在世界各地的奶牛场中，牛乳腺炎是一种严重和花费高的疾病。 这种疾病通常在哺乳期的各个阶段都有发病的可能性，而50％的牛乳 腺炎是在哺乳期的早期发病。在哺乳期的各个阶段，乳腺的分泌物都 是一种适宜细菌生长的良好的培养基，当外界的细菌成功的穿过乳头 和导管进入乳腺组织时，就会造成乳腺内感染发炎。
临床的牛乳腺炎的病例是由环境中细菌引起的，而且细菌牛乳腺 炎的发病率最近几年的总的百分数有急剧上升的趋势。细菌是一种存 在于环境中的微生物，。但是在奶牛产奶后，由于乳腺孔是开放的， 极易引起乳腺的细菌的感染，进而引起牛乳腺炎的发生。革兰氏阴性 菌是使牛奶产量减少，损害牛的健康，引起奶牛死亡的主要原因，而 革兰氏阴性菌细菌引起牛乳腺炎的病例中又以大肠杆菌(E.coli)所 引起的临床病例最为常见，大约60％的牛乳腺炎是由大肠杆菌 (E.coli)所引起的。
目前国内外对牛乳腺炎的治疗是抗生素和疫苗，然而抗生素治疗 牛乳腺炎存在诸多不利的因素：(1)易出现抗药性和耐药性；(2)单 一药物抗菌谱不够广，影响疗效；(3)易造成牛奶中药物残留及奶牛 体内药物蓄积，危及人类健康；(4)易引起其它的副作用，如奶牛的 肠道菌群失调，影响食欲、胃肠功能以及生产性能等。基于此，许多 年以来全世界的畜牧兽医研究人员一直致力于一种安全，有效，价格 低廉的预防和治疗牛乳腺炎的药物的研究和开发。经过广泛的试验， 各种牛乳腺炎疫苗在世界各地相继被开发和投入到生产使用中。这些 牛乳腺炎疫苗均是采用传统的生产疫苗的方法，如加热、化学灭活(甲 醛或酚)和照射等制备的，而这些方法均可对免疫原性造成一些损害， 对于正确地刺激动物免疫系统必需的重要的表位/抗原有伤害。同时 又产生一些替代的或“非天然”的疫苗抗原，这些化学物质必须从疫 苗中除去，否则会造成环境健康和安全性的问题。同时这些用传统方 法制备的牛乳腺炎疫苗的内毒素含量高，副作用大。
利用疫苗防治牛乳腺炎最常见的一个问题是细菌抗原的变异，即 细菌利用免疫系统的抗体只识别非常特异的抗原并依次接合到细胞 表面的特性，细菌不停地改变它们的表面结构，使得免疫系统在产生 新的抗体时总是落后于细菌，造成了牛乳腺炎疫苗在第一年时效果良 好，在第二年却不幸的失败。解决上述问题是提高免疫系统的能力， 包括：(1)识别细菌不易改变的部分；(2)选择革兰氏阴性细菌(大 肠杆菌、沙门氏菌和白喉杆菌等)的通用结构。在对牛乳腺炎疫苗的 研究开发的过程中，人们发现在所有的革兰氏阴性菌的细胞壁的内层 都存在一个区域，内含通用核心通用抗原，在细菌生长的最快的时期 (对数生长期)，这个部位暴露于免疫系统，且它含有革兰氏阴性菌 的内毒素部分-脂质A，这样可以通过抗体结合内毒素达到减少内毒 素的作用。利用这个原理，J5大肠杆菌(E.Coli)是最初采用核心 通用抗原来制备牛乳腺炎疫苗。但是由于J5大肠杆菌(E.Coli)疫 苗制备时采用的是传统的制备疫苗的方法，仍然有传统方法所有的一 些弊端，并没有充分发挥出核心通用抗原大肠杆菌(E.Coli)疫苗的 优势。
在微生物学的研究中，研究人员发现，革兰氏阴性菌在蔗糖-6 果糖转移酶(sacB)存在，在蔗糖为底物诱导的情况下，可以杀灭自 身，这种自杀方式并不需要改变自身的外膜蛋白(疫苗抗原或表位)， 同时用来诱发这种灭活性质的化学物质是无毒的蔗糖。

本发明的目的在于提供一种牛乳腺炎疫苗的制备方法，即利用含 有核心通用抗原的革兰氏阴性菌，通过含有蔗糖-6果糖转移酶(sacB) 基因质粒的转化，在蔗糖的诱导下，使革兰氏阴性菌自杀，收集这些 含有核心通用抗原的革兰氏阴性菌，制备疫苗的方法，它对疫苗的免 疫原性没有损害，不会伤害正确地刺激动物免疫系统必需的重要的表 位/抗原，不会产生替代的或非天然的疫苗抗原，所用的化学诱导物 质是食用的无毒的蔗糖，不必从疫苗中除去这些诱导物。同时可以大 大减少疫苗中的内毒素，减少死亡率，刺激免疫系统抵御全部的大肠 杆菌、沙门氏菌等革兰氏阴性菌所引起的牛乳腺炎。
