一种大菱鲆个体育种值评估方法

IPRDB

API 数据接口

专利申请

使用指引 chat嘟嘟

会员体验

联系我们

交流群

现在联系顾问~

一种大菱鲆个体育种值评估方法
申请号	CN201410514807.7	申请日	2014-09-30	公开(公告)号	CN104313135B	公开(公告)日	2015-07-01
申请人	中国水产科学研究院黄海水产研究所;			发明人	王伟继; 官健涛; 胡玉龙; 栾生; 孔杰;
摘要	本发明的目的是提供一种大菱鲆个体育种值评估方法，以解决利用背景来源不明、物理系谱残缺、或者利用引进的大菱鲆群体进行良种选育时，无法利用物理系谱信息推算出个体亲缘系数，从而不能进行个体遗传参数评估的问题，从而弥补现有技术的不足。相比于依靠物理系谱评估育种值的方法，本方法的方法能够大幅节约个体育种值评估的时间期限，即无需经过多代培育家系材料等繁琐步骤，只需一代即可完成个体育种值评估。
权利要求	1.一种大菱鲆个体育种值评估方法，其特征在于，所述的方法包括有如下的步骤： 1)首先将待检测的大菱鲆雌雄个体来构建家系， 2)对构建的家系中的子代个体在养殖后，选取全部或部分个体进行生长性状的测量；获得个体的生长性状的测量值； 3)提取构建家系的雌雄亲本的DNA进行SSR位点基因分型；记录每一个体在每个SSR位点上的等位基因峰值数据； 4)利用Coancestry 1.0.1.2软件对SSR分型数据进行计算求得亲本个体间的共祖率coancestry及近交系数F；家系子代个体间的共祖率由其父母本间的共祖率根据公式(1)求得，其中个体与其本身的共祖率由公式(2)求出，并按公式(3)计算出子代个体间的遗传相关系数，即分子遗传相关系数； rPQ＝2θPQ (3) 其中A和B、C和D分别代表P和Q的父母本，θ代表共祖率，F代表近交系数，r代表遗传相关系数； 5)然后利用R 3.0.2软件将父母本间共祖率转化为其子代个体间的分子遗传相关系数矩阵；最后利用ASReml软件计算个体育种值：yijk＝μ+cbi+aj+dk+eijk 其中yijk代表大菱鲆个体的体重值，μ表示均值，bi代表第i个个体的日龄，作为协变量，c是相应的回归系数，aj代表加性遗传效应，dk代表母性共同环境效应，eijk表示残差效应；再根据狭义遗传力公式求得遗传力估计值：和分别表示加性遗传方差及表现方差。 2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤1)中的家系为母系半同胞家系组和/或全同胞家系。 3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中的SSR位点基因分型所用到的微卫星引物序列信息如下： 4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述的步骤3)中所述的SSR位点基因分型是利用全自动基因分析仪进行SSR基因分型。
说明书全文	一种大菱鲆个体育种值评估方法技术领域 [0001] 本发明属于海水动物遗传育种领域，具体地涉及一种可实现对大菱鲆个体进行育种值评估的方法背景技术 [0002] 大菱鲆(Scophthalmusmaximus L.)是原产于欧洲的底栖海水鱼类，由于其生长迅速、耐低温、性格温驯并易于集约化养殖等优点，一直以来是欧洲等地的优良海水养殖品种之一。我国于1992年开始引进大菱鲆，自1999年前后突破生产性育苗技术以来，大菱鲆养殖产业在我国得到迅猛发展，已经成为我国北方沿海地区重要的海水养殖种类。但我国不是大菱鲆原产国，长期以来一直依靠欧洲大菱鲆原产国来提供、补充种源。同时，由于国内生产中忽视良种培育，累代养殖和近亲交配导致养殖业中普遍出现种质退化现象，主要表现为生长速度降低、白化率增高、出苗率降低等现象。以养殖周期为例，引进初期时，达到商品规格的养殖时间为7-8个月，而现在普遍延长到14个月左右。因此，良种选育已经成为我国大菱鲆养殖生产可持续健康发展的重要研究内容之一。研究表明基于完整物理系谱记录的传统良种选育模式是开展大菱鲆良种选育的重要途径之一。