用于检测乳腺炎奶牛牛奶中病原体的侧流测定

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用于检测乳腺炎奶牛牛奶中病原体的侧流测定
申请号	CN202280032625.9	申请日	2022-03-07	公开(公告)号	CN117255946A	公开(公告)日	2023-12-19
申请人	硕腾服务有限责任公司;			发明人	S·韦利讷尼; A·F·肯沃西;
摘要	本发明提供了用于检测作为动物奶样品中的革兰氏阳性菌标识符的脂磷壁酸(LTA)的侧流装置。该装置包括：a)条状物，其由能够使流体沿条状物的一部分毛细管流动的材料形成，b)样品垫，其靠近条状物一端，用于接收牛奶样品，c)缀合物垫，其位于条状物中，使得在操作中样品在毛细管作用下从样品垫通过条状物流到缀合物垫，并且动员缀合物垫中包含的缀合物，该缀合物包含已缀合至检测剂的抗LTA抗体，d)测试线，其包含沿着基本上垂直于样品沿条状物流动的方向的条带固定在条状物内的抗LTA抗体，使得当包含固定化抗LTA抗体缀合物和样品中的LTA的形成的复合物接触测试线中的固定化抗LTA抗体时，样品中LTA的存在由可见颜色变化指示。
权利要求	1.一种侧流装置，其用于检测作为动物奶样品中乳腺炎革兰氏阳性菌标识符的在革兰氏阳性菌表面表达的脂磷壁酸(LTA)，所述装置包括：a)条状物，其由能够使流体沿所述条状物的一部分毛细管流动的材料形成，b)样品垫，其靠近所述条状物的一端，用于接收所述奶样品，c)缀合物垫，其位于所述条状物中，使得在操作中所述样品在毛细管作用下从所述样品垫通过所述条状物流到所述缀合物垫，并且动员所述缀合物垫中包含的缀合物，所述缀合物包含已缀合至检测剂的抗LTA抗体，d)测试线，其包含沿着基本上垂直于样品沿所述条状物流动的方向的条带固定在所述条状物内的抗LTA抗体，使得当包含固定化抗LTA抗体缀合物和所述样品中的LTA的形成的复合物接触所述测试线中的所述固定化抗LTA抗体时，所述样品中LTA的存在由可见颜色变化指示。 2.权利要求1的装置，其中所述奶样品已富集细菌细胞。 3.权利要求1或权利要求2的装置，其中所述奶样品来自奶牛的乳腺炎区域。 4.权利要求1至3中任一项的装置，其还包括芯吸垫，所述芯吸垫用于接收并保留通过所述测试线之后的样品。 5.权利要求1至4中任一项的装置，其中所述缀合物和所述测试线中的所述抗LTA抗体是单克隆抗体。 6.权利要求1至5中任一项的装置，其中所述缀合至所述抗LTA抗体的检测剂选自金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶和荧光分子。 7.权利要求6的装置，其中所述检测剂包含金属金的纳米颗粒或纳米壳。 8.权利要求1至7中任一项的装置，其中所述侧流装置是试纸条。 9.权利要求8的装置，其中所述试纸条的所述样品垫部分可浸入所述奶样品中。 10.权利要求1至7中任一项的装置，其中所述条状物容纳在盒内。 11.权利要求1至10中任一项的装置，其中所述样品垫包括用于从所述样品去除一种或多种组分的滤膜。 12.权利要求11的装置，其中通过所述样品垫的滤膜从所述样品去除的一种或多种组分是细胞、细胞材料、脂肪或颗粒物质。 13.权利要求1至12中任一项的装置，其还包含基本上垂直于所述样品沿所述条状物流动的方向定位的对照线。 14.权利要求13的装置，其中所述缀合物垫还包含对革兰氏阳性细菌非特异性的抗体，所述抗体与检测剂缀合以形成第二抗体缀合物，使得在操作中所述样品从所述样品垫流至所述缀合物垫并动员第二抗体缀合物，所述第二抗体缀合物通过所述测试线而没有反应性并穿过所述对照线。 15.权利要求14的装置，其中沉积在所述对照线处的是能够在所述动员的第二抗体缀合物穿过所述对照线时与所述第二抗体缀合物结合的抗体，所述对照线处的结合由可见颜色变化指示。 16.权利要求14或权利要求15的装置，其中所述第二抗体缀合物中的抗体来自除所述奶样品来源物种之外的动物物种。 17.权利要求14至16中任一项的装置，其中与所述第二抗体缀合物中的抗体缀合的检测剂选自金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶和荧光分子。 18.权利要求17的装置，其中与所述第二抗体缀合物中的抗体缀合的检测剂包含金属金的纳米颗粒或纳米壳。 19.权利要求1至18中任一项的装置，其中所述条状物由硝化纤维形成。 20.权利要求1至19中任一项的装置，其中所述奶样品来自选自犬科动物、猫科动物、马科动物、山羊动物、绵羊动物或牛科动物的动物。 21.权利要求1至20中任一项的装置，其中所述奶样品来自牛科动物。 22.用于检测来自动物的奶样品中的作为乳腺炎革兰氏阳性菌标识符的脂磷壁酸(LTA)的方法，所述方法包括使用权利要求1至21中任一项的装置。 23.