本发明牛乳腺炎疫苗的制备方法包括以下步骤：
a.提取含有蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因的质粒；
b.制备革兰氏阴性菌感受态细胞；
c.转化步骤a中提取含有的蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因的 质粒进入步骤b所制备的革兰氏阴性菌感受态细胞中；
d.鉴定，获得转化的革兰氏阴性菌；
e.已转化的革兰氏阴性菌在细菌培养基中生长直到浓度达到 105-1012CFU/ml；
f.收集步骤e中的已转化的革兰氏阴性菌，室温，400g，离心 20分钟；
g.弃上清液，用1-10％(体积比)的蔗糖和清洗物质清洗疫苗， 重悬浮，在37℃下，混合20分钟，诱导自杀性蔗糖-6果糖转移 酶(sacB)基因表达，混合物在400g，4℃下再次离心，弃上清 液；
h.重复步骤g两次；
i.疫苗在清洗物质中被悬浮，按佐剂和疫苗体积比为3∶2的比 例加入佐剂，使疫苗每一次免疫量的浓度为8.0×105CFU或以上。
本发明的优点是本发明牛乳腺炎疫苗的制备方法，由于采用核心 通用抗原与自杀性革兰氏阴性菌结合的制备方法，不会对疫苗的免疫 原性造成损害，不会伤害正确地刺激动物免疫系统必需的重要的表位 /抗原，不会产生替代的或非天然的疫苗抗原，所用的化学诱导物质 是食用的无毒的蔗糖，不必从疫苗中除去这些诱导物。同时制备的疫 苗大大减少了传统制备疫苗方法象加热，或化学灭活(甲醛或酚)及 照射可能产生的致癌疫苗的机会。同时可以大大减少疫苗中的内毒 素，减少副作用，刺激免疫系统抵御全部的大肠杆菌，沙门氏菌等革 兰氏阴性菌所引起的牛乳腺炎，进而有效的预防牛乳腺炎的发生。

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述。应理解，这些实施 例仅用于说明本发明，而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未 注明具体条件的方法，通常按常规条件中所述的条件，或按制造厂商 所建议的条件。
实施例1： 1.提取含有蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因的质粒
 购买一株大肠杆菌(E.coli)DH5F’(ATCC #77281)，此菌株含 有质粒pHSS21，它具有潮霉素抗性的标记和蔗糖-6果糖转移酶 (sacB)基因，因而具有蔗糖的敏感性。参看(Schweizer，H.P.(1992) 使用Coli1型载体和带有便携oriT和sacB标记物的暗盒进行青绿色 假单胞菌等位基因交换，分子微生物学6(9)1195-1204)。利用常规 的分子生物学方法，提取质粒pHSS21，做为下一步转化所用的质粒。 2.制备大肠杆菌(E.coli)J5感受态细胞
(a)接种大肠杆菌(E.coli)J5到40ml的含有卡那霉素的TSA 培养基上，在37℃培养条件下过夜培养；
(b)第二天，接种过夜的大肠杆菌(E.coli)J5培养物在40mlLB 培养基的烧瓶中，过夜培养，直到OD600达到0.06；
(c)在37℃的水浴摇床中温育直到OD600达到0.6；
(d)在冰上冷却烧瓶，收集细胞，在4℃，4000g，离心15分 钟；
(e)弃去上清液，在40ml冷却的双重蒸馏水中重悬沉淀，在4 ℃，4000g，离心15分钟；