完整、准确的系谱信息不仅可以有效指导亲本选留，避免近交衰退；同时利用系谱信息推算出的个体亲缘系数也是用来进行遗传参数评估的重要数据。但是由于大菱鲆性成熟周期长(2-3年)，个体标记要求严格，目前国内几乎没有育苗场保有多代、完整的个体物理系谱记录信息；而且大菱鲆属于引进物种，群体个体的遗传背景不清，这也为开展大菱鲆良种选育造成了很大的困难。虽然分子标记可以部分实现物理系谱重建，但其有限性突出表现为只能重建到父母本一代，只能推算出父母本的基因型组合，而无法推算出具体的父本、母本的基因型等。然后在良种选育过程中，最重要的遗传参数评估就是个体/家系育种值的评估。因此，生产中迫切需要一种无需多代详细物理系谱记录就能够对个体进行育种值评估的技术。发明内容 [0003] 本发明的目的是提供一种大菱鲆个体育种值评估方法，以解决利用背景来源不明、物理系谱残缺、或者利用引进的大菱鲆群体进行良种选育时，无法利用物理系谱信息推算出个体亲缘系数，从而不能进行个体遗传参数评估的问题，从而弥补现有技术的不足。 [0004] 本发明的大菱鲆个体育种值评估方法，包括有如下的步骤： [0005] 1)首先将待检测的大菱鲆雌雄个体来构建家系，所述的家系为母系半同胞家系组和/或全同胞家系； [0006] 2)对构建的家系中的子代个体在养殖后，选取全部或部分个体进行生长性状的测量；获得个体的生长性状的测量值； [0007] 3)提取构建家系的雌雄亲本的DNA进行SSR位点基因分型；记录每一个体在每个SSR位点上的等位基因峰值数据； [0008] 利用已经公开的12个大菱鲆SSR位点进行SSR-PCR扩增，12对引物正向序列5′端分别标记6-FAM,HEX或ROX荧光标记；利用全自动基因分析仪进行12个位点的SSR基因分型，最后利用GeneMapper3.7(Applied Biosystems)准确读取并记录每一个体在每个SSR位点上等位基因峰值数据。 [0009] 4)利用Coancestry1.0.1.2软件对SSR分型数据进行计算求得亲本个体间的共祖率coancestry及近交系数F； [0010] 家系子代个体间的共祖率由其父母本间的共祖率根据公式(1)求得，其中个体与其本身的共祖率由公式(2)求出，并按公式(3)计算出子代个体间的遗传相关系数，即分子遗传相关系数； [0011] [0012] [0013] rPQ＝2θPQ (3) [0014] 其中A和B、C和D分别代表P和Q的父母本，θ代表共祖率，F代表近交系数，r代表遗传相关系数； [0015] 5)然后利用R3.0.2软件将父母本间共祖率转化为其子代个体间的分子遗传相关系数矩阵；最后利用ASReml软件计算个体育种值： [0016] y＝Xb+Zu+e [0017] 其中y代表大菱鲆家系子代个体的测量值，bi代表固定效应，u代表随机效应，e表示残差效应。 [0018] 再根据狭义遗传力公式求得遗传力估计值： [0019] [0020] 和分别表示加性遗传方差及表现方差。 [0021] 相比于依靠物理系谱评估育种值的方法，本方法的方法具有如下的优点：1)能够大幅节约个体育种值评估的时间期限，即无需经过多代培育家系材料等繁琐步骤，只需一代即可完成个体育种值评估；2)精确度能够有所提高。在大菱鲆育种过程中，由于管理不善及其它原因造成的系谱潜在错误是经常发生的，对于大菱鲆这种性成熟周期长、繁殖力高的鱼类更为常见。因此，由系谱推断的亲缘系数往往不够准确，而分子亲缘系数则无需受限于此，仅通过直接分析亲本间的分子亲缘系数即可用于个体遗传参数评估。具体实施方式 [0022] 本发明的方法可以满足没有任何物理系谱记录的条件下，开展大菱鲆良种选育工作，其针对的选育性状主要为体长、体重等生长性状。尤其适合以引进群体或初建的基础群体开展大菱鲆良种选育的工作。可以满足任意生长阶段大菱鲆个体育种值评估。 [0023] 遗传参数是数量遗传学的基本内容,包括遗传力、重复率、性状间遗传相关三个基本参数。遗传力反映性状遗传与环境的关系，重复率反映同一性状各次度量值间的关系，遗传相关表明性状与性状间的遗传关系。这是数量性状各种关系中最重要的三种关系。