用于检测作为乳腺炎革兰氏阳性细菌标识符的脂磷壁酸(LTA)的方法，所述方法包括使来自动物的奶样品与包含已与检测剂缀合的抗LTA抗体的缀合物接触，其中在所述抗LTA缀合物和所述样品中革兰氏阳性细菌上存在的LTA之间形成抗体‑抗原复合物；用抗LTA抗体捕获所形成的抗体‑抗原复合物；并检测所捕获的复合物。 24.权利要求23的方法，其中所述奶样品已富集细菌细胞。 25.权利要求23或权利要求24的方法，其中所述缀合物中用于捕获所述抗体‑抗原复合物的所述抗LTA抗体是单克隆抗体。 26.权利要求23至25中任一项的方法，其中缀合至所述抗LTA抗体的所述检测剂选自金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶和荧光分子。 27.权利要求23至26中任一项的方法，其中所述检测剂包括金属金的纳米颗粒或纳米壳。
说明书全文	用于检测乳腺炎奶牛牛奶中病原体的侧流测定技术领域 [0001] 本发明涉及基于富集的侧流(LF)测试，用于直接检测从乳腺炎奶牛的各个区域收集的牛奶样品中的目标革兰氏阳性细菌。背景技术 [0002] 奶牛通常每天挤奶至少两次。大多数牛奶场都有足够的机器一次挤奶二十多头奶牛。挤奶机通过在乳头周围产生脉动真空来模仿小牛的动作，从而使牛奶从乳房中释放出来。 [0003] 牛奶通常在农场低温下储存在储奶桶或储奶筒仓中，时间不超过48小时。收集牛奶后，奶农再次挤奶之前，要彻底清洁储奶桶和不锈钢管道。 [0004] 牛奶每24或48小时由罐车从农场收集，这些罐车具有特殊的不锈钢车身，这些车身经过严格隔热以在运输到加工厂的过程中保持牛奶低温。奶罐车司机是经过认证的牛奶分级员，有资格在收集前评估牛奶。罐车司机根据温度、视觉和气味对牛奶进行分级，并在必要时拒绝牛奶。在泵送到罐车之前，从每个农场的收集中采集代表性样品。收集后，牛奶被运输到工厂现场并在加工前储存在冷藏筒仓中。 [0005] 牛奶样品在收集前从农场大桶中取样，并在到达工厂后从散装奶罐车中取样。在牛奶进入工厂加工区域之前，会对来自散装奶罐车的样品进行抗生素和温度测试。检测农场牛奶样品的乳脂、蛋白质、散装牛奶细胞计数和细菌计数。如果牛奶不符合质量标准，就会被拒绝。大多数农民根据他们的牛奶的质量和成分获得报酬。 [0006] 乳腺炎是由于微生物感染或物理创伤引起的乳腺和乳房组织的炎症。其仍然是全球奶牛最常见和代价最高的疾病。乳腺炎导致的经济损失发生在亚临床和临床疾病中。临床乳腺炎很明显，并且很容易通过乳汁或乳房异常或继发临床症状的出现来检测。目前对亚临床乳腺炎的诊断是根据间接测试的结果进行的，例如体细胞计数(SCC)、加州乳腺炎测试(CMT)或作为感染间接指标的乳汁电导率。通常，当诊断出乳腺炎时，会对奶牛进行挤奶，并通过乳房内输注用抗生素治疗受感染的区域。 [0007] 乳腺炎的早期检测可以改善治疗结果，检测革兰氏阳性菌的能力可以推动治疗决策。目前所有获得许可的乳房输液产品都标有治疗革兰氏阳性乳腺炎病原体(例如，葡萄球菌和链球菌)的标签。标识用于治疗革兰氏阴性乳腺炎病原体(例如，大肠杆菌)的抗菌剂较少。监管和环境压力继续导致减少广谱抗菌剂和/或毯式疗法在牛乳腺炎治疗中的使用的趋势。因此，准确、快速地诊断导致乳腺炎的病原性病原体以促进窄谱抗菌剂的针对性使用并确保治疗成功和积极结果变得越来越重要。期望将诊断工作集中在乳腺炎的早期诊断上(例如，基于临床体征、乳制品记录、SCC等)，然后确定病原学病原体以启动及时和适当的抗生素治疗。 [0008] 目前，乳腺炎的诊断通常依赖于(1)SCC作为感染的间接指标，以及(2)体外牛奶培养，这是一种基于实验室的病原体识别方法，通常需要在数天至数周的典型周转时间内运送奶样品。这两种方法都不能满足奶农或兽医早期检测和鉴定乳腺炎病原体的需要。因此，期望提供检测牛奶中乳腺炎病原体的即时检测以指导抗菌药物选择。特别是，革兰氏阳性标识诊断将满足客户需求并补充市场上的治疗选择，从而提供针对个体动物量身定制的更全面的客户解决方案。如果在第一次挤奶之后、下一次挤奶之前进行即时测试，将是期望的，以帮助确保从农场收集的牛奶的质量和成分，减少经济损失，同时改善治疗结果。 [0009] 发明概述 [0010] 脂磷壁酸(LTA)是几乎所有革兰氏阳性菌细胞壁层中存在的主要促炎结构。其在细菌感染、炎症和感染性休克的发生和进展中发挥着重要作用。本发明提供了一种侧流装置，用于检测动物奶样品中作为乳腺炎革兰氏阳性菌标识符的革兰氏阳性菌表面表达的LTA。该装置包括：a)条状物，其由能够使流体沿条状物的一部分毛细管流动的材料形成，b)样品垫，其靠近条状物一端，用于接收牛奶样品，c)缀合物垫，其位于条状物中，以便在操作中样品在毛细管作用下从样品垫通过条状物流到缀合物垫，并且动员缀合物垫中包含的缀合物，该缀合物包含已缀合至检测剂的抗LTA抗体，d)测试线，其包含沿着基本上垂直于样品沿条状物流动的方向的条带固定在条状物内的抗LTA抗体，使得当形成的包含固定化抗LTA抗体缀合物和样品中的LTA的复合物接触测试线中的固定化抗LTA抗体时，样品中LTA的存在由可见颜色变化指示。