BI和p91023、pCDNA系列、pCMV1、pMAMneo，以及裂 解病毒载体(例如牛痘病毒、腺病毒)、游离型病毒载体(例如牛乳头瘤 病毒)、和逆转录病毒载体(例如鼠科逆转录病毒)，来实现在哺乳动物 细胞中表达。例如，使用各种杆状病毒载体，包括pFastBac1、pFastBacHT 系列、pBluesBac4.5、pBluesBacHis系列、pMelBac系列和 pVL1392/1393，来实现在昆虫细胞中的表达。

可以使用翻译偶联提高表达。该策略使用来自相对翻译系统为天然 的高度表达基因的短上游开口读框，将其放置在启动子的下游，在几个 氨基酸密码子之后由终止密码子接着核糖体结合位点。就在终止密码子 之前是第二个核糖体结合位点，并且在终止密码子之后是用于启动翻译 的起始密码子。该系统溶解RNA的二级结构，使得足够开始翻译。参见 Squires等人(1988)“生物化学杂志”263:16297-16302。

本发明的多肽可以在许多宿主细胞中表达，这些宿主细胞包括大肠 杆菌、其它细菌宿主、和各种高级真核细胞如COS、CHO和HELa细胞系 和骨髓瘤细胞系。这些宿主细胞可以是哺乳动物细胞、植物细胞、昆虫 细胞或微生物，例如酵母细胞、细菌细胞或真菌细胞。适宜的宿主细胞 的例子包括定氮菌属种(例如维涅兰德固氮菌)、假单胞菌属种、根瘤菌 属种、欧文氏菌属种、埃希氏杆菌属种(例如大肠杆菌)、杆菌属、假单 胞菌属、变形杆菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、根瘤菌 属、透明颤菌属、副球菌属和克雷伯氏菌属种，以及许多其它的。这些 细胞可以是任意几种属，包括酵母属(例如啤酒酵母)、念珠菌属(例如， 产朊假丝酵母、近平滑假丝酵母、克鲁斯氏假丝酵母、易变假丝酵母、 解脂假丝酵母、涎沫假丝酵母、季也蒙氏假丝酵母、白色假丝酵母和土 生假丝酵母)、毕赤氏酵母属(例如，粉状毕赤氏酵母和奥默列氏毕赤氏 酵母)、球拟酵母属(例如，白色球拟酵母、球面球拟酵母、木质球拟酵 母、无名球拟酵母和易变球拟酵母)、德巴利氏酵母属(例如，类球形德 巴利氏酵母、D.cantarellii、球形德巴利氏酵母、汉逊氏德巴利氏酵 母和D.japonicus)、接合糖酵母属(例如，Z.rouxii和拜列氏接合糖 酵母)、克鲁维氏酵母属(例如，马克斯克鲁维氏酵母)、汉逊氏酵母属(异 常汉逊氏酵母和杰丁汉逊氏酵母)、和酒香酵母属(例如，蓝姆啤可酒香 酵母和异酒香酵母)。有用细菌的例子包括，但不限于，埃希氏杆菌属、 肠杆菌属、定氮菌属、欧文氏菌属、克雷白氏杆菌属。生产重组蛋白质 的常用昆虫细胞为Sf9细胞(来自草地夜蛾卵巢细胞)和High Five细胞 (来自粉纹夜蛾卵细胞同源物；可从Invitrogen商购获得)。

可以通过公知方法如用于大肠杆菌的氯化钙转化和用于哺乳动物细 胞的磷酸钙处理或电穿孔将本发明的表达载体转移到所选宿主细胞中。 由所述质粒转化的细胞可以通过在质粒上含的基因，例如amp、gpt、neo 和hyg基因赋予的抗生素抗性来选择。

一旦表达，可以根据本领域的标准步骤将重组多肽提纯，这些标准 步骤包括硫酸铵沉淀、亲和柱、离子交换和/或大小排阻层析、凝胶电 泳等(一般参见R.Scopes“蛋白质提纯”Springer-Verlag,N.Y.(1982), Deutscher，“酶学方法”第182卷：“蛋白质提纯指南”纽约学术出版 公司(1990))。至少约90-95％同源性的基本上纯的组合物为优选，并且 最优选98-99％或更高的同源性。一旦部分提纯或者提纯至所需同源性， 然后可以使用所述多肽(例如，在临床前或临床研究汇总治疗炎症)。

为了便于提纯本发明的多肽，编码所述多肽的核酸还可以包括用于 表位或“标记”的编码序列，为此可以利用亲和结合试剂。适宜表位的 例子包括myc和V-5报道基因；用于重组生产具有这些表位的多肽的表 达载体是可商购获得的(例如，Invitrogen(Carlsbad CA)载体 pcDNA3.1/Myc-His和pcDNA3.1/V5-His适宜在哺乳动物细胞中表达； Invitrogen(Carsbad,CA)载体pBlueBacHis和Gibco(Gaithersburg,MD) 载体pFastBacHT适宜在昆虫细胞中表达)。适宜将一标记附着在本发明 的蛋白质上的其它表达载体和相应检测系统对本领域技术人员来说为已 知，并且几种可商购获得(例如，FLAG”(Kodak,Rochester NY)。适宜 标记的另一例子是一多组氨酸序列，它能够结合金属螯合亲和配体。典 型地，使用6个相邻的组氨酸，尽管可以使用大于6个或少于6个的。 可以用作多组氨酸标记的结合部分的适宜金属螯合亲和配体包括次氨基 三乙酸(NTA)(Hochuli,E.(1990)在“基因工程：原理和方法”中的“用 金属螯合吸附剂提纯重组蛋白质”J.K.Setlow编辑，纽约Plenum出版 社；可从Qiagen(Santa Clarita,CA)商购获得)。

适宜用作标记的其它半抗原对本领域技术人员来说为已知且描述在 例如“荧光探针和研究化学试剂手册”(第6版，Eugene OR分子探针公 司)。例如，二硝基苯酚(DNP)、地高辛配基、巴比土酸盐(参见例如 US5414085)和几种荧光团作为半抗原是有用的，也可以是这些化合物的 衍生物。可商购获得试剂盒用于将半抗原和其它部分连接到蛋白质和其 它分子上。例如，当该半抗原包括巯基时，可以使用例如SMCC的异双 功能接头将该标记附着在存在于捕获试剂上的赖氨酸残基上。

B、天然存在的多肽

包括全长PX3.101及其片段的本发明的天然存在的多肽，可以使用 例如亲和层析的常规技术进行分离。例如，通过公知技术相对预先提纯 的PX3.101或其片段产生多克隆或单克隆抗体并附着在适宜亲和柱上。 参见例如Hudson和Hay的“实际免疫学”(Blackwell科学出版社，英 国牛津，1980)、第8章(为此将其全部内容加入本文作为参考)。通过 本领域技术人员已知的化学或酶裂解法由整个PX3.101产生肽片段。实 施例Ⅱ也陈述了一种提纯PX3.101的方法。

C、其它方法

另外，本发明的多肽可以通过化学方法合成或者使用多核苷酸模板 介导翻译通过体外翻译系统生产。化学合成多肽的方法和体外翻译为本 领域中众所周知的，并且还被Berger和Kimmel描述在“酶学方法”第 152卷“分子克隆技术指南”加拿大San Diego学术出版社，1987年(为 此将其全部内容加入本文作为参考)中。

