一种大菱鲆家系育种值评估方法

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一种大菱鲆家系育种值评估方法
申请号	CN201410148388.X	申请日	2014-04-14	公开(公告)号	CN103882144A	公开(公告)日	2014-06-25
申请人	中国水产科学研究院黄海水产研究所;			发明人	王伟继; 官健涛; 胡玉龙; 栾生; 孔杰;
摘要	一种大菱鲆家系育种值评估方法，本发明属于海水动物遗传育种领域，它包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理；相比于依靠物理系谱评估育种值的方法，本方法能提高个体间亲缘系数准确度，在育种值预测及其准确度方面发挥优势。以此更好的指导选育工作。
权利要求	1.一种大菱鲆家系育种值评估方法，其特征在于所述方法包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理；所述的家系个体数据采集：对于所构建家系的大菱鲆，在4月龄时，每个家系挑选体重排名前60的个体作为核心选育家系，测量体重数据，取其平均值作为家系核心选育家系平均值，同时提取每个家系留种个体的DNA；所述的微卫星位点基因分型：利用大菱鲆已经公布的12个SSR位点进行SSR-PCR扩增，12对引物正相序列5‘端分别标记6-FAM，HEX及ROX荧光标记；利用全自动基因分析仪进行12个位点的微卫星位点基因分型，最后利用GeneMapper3.7准确读取并记录每一个体在每一个位点上的等位基因峰值；所述的数据处理： SSR位点数据按照Coancestry1.0.1.2软件的要求输入到软件中处理，得到分型个体两两之间的分子遗传相关系数；根据分型个体两两之间的分子遗传相关计算平均分子遗传相关系数，来表示所有个体间的遗传相关系数；再利用R3.0.2软件将得到的结果转化为分子亲缘矩阵的形式；利用R3.0.2软件中corpcor程序包的make.positive.definite函数将上述矩阵进行正定，正定后再用is.positive.definite函数验证；利用ASReml3.0软件根据线性混合模型估计方差组分及育种值。 2.根据权利要求1所述的一种大菱鲆家系育种值评估方法，其特征在于所述的家系个体数据采集步骤，提取每个家系20个个体的DNA，所述的20个个体为随机选取。
说明书全文	一种大菱鲆家系育种值评估方法技术领域 [0001] 本发明属于海水动物遗传育种领域，具体地涉及一种可实现对大菱鲆家系进行育种值评估的方法背景技术 [0002] 大菱鲆（Scophthalmus maximus L.）是原产于欧洲的底栖海水鱼类，具有生长迅速、耐低温、风味独特、性格温顺、宜于集约化养殖等优点，是欧洲等地的优良海水养殖品种之一。自1999年突破生产性育苗技术以来，大菱鲆养殖产业在我国得到迅速发展，已经成为我国北方沿海重要的鱼类养殖品种。由于我国不是大菱鲆的原产地，养殖生产中长期依赖于欧洲大菱鲆原产国提供、补充种源。同时，由于累代养殖和近亲交配比较严重，国内大菱鲆产业普遍出现了种质退化现象。主要表现为生长速度降低、白化率增高、出苗率降低等现象。良种选育已经成为我国大菱鲆养殖产业可持续发展的重要课题之一。基于完整物理系谱记录的良种选育模式是开展菱鲆良种选育的重要途径之一。完整、准确的系谱信息不仅可以有效指导亲本选留，避免近交衰退；同时利用系谱信息推算出的个体亲缘系数也是用来进行遗传参数评估的重要数据。但是由于大菱鲆性成熟周期长（2-3年），目前绝大多数良种场亲鱼保有数量有限，更不用说完整的物理系谱记录信息；同时，大菱鲆属于引进物种，群体的遗传背景不清，这也为开展大菱鲆良种选育造成了很大的困难。虽然利用分子标记可以实现系谱重建，但是这种重建是很有限的，比如只能重建到父母本一代，只能推算出父母本的基因型组合，而无法推算出具体的父本、母本的基因型。良种选育过程中，最重要的遗传参数评估就是个体/家系育种值的评估。因此，目前迫切需要一种无需详细的物理系谱记录就能够对家系进行育种值评估的技术。发明内容 [0003] 本发明要解决的技术问题是提供一种大菱鲆家系育种值评估方法，以解决利用背景不清、物理系谱记录不全、或者引进大菱鲆群体进行良种选育时，无法利用系谱信息推算出的个体亲缘系数从而进行遗传参数评估的问题。 [0004] 本发明是通过如下技术方案实现的： [0005] 一种大菱鲆家系育种值评估方法，包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理； [0006] 所述的家系个体数据采集：对于所构建家系的大菱鲆，在4月龄时，每个家系挑选体重排名前60的个体作为核心选育家系，测量体重数据，取其平均值作为家系核心选育家系平均值，同时从每个家系留种个体取20尾个体，提取DNA； [0007] 所述的微卫星位点基因分型：利用大菱鲆已经公布的12个SSR位点进行SSR-PCR扩增，12对引物正相序列5‘端分别标记6-FAM，HEX及ROX荧光标记；利用全自动基因分析仪进行12个位点的微卫星位点基因分型，最后利用GeneMapper3.7(Applied Biosystems)准确读取并记录每一个体在每一个位点上的等位基因峰值； [0008] 所述的数据处理： [0009] SSR位点数据按照Coancestry1.0.1.2软件的要求输入到软件中处理，得到分型个体两两之间的分子遗传相关系数（rXY）； [0010] 根据分型个体两两之间的分子遗传相关系数（rXY）计算平均分子遗传相关系数（AMR），来表示所有个体（包括未分型个体）间的遗传相关； [0011] 再利用R3.0.2软件将得到的结果转化为分子亲缘矩阵（Numerator Matrix）的形式；利用R3.0.2软件中corpcor程序包的make.positive.definite函数将上述矩阵进行正定（Bending），正定后再用is.positive.definite函数验证； [0012] 利用ASReml3.0软件根据线性混合模型估计方差组分及育种值。 [0013] 本发明与现有技术相比的有益效果：相比于依靠物理系谱评估育种值的方法，本方法能提高个体间亲缘系数准确度，在育种值预测及其准确度方面发挥优势。在育种过程中，由管理及其他不可避免的失误造成的系谱潜在错误是经常发生的，尤其对大菱鲆这种生殖力较高的鱼类群体。因此，由系谱推断的分子亲缘系数往往是不够准确的。所以需要从分子水平上去估算个体间的遗传相关，以此来获得准确的育种值预测值，以此更好的指导选育工作。具体实施方式 [0014] 实施例 [0015] 下面通过实施例对本发明的技术方案作进一步的解释，但本发明的保护范围不受实施例任何形式上的限制。 [0016] 一种大菱鲆家系育种值评估方法，包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理；具体步骤如下： [0017] 一.大菱鲆家系构建 [0018] 2013年初（1月份）对候选大菱鲆亲鱼通过控温控光进行生殖调控。4月末水温适合时，从候选亲鱼中挑选性腺发育成熟，体型完整，体色正常，摄食积极，无伤残健康活泼，体重2千克以上的个体进行人工受精，构建大菱鲆家系。具体为：受精卵放置在80×60×60cm孵化网箱内充气孵化，海水温度维持在14～15℃。孵化3天后吸取上浮卵 2 并按照20ml/m(350粒/ml)的标准，由孵化池移入提前调好水温、盐度、PH及溶解氧的圆形 2 3 玻璃钢缸中（0.5m，容积0.5m）微充气，静水孵化至出苗，各家系均单独培育。此后培育过程参照大菱鲆家系常规养殖方法，共培育大菱鲆家系19个。 [0019] 二.家系个体数据采集与DNA提取： [0020] 待家系个体生长至4月龄时，每个家系挑选体重排名前60的个体作为核心选育家系，测量体重数据，取其平均值作为家系核心选育家系，1-19号家系体重平均值（g）分别为8.11，5.71，6.07，7.11，5.15，5.48，6.35，5.73，5.39，4.79，4.39，5.64，4.92，5.66，4.97，4.97，5.00，6.23，6.32。同时从每个家系留种个体随机选取20尾个体，取其鳍条末端组织（类似于取动物的毛发组织，不会对个体造成任何伤害）备个体基因组DNA提取。参照常规方法提取基因组DNA-75℃低温保存。 [0021] 三.微卫星位点基因分型： [0022] PCR及产物检测：选用大菱鲆已经公布的12个SSR位点进行SSR-PCR扩增，位点名称分别为YSKr271,YSKr262,YSKr108,YSKr231,YSKr80,YSKr244,YSKr197,YSKr115,YSKr221,YSKr124,YSKr218，YSKr259（表1），12对引物正相序列5‘端分别标记6-FAM，HEX及ROX荧光标记。PCR反应体系包括：总体积25μl，其中基因组DNA2μl(50ng/μl)，TaqDNA聚 2+ 合酶0.2μl(5U/μl)，10×PCR Buffer2.5μl，Mg 2μl（2.5mmol/L），dNTP2μl(2.5mmol/L),引物各0.5μl（10μmol/L），ddH2O15.3μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min后进入 25个PCR循环：95℃变性40s，退火1min（各引物的退火温度见表1），72℃延伸1min，最后于72℃延伸5min，4℃保存。 [0023] 表1微卫星引物的基本特征 [0024] [0025] [0026] 基因分型：利用ABI3130型全自动基因分析仪进行12个位点的微卫星分型。在96孔板的每个加样孔里分别加2μl上述PCR扩增产物与8μl内标体系（去离子甲酰胺：GeneScanTM-500LIZ Size Standard=7.9:0.1，所述的比值为体积比）充分混合后， 95℃变性5min，结束后迅速将96孔板置于冰水混合物中冷却。将冷却后的样品置于Applied Biosystems的3130基因分析仪中，进行荧光数据收集和基因分型。最后利用GeneMapper3.7(Applied Biosystems)准确读取并记录每一个体在每一个位点上的等位基因峰值。 [0027] 四.数据处理： [0028] 1.分型位点数据按照Coancestry1.0.1.2软件的要求输入到软件中处理，得到分型个体两两之间的分子遗传相关系数（rXY）。 [0029] 2.为了利用每个家系分型个体间的分子遗传相关系数估计所有个体间的遗传相关系数，将已得到的rXY进行转化，转化后，所有个体间的遗传相关度均用平均分子遗传相关系数（AMR，average molecular relatedness）来表示，AMR计算公式如下： [0030] 家系内 [0031] 其中表示家系内个体间的平均分子遗传相关系数，∑rw和nw分别代表家系内所有分型个体间的分子遗传相关系数之和及其数目。 [0032] 家系间 [0033] 其中表示家系间个体间的平均分子遗传相关系数，∑rb和nb分别是家系间所有分型个体间的分子遗传相关系数之和及其数目。19个家系内及家系间的AMR见表一。 [0034] 表一19个家系内和家系间的平均分子遗传相关系数 [0035] [0036] 。利用R3.0.2软件根据公式（1）和（2），计算所有个体间的平均分子遗传相关系数，并形成一个亲缘系数矩阵。 [0037] 3.利用R3.0.2软件中corpcor程序包的make.positive.definite函数将上述矩阵进行正定（Bending）即其特征值均大于零，正定后再用is.positive.definite函数验证。 [0038] 4.根据ASReml3.0软件流程，将正定后的矩阵转化为.grm文件，连同表型数据文件及相应的系谱文件一起输入到ASReml3.0软件，使用AI-REML算法，利用动物模型（如下）估计方差组分及家系育种值。 [0039] y＝Xb+Zu+e [0040] 其中y为表型值向量，X和Z分别为b和u的设计矩阵，b,u和e分别为固定效应，随机效应（加性遗传效应，母系共同环境效应）及残差的向量，以日龄作为协变量，加入到模型中矫正体重值。 [0041] 按照Henderson（1959）混合方程组（如下）求解动物模型。 [0042] [0043] 其中X’和Z’分别为X和Z矩阵的转置；A-1是A矩阵的逆矩阵；和分别是固定效应和随机效应的估计值； [0044] 5.估算的育种值及其标准误从得到的.pvc文件中提取。对于只利用系谱估算家系育种值的方法，则不需要计算.grm文件，直接将表型数据文件及已知的系谱文件导入到ASReml文件利用动物模型估算育种值即可。根据平均分子遗传相关系数(AMR)和物理遗传相关系数，估计的家系育种值见表二。 [0045] 表二19个家系的估计育种值 [0046] [0047] 6.利用交叉验证（cross-validation）比较PR与AMR在育种值准确度的差异。利用R3.0.2软件将测得的体重数据随机分为均等的10份，其中9份作为训练集（training set），剩下一份作为验证集（validation set）。根据训练集数据，在ASReml3.0中用动物模型来预测验证集表型值。根据如下公式来计算育种值准确度 [0048] [0049] 其中表示育种值准确度；表示验证集的预测值与观察值之间的2 皮尔逊相关度；h 表示根据系谱及体重数据估算的遗传力。分别根据PR及AMR来进行交叉验证，并重复500次，取平均值作为最终结果。结果显示AMR方法估计的育种值准确度（ 0.660指的是根据PR估计的遗传力，下面的0.660与之相同）要高于物理系谱方法估计育种值的准确度 [0050] [0051] 技术指标 [0052] 一种大菱鲆家系育种值估算方法可以满足没有任何物理谱系记录的条件下，开展大菱鲆良种选育工作，其针对的选育性状主要为生长方面的，包括体长、体重。尤其适合以引进群体或初建的基础群体开展大菱鲆良种选育的工作。其可以满足进行家系水平、任意生长阶段的大菱鲆育种值评估。 [0053] 应用范围 [0054] 该技术主要应用于大菱鲆良种选育领域，尤其是引进群体及物理谱系记录不完整甚至缺乏的选育群体。主要针对性状为生长性状，是一种家系水平的育种值精确估算。