在一个实施方案中，条状物由硝化纤维形成。 [0011] 在一个实施方案中，奶样品已富集细菌细胞。在另一个实施方案中，奶样品来自奶牛的乳腺炎区域。 [0012] 在进一步的实施方案中，奶样品来自选自犬科动物、猫科动物、马科动物、山羊动物、绵羊动物或牛科动物的动物。在具体的实施方案中，奶样品来自牛科动物。 [0013] 在一个实施方案中，该装置还包括用于在穿过测试线和任选的对照线之后接收和保留样品的芯吸垫。 [0014] 在另一个实施方案中，缀合物和测试线中的抗LTA抗体是单克隆抗体。在一个实施方案中，与抗LTA抗体缀合的检测剂选自以下：金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶和荧光分子。在具体的实施方案中，检测剂包含金属金的纳米颗粒或纳米壳。 [0015] 在一个实施方案中，侧流装置是试纸条(dipstick)。在另一个实施方案中，试纸条的样品垫部分可浸入牛奶样品中。在一个实施方案中，试纸条的样品垫部分可浸入已富集细菌细胞的牛奶样品中。在该装置的进一步实施方案中，条状物容纳在盒内。 [0016] 在一个实施方案中，装置的样品垫部分包括用于从样品去除一种或多种组分的滤膜。在具体的实施方案中，通过样品垫的滤膜从样品中去除的一种或多种组分是细胞、细胞材料、脂肪或颗粒物质。 [0017] 在一个实施方案中，该装置还包括基本上垂直于样品沿条状物流动的方向定位的对照线。在另一个实施方案中，装置的缀合物垫部分还包括对革兰氏阳性细菌非特异性的抗体，其与检测剂缀合以形成第二抗体缀合物，使得在操作中样品从样品垫流至缀合物垫并动员第二抗体缀合物，该第二抗体缀合物通过测试线而没有反应性并穿过对照线。 [0018] 在一个实施方案中，沉积在装置的对照线处的是能够在动员的第二抗体缀合物穿过对照线时与该动员的第二抗体缀合物结合的抗体，在对照线处的结合由可见的颜色变化指示。在另一个实施方案中，第二抗体缀合物中的抗体来自除奶样品来源的物种之外的动物物种。 [0019] 在一个实施方案中，与第二抗体缀合物中的抗体缀合的检测剂选自以下：金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶和荧光分子。在具体的实施方案中，与第二抗体缀合物中的抗体缀合的检测剂包含金属金的纳米颗粒或纳米壳。 [0020] 本发明进一步提供了一种用于检测作为来自动物的奶样品中的作为乳腺炎革兰氏阳性菌标识符的脂磷壁酸(LTA)的方法，该方法包括使用根据上述任意实施方案所述的装置。在一个期望的实施方案中，奶样品已富集细菌细胞。 [0021] 本发明还提供了检测作为乳腺炎革兰氏阳性菌标识符的脂磷壁酸(LTA)的方法。该方法包括使来自动物的奶样品与包含已与检测剂缀合的抗LTA抗体的缀合物接触，其中在抗LTA缀合物和样品中革兰氏阳性细菌上存在的LTA之间形成抗体‑抗原复合物；用抗LTA抗体捕获形成的抗体‑抗原复合物；并检测捕获的复合物。在该方法的具体实施方案中，奶样品已富集细菌细胞。 [0022] 在该方法的另一个实施方案中，缀合物中用于捕获抗体‑抗原复合物的抗LTA抗体是单克隆抗体。 [0023] 在该方法的进一步实施方案中，与抗LTA抗体缀合的检测剂选自以下：金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶和荧光分子。在具体的实施方案中，检测剂包含金属金的纳米颗粒或纳米壳。 [0024] 在一个实施方案中，本发明的方法能够检测≥100CFU/mL的目标革兰氏阳性细菌。附图说明 [0025] 图1是本发明的侧流(LF)装置的示意图。 [0026] 图2是根据本发明的基于富集的LF测定的工作流程的一个实施方案的示意图。 [0027] 图3是显示用于鉴定乳腺炎奶牛中的病原体的常规诊断方法与本发明的即时诊断方法的比较的示意图。 [0028] 本发明的其他目的、方面、特征和优点将从以下描述中变得显而易见。 [0029] 然而应当理解，详细描述和具体实施例虽然指示了本发明的优选实施方案，但仅以示例的方式给出， [0030] 因为本发明精神和范围内的各种改变和修改将在详细描述中对本领域技术人员显而易见。 [0031] 发明详述 [0032] 定义 [0033] 在整个说明书中，除非上下文另有要求，否则词语“包括”、“包含”和“包含”将被理解为暗示包括所述的步骤或元素或者步骤组或元素组，但不排除任何其他步骤或元素或步骤组或元素组。 [0034] 术语“脂磷壁酸”及其缩写“LTA”在本文中可以互换使用。LTA是几乎所有革兰氏阳性菌细胞壁层中存在的主要促炎结构。其在细菌感染、炎症和感染性休克的发生和进展中发挥着重要作用。