Ⅳ、抗体

在本发明的另一实施方式中，提供了与PX3.101多肽或其片段免疫 反应的抗体。所述抗体可以为多克隆抗体、不同的单克隆抗体或具有不 同表位特性的混合单克隆抗体。通过本领域中公知的方法由含抗原的蛋 白质片段制备单克隆抗体(参见例如Kohler等的“自然”256:495, (1975)；和Harlow和Lane“抗体，实验室手册”(C.S.H.P.,NY,1988)， 为此将它们两者的全部内容加入本文作为参考)。

A、抗体的生产

可以使用整个多肽或含有感兴趣的小肽的片段作为免疫抗原制备结 合到本发明的PX3.101多肽或其它多肽上的抗体。例如，可以理想地生 产特异性地结合到PX3.101的N-或C-端结构域上的抗体。用于免疫动 物的所述多肽可以来自天然源、由翻译的cDNA获得、或者通过化学合 成制备，并且如果需要的话可以与载体蛋白质接合。常用的载体包括匙 孔血蓝蛋白(KLH)、甲状腺球蛋白、牛血清白蛋白(BSA)和破伤风类毒素。 然后使用该偶联肽免疫动物(例如，小鼠、大鼠或兔)。

还描述了用于产生人单克隆抗体的技术，但是它通常比鼠类技术更 苛刻并不能用于所有抗原。参见例如Larrick等人的US5001065，用作 综述(为此将其加入本文作为参考)。一种选择性方案是通过重组DNA技 术将非人抗体的互补性决定区或CDR区(参见例如Kabat等人的“免疫 用感兴趣的蛋白质的序列”美国卫生和人类服务部(1987)；和Chothia 等人“分子生物学杂志”196:901-917(1987))连接到人恒定区产生人化 抗体。参见Queen等人“美国国家科学院院报”86:10029-10033(1989) 和WO90/07861(为此加入本文作为参考)。或者，可以根据Huse等人在 “科学”246:1275-1281(1989)中所概括的常规方案通过从人B细胞中 筛选DNA文库，分离编码人单克隆抗体或其结合片段的DNA序列，然后 克隆和扩增编码所需特异性的抗体(或结合片段)的序列。Huse所描述的 该方案与噬菌体展示技术组合将更有效。参见例如Dower等人的 WO91/17271和McCafferty等人的WO92/01047(为此将每个加入本文作 为参考)。还可以使用噬菌体展示技术诱变前面所示对本发明肽具有亲 和性的抗体的CDR区。选择具有提高了的结合亲和性的抗体。

这些抗体可以被进一步通过例如结合到一载体上或由一载体洗脱至 结合产生抗体的所示多肽或肽来提纯。还可以使用本领域中已知的许多 其它技术提纯多克隆或单克隆抗体(参见例如Coligan等人的“免疫学 的目前方案”第9单元，Wiley Interscience,(1994)，将其全文加入 本文作为参考)。

还可以使用抗独特型技术生产模拟表位的单克隆抗体。例如，由一 级单克隆抗体制备的抗独特型单克隆抗体在超可变区将具有结合结构 域，所述超可变区为通过一级单克隆抗体结合的表位的“图像”。

B、抗体的用途

本发明的抗体例如可用于筛选cDNA表达文库并用于鉴定含编码结构 上相关的、免疫交叉反应性蛋白质的cDNA插入片段的克隆。参见例如 Aruffo和Seed的“美国国家科学院院报”84:8573-8577(1977)(为此将 其全文加入本文作为参考)。抗体还可用于鉴定和/或提纯结构上与用于 产生该抗体的天然PX3.101或其片段相关的免疫交叉反应性蛋白质。

Ⅴ、治疗方法和组合物

A、一般

本发明还提供了含有包括全长PX3.101及其片段的本发明多肽的药 用组合物。正如下面实施例V中详细解释的，本发明的药用组合物可以 用于治疗人和兽医受治疗者中的各种疾病。可以用本发明的某些药用组 合物治疗的疾病包括各种炎症和自身免疫疾病(例如类风湿性关节炎、 多发性硬化、牛皮癣、全身性红斑狼疮(SLE)、克罗恩氏病、硬皮病)、 转移性癌症、和与趋化因子(例如IL8、IL-10和TNF-α)生产失调有关 的疾病如阿耳茨海默氏病。还可以使用一些组合物治疗疼痛，即该组合 物可以被用作止痛药。

本发明的药用组合物适宜用于各种药物释放系统中。用于本发明的 适宜制剂在“Remington的药用科学”费城Mace出版公司，PA，第17 版(1985)可以找到。就药物释放方法的简单评述，参见Langer的“科 学”249:1527-1533(1990)。

B、组合物和释放

用于预防或治疗处理的药用组合物含有活性治疗剂，例如PX3.101 蛋白或其片段，PX3.101受体或其片段，和抗体和其独特型抗体，和许 多其它组分。可以使用全长PX3.101的不同亚序列。例如，在实施例Ⅴ 中描述的用于动物研究的多肽组合物包括具有由SEQ ID NO:2的残基 20-92、22-92、24-92和26-92组成的氨基酸序列的肽。

有些情况下，通过使用本发明的药用组合物和其它已知在治疗各种 疾病，特别是炎症中有效的互补化合物，可以提高所述疗效。例如，本 发明的药用组合物还可以包括在治疗炎症，如类风湿性关节炎中有效的 化合物。这些化合物包括ENBREL(由Immunex生产)和INDOMETHACIN(由 Merck生产)、METHOTREXATE(由Mylan和Roxane实验室公司生产)、 CELEBREX(由Mosanto生产)、VIOXX(由Merck生产)、或者 CYCLOSPORINE(由Novartis生产)。可以用于治疗炎症并可以与本发明 的某些组合物组合的其它化合物可以在Physician’s Desk Reference(1998)中找到，将其全部内容加入本文作为参考。用于与 PX3.101、其片段和/或其抗体组合的互补化合物典型地具有与PX3.101 或其片段不同的作用模式和/或与它们的疗效时间不同。因此，例如， 本发明的药用组合物包括治疗有效量的PX3.101(或其活性片段)和 ENBREL，这是由于早期研究显示这两种化合物呈现出具有不同的作用机 理和一旦治疗停止后疗效保持的时间不同。

根据所需制剂，所述组合物还可以包括药用上可接受的、无毒载体 稀释剂，它被定义为常用于配制向动物或人给药的药用组合物。该稀释 剂经选择，以便不影响所述组合的生物活性。这些稀释剂的例子有蒸馏 水、缓冲液、生理盐水、PBS、林格氏溶液、葡萄糖溶液和Hank氏溶液。 此外，所述药用组合物或制剂还可以包括其它载体、佐剂或无毒、非治 疗、非免疫原的稳定剂、赋形剂等。所述组合物还可以包括接近生理条 件的其它物质，例如pH调节和缓冲剂、毒性调节剂、润湿剂、去污剂 等。

所述组合物还可以包括任意多种稳定剂，例如抗氧化剂。而且，所 述多肽可以与提高该多肽在体内的稳定性、或者提高其药理学特性(例 如增加该多肽的半衰期、降低其毒性、提高溶解性或吸收)的各种公知 化合物混合。这些改进或复合剂的例子包括硫酸盐、葡萄糖酸盐、柠檬 酸盐、磷酸盐等的生产。所述组合物的多肽还可以与提高其体内属性的 分子复合。这些分子包括，例如碳水化合物、聚胺、氨基酸、其它肽、 离子(例如钠、钾、钙、镁、锰)和脂类。

关于适宜不同种给药制剂的其它指导可以在“Remington的药用科 学”费城Mace出版公司，PA，第17版(1985)中找到。就给药方法的简 单评述，参见Langer的“科学”249:1527-1533(1990)。