(f)弃去上清液，在20ml冷却的双重蒸馏水中重悬沉淀，在4 ℃，4000g，离心15分钟；
(g)弃去上清液，在5ml冷却的10％的甘油中重悬沉淀，在4 ℃，4000g，离心15分钟；
 (h)弃去上清液，在1ml冷却的10％的甘油中重悬沉淀，在4 ℃，4000g，离心15分钟；
 (i)每50ul一等份贮存在离心管中，放在冰上5分钟，然后放 在冰箱中冷冻保藏。 3.转化步骤1中提取含有蔗糖-6果糖转移酶(sacB)基因的质粒进 入步骤2所制备的大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞中
(a)在室温下轻轻的融化细胞，放在冰上；
(b)将下列4瓶细胞和质粒混合；
(1)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2ml 具有卡那霉素抗性pHSS21质粒；
(2)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2ml 具有氨卡青霉素抗性pUC19质粒；
(3)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2ml 的重蒸无菌水；
(4)仅仅40ml的大肠杆菌(E.coli)J5感受态细胞； 其中(2)(3)(4)为对照实验组。
(c)分别同时转移上述4瓶混合物到4个在冰上预冷电穿孔的 小槽中；
(d)在200欧姆的电阻下，用1.8千伏电压电穿孔5微秒；
(e)迅速加1ml室温下的培养基SOC到电穿孔的小槽中，轻轻 地，但迅速地重悬浮细胞；
(f)转移重悬浮的细胞到4个新的离心管中，在37℃，水浴摇 床中温育1小时；
(g)将上述转化细胞涂抹平铺在合适的选择性培养基中，在37 ℃下温育过夜；
(1)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和 2mlpHSS21质粒的转化细胞涂抹平铺在具有卡那霉素抗性的 TSA培养基中；
(2)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2mlpUC19 质粒的转化细胞涂抹平铺在具有氨卡青霉素抗性的TSA培养基 中；
(3)40ml大肠杆菌(E.coli)J5的感受态细胞和2ml 的重蒸无菌水的转化细胞分别涂抹平铺在具有卡那霉素抗性和 氨卡青霉素抗性的TSA培养基中；
(4)40ml的大肠杆菌(E.coli)J5感受态细胞的转化细 胞分别涂抹平铺在具有卡那霉素抗性和氨卡青霉素抗性的TSA 培养基中。 4.利用蔗糖敏感性检测转化细胞
1.分别加入3个怀疑是转化细胞的大肠杆菌(E.coli)克隆到3 个50ml含有卡那霉素的TSB的培养基中，37℃下温育20小时；
2.转移1ml过夜的培养物到50ml含有卡那霉素的TSB的培养基 中；
3.记录培养物的OD580值，把培养物放在37℃的水浴摇床中培养；
4.当OD580增加10倍时，在2000g，离心10分钟；
5.弃上清液，在13ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的缓冲液中重悬 浮沉淀；
6.在2000g，离心10分钟，沉淀菌体；
7.在10ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的缓冲液中重悬浮沉淀。
8.加34.5ul样品到1ml的10mM Na3PO4(PH7.4)的缓冲液中， 测培养物的OD620值。
9.调整所得到的液体培养物达到1×107CFU/ml；