LTA是复杂的含糖基磷酸酯的聚合物，其经由脂质锚连接到革兰氏阳性细菌的细胞膜上。 [0035] 术语“抗体”，也称为“免疫球蛋白”，是免疫系统的Y形蛋白质，可特异性识别异物或抗原，例如细菌、酵母、寄生虫和病毒的组分。抗体“Y”的每个尖端都包含一个抗原结合位点，该位点对抗原上的特定表位(如革兰氏阳性细菌上存在的LTA)具有特异性，从而使这两个结构能够精确地结合在一起。当暴露于与该抗体特异性相互作用的抗原(例如,微生物或病毒抗原)时，给定抗体的产生会增加。因此，对来自受试者的样品中抗原特异性抗体的检测可以告知该受试者当前是否暴露于或之前已经暴露于给定微生物，如病毒、细菌、真菌或寄生虫。“抗体”通常包含Fc区的全部或一部分，并且还可以包含一个或多个抗原结合位点，以促进通过抗体特异性结合剂(如抗原或抗原肽)进行检测。抗体可以是例如IgG、IgE、IgD、IgM或IgA类型。在一个实施方案中，用于本文的装置和方法的抗体是单克隆抗体(mAb)。在一个实施方案中，本文使用的术语“抗体”可以包含Fc区的全部或一部分，或者替代性地，其可以仅包含抗体的抗原结合部分，如Fab片段。 [0036] 术语“蛋白质”是指氨基酸残基的聚合物及其变体以及合成的和天然存在的类似物。因此，这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基是合成的非天然存在的氨基酸(如相应的天然存在的氨基酸的化学类似物)的氨基酸聚合物，以及天然存在的氨基酸聚合物和其天然存在的化学衍生物。 [0037] 术语“抗原”是指具有能够刺激特异性免疫应答的独特表面特征或表位的分子。抗体(免疫球蛋白)是免疫系统响应抗原暴露而产生的。抗原可以是蛋白质、碳水化合物或脂质，但只有蛋白质抗原被归类为免疫原，因为碳水化合物和脂质本身不能引发免疫应答。 [0038] 抗体的“抗原结合位点”或“结合部分”是指免疫球蛋白分子中参与抗原结合的部分。抗原结合位点由重(“H”)链和轻(“L”)链的N端可变区(“V”)的氨基酸残基形成。重链和轻链的V区内的三个高度不同的延伸被称为“高变区”，其插入在称为“框架区”或“FR”的更保守的侧翼延伸之间。在抗体分子中，轻链的三个高变区和重链的三个高变区在三维空间中彼此相对排列以形成抗原结合表面。抗原结合表面与结合的抗原的三维表面互补，每条重链和轻链的三个高变区称为“互补决定区”或“CDR”。 [0039] 术语“纳米颗粒”是指尺寸为1‑200nm的均匀颗粒。 [0040] 术语“纳米壳”是指由核心和金属壳(通常是金)组成的纳米颗粒。 [0041] 侧流装置和试剂盒 [0042] 参考附图，图1示出了本发明的LF装置(1)。该装置(1)具有使来自受试者的体液样品进行毛细管流动的样品垫(2)、包括包含已缀合至检测剂的抗LTA抗体的可移动缀合物的缀合物垫(3)、膜(4)和用于接收和保持通过毛细管流从样品垫(2)行进并穿过结合物垫(3)和膜(4)的流体的芯吸垫(7)。显示了包含固定化抗LTA抗体的测试线(5)。条带(6)是阳性对照线。装置(1)还可以包括连接样品垫、缀合物垫和硝化纤维的粘合带或覆盖带(8)，以及背衬(未显示)。 [0043] 当液态奶样品沉积在样品垫(2)上或将样品垫(2)浸入液态奶样品中时，流体通过毛细管流动从样品垫(2)流向缀合物垫(3)，在其中样品与已与检测剂(未显示)缀合的抗LTA抗体接触。样品中革兰氏阳性菌表面大量表达的LTA将与缀合物垫(3)上的抗LTA缀合物反应形成复合物。流体动员形成的复合物并将其输送至测试线(5)。具体而言，样品中的任何LTA抗原与缀合物垫(3)处的抗LTA抗体缀合物之间形成的抗LTA抗体‑LTA抗原‑检测剂复合物穿过膜(4)迁移到测试线(5)，在其中复合的LTA被沉积在该处的抗LTA抗体固定。如果样品中存在LTA，检测剂在测试线(5)上的积累形成视觉信号，即则颜色发生变化，表明结果呈阳性。如果样品中不存在LTA，则缀合物不会固定在测试线(5)上，而是继续迁移至芯吸垫(7)。测试线(5)处未形成视觉信号表明样品对LTA呈阴性，这意味着样品对革兰氏阳性菌呈阴性，因为LTA在革兰氏阳性菌表面表达。 [0044] 在图1中的装置(1)的另一个实施方案中，缀合物垫(3)还包括对革兰氏阳性细菌不具有特异性的免疫球蛋白，其中免疫球蛋白与检测剂(未显示)缀合以形成第二抗体缀合物，使得在操作中奶样品从样品垫(2)流向缀合物垫(3)并动员第二抗体缀合物，其通过测试线(5)而没有反应性并穿过对照线(6)。在一个实施方案中，沉积在对照线处的是能够在移动的第二抗体缀合物穿过对照线(6)时与移动的第二抗体缀合物结合的抗体，在对照线(6)处的结合由可见的颜色变化指示。在一个实施方案中，第二抗体缀合物中的免疫球蛋白来自除奶样品来源的物种之外的动物物种。 [0045] 缀合物垫(3)、样品垫(2)和膜(4)之间存在物理重叠和接触，以允许LTA‑金缀合物复合物形成并适当流到测试条上。