为了预防和/或治疗可以施用含有所述多肽的组合物。药用组合物中 的多肽典型地以治疗量出现，该量为足够改善病态或病状，特别是伴随 发炎的症状的量，或者以任意方式预防、阻碍、延缓或逆转病程或任意 其它不受欢迎的病状的量。所述多肽在所述药用组合物中的浓度可以在 很大范围内变化，即从不到约0.1wt％，通常为至少约1wt％，到高至20wt％ 或更多。

在治疗应用方面，如上所述，将组合物以足够治愈或至少部分阻止 病状及其并发症的量施用到已患病的患者。根据已建立好的几种方案中 的任意一种可以容易地测定本发明的药用组合物或多肽的适宜量。例 如，常用动物研究(例如小鼠、大鼠)测定每公斤重量的生物活性剂的最 大耐受剂量。一般来说，所试验的动物种中至少一种为哺乳动物。可以 将动物研究的结果外推以确定其它种如人的使用剂量。

有效剂量的构成还取决于疾病或状态的性质和严重程度，以及患者 的健康状态，但是通常在约1-500mg提纯蛋白质/kg体重的范围，更常 规使用约5-100mg/kg的剂量。

在预防应用方面，将含有本发明化合物的组合物给投到可接受的或 者有特定疾病或感染危险的患者中将这种量定义为“预防有效”量或剂 量。在这种用途中，精确量还取决于患者的健康状况和体重。典型地， 该剂量为约1-500mg提纯蛋白质/kg体重，更常用的剂量为约5- 100mg/kg。

可以各种不同方式施用本文中所述的药用组合物。例子包括经口、 鼻、直肠、局部、腹膜内、静脉内、肌内、皮下、经皮、眼、鞘内和颅 内方法施用含有药用上可接受的载体的组合物。

就口服而言，可以固体剂量形式如胶囊、片剂和粉剂、或液体剂量 形式如酏剂、糖浆剂和悬液施用活性组分。所述活性组分可以与非活性 组分和粉状载体，如葡萄糖、乳糖、蔗糖、甘露糖醇、淀粉、纤维素或 纤维素衍生物、硬脂酸镁、硬脂酸、糖精钠、滑石粉、碳酸镁一起包封 在明胶胶囊中。可以加入以提供所需颜色、口味、稳定性、缓冲能力、 分散性或其它已知所需特性的其它非活性组分的例子有红氧化铁、硅 胶、十二烷基硫酸钠、二氧化钛和可食用的白色墨水。类似的稀释剂可 以用于制备压缩片剂。片剂和胶囊都可以加工成持续释放的产品，从而 提供药物在几小时内的连续释放。压缩片剂可以涂有糖或涂有膜，以掩 盖任何不愉快的口味并防止片剂与大气接触，或者涂有肠衣以选择性地 在胃肠道中分解。口服用液体剂量形式可以含有增加患者接受性的着色 剂和风味剂。

如果需要的话，可以配制成涂有肠衣或其它保护形式的固体或液体 制剂。在液体制剂的情况下，所述制剂可以与保护剂如中等链三酸甘油 酯的液体混合物混合或者简单地与其共同给药，或者可以将所述制剂填 充到肠衣胶囊(例如软或硬的明胶，其本身选择性地另外涂有肠衣)中。 或者，含有所述多肽的固体制剂可以用肠衣材料涂敷以形成片剂。肠溶 衣在片剂或胶囊上的厚度可以变化。典型的厚度范围为0.5-4微米厚。 所述肠溶衣可以含有传统上用于口服药用制剂的任意肠材料。适宜的肠 溶衣材料例如从“Remington的药用科学”费城Mace出版公司，第17 版(1985)和“Hagars Handbuch der Pharmazeutischen Praxie”,Springer Verlag，第4版第7a卷(1971)中得知。

另一释放选择包括将组合物加入伴有脂类的结构(例如脂质体或其它 脂类复合物)中，该结构可以提高组合物中多肽组分的药用特性。接着 可以通过加入适宜引导分子(例如特异性抗体或受体)将含有所述组合物 的复合物引导到特定靶细胞上。还可以将所述多肽与引导剂直接复合。

制备用于静脉内给药的组合物典型地含有选择性地补充有20％白蛋白 溶液的100-500ml的消毒0.9％NaCl或5％葡萄糖和100-500mg的本发明 多肽。肌内注射用的典型药用组合物应制备以含有例如1ml无菌缓冲水 和1-10mg的本发明提纯蛋白质。制备非肠道给药组合物的方法在本领 域中为公知并在各种来源中详细描述，包括“Remington的药用科学” 费城Mace出版公司，PA，第17版(1985)中。

具体地当所述组合物在体内使用时，用于配制本发明药用组合物的 组分优选纯度高且基本上无潜在有害污染物(例如至少国家食品(NF) 级，一般至少分析级，更典型地至少药用级)。而且，打算在体内使用 的组合物通常无菌。为了在使用前所给化合物必需合成的程度，所得产 品典型地几乎无任何潜在毒性剂，特别是可以在合成或通常步骤中存在 的任何内毒素。非肠道给药用的组合物还应无菌，基本上等渗并在GMP 条件下制备。

Ⅴ、用途

可以使用本发明的药用组合物治疗各种疾病。例如，可以使用所述 药用组合物治疗各种炎症。如实施例Ⅴ中详细描述的，已显示了本发明 的某些组合物在动物模式研究中对治疗类风湿性关节炎是有效的。具体 地说，PX3.101抑制类风湿性关节炎的发病机理中涉及到几种酶如环氧 合酶、磷脂酶、脂氧合酶和各种蛋白酶。PX3.101多肽还显示出抑制细 胞因子与其受体之间的相互作用(参见实施例Ⅵ)，例如IL-8/CXCR2相 互作用。IL-8为调节炎症过程的主要趋化因子(参见例如Harada等人的 (1994)“J.Leukoc.Biol.”56:559)。还有证据显示IL-8与肿瘤血管 生成和肿瘤转移有关(Koch等人的“科学”258:1798)。因此本发明的一 些多肽可以用于治疗癌症、自身免疫疾病、和/或与趋化细胞失调有关 的其它炎症，特别是与IL-8相关的疾病如阿耳茨海默氏病。

本发明的PX3.101和其它多肽还发现用于抑制和动力学调查研究。 例如，PX3.101可以用于研究趋化因子与其受体之间的相互作用，例如 IL-8与CXCR2和CXCR1之间的相互作用。抑制趋化因子的方法通常包括 将大量趋化因子和受体与本发明的多肽混合。更具体地说，该方法包括 将本发明的多肽添加到含趋化因子和受体的样品中，并优选混合所得混 合物。添加可以在体外溶液中进行或直接在患者中进行。

PX3.101还可用于包括抑制各种酶的研究或处理中，这些酶例如有环 氧合酶(例如，COX1和COX2)、磷脂酶(例如磷脂酶A2和磷脂酶C)、脂 氧合酶、和各种蛋白酶(例如胰蛋白酶和组织蛋白酶G)。这些方法通常 包括将酶，特别是炎症过程中涉及的那些，与本发明的多肽混合。典型 地，将大量多肽添加到含感兴趣的酶的样品中。这里，同样地，添加可 以在体外溶液中进行或直接在患者中进行。

基于前面的活性，还希望本发明的某些多肽可以用于治疗血凝固疾 病、加速伤口愈合、UV-光保护、减少各种老化现象和作为止痛剂。

通过使用PX3.101研究趋化因子与其受体之间的相互作用，或者 PX3.101与同源受体(例如与受体结合的氨基酸序列)之间的直接相互作 用，可以开发模拟该相互作用的小分子，因此使所用的该小分子能够获 得与使用PX3.101获得的治疗效果相似的治疗效果。