有了这三种关系的参数,数量遗传学中各种计算就有了框架,因此是各种有关计算的基础。 [0024] 共祖率定义为：在一个基因座上，两个体其中一个个体随机等位基因与另一个个体随机等位基因后裔同样的概率。 [0025] 近交系数(inbreeding coefficient)是指一个个体任一位点上两个基因来源于同一祖先的概率，适用于一个个体，表示该个体的亲本间亲缘关系的程度。 [0026] 全同胞家系：两个相同亲本的后代统称为全同胞家系 [0027] 母系半同胞家系组：指一个雌性亲本与多个雄性亲本繁殖产生的多个家系组成一个母系半同胞家系组。 [0028] 下面对本发明的方法做进一步的描述。 [0029] 本发明的大菱鲆个体育种值评估方法，包括大菱鲆家系构建、家系个体数据采集与DNA提取、微卫星位点基因分型和数据处理步骤；具体如下： [0030] 一.大菱鲆家系构建 [0031] 2013年初(1月份)对候选大菱鲆亲鱼通过控温控光进行生殖调控。4月末水温适合时，从候选亲鱼中挑选性腺发育成熟，体型完整，体色正常，摄食积极，无伤残健康活泼，体重2千克以上的个体进行人工受精，构建大菱鲆家系。具体为：分别对挑选出的雌雄亲鱼进行人工挤卵挤精，在烧杯中混合受精，再将受精卵放置在80×60×60cm孵化网箱内充气孵化，海水温度维持在14.5℃左右。孵化100小时后吸取上浮卵并按照10-30ml/m2(350粒2 /ml)的标准，由孵化池移入提前调好水温、盐度、PH及溶解氧的圆形玻璃钢缸中(0.5m，容 3 积0.5m)微充气，静水孵化至出苗，各家系均单独培育。此后培育过程参照大菱鲆家系常规养殖方法，共培育大菱鲆家系39个，涉及亲本包括31尾雄鱼和16尾雌鱼，包括9个母系半同胞家系组和6个全同胞家系。 [0032] 二.家系个体数据采集与DNA提取： [0033] 待家系个体生长至3月龄时，每个家系挑选体重排名前60的个体作为核心选育家系，并其测量体重数据，1-39号家系体重平均值(g)分别为10.27，10.66，9.93，9.64，10.62，9.62，9.92，9.28，9.84，9.86，11.43，10.69，11.71，7.61，8.11，5.71，6.07，7.11， 5.15，6.44，5.79，5.95，5.47，5.48，6.35，5.73，5.39，4.79，4.39，5.35，5.63，5.64，4.92， 5.66，4.97，4.97，5.00，6.23，6.32。同时对每个家系涉及的亲本取其鳍条末端组织(类似于取动物的毛发组织，不会对个体造成任何伤害)备个体基因组DNA提取。参照常规方法提取基因组DNA，-75℃低温保存。 [0034] 三.微卫星位点基因分型： [0035] PCR及产物检测：选用大菱鲆已经公布的12个SSR位点进行SSR-PCR扩增，位点名称分别为YSKr271,YSKr262,YSKr108,YSKr231,YSKr80,YSKr244,YSKr197,YSKr115,YSKr221,YSKr124,YSKr218，YSKr259(表1)，12对引物正相序列5’端分别标记6-FAM，HEX及ROX荧光标记。PCR反应体系包括：总体积25μl，其中基因组DNA2μl(50ng/μl)，TaqDNA聚 2+ 合酶0.2μl(5U/μl)，10×PCR Buffer2.5μl，Mg 2μl(2.5mmol/L)，dNTP2μl(2.5mmol/L),引物各0.5μl(10μmol/L)，ddH2O15.3μl。PCR扩增条件为：95℃预变性5min后进入 25个PCR循环：95℃变性40s，退火1min(各引物的退火温度见表1)，72℃延伸1min，最后于72℃延伸5min，4℃保存。 [0036] 表1：微卫星引物的基本特征 [0037] [0038] 基因分型：利用ABI3130型全自动基因分析仪进行12个位点的微卫星分型。在96孔板的每个加样孔里分别加2μl上述PCR扩增产物与8μl内标体系(去离子甲酰胺： GeneScanTM-500LIZ Size Standard＝7.9:0.1)充分混合后，95℃变性5min，结束后迅速将96孔板置于冰水混合物中冷却。