在一个实施方案中，该装置是试纸条，其中试纸条的缀合物垫、样品垫和膜由粘合带或覆盖带覆盖，并且容纳在长支撑卡(backing card)上，该长支撑卡为试纸条提供15mm长的手柄。 [0046] 在一个实施方案中，首先根据下文和图2中描述的富集方法使用富集培养基/肉汤对原料奶样品进行富集，其合适的配方显示在图2中并在实施例中公开。其基于从奶样品中富集细菌细胞至可检测水平，并随后通过革兰氏阳性特异性LF测试进行检测。在一个实施方案中，在挤奶前按照国家乳腺炎委员会(NMC)指南在无菌条件下收集来自牛乳腺炎区域的奶样品，与富集肉汤混合并在37℃下孵育约7小时。在一个实施方案中，在下一次挤奶(8‑12小时)之前，在根据本发明的LF测定测试等份的富集奶样品，以允许诊断和适当的抗生素治疗。 [0047] 如图2所示，在一个实施方案中，使用一次性移液管，将约200‑250μL等份的富集奶样品添加到试管中。接下来将侧流试纸条的样品垫部分(2)浸入试管中的富集奶样品中。然后开始流体流动，导致样品从样品垫迁移到相邻的缀合物垫(3)。 [0048] 在一个非限制性实施方案中，沉积到缀合物垫(3)上的是不同的金缀合物：1)与金颗粒缀合的抗LTA抗体；和2)与金颗粒缀合的非革兰氏阳性菌特异性的免疫球蛋白，如鸡IgY。金缀合的抗LTA抗体将与牛奶样品中存在的革兰氏阳性细菌LTA抗原形成复合物。形成的复合物沿着测试条移动并与抗LTA抗体形成复合物，该复合物在测试线(5)上的膜(4)上形成条纹。当抗LTA抗体‑LTA抗原复合物被捕获在敏化的测试线(5)上时，其累积导致形成清晰可见的粉红色/红色条带。对照线上的粉红色/红色条带确保测试正确进行。至于对照，在一个实施方案中，缀合物垫(3)上的鸡IgY金缀合物迁移穿过相邻的膜，其中其通过测试线(4)而没有反应性，并穿过其上沉积有驴抗鸡IgY的另一条线(对照线6)。鸡IgY‑金缀合物与该对照线结合，金胶体颗粒的累积形成可见的红线。 [0049] 图3显示了采用金标准细胞培养方法来鉴定病原体的用于检测乳腺炎的常规诊断方法与本发明的即时诊断方法的比较。如图所示，常规方法需要1‑5天才能识别病原体，然后才能及时采取适当的抗生素治疗。相比之下，本发明的即时侧流测试采用奶样品富集步骤，该步骤在一个实施方案中需要大约6‑7小时，并且在优选的实施方案(未描绘)中需要大约7‑7.5小时，并且该测试本身可以在大约10分钟内完成。这使得农民能够及时，例如在下次挤奶之前获得结果。这有助于确保从农场收集的牛奶的质量和成分，并减少经济损失。同时，其至少可以改善治疗结果，因为其指导抗菌药物的选择。 [0050] 本发明进一步提供了试剂盒，其包含本文所述的一个或多个LF装置以及使用该装置来检测作为测试样品中革兰氏阳性细菌指示物的LTA抗原的说明书。 [0051] 本发明的侧流装置检测革兰氏阳性菌表面大量表达的LTA。在一个方面，该侧流装置包括：a)条状物，其由能够使富集奶样品沿条状物的一部分毛细管流动的材料形成，b)样品垫，其靠近条状物一端，用于接收富集奶样品，c)缀合物垫，其位于条状物中，以便在操作中富集奶样品在毛细管作用下从样品垫通过条状物流到缀合物垫，并且动员缀合物垫中包含的缀合物，该缀合物包含已缀合至检测剂的抗LTA抗体，d)测试线，其包含沿着基本上垂直于样品沿条状物流动的方向的条带固定在条状物内的抗LTA抗体，使得当包含固定化抗LTA抗体缀合物和富集奶样品中的LTA的形成的复合物接触测试线中的固定化抗LTA抗体时，富集奶样品中LTA的存在由可见颜色变化指示，e)对照线，其位置基本垂直于富集奶样品沿着条状物的流动方向，当样品被加载到样品加载区域时，对照区域与样品流体连通，和f)芯吸垫，其用于接收和保留通过检测带后的样品。 [0052] 用于本发明的抗LTA抗体可以针对来自革兰氏阳性细菌物种的脂磷壁酸产生。在一方面，抗LTA抗体能够与细菌感染样品中的革兰氏阳性菌脂磷壁酸特异性反应。革兰氏阳性细菌的特征在于革兰氏染色过程中的蓝紫色反应。颜色反应是由结晶紫(主要革兰氏染色染料)与碘媒染剂复合引起的。当使用脱色剂时，由于穿过细胞壁的孔的关闭，观察到结晶紫/碘复合物缓慢脱水。 [0053] 在一个实施方案中，抗LTA抗体是针对来自表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis)的脂磷壁酸产生的。在另一个实施方案中，抗LTA抗体是针对来自酿脓链球菌(Streptococcus pyogenes)的脂磷壁酸产生的。在又一个实施方案中，抗LTA抗体是针对来自枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)的脂磷壁酸产生的。 [0054] 针对来自革兰氏阳性菌的脂磷壁酸而产生的抗LTA抗体可商购获得。例如，小鼠单克隆抗LTA抗体(IgG1类)可从QED Biosciences，Inc.