10.取10ml样品，用10mM Na3PO4(PH7.4)的缓冲液稀释10倍， 加入蔗糖使蔗糖的最终浓度为1.0，2.5，5.0，10.0％。
11.在37℃培养，在30，60，90，120分钟时取样，放在TSB平 板中检测，若没有克隆菌落生长，可初步断定是转化细胞。
12.取上述初步判定的对数生长期的转化细胞，在500ml卡那霉 素的TSB培养基中培养；
13.在摇床中温育上述培养物，直到培养物达到一个稳定生长状 态，即可见光的吸收密度值OD600不再增加；
14.在每个样品中加入蔗糖使蔗糖的最终浓度为1.0，2.5，5.0， 10.0％；
15.在37℃的水浴摇床中培养。
16.在30，60，90，120分钟时取样0.25ml加入2ml的含有卡 那霉素的浓度为35g/ml的TSB培养基中。
17. 37℃，温育样品过夜，第二天测样品的可见光的吸收密度 值OD600，进一步判断转化细胞。
结果表明：在转化细胞生长到对数生长期后，加入诱导自杀 的蔗糖的最终浓度范围是1-10％，优选的蔗糖最终的浓度范围是 2.5％-5.0％，制备疫苗的最佳的时间是加入蔗糖以后30-120分 钟，优选的制备疫苗的最佳的时间是加入蔗糖以后60-90分钟。 5.挑选上述判定的已转化的大肠杆菌(E.coli)J8，在胰酶解酪 蛋白-大豆培养基中生长，当转化的大肠杆菌(E.coli)J8浓度达 到105-1012； 6.收集步骤5中的J8大肠杆菌，室温，400g，离心20分钟； 7.弃上清液，用2.5-5％(体积比)的蔗糖和无菌的非热的盐，重 悬浮疫苗，在37℃下，混合20分钟，混合物在400g，4℃下再次 离心，弃上清液； 8.重复步骤7两次； 9.疫苗在无菌的非热的盐被悬浮，按佐剂和疫苗体积比为3∶2的 比例加入佐剂，使疫苗每一次免疫量的浓度为6.0×109CFU。
为了更好地理解本发明的实质，下面结合具体的试验来说明本发 明牛乳腺炎疫苗的制备方法在减少内毒素、副作用、抗革兰氏阴性菌 的广普性、疫苗的安全性及预防牛乳腺炎方面的有益效果。 试验1：用鲎阿米巴样细胞裂解物检测(LAL)方法检测疫苗中内毒 素(EU)的含量
在疫苗自杀灭活后，用无菌的非热源的盐(sterile， nonpyrogenic saline)洗制备的疫苗3次，用鲎阿米巴样细胞裂解 物检测(LAL)方法检测本发明制备疫苗在用无菌的非热源的盐 (sterile，nonpyrogenic saline)洗前洗后及与3种常用的牛乳腺 炎革兰氏阴性菌疫苗中内毒素(EU)的含量的平均值。
检测结果如表1：
    表1：几种牛乳腺炎疫苗的内毒素(EU)的含量     牛乳腺炎疫苗名称   剂量   (ml)   内毒素含量   (EU/ml) 本发明方法制备的疫苗洗前    5   500,000 本发明方法制备的疫苗洗后    5   49,000 其它方法制备的革兰氏阴性菌疫苗 产品(平均)    5   2,630,000
试验结果表明：用本发明的方法制备的牛乳腺炎的疫苗的内毒素 通过用无菌的非热源的盐(sterile，nonpyrogenic saline)洗3次 以后，游离的内毒素的含量减少了大约90％左右。每毫升的疫苗中内 毒素的含量不到50,000EU，且大大低于传统制备疫苗方法中内毒素 的平均水平。 试验2：牛乳腺炎疫苗的免疫保护试验
选用6头奶牛为试验组，3头奶牛做对照，用本发明制备的疫 苗免疫接种，接种时间分别是干奶期，干奶中期，和产小牛后两周内 每次皮下注射2ml，之后接种大肠杆菌(E.Coli)300CFU，进行免疫保 护试验。在接种病原菌7天后，立刻观察临床症状和培养有无细菌出 现，若有细菌出现，通过标准的微生物学技术鉴定。