PX3.101的核苷酸和肽序列还可用于产生引物和/或探针，从而筛选 不同种，特别是人中的PX3.101同源物。PX3.101的人同源物可以直接 用作治疗物或用作筛选用于不同人疾病的药物候选者的靶子。

以下实施例旨在进一步说明本发明的特定方面，并不打算用于限制 本发明的范围。

                         实施例Ⅰ

                     (常规方法和材料)

A、电泳和Western印迹

根据标准方法(Sambrook等人的“分子克隆；实验室手则”第2版， 冷泉港实验室出版社，1989)进行SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。 提纯PX3.101蛋白在10-20％SDS-聚丙烯酰胺梯度凝胶(BioRad, Richmond,CA)中电泳，然后转移到硝基纤维素膜(Schleicher和Schull, Keene,NH)上。将从用PBS或PX3.101(200μg/kg)处理过的动物中收集 的血清在封闭性溶液(PBS、0.2％吐温-20、5％奶粉)中以1:30稀释。使 用小多级筛选设备将印迹分开并用稀释过的血清探测这些印迹。 使用辣根过氧化物酶(HRP)-缀合的羊抗-小鼠IgG的1:10000稀释液作 二级抗体。使用ECL(增强的化学-发光)系统目测检验信号。

B、质谱分析

由耶鲁大学的Heck Facility根据它们网站 (http://www.info.med.vale.edu/wmkeck)上描述的方案进行质谱分 析。使用基质辅助的激光解吸电离质谱仪(MALDI-MS)测定来自PX3.101 的胰蛋白酶消化液的肽片段的分子量，并使用MALIDI-MS和电喷电离质 谱仪(ESMS)测定提纯PX3.101相互衍生物的分子量。在配备有延迟提取 和反射的研究级VG Tofspec SE仪器上进行MALDI-MS。在一微量Q-Tof 质谱仪上进行ESMS。

C、反相(RP)HPLC

使用一SD-200型Varian Dynamax溶剂输送组件和一UV检测器(UV- C型Dynamax吸收检测器)进行反相HPLC(RP-HPLC)。使用Varian Dynamax 方法(1.4.6版)软件进行数据采集。典型地使用一Varian Microsorb-MV C-18反相柱(0.46cm×25cm)进行分析，同时一半-预制C-18反相柱 (1.0em×25cm)、Varian Dynamax 300A主要用于提纯。用于洗脱的缓 冲液为缓冲液A(水和0.1％三氟乙酸)和缓冲液B(乙腈和0.1％三氟乙 酸)。使用由缓冲液A和B形成的不连续线性梯度进行洗脱。在室温下 转动柱。(分析HPLC用的流速：1ml/min；半-预制柱用的流速为 4ml/min)。用手收集峰值馏份。

D、HPLC-离子交换层析法

还使用HPLC-离子交换层析法提纯PX3.101。使用上述的相同溶剂输 送系统。使用一Varian Hydropore强阳离子交换柱(0.46cm×10cm)。 用于洗脱的缓冲液为缓冲液A(0.1M甲酸铵水溶液，pH5.8)和缓冲液B(1M 甲酸铵，pH6.7)。使用由缓冲液A和B形成的不连续线性梯度进行洗脱。 以1ml/min的流速在室温下转动柱。

E、氨基酸分析

在一6300型Beckman离子交换仪上在115℃下在100μl的6N HCl、 0.2％苯酚以及含有2nM正亮氨酸中分析16小时之后进行氨基酸分析。 正亮氨酸用作内标准以校正在样品转移和干燥等时可能发生的丢失。水 解之后，将该HCl在一Speedvac中干燥，所得氨基酸溶解到含2nM高 丝氨酸的100μl Beckman样品缓冲液中，该高丝氨酸起二级内标准的作 用，从而非依赖性地监控样品转移到分析仪上。使用2nM氨基酸混合物 校准该仪器并根据厂家程序并使用厂家缓冲液操作。使用Perkin Elmer/Nelson数据采集软件在外部计算机上进行数据分析。通过在二级 样品中用过甲酸在先氧化获得提高量的半胱氨酸。该步骤将半胱氨酸和 胱氨酸转化为磺基丙氨酸。过甲酸氧化可以破坏胰蛋白酶。

F、N-端测序

如上所述(Stone等人在“蛋白质化学技术”，学术出版社，1992，纽 约，23-34中)进行PX3.101的直接N-端氨基酸测序。通过SDS-PAGE提 纯的PX3.101在一小蛋白印迹纯PVDF膜(Applied Biosystems,Foster City,California)上进行点印迹。由Ponceau S目测检验该带并经切 割用于N-端蛋白测序。或者，来自Sephadex G-50层析的PX3.101经进 一步提纯并通过如上所述的RP HPLC和HPLC-离子交换层析分解相互衍 生物。用Applied Biosystems测序仪(Model Procise 494 cLc,Foster City,California)通过自动Edman降解进行任一形式的N-端蛋白测序。 使用一联机HPLC-分析仪鉴定苯基硫乙内酰脲(PTH)氨基酸。

G、内部测序

根据标准方法(Stone等人的“用于微测序的蛋白质和肽提纯的实用 指南”第2版，学术出版社，1993年，纽约，43-69)进行内部蛋白质测 序。Coumassie Blue染色的SDS-PAGE凝胶带经切割并经受凝胶中的胰 蛋白酶消化。然后提取肽片段并通过LC/MS/MS分析进行分析。将所得 MS/MS谱带与国家生物技术信息中心中非丰余数据库的谱带比较，从而 测定该蛋白质是否为已知。当使用该方法鉴定非蛋白质时，通过反相HPLC 将该消化液提纯。收集测得的峰值馏份并将所选择的肽进行质谱分析。 然后如实施例Ⅰ中所述对这些肽进行N-端氨基酸测序。

                      实施例Ⅱ

                 (蛋白质的提纯和鉴定)

A、分馏蜂毒

将冻干蜂毒(约0.5g)(Apitronic Services,Richmond,British Columbia,Canada)或蜂毒悬浮液(每m1约有0.5g固形物，Sigma,St. Louis,Missouri)稀释在10ml的0.1M甲酸铵缓冲液(pH4.6)中，得到 具有约0.05g蜂毒/ml浓度的溶液。将该溶液离心并通过0.45μm过滤 器过滤，然后加样到用0.1M甲酸铵缓冲液(pH4.6)预平衡的Sephadex G-50柱(2只柱，每个1.5×170cm(直径×长度)，串联连接)。该柱以 约0.6ml/min洗脱，并收集100滴(约4.0ml)馏份。

含PX3.101的馏份(馏份65-72)出现在磷脂酶A2和蜂毒肽四聚物的 峰值之间(图1)。通过SDS凝胶电泳分析肩峰中的馏份(馏份65-72)。 仅发现一个主要带具有分子量低于磷脂酶A2。在该带中的蛋白质具有约 7700道尔顿的表观分子量并称为PX3.101。蜂毒肽单体具有3000道尔 顿的分子量。