，San Diego，CA商购获得(目录号：15711)。其针对表皮葡萄球菌Hay菌株(ATCC#55133)而产生，并与表皮葡萄球菌Hay菌株以及表皮葡萄球菌临床菌株(I、II和III型)、金黄色葡萄球菌菌株5和8、酿脓链球菌、粪链球菌(Streptococcus fecaelis)和变形链球菌(Streptococcus mutans)的脂磷壁酸发生反应。此外，属于IgG1类的针对革兰氏阳性菌的小鼠单克隆抗体[克隆G43J](ab267414)可从Abcam(Cambridge,UK)商购获得。据信Abcam抗体是针对来自枯草芽孢杆菌的脂磷壁酸而产生的。本发明人还使用本领域众所周知的方法成功地产生了针对来自酿脓链球菌的脂磷壁酸的单克隆抗体。此外，还成功地使用重组方法克隆了针对来自酿脓链球菌的脂磷壁酸的抗体的抗原结合区(Fab片段)。来自酿脓性链球菌的脂磷壁酸可以例如从Sigma Aldrich(目录号L3140‑5MG)购得。这些都是可用于本发明的抗LTA抗体的非限制性实例。 [0055] 用于将捕获实体如抗LTA抗体固定在固相上的合适方法包括离子相互作用、疏水相互作用、共价相互作用等。就将缀合物固定在缀合物垫上而言，通常使用类似于喷枪的专用喷雾器将它们喷到缀合物垫上。试剂在缀合物垫上干燥。同样，使用精密分配机将测试线和对照线划到测试条(例如硝化纤维素)上。蛋白质与硝化纤维素结合并以这种方式固定。 [0056] 样品垫不仅接收用于测试的奶样品，而且去除其中否则可能阻碍流体通过条状物的毛细管流动或对测试线处形成的LTA抗原‑抗LTA抗体复合物的检测产生不利影响的组分。可以通过样品垫去除的奶组分包括细胞、细胞材料、脂肪和颗粒物质。为了检测来自受试者的奶样品中的LTA抗原，样品垫充当奶过滤垫，其去除否则可能会干扰样品沿条状物的流动的奶组分如细胞和脂肪。 [0057] 发现硝化纤维是制造条状物的合适材料。其他材料也可以是合适的，只要它们允许期望的毛细管流速并且能够实现合适的检测灵敏度，如PVDF膜、聚乙烯膜、尼龙膜或类似类型的膜。 [0058] 在一个实施方案中，奶样品来自动物，例如但不限于牛科动物。在具体的实施方案中，奶样品来自奶牛。在一个实施方案中，奶样品来自奶牛的乳腺炎区域。 [0059] 检测剂是当在测试线或对照线积累时提供可检测变化的任何试剂。检测剂在测试线上的积累表明奶样品中存在革兰氏阳性菌表面大量表达的LTA抗原。实际上，检测剂直接或间接与抗LTA抗体缀合以形成包含在缀合物垫中的缀合物，该缀合物能够与来自样品的LTA抗原结合。在一些实施方案中，缀合物垫还可以包括对革兰氏阳性细菌非特异性的第二抗体。第二抗体直接或间接缀合至检测剂，以便在操作中，样品动员第二抗体缀合物，其通过检测带而不发生反应并穿过对照线，在对照线上沉积有能够与动员的第二抗体缀合物中存在的抗体结合的抗体。当第二抗体缀合物穿过对照线并且沉积在对照线处的抗体与其结合时，结合通过可见的颜色变化来指示。 [0060] 检测剂的累积导致测试线和对照线处可见的颜色变化或可观察到的荧光，或任何其他合适的变化。在本发明的各种具体考虑的实施方案中，与缀合物垫上的抗LTA抗体缀合的检测剂选自金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶或荧光分子。在具体实施方案中，与抗LTA抗体缀合的金属纳米颗粒或金属纳米壳选自金颗粒、银颗粒、铜颗粒、铂颗粒、镉颗粒、复合颗粒、金空心球、金包被的二氧化硅纳米壳或二氧化硅包被的金壳。在一个期望的实施方案中，与抗LTA抗体缀合的检测剂包括金属金的纳米颗粒或纳米壳。 [0061] 在本发明的其他具体考虑的实施方案中，与缀合物垫上的第二抗体(对革兰氏阳性细菌非特异性)缀合的检测剂选自金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶或荧光分子。在具体的实施方案中，与第二抗体缀合的金属纳米颗粒或金属纳米壳选自金颗粒、银颗粒、铜颗粒、铂颗粒、镉颗粒、复合颗粒、金空心球、金包被的二氧化硅纳米壳和二氧化硅包被的金壳。 [0062] 在一个实施方案中，认为与缀合物垫上的抗LTA抗体缀合的检测剂可以与缀合物垫上的第二抗体缀合的检测剂相同或不同。在一个期望的实施方案中，与抗LTA抗体缀合的检测剂和与第二抗体缀合的检测剂都是金纳米颗粒，以产生胶体金缀合物。 [0063] 方法 [0064] 本发明进一步提供了一种用于检测作为来自动物的奶样品中的乳腺炎革兰氏阳性菌标识符的脂磷壁酸(LTA)的方法，该方法包括使用根据上述任意实施方案所述的装置。在一个期望的实施方案中，奶样品已富集细菌细胞。在一个实施方案中，奶样品来自奶牛。在一个具体的实施方案中，奶样品来自根据国家乳腺炎委员会(NMC)指南在无菌条件下采集的牛乳腺炎区域。优选地，该方法在第一次挤奶之后但在下一次挤奶之前进行。通常，奶牛每天挤奶2‑3次。 [0065] 本发明还提供了检测作为乳腺炎革兰氏阳性菌标识符的脂磷壁酸(LTA)的方法。该方法包括使来自动物的奶样品与包含已与检测剂缀合的抗LTA抗体的缀合物接触，其中在抗LTA缀合物和样品中革兰氏阳性细菌上存在的LTA之间形成抗体‑抗原复合物；用抗LTA抗体捕获形成的抗体‑抗原复合物；并检测捕获的复合物。在该方法的具体的实施方案中，奶样品已富集细菌细胞，例如通过使用图2中所示和实施例部分中描述的富集方法和富集肉汤。考虑到许多临床奶样品中的细菌负载较低(约100CFU/mL)，因此期望包括奶样品制备步骤，其中首先对奶样品进行细菌细胞富集。奶样品富集方法使得能够检测临床和亚临床乳腺炎病例。 [0066] 在该方法的一个实施方案中，缀合物中用于捕获抗体‑抗原复合物的抗LTA抗体是单克隆抗体。 [0067] 在该方法的进一步实施方案中，与抗LTA抗体缀合的检测剂选自以下：金属纳米颗粒或纳米壳、非金属纳米颗粒或纳米壳、酶和荧光分子。在具体实施方案中，检测剂包含金属金的纳米颗粒或纳米壳。 [0068] 本发明参考以下实施例进一步描述。 [0069] 应当理解，所要求保护的本发明不旨在以任何方式受到这些示例的限制。实施例 [0070] 实施例1‑奶样品富集方法 [0071] 通常，单独的侧流测试不足以检测约100CFU/mL的低细菌负载，这与某些乳腺炎奶样品有关。在此背景下，期望适合乳制品运营和人员日常活动的奶样品制备方法。 [0072] 本实施例描述了富集方法的开发。其基于从奶样品中富集细菌细胞至可检测水平，并随后通过革兰氏阳性特异性LF测试进行检测。预计将在挤奶前按照NMC指南收集来自奶牛乳腺炎区域的牛奶样品，与富集肉汤混合并在37℃下孵育7小时。最后，在下一次挤奶(8‑12小时)之前，在LF测试中对等份富集牛奶样品进行测试，以便进行诊断和适当的抗生素治疗。 [0073] 评估了五种生长培养基：(1)Todd‑Hewitt肉汤(THB)、(2)含粘菌素和萘啶酸的THB(LIM肉汤)、(3)脑心浸液(BHI)肉汤、(4)营养肉汤和(5)胰蛋白酶大豆肉汤(TSB)。通过在37℃下孵育不同比例的牛奶样品和不同的生长培养基来测试牛奶富集方法。孵育7小时后，1.0mL牛奶样品和1.0mL THB的混合物支持更高的细菌生长，但也在LF试纸条上生成不期望的高非特异性结合(NSB)。其他四种培养基也观察到这种高NSB，但它们支持相对较低的细菌生长。当从THB中去除牛心浸液组分时，NSB被显著消除，并且细菌生长被证明与在THB中观察到的相当。 [0074] 基于上述发现，配制了减轻NSB的测试专用富集肉汤，其中含有来自Millipore Sigma的特殊蛋白胨(20.0g/L)、右旋糖(2.0g/L)、氯化钠(2.0g/L)、磷酸二钠(Disodium phosphate)(0.4g/L)、磷酸氢二钠(Sodium Phosphate dibasic)(0.4g/L)、萘啶酸钠盐(0.03g/L)和碳酸钠(2.5g/L)。所有培养基组分都可以从商业来源容易地获得。 [0075] 实施例2‑关键试剂的选择 [0076] 为当前测定开发选择的关键试剂优选地检测奶样品中的大范围的目标革兰氏阳性细菌或相关抗原。选择三种不同的细菌生物分子来生成单克隆抗体(mAb)。根据其与目标革兰氏阳性细菌的反应性，选择商业抗脂磷壁酸(LTA)mAb(QED Bioscience Inc.，CA)用于LF测定开发(表1)。 [0077] 表1.靶向试剂和抗LTA单克隆抗体的选择标准的综述 [0078] [0079] [0080] 选择可从QED Biosciences,Inc.,San Diego,CA商购的单克隆抗LTA抗体(IgG1类)(目录号：15711)用于LF测试开发。该抗体是针对表皮葡萄球菌Hay菌株(ATCC#55133)产生的。宿主物种是小鼠。抗LTA抗体与表皮葡萄球菌Hay菌株以及表皮葡萄球菌临床菌株(I、II和III型)、金黄色葡萄球菌菌株5和8、酿脓性链球菌、粪链球菌和变形链球菌的脂磷壁酸发生反应。其不与金黄色葡萄球菌的肽聚糖或肽聚糖‑鼠李糖发生反应，也不与肺炎球菌的多糖发生反应。该抗体不与大肠杆菌(E.coli)或乙型流感嗜血杆菌(H.influenzae type B)发生交叉反应。 [0081] 实施例3‑初步侧流试纸条的开发 [0082] 本实施例描述了本发明的装置和方法的一个实施方案。选择基于侧流的夹心免疫测定形式。该测试由层压到粘性背衬卡上的硝化纤维素膜组成。硝化纤维素膜的两端与相邻的缀合物垫和相邻的吸收垫重叠。样品垫与缀合物垫重叠。将所有试剂沉积到相应的膜上后，将卡切成约5mm宽的条状物。 [0083] 测试条结构由表2中公开的组件组成。使用实施例4中描述的测试方案，对已根据实施例1中描述的方法和优选富集培养基富集细菌细胞的临床奶样品进行免疫测定。 [0084] 表2.使用抗LTA mAb(QED Bioscience Inc.