试验结果表明，对照组的3头奶牛都出现了临床症状，且其中一 头在免疫保护7天后，因为严重的症状，不得不实施安乐死。而试验 组在接种12小时后，出现了临床症状，其中5头奶牛恢复正常状况， 没有一头奶牛死亡。对照组的3头奶牛在病圈中平均天数是7天，而 试验组在病圈中的天数是3天，利用抗生素治疗使患乳腺炎的奶牛恢 复健康的天数是14天，而利用疫苗治疗的天数是8天。具体的对比 试验结果见表2：
    表2：免疫保护7天后牛乳腺炎疫苗的免疫效果 试验组别 7天后牛乳腺炎临床   症状减少率(％)   在病圈中的   平均天数 抗生素治疗  的平均数 对照组     0     7     14 试验组     83     3     8 试验3：牛乳腺炎疫苗减少副作用(安全性)试验
a.用3头4个月的奶牛，它们在临床上是健康的，即正常的体温， 正常的白细胞数，食欲良好，正常的粪便。在免疫接种前记录 它们的直肠的体温。皮下接种疫苗标签剂量的10倍，72小时 观察奶牛有无不良反应。在72小时内未发现被试验的奶牛有异 常的现象。
b.用3组，每组6头怀孕6-7月的小母牛以疫苗标签数量皮下接 种疫苗，每周接种疫苗一次，连续三周。在第三次接种一周以 后，通过直肠触诊确认试验的动物是否仍在怀孕，结果表明，3 组试验中，只有一组有1头怀孕6-7月的小母牛流产。
试验结果表明，本疫苗是安全的。 试验4：利用酶连免疫吸附反应(ELISA)检测J8疫苗的血清学反应
选用20头12个月，健康的正常食欲的母牛，4组，每组5头， 用牛乳腺炎疫苗J8进行阳性血清学反应试验。在免疫接种前，取每 头试验动物的血清，每份血清3等份，在40℃或更底温度下冷藏。 以不同的剂量皮下接种疫苗，每周接种疫苗一次，连续三周。在最后 一次免疫后一周，取每头试验动物的免疫后血清，每份血清3等份， 通过酶连免疫吸附反应检测免疫后免疫球蛋白(IgG和IgM)的ELISA 值。 表3酶连免疫吸附反应(ELISA)检测疫苗的血清学反应试验结果 试验组别 免疫总剂量   (CFU) 免疫前IgG的 ELISA效价值 免疫后IgG的 ELISA效价值  1  5.0×1010 250  22600  2  6.0×109 234  16280  3  8.0×105 200  1117  4  8.2×103 226  318 试验结果表明：在4组免疫动物中都产生了免疫球蛋白的抗体，接种 J8疫苗后，免疫球蛋白IgG的ELISA值最多是免疫前的90倍。可以 看出，J8疫苗能产生有效免疫效果的CFU最小的含量是8.0×105， 优选的CFU含量范围是8.0×105-5.0×1010，更优选的CFU含量范 围是6.0×109。 试验5：交叉反应免疫吸附试验
取来自于试验4的第3组的J8免疫血清，用酶连免疫吸附反应 (ELISA)测定抗大肠杆菌抗体与革兰氏阳性和阴性细菌的交叉反应 免疫吸附。试验结果见表4
        表4J8牛乳腺炎疫苗和革兰氏阴性菌的
        交叉反应免疫吸附(IgG ELISA)试验结果     被检测的微生物   IgG ELISA吸附的百分率％     大肠杆菌J8     100     大肠杆菌O157：H7     92     大肠杆菌O11B：4     90     鼠伤沙门菌     95     绿脓假单胞菌     67     鼻肺炎克雷伯杆菌     63     粘质沙雷菌     71     多杀巴斯德菌     74
试验结果表明，通过本发明方法制备疫苗产生的抗体可以和其它 广阔范围的革兰氏阴性菌产生交叉反应抗体，证明了通过本发明试验 方法制备的牛乳腺炎J8疫苗对革兰氏阴性菌是通用的。