B、提纯PX3.101

含PX3.101的Sephadex G-50柱馏份(通过SDS-PAGE鉴定)经混合并 如实施例Ⅰ中所述通过RP HPLC富集PX3.101。在该RP HPLC步骤中获 得的典型洗脱图示于图2A中。经SDS-PAGE和胰蛋白酶抑制试验证实(数 据未显示)的含PX3.101的馏份经冷冻干燥，并通过实施例Ⅰ中所述的 离子交换HPLC进一步提纯。洗脱图示于图2B中。将二次RP HPLC用作 提纯的最终步骤并根据实施例Ⅰ中所述的条件洗脱图2C中显示了该洗 脱图，在该最终步骤中获得三个主要峰值，它们都具有肩。这些主峰被 命名为Puri-#1、Puri-#2和Puri-#3。这些馏份具有以SDS-PAGE为基 础的相似分子量，并且它们都显示出相似的胰蛋白酶抑制活性(数据未 显示)。主峰的N-端测序证实，它们都为PX3.101，但是测定出一个到 几个N-端氨基酸(表Ⅱ)。这些分子被认为是PX3.101的相互衍生物。 这些结果与直接N-端测序结果一致，其中来自SDS-PAGE的主PX3.101 带产生多种序列(参见下面)。将Puri-#1、Puri-#2和Puri-#3馏份混 合并用于动物研究及PX3.101的作用机理研究(参见实施例Ⅴ和Ⅵ)。

C、鉴定

来自与G-50馏份一起运转的SDS凝胶的主凝胶带经切割并经受凝胶 中的胰蛋白酶消化。所得消化液通过LC/MS/MS分析。消化的结果发现 10-12个主要肽片段并测定其分子量(数据未显示)。发现NCBI非丰余数 据库中的肽与来自胰蛋白酶消化液的肽的推断分子量不匹配。

然后将来自胰蛋白酶消化液的肽片段通过RP-HPLC提纯。提纯的详 细    方    案    描    述     在     以    下     网    站 (http://info.med.vale.edu/wmkeck/prochem.htm)中。将该峰值馏份 (#47、61、62、65、75、88和106)收集并通过质谱仪进一步分析。选 择4个肽片段(馏份#47、62、75和88)用于氨基酸测序。这些肽的氨基 酸序列示于下表Ⅰ中。

还尝试印迹在PVDF膜上的主SDS凝胶带的直接N-端测序，但是在每 个测序循环中产生多个氨基酸(数据未显示)。该结果暗示，或者主要污 染物或者存在多种形式的PX3.101为相互衍生物。进一步研究显示，多 种形式该分子的存在导致N-端缺失不同数量的氨基酸(参见下面)。

在来自最终RP-HPLC柱的收集馏份(即Puri-#1、Puri-#2和Puri-#3， 参见图2C)中所含的多肽具有以SDS-PAGE为基础的相似分子量，并且它 们都显示出相似的胰蛋白酶抑制活性(数据未显示)。主峰的N-端测序证 实，它们都为PX3.101，但测定出一种至多种的N-端氨基酸(表Ⅱ)。这 些分子被认为是PX3.101的相互衍生物。这些结果与直接N-端测序结果 一致，其中来自SDS-PAGE的主要PX3.101带产生多种序列(参见下面)。

约7700道尔顿的推断分子量与PX3.101在SDS-凝胶上的移动正好一 致，但是与Sephadex G-50分级柱的洗脱图中洗脱的蛋白质不太一致。 含PX3.101的馏份在磷脂酶A2(MW19000)和蜂毒肽四聚物之间洗脱的事 实说明表观分子量在11400和19000之间。这种差异暗示，该PX3.101 以二聚物出现，或者蛋白质存在明显的翻译后修饰。在非还原条件下获 得的凝胶电泳结果说明存在PX3.101分子二聚物(数据未显示)。

葡萄糖测定未显示PX3.101的任意糖基化(数据未显示)。通过质谱 分析测定的Puri-#1、Puri-#2和Puri-#3的分子量与从其氨基酸序列 推断的分子量正好匹配(表Ⅱ)。这些结果暗示，这些衍生物不存在翻译 后修饰。这些相互衍生物的C-端可能是完整且相同的。

用于动物研究的提纯PX3.101的氨基酸分析显示，它在0.26- 86ml/mg/cm的280nm下具有消光系数。通过280nm下的吸光度和消光系 数确定任意给定制品的蛋白量。

                      实施例Ⅲ

          (克隆PX3.101 cDNA和推断蛋白序列)

A、方法

以由蛋白质测序获得的氨基酸序列(NEIFSR--SEQ ID NO:9)为基础 设计简并低聚核苷酸引物(5’ATGGATCCAAYGARATHTTYWSNAG 3’-SEQ ID NO:8)(Y=C或T；R=A或G；H=A或C或T；W=A或T；N=A或C或G或T)。 由Genemed合成公司合成并提纯所有PX3.101引物和低聚(dT)(5’ TTGCGGCCGCTTTTTTTTTTTTTTTTTT3’-SEQ ID NO:10)。

如前面所述(Chomczynski等人(1995)“生物化学年鉴”225:163)制 备蜂毒腺的总RNA。由Apitronic Services(Richmond,British Columbia, Canada)从蜜蜂中收集毒腺并在-80℃下贮藏。使用玻璃-聚四氟乙烯匀 浆器将于STAT-60溶液(TEL-TEST“B”公司，TX)中的100个毒腺匀浆。 使用来自TEL-TEST“B”公司的RNA分离试剂盒将总RNA提取并分离。

使用来自蜜蜂的总RNA为模板以及低聚(dT)为引物通过逆转录合成 第一链cDNA。使用简并PX3.101引物和低聚(dT)通过PCR扩增该PX3.101 基因片段。将扩增的DNA片段克隆到pBluescript sk(+)载体的NotⅠ和 BamHⅠ部位中。通过来自Genemed合成公司的契约服务获得所述DNA片 段的序列。分析所推断的蛋白质序列，从而看它们是否匹配通过蛋白质 测序获得的肽序列：即序列：a)PSNEIFSR(SEQ ID NO:11)(SEQ ID NO:2 的残基38-45)、b)GFGGFGGLGGR(SEQ ID NO:12)(SEQ ID NO:2的残 基24-34)、c)VCVPR(SEQ ID NO:13)(SEQ ID NO:2的残基84-88)、 或d)PNVVPK(SEQ ID NO:14)(SEQ ID NO:2的残基55-60)。

为了得到含有氨基端和信号肽的编码序列的PX3.101基因的全长 cDNA，使用5’-RACE(cDNA末端的快速扩增)系统(Gibco,MD)。合成低 聚核苷酸引物ASEQ2(5’ATCGCGGAACGCA 3’-SEQ ID NO:15)和ASEQ3(5’ AAGGATCCAAGTCTACATACAC 3’-SEQ ID NO:16)，并将它们用于扩增 PX3.101cDNA的5’端。将PCR产物克隆到pBluescript sk(+)载体的BamHⅠ 和SalⅠ部位并测序。分析推断蛋白序列，看它们是否匹配通过蛋白测 序获得的肽序列：GFGGFGGLGGR(SEQ ID NO:12)(SEQ ID NO:2的残基 24-34)。通过搜索该数据库分析PX3.101的蛋白和基因序列，从而鉴定 任意结构的功能性基序。

B、结果

发现了一种DNA片段，它含有肽(NEIFSR(SEQ ID NO:10)--SEQ ID NO:2的残基40-45)、(VCVPR(SEQ ID NO:13)--SEQ ID NO:2的残基 84-88)、和(PNWPK(SEQ ID NO:14)--SEQ ID NO:2的残基55-60)的 编码序列。该DNA片段为部分PX3.101基因。从蜜蜂cDNA文库中分离 全长PX3.101基因(472个碱基对；SEQ ID NO:1)。它含有276个碱基对 编码序列(SEQ ID NO:1的残基74-349)、5’端非翻译区、3’端非翻译区 和聚(A)尾。推测PX3.101蛋白由92个氨基酸(SEQ ID NO:2)组成，含 有肽(GFGGFGGLGGR(SEQ ID NO:12)--SEQ ID NO:2的残基24-34)。 PX3.101的核苷酸和推测氨基酸序列示于图3A中。