，CA)的侧流试纸条 [0085] [0086] [0087] 可以使用标准抗体与胶体金的缀合方法来制备缀合物。将抗LTA抗体与期望pH值的缓冲液混合。将胶体金(nanoComposix,San Diego,CA)添加至该抗体并混合5‑10分钟。将第二种碱性缓冲液添加至缀合物以提高pH值，并通过添加BSA来封闭缀合物。 [0088] 为了制备对照缀合物，将胶体金调节至期望pH值。将20至100μg/ml之间的饱和量蛋白质(例如，鸡IgY)添加至金并孵育10分钟。然后将BSA阻断剂添加至金并再孵育10分钟。将包含BSA和蔗糖的稳定剂缓冲液添加到缀合物中。 [0089] 将缀合物在临界、优化的OD下与由去污剂、缓冲液、蔗糖和BSA组成的缀合物稀释剂混合在一起。用喷气喷雾器将缀合物喷到缀合物垫上。 [0090] 测试线试剂和对照线试剂、抗LTA抗体和驴抗鸡IgY分别在含有稳定糖的沉积缓冲液中稀释至优化的关键(critical)浓度。使用能够喷射微量体积的高精度流体处理器将试剂沉积到硝化纤维上。将卡片存储在<30％的相对湿度下。 [0091] 实施例4‑测试方案 [0092] 将1.0mL牛奶样品添加到含有1.0mL富集肉汤的刻度管中。 [0093] 将装有牛奶和富集肉汤混合物的试管在常规细菌培养箱中于37℃孵育7小时(不需要专门的牛奶样品制备装置)。 [0094] 孵育后，将LF试纸条放入富集牛奶样品中，测试富集牛奶样品(200‑250μL)。 [0095] 富集牛奶样品中革兰氏阳性菌表面大量表达的LTA抗原会迁移到缀合物垫上，并与缀合有胶体金的抗LTA抗体发生反应。抗LTA抗体缀合物和样品中的LTA之间形成复合物。形成的复合物迁移穿过硝化纤维，其中复合的LTA被沉积在测试线上的抗LTA抗体固定。如果存在LTA抗原，则检测线上胶体金颗粒的累积形成可见的红线，表明结果为阳性。如果样品中不存在LTA抗原，则金缀合物不会固定在测试线上，而是继续迁移到吸收垫上。测试线上没有形成红线表明样品的LTA呈阴性，这意味着不存在革兰氏阳性菌。在一个实施方案中，沉积到缀合物垫上的第二缀合物(对照缀合物)由缀合至胶体金的鸡IgY组成。对照缀合物迁移穿过硝化纤维，并通过抗鸡IgY抗体固定在第二条反应线(对照线)上。胶体金对照缀合物颗粒的累积形成红色对照线。对照线是程序对照，表明测试已正确执行且正确流动。 [0096] 10分钟后目视读取测试条。 [0097] 实施例5‑样品收集 [0098] 样品组由以下组成，这些样品是从不同的牛奶场在冰上过夜接收的： [0099] ·含有≥100CFU/mL的目标革兰氏阳性菌的临床牛奶样品(n＝108)衍生自奶牛的感染区域 [0100] ·清洁且培养阴性的牛奶样品(n＝103)衍生自奶牛的无乳腺炎区域 [0101] 通过直接培养，然后进行MALDI‑ToF分析，对每个临床牛奶样品中存在的一种或多种病因学乳腺炎病原体进行计数和鉴定。 [0102] 实施例6‑测试结果‑基于富集的侧流测定的检测限(LoD) [0103] 使用添加了不同浓度(CFU/mL)的每种目标革兰氏阳性细菌的牛奶样品来估计α原型测试的检测限(LoD)。每个富集样品均经过10次重复测试，10次重复中有9次检测呈视觉阳性时的浓度(CFU/mL)被认为是针对每种目标细菌的特异性LoD。 [0104] 表3.基于富集的侧流测定的LoD估计 [0105] [0106] 实施例7‑初步诊断性能的估计 [0107] 在37℃富集7小时后，在三个不同批次的LF试纸条上测试每个富集牛奶样品的等分试样。10分钟后，记录目视结果。使用培养结果为参考： [0108] ·测试条批次#1和2在105/108临床牛奶样品中检测到目标革兰氏阳性细菌。诊断灵敏度和特异性估计分别为97.2％(95％ CI:92.1‑99.4％)和95.1％(95％ CI:89.0‑98.4％)(表4)。 [0109] ·测试条批次#3产生104/108阳性结果。诊断灵敏度和特异性估计分别为96.3％(95％ CI:90.8‑99.0％)和96.1％(95％ CI:90.4‑98.9％)(表4)。 [0110] 批次#1和批次#2观察到3个假阴性结果和5个假阳性结果；而批次#3观察到四个假阴性和四个假阳性结果。 [0111] 表4.基于富集的侧流测定的灵敏度和特异性的估计 [0112] [0113] 实施例8‑仪器 [0114] 在一个实施方案中，该LF测试的结果解释基于技术人员的目视评估。其设计目的是设置简单、操作时间有限且易于读取。该试剂盒不需要复杂的侧流阅读器和相关软件，尽管LF测试可以基于侧流阅读器对测试结果的评估(如果期望)。然而，牛奶样品富集步骤需要能够维持37℃温度的简单细菌培养箱(例如，加热块)。进行农场养殖的牛奶场在乳品办公室或乳品实验室中设有这些培养箱。在一个实施方案中，可以为那些没有培养箱的牛奶场提供便携式培养箱。