将冷却后的样品置于Applied Biosystems的3130基因分析仪中，进行荧光数据收集和基因分型。最后利用GeneMapper3.7(Applied Biosystems)准确读取并记录每一个体在每一个位点上的等位基因峰值。 [0039] 四、统计分析： [0040] 1.遗传相关系数的估算 [0041] 利用Coancestry1.0.1.2软件对SSR分型数据进行处理，计算求得亲本个体间的共祖率(coancestry)及近交系数(F)。 [0042] 子代个体间的共祖率可以由其父母本间的共祖率根据公式(1)求得，其中个体与其本身的共祖率由公式(2)求出，当已求出个体间共祖率时，根据个体间遗传相关系数(r)等于共祖率的两倍可以直接算出子代个体间的分子遗传相关即公式(3)。 [0043] [0044] [0045] rPQ-2θPQ (3) [0046] 注：A和B、C和D分别是P和Q的父母本，θ代表共组系数，F代表近交系数，r代表遗传相关系数。 [0047] 利用R3.0.2软件根据上述原理和公式，将父母本间共祖率转化为其子代个体间的分子遗传相关系数矩阵(见表2)，根据完整系谱(三代系谱)计算出的子代个体间物理遗传相关系数矩阵(见表3)。 [0048] 表2：分子遗传相关系数矩阵，其中第一行与第一列均为家系号，子代个体间的遗传相关系数与家系间的相同，故此处展示的是家系水平的估算值。 [0049] [0050] 表3：物理遗传相关系数矩阵，第一行与第一列均为家系号，子代个体间的遗传相关系数与家系间的相同，故此处展示的是家系水平的估算值。 [0051] [0052] 在家系水平上，计算物理遗传系数及分子遗传系数之间的皮尔逊相关系数。 [0053] 结果显示，这两种相关系数之间的皮尔逊系数为0.872(P<0.01)。 [0054] 2.遗传系数的估计 [0055] 根据动物模型估计大菱鲆群体的遗传力，预测个体育种值。 [0056] yijk＝μ+cbi+aj+dk+eijk [0057] y代表大菱鲆个体的体重值，μ表示均值，bi代表第i个个体的日龄，作为协变量，c是相应的回归系数，aj代表加性遗传效应，dk代表母性共同环境效应，e表示残差效应。 [0058] 方差组分结构： [0059] [0060] a、d和e分别代表加性遗传效应，母性共同环境效应及残差效应，和 [0061] 分别是它们的方差。 [0062] 具体计算过程通过ASReml3.0软件完成，根据ASReml软件的要求整理系谱文件及数据文件，其中系谱文件分别根据物理遗传相关系数及分子相关系数整理，然后将上述动物模型输入到ASReml软件中，最后利用AI-REML算法分别根据两种系谱文件迭代求得各个分差组分和育种值的估计值。再根据狭义遗传力公式(如下)求得遗传力估计值。 [0063] [0064] 和分别表示加性遗传方差及表现方差。 [0065] 结果显示：利用物理遗传相关系数及分子遗传相关系数估计的遗传力分别为0.5470(±0.2161)及0.5220(±0.1336)。利用t-test检验两种遗传力间差异的显著性，t值为0.098，故差异不显著。两种方法预测的个体育种值之间皮尔逊相关度为0.878。 [0066] 3.交叉验证 [0067] 本实验利用交叉验证方法来比较两种方法预测能力及预测个体育种值的准确性。方法如下：将全部的数据集随机等分为十份，其中一份作为验证集，其余九份作为训练集，即每次用训练集建立模型来预测验证集的育种值，以验证集实际表型值与预测育种值之间的皮尔逊相关度来评价两种方法预测能力大小，以此来衡量预测育种值的准确度。 [0068] 结果：根据物理遗传相关系数及分子遗传相关系数的两种方法预测能力分别为0.8135和0.8136，故说明两种方法的预测能力差异很小。 [0069] 不论在遗传力估算还是个体育种值预测方面，利用父母本SSR位点推导出来的子代分子遗传相关系数进行遗传评估的方法与依据完整系谱(三代系谱)的方法无明显差异，为大菱鲆群体选育提高了一种良好的替代方法。