与其它分泌型分子相同，PX3.101蛋白在N-端由19个氨基酸信号肽 组成(图3B；SEQ ID NO:2的残基1-19)。PX3.101信号肽的编码序列可 用于构建表达载体，从而以分泌形式表达重组蛋白。

在蜂毒中的分泌型和天然PX3.101蛋白由5个GGX重复开始(图3B； SEQ ID NO:2的残基20-34)。GGX重复存在于几种结构蛋白中，包括角 蛋白(CAA28991)、外展蛋白(2739489)、纤维蛋白(P22232)、弹性蛋白 (207462)、蜘蛛丝蛋白(AAC38847)、蛤贝足丝的前胶原D(2772914)和 前胶原P(2388676)、同源异型蛋白Spalt附加物(AAC38847)、 Alcelaphine疱疹病毒1的推定立即早期蛋白(2338034)、Epstein-Barr 病毒的EBNA-1(PO3211)、和许多结核杆菌蛋白(CAA17751、CAA15537、 CAA17576、CAA17749)。GGX重复形成凝聚螺旋状结构并可能涉及聚合物 的形成。有趣的是，在类风湿性关节炎患者中发现了抗角蛋白、纤维蛋 白或弹性蛋白的自身抗体。

PX3.101的C-端富含半胱氨酸(图3B；SEQ ID NO:2的残基35-92)。 在58个氨基酸中有10个半胱氨酸。例如这种富含半胱氨酸的基序出现 在一组蛋白质中，这些蛋白质包括tectorin(CAA68138)、 zonadhesin(3327421)、IgG Fc结合蛋白(AAD15624)、yon Willebrand 因子(CAA27765)、ECM 18(1100979)、粘蛋白(AF015521)、血球蛋白 (P980920)、SCO-spodin(CAA69868)、肿瘤坏死因子受体Ⅱ(2739045)、 来自蜜蜂的胰凝乳蛋白酶抑制剂(4699856)、抗凝聚蛋白C2(1203803)和 几种与EGF类结构域相似的蛋白(CAA98455、AF016450、1226303、U70857、 1226304)。上面大多数的蛋白质为介导不同信号转导路径的胞外蛋白并 具有富含一个以上半胱氨酸的基序。Tectorin，与听力残疾有关的蛋白 质，具有三个这种富含半胱氨酸的结构域。IgG Fc结合蛋白具有多达12 个。

数据库搜索鉴定了作为PX3.101潜在同源物的几种蛋白质候选者。 它们都为带有信号肽和至少一个富含半胱氨酸的小蛋白。它们的图示结 构和名称或登记号概括在图3C中。

                     实施例Ⅳ

            (重组PX3.101蛋白的表达和提纯)

A、方法

为了产生重组PX3.101蛋白，将PX3.101的全长cDNA克隆到 pFastBacHTb中，该pFastBacHTb为一种杆状病毒表达载体，框内具有 His-标记(Gibco,MD)的编码序列(参见图8)。该病毒表达载体被设计成 所述重组蛋白以高水平生产并快速扩增(Lukow等人的“生物/技术” 1989,6:47)。

将pFastBacHTb-PX3.101用于转化DH10Bac细胞(Gibco)以转移到杆 粒中。含有PX3.101 cDNA的重组杆粒经分离并通过PCR评价。为了产 生杆状病毒，用重组杆粒感染SF9细胞(Invitrogen,CA)。在30℃下培 养5天之后，将病毒种子收集并用于感染SF9细胞，从而产生高效价病 毒种子，通过噬斑法测定病毒种子的效价。

为了使产生PX3.101蛋白的条件最佳化，将该重组杆状病毒种子用 于感染High Five细胞(Invitrogen,CA)，与其它昆虫细胞相比，该细 胞为通常表达显著高水平重组蛋白的昆虫细胞系(Wickham等人的“生物 技术工程”1992,8:391)。将1升无血清培养基中以对数中期生长的 High-five细胞用重组杆状病毒种子感染(1:100v/v)。在30℃下培养96 小时之后，通过离心收获细胞并使用胍溶解缓冲液(6M盐酸胍，20mM磷 酸钠，500mM氯化钠，pH7.8)溶解。

离心之后，收集上清液并用预平衡的PROBOND树脂(Invitrogen,CA) 在4℃培养3小时。接着用2柱床体积的以下缓冲液将该柱冲洗2次： 变性结合缓冲液(8M脲、20mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH7.8)、变性冲 洗缓冲液1(8M脲、20mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH6.0)、和变性冲洗 缓冲液2(8M脲、20mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH5.3)。使用变性洗脱 缓冲液(8M脲、20mM磷酸钠、500mM氯化钠，pH4.0)从该柱中洗脱重组 PX3.101。通过rTEV蛋白酶消化除去该His标记。

B、结果

将重组PX3.101在变性溶解缓冲液中表达并溶解。通过蛋白酶rTEV 消化除去His标记之后，重组PX3.101的大小与SDS-聚丙烯酰胺凝聚电 泳上的几乎相同。HPLC之后使用PROBOND亲和柱将重组PX3.101提纯。 从1升细胞培养物中获得约20mg PX3.101蛋白。

蛋白质重折叠之后，重组PX3.101蛋白(●)和天然PX3.101蛋白(▲) 在抑制IL-8结合到其受体CXCR2方面显示出等价活性(图7B)。

                      实施例Ⅴ

           (动物研究--胶原诱导型关节炎小鼠研究)

A、常规方法

胶原诱导型关节炎(CIA)动物模型公知为最适宜检测治疗类风湿性关 节炎的潜在疗法的体内模型系统，并被食品和药品管理局推荐用于准备 IND(研制新药)申请的临床前检测。

以下两个动物研究用来自Jackson实验室(Bar Harbor,ME)的8-1G 周龄DBA/1J雄性小鼠开始。按照Rosloniec等人(“免疫学目前方案”， John Wiley和Sons公司，1996年)所述的方案在所有动物中诱导疾病。 简言之，将Ⅱ型鸡胶原以4mg/ml溶解到10mM乙酸中，并在4℃下搅拌 过夜。重要的是将Ⅱ型天然胶原保持在低温图示溶解以防止其变性。 在免疫前使用高速匀浆器将Ⅱ型鸡胶原在等体积完全弗氏佐剂(CFA)中 乳化。在整个乳化过程中将溶液保持低温。

在第1天，在DBA/1JLacJ小鼠的尾部下面皮下注射乳化于CFA中的 0.1mg鸡Ⅱ型胶原。在第21天，进行第二次相同注射。

如上所述，在不同时间向上背/肩部的组织皮下施加不同处理。至少 每周两次通过计数每只动物的肿大脚趾、爪和踝的数量记录每次研究的 发炎。每个关节被赋值0(未发炎)或1(发炎)的评分。根据这种评分系 统，最大评分28(7次测定/肢×4肢)和最小评分0可以对任意单个评 分情况下的动物赋值。该数据代表了疾病的严重程度。

B、研究1

1、方法

5组各10只小鼠按如下处理：

第1组：在第16天开始连续15天皮下施用PX3.101(200μg/kg)。

第2组：在第1天开始连续30天皮下施用蜂毒(1000μg/kg)(从 Apitronic Services获得溶于PBS中)。

第3组：阴性对照(从第1天开始连续30天皮下施用磷酸缓冲盐水 (PBS))。

第4组：从第1天开始连续30天口服消炎痛(1000μg/kg)(正对照； 从Sigma Chemical Co.,St.Louis,MO获得)。

第5组：正常对照(与第3组相同，只是小鼠未接受胶原)。

在第52天，从负对照(第3组)和PX3.101处理过的动物(第1组)中 获得血样并评价该动物模型中的PX3.101的免疫原性。制备血清并通过 实施例Ⅰ中所述的Western印迹分析测定。

2、结果

从第16-30天小鼠每天用200μg/kg剂量的PX3.101处理抑制了 CIA(胶原诱导型关节炎)小鼠的发炎。其活性可与消炎痛(一种已知的抗 关节炎药(每天处理剂量为1mg/kg，第4组)(参见图4A))媲美。当与第 3组负对照组比较时统计显著性为p＜0.05。

用PX3.101和PBS处理的小鼠的病理组织学研究进一步证实了 PX3.101在抑制发炎的治疗活性(参见图5A-5C)。在图5A-5C中，位于 照片中心附近的白色空间为含滑液的小鼠关节中的骨头(大黑区)之间的 空间。小黑点颗粒，在图5B中尤为明显的，为浸润关节的白细胞(例如 中性白细胞、T-细胞、巨噬细胞和其它作为免疫反应部分刺激的细胞)的 核心。中心白细胞活跃地降解骨头。

图5A显示了没有注射诱导关节炎的胶原的正常关节(第5组)。黑骨 物为光滑且未被降解的并且存在很少的白细胞。正好相反，在注射有胶 原并且然后用PBS处理的小鼠的关节中存在大量白细胞(第3组，参见 图5B)。在该阴性对照处理组中，观察到骨糜烂和白细胞浸入并且软骨 明显破坏(参见图5B)。图5C为用PX3.101处理的第1组小鼠的关节照 片。几乎观察不到骨糜烂以及软骨破坏。在关节中也有很少的白细胞。 该结果暗示，PX3.101可以抑制白细胞迁移到发炎部位。这种假设得到 我们发现PX3.101抑制趋化因子IL-8与其CXCR1和CXCR2之间相互作 用(参见图7A和实施例Ⅵ)的支持。IL-8为炎症中所包含的主要趋化因 子。其功能包括向发炎部位补充中性白细胞并激活它们释放过氧化物、 蛋白酶和生物活性脂类。

Western印迹分析在用200μg/kg的PX3.101处理连续15天的小鼠血 清中未检出抗PX3.101的抗体。

C、研究2

1、方法

4组各7-8只小鼠按如下处理：

第1组：在第22天开始连续15天皮下施用PX3.101(200μg/kg)。

第2组：在第22天开始连续15天皮下施用PX3.101(40μg/kg)。

第3组：在第22天开始连续15天皮下施用PX3.101(8μg/kg)。

第4组：阴性对照(从第22天开始连续15天皮下施用磷酸缓冲盐水 (PBS))。

2、结果

证实了不同浓度PX3.101在抑制CIA(胶原诱导型关节炎)中发炎的有 效性。在该研究中，小鼠接受PX3.101处理的时间为从第22-37天，而 不是上面研究1中的第16-30天。以三种剂量(8μg/kg、40μg/kg、和 200μg/kg)进行试验，40μg/kg表现为最佳浓度(图6)。

该研究结果说明，PX3.101分子在该动物中的活性以非线性方式依赖 其剂量。在临床前或临床研究中已在许多情况下，例如TNF-α可溶性受 体和弛缓素，硬皮病的临床后期开发中的药物候选者观察到这种现象。

此外，在间断地用PX3.101处理之后观察到基本上保持了治疗效果， 这暗示该分子可能具有长久效果。

D、动物研究总结

证实从蜜蜂毒液提纯的组分的治疗潜力与PX3.101的相同。在评价 两个研究的数据时，发现PX3.101的体内活性依赖其剂量和开始治疗的 时间。剂量测试时PX3.101的最有效剂量为40μg/kg。

                  实施例Ⅵ

               (作用机理研究)

A、方法--趋化因子或细胞因子/受体结合

通过Panlabs进行测定PX3.101对趋化因子或细胞因子/受体结合影 响的试验。为了抑制IL-8/CXCR2结合，将提纯(天然存在的或重组 的)PX3.101添加到0.2ml含0.15mg/ml表达CXCR2的人重组CHO细胞的 膜制剂、0.015nM 125I-标记的IL-8和10nM未标记的IL-8的反应溶液 中，使得最终PX3.101浓度为0、0.01、0.1、1.0和10μM。在室温下 将反应混合物培养60分钟。然后将结合的放射性配体与未结合的放射 性配体分离并在一γ计数仪上测定其放射活性。进行相似试验以测定 PX3.101对IL-8/CXCR1相互作用的影响，其中使用表达CXCR1的人重组 CHO细胞的膜制剂并测定单一机理的PX3.101(10μM)。以相似方式进行 TNF-α/TNF-α受体结合试验。简言之，将10μMPX3.101添加到含50mM Tris-HCl(pH7.4)、0.5mM EDTA、0.028nM125I-标记的TNF-α、40nM未 标记的TNF-α和表达TNF-α受体的人U937细胞的制剂的反应溶液中。将 该混合物在4℃下培养3小时。将结合的放射性配体与未结合的放射性 配体分离，并在一λ计数器上计数放射活性。

B、结果

发现PX3.101特异性地抑制IL-8与CXCR1之间的相互作用和IL-8 与CXCR2之间的相互作用(图7A)。PX3.101以剂量依赖型方式抑制IL-8 与CXCR2相互作用(图7A)。初步试验显示IC50为0.5μM。但是，TNF-α 与其受体的结合不受PX3.101的影响(图7A)。

IL-8为调节发炎过程的主要趋化因子。还有研究暗示它还可能包含 在肿瘤血管生成和瘤转移中(Koch等人(1992)“科学”258:1798)。由于 PX3.101抑制IL-8与其受体CXCR1和CXCR2的结合，因此希望PX3.101 在治疗癌症、炎症、自身免疫疾病和其它涉及IL-8的疾病中有效。天 然存在的提纯PX3.101和重组PX3.101对IL-8/CXCR2相互作用的抑制 示于图7B中。

还发现PX3.101抑制类风湿性关节炎致病中涉及的几种酶，包括环 氧合酶(COX1和COX2)、磷脂酶A2、磷脂酶C、脂氧合酶，以及蛋白酶 中胰蛋白酶和组织蛋白酶G(数据未显示)。这些酶中几种或者被整合到 磷脂膜(环氧合酶)中或者使用脂肪酸或磷脂作为其底物(磷脂酶A2、磷 脂酶C、脂氧合酶)。有趣的是，当使用在脂囊泡中提纯的酶时PX3.101 抑制COX1，但显示不抑制其自由酶溶液。该结果暗示，在PX3.101和脂 类、脂肪酸之间可能通过非特异性相互作用发生脂类/脂肪酸相关的酶 的抑制。

应理解为，本文中所述的实施例和实施方式仅仅是为了说明目的， 在此基础上的各种改进和变化对本领域技术人员来说是显而易见的，并 且应包括在本申请的实质和范围以及附加权利要求书的范围内。为此将 本文所引证的所有出版物、专利和专利申请的全部内容都加入本文作为 参考。

                             表

表Ⅰ：凝胶中胰蛋白酶消化所得的选择片段 肽片段 SEQ ID NO：     氨基酸序列 通过质谱的MW(D)     #47     17     V-X-V-P-R     未检出     #62     18     X-P-S-N-E-I-F-S-R     1124.2     #75     12     G-F-G-G-F-G-G-L-G-G-R     982.9     #88     19     X-X-P-N-V-V-P-K     未检出

*V=甘氨酸、P-脯氨酸、C=半胱氨酸、K=赖氨酸、S=丝氨酸I=异亮氨 酸、G=谷氨酸、N=天冬酰胺、X=不确定

表Ⅱ：来自蜜蜂毒液的PX3.101蛋白馏份的N-端序列(图2C) 名称 SEQ ID  NO: 蜜蜂毒液中PX3.101蛋     白的N-端序列 通过质谱测 定的MW(D) 以序列为基础的 推测MW(D)*  Puri-#1     20  G-G-F-G-G-L-G-G-R-G     7178     7178  Puri-#2     21  G-F-G-G-F-G-G-L-G-G     7405     7382  Puri-#3     22  F-G-G-F-G-G-F-G-G-L     7586     7586

*假设所有10个半胱氨酸来自5对二硫键，使用IntelliGenetics 程序推测分子量。还假设蛋白的C-端完整且分子不存在翻译后修饰。

G=谷氨酰胺、F=苯丙氨酸、R=精氨酸、L=亮氨酸

               相关申请的互相参考

本申请要求1998年9月14日申请的美国临时申请60/100172的益 处，将其全部内容加入本文作为参考。

                               序列表 <110>Cui,Xiangmin      Lu,Yuefeng      Pan Pacific Pharmaceutical,Inc. <120>蜂毒蛋白的有用特性和编码这种峰毒蛋白的基因 <130>019049-000200PC <140> <141> <150>US 60/100,172 <151>1998-09-14 <160>22 <170>PatentIn Ver.2.0 <210>1 <211>472 <212>DNA <213>Apis mellifera <220> <221>CDS <222>(74)..(352) <223>蜂毒PX3.101蛋白 <400>1 attcacagtg caacgtaagt tcttttcttc tttttttttt cgaaaaaaca actttgtttg 60 agaagaacaa aac atg tct cgt ctg gtt crt gcc tcc ttc crt ctt ttg    109

           Met Ser Arg Leu Val Leu Ala Ser Phe Leu Leu Leu

             1               5                  10 gca att ttc tcc atg ctt gtt gga gga ttt gga gga ttt gga gga ttt   157 Ala Ile Phe Ser Met Leu Val Gly Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Phe

     15                  20                  25 gga gga ctt gga gga cgt ggt aaa tgt cca agc aat gag atc ttc agt   205 Gly Gly Leu Gly Gly Arg Gly Lys Cys Pro Ser Asn Glu Ile Phe Ser

 30                  35                  40 aga tgc gat gga cgg tgc caa cgt ttt tgc ccc aat gtt gtt cct aaa   253 Arg Cys Asp Gly Arg Cys Gln Arg Phe Cys Pro Asn Val Val Pro Lys  45                  50                  55                  60 cct tta tgc atc aag ata tgt gca cca gga tgt gta tgt aga crt ggt   301 Pro Leu Cys Ile Lys Ile Cys Ala Pro Gly Cys Val Cys Arg Leu Gly

             65                  70                  75 tat tta agg aat aaa aag aag gta tgc gtt ccg cga tct aaa tgc gga   349 Tyr Leu Arg Asn Lys Lys Lys Val Cys Val Pro Arg Ser Lys Cys Gly

         80                  85                  90 tgacttttat aattatttca tgattatttt atgattgttt aacaattatt gtattgtatt 409 ttatcattca taaaaattgt tatgttatta ttttatcagt aaaaaaaaaa aaaaaaaaaa 469 aaa                                                               472 <2l0>2 <21l>92 <212>PRT <213>Apis mellifera <400>2 Met Ser Arg Leu Val Leu Ala Set Phe Leu Leu Leu Ala Ile Phe Ser   1               5                  10                  15 Met Leu Val Gly Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Leu Gly

         20                  25                  30 Gly Arg Gly Lys Cys Pro Ser Asn Glu Ile Phe Ser Arg Cys Asp Gly

     35                  40                  45 Arg Cys Gln Arg Phe Cys Pro Asn Val Val Pro Lys Pro Leu Cys Ile

 50                  55                  60 Lys Ile Cys Ala Pro Gly Cys Val Cys Arg Leu Gly Tyr Leu Arg Asn  65                  70                  75                  80 Lys Lys Lys Val Cys Val Pro Arg Ser Lys Cys Gly

             85                  90 <210>3 <211>26 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：正向引物ASEQ 10 <400>3 aaggatccac agtgcaacgt aagttc                                       26 <210>4 <211>55 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：正向引物ASEQ 11 <400>4 aaggatccgg aggatttgga ggatttggag gatttggagg acttggagga cgtgg       55 <210>5 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：反向引物ASEQ 13 <400>5 actgataaaa taataac                                  17 <210>6 <211>16 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：反向引物ASEQ 14 <400>6 atgaatgata aaatac                                   16 <210>7 <211>17 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：反向引物ASEQ 15 <400>7 ttataaaagt catccgc                                  17 <210>8 <211>25 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：简并低聚核苷酸引物 <220> <221>修饰碱基 <222>(23) <223>n=g,a,c或t <400>8 atggatccaa ygarathtty wsnag                        25 <210>9 <211>6 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：由蛋白质测序获得的氨基酸序列 <400>9 Asn Glu Ile Phe Ser Arg   1               5 <210>10 <211>28 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：低聚(dT) <400>10 ttgcggccgc tttttttttt tttttttt                         28 <210>11 <211>8 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：

通过蛋白质测序获得的SEQ ID NO:2的残基38-45，

来自凝胶中胰蛋白酶消化的肽片段#75 <400>11 Pro Ser Asn Glu Ile phe Ser Arg   1               5 <210>12 <211>11 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：通过蛋白质测序获得的SEQ ID NO:2的残基24-34 <400>12 Gly Phe Gly Gly Phe Gly Gly Leu Gly Gly Arg   1               5                  10 <210>13 <211>5 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：通过蛋白质测序获得的SEQ ID NO:2的残基84-88 <400>13 Val Cys Val Pro Arg   1               5 <210>14 <21l>6 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：通过蛋白质测序获得的SEQ ID NO:2的残基55-60 <400>14 Pro Asn Val Val Pro Lys   1               5 <210>15 <211>13 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：5’RACE低聚核苷酸引物ASEQ 2 <400>15 atcgcggaac gca                                        13 <210>16 <211>22 <212>DNA <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：5’RACE低聚核苷酸引物ASEQ 3 <400>16 aaggatccaa gtctacatac ac                              22 <210>17 <211>5 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：来自凝胶中胰蛋白酶消化的肽片段#47 <220> <221>MOD RES <222>(2) <223>Xaa=不确定氨基酸 <400>17 Val Xaa Val Pro Arg   1               5 <210>18 <211>9 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：来自凝胶中胰蛋白酶消化的肽片段#62 <220> <221>MOD RES <222>(1) <223>Xaa=未确定氨基酸 <400>18 Xaa Pro Ser Asn Glu Ile Phe Ser Arg   1               5 <210>19 <211>8 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：来自凝胶中胰蛋白酶消化的肽片段#48 <220> <221>MOD RES <222>(1)..(2) <223>Xaa= 未确定氨基酸 <400>19 Xaa Xaa Pro Asn Val Val Pro Lys   1               5 <210>20 <211>10 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：来自Puri-#1的N-端序列 <400>20 Gly Gly Phe Gly Gly Leu Gly Gly Arg Gly   1               5                  10 <210>21 <211>10 <212>PRT <213>人工序列 <220> <223>人工序列的说明：来自Puri-#2的N-端序列