乳畜群中的乳腺炎是乳品生产商遇到的费用最大且最困难的疾 病之一。旨在治愈临床乳腺炎的传统治疗包括乳房内抗微生物治疗。 尽管商业上可购买很多乳房内抗微生物产品，但是临床乳腺炎的治愈 率却令人费解地低：对于乳酸链球菌(Streptococcus spp.)乳腺炎为 46％，对于葡萄球菌属(Staphylococcus spp.)乳腺炎为21％，对于金黄 色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)乳腺炎仅为9％。见Wilson等(1996) National Mastitis Council Proceedings 164-165，和Crandall等(2005) NMC Annual Meeting Proceedings 215-216。因此，乳品生产商经常通 过从他们的畜群剔出有乳腺炎倾向的动物而简单地处理该疾病。
由于在治疗乳腺炎中有困难，故预防新的乳房内感染是乳业中的 主要焦点。与泌乳期间的新感染相比，干乳期间的新感染发生率非常 高。(例如，一项研究显示所有新的革兰氏阴性菌乳房内感染中的61％ 发生在干乳期间。见Todhunter等，(1995)J.Dairy Sci.78：2366.)。紧 随干乳后的三周和产犊前的两周为尤其容易发生新感染的时期。因 此，在近年来乳品生产商已相当多的努力关注干乳期间奶牛的“预防护 理”。
2003年4月，在美国市场引入了一种用于干乳期奶牛的内部(或 “乳房内”)乳头密封剂(ITS)。该产品以“ORBESEAL”商标(美国商标登 记号2,772,198和3,120,693)在美国销售，已在新泽西开发。被引入美 国市场的”ORBESEAL”牌ITS包含分散于粘稠糊剂中的65％w/w碱式 硝酸铋。ITS产品不包含任何抗生素，该产品也不包含任何活性抗微 生物剂。使用管式给药注射器将ITS注射至乳头末端，其方式与应用 干乳期奶牛抗生素的方式一致。ITS产品填充乳头管的裂沟和褶，因 此对病原体形成物理屏障。见2001年7月3日颁布的美国专利第 6,254,881号，其内容通过引用结合到本文中。
在新泽西的初期研究推断，在预防产犊期间新的乳房内感染中和 预防泌乳的第一个五(5)个月期间乳腺炎的临床表现中，“ORBESEAL” 牌产品产生与广谱长效乳房内抗生素一样的作用。见Woolford等 (1998)New Zealand Veterinary Journal 46：1。美国的最近研究也推断该 ITS产品改善已用苄星氯唑西林注射的奶牛的乳房健康。见Godden 等(2003)J.Dairy Sci.86：3899-3911。因此，“ORBESEAL”牌ITS被证 实在减少干乳期间乳牛乳腺炎新病例的数目方面是有效工具。尽管其 引入美国市场相对时间短，但“ORBESEAL”牌产品已被市场广泛接受 并且在美国乳畜群中广泛使用。简而言之，“ORBESEAL”牌产品对于 预防乳腺炎的特定目的是非常有效的。
“ORBESEAL”牌ITS产品引入美国之后，在成熟的乳制品中开始 出现视觉缺陷，最显著的是成熟的切达干酪。视觉缺陷为整个成熟干 酪中出现小黑点(直径约0.5-5mm)的形式。斑点是纯粹的美学、视觉 缺陷，降低受该问题影响的干酪的质量等级(以及因此导致的市场价 值)。干酪中斑点并不伴随有任何感官缺陷。受黑点影响的干酪是适合 销售的，尽管等级低于未受影响的干酪。该缺陷称为“黑点缺 陷”(BSD)。
发明概述
本发明的第一种形式涉及为了在动物干乳期间预防性治疗乳房 疾病在非人动物的乳头管内形成物理屏障，同时在由该动物乳汁制成 的乳制品中防止BSD的方法。该方法包括向动物的乳头管内注入乳头 密封制剂，其中乳头密封制剂是无铋的。该制剂以一定量给予，该量 足以形成物理屏障以阻止微生物进入乳头，但不会在用该动物乳汁制 成的乳制品中引起黑点缺陷。该方法的优选实施方案包含注入在凝胶 基质中含有无铋、非毒性重金属盐的乳头密封制剂。优选，该乳头密 封剂缺少抗感染剂(即该乳头密封剂优选不含抗生素或其它抗感染活 性剂)。优选该方法包括注入乳头密封制剂，该制剂包含至少约30％ 重量的无铋、非毒性重金属盐，更优选包含约50％至约75％重量的无 铋、非毒性重金属盐，还更优选包含约65％重量的无铋、非毒性重金 属盐。该盐的目的主要是赋予组合物足够的密度，以便使ITS“停留” 在乳头管内。在所述方法的一种形式中，非毒性重金属盐选自二氧化 钛、氧化锌、硫酸钡和这些盐的组合。
凝胶基质可为任何合适的凝胶制剂，为制药领域中熟知的制剂基 质。优选的凝胶基质包括硬脂酸铝和液态石蜡(如矿物油、白凡士林、 黄凡士林等)。典型的凝胶基质包括蜡或某些类型的油以及盐如硬脂酸 铝或硬脂酸镁。
本发明的另一种形式涉及乳房内乳头密封剂，该密封剂包含组合 应用的凝胶基质和分散在凝胶基质中的非毒性重金属盐，其中重金属 盐无铋。如早先说明的，乳头密封剂优选包含至少约30％重量，更优 选约50％至约75％重量，还更优选约65％重量的重金属盐。重金属盐 优选为二氧化钛、氧化锌、硫酸钡或其组合。凝胶基质优选包含硬脂 酸铝和液态石蜡。
本发明的再一种形式为乳房内乳头密封剂的改进。尤其是，为了 在动物干乳期间预防性治疗乳房疾病在非人动物的乳头管内形成物 理屏障的方法中，其中该方法包括向动物乳头管中注入无抗感染药物 的密封制剂的步骤，本发明的改进包括注入在凝胶基质中含无铋、非 毒性重金属盐的乳头密封制剂。该改进防止在由所治疗动物乳汁制成 的乳制品中形成黑点缺陷。
附图简述
图1A和1B为18kg成熟的白切达干酪团块中典型黑点缺陷的照 片。图1A显示团块的表面，黑点缺陷可容易的见到。图1B为显示缺 陷尺寸的放大图(有叠加的标尺)。此类点相等的分布在整个干酪中。
图2为黑点缺陷的电子显微照片，显示硫化铋(III)纳米棒的特征 性发状或棒状结构。任何非BSD干酪或非BSD干酪测试区域中未出 现这种结构。图2中显示的棒具有37.09nm至129.33nm的直径。
图3为黑点缺陷区域的单一棒状结构的电子显微照片。该棒显示 直径为130.88nm，并显示平分棒长度的线。
图4A和4B为实验室诱导的黑点缺陷的图像。在图4A中， “ORBESEAL”牌乳房内乳头密封剂(ITS)的各种组分与干酪掺混，各黑 点立即照相。图4B显示暴露于成熟切达干酪的挥发物或硫化氢气体 之后照相的相同斑点。位点4和5分别含有碱式硝酸铋和完整的 “ORBESEAL”牌ITS制剂。
发明详述
开始于2003年晚期，干酪制造者向威斯康星大学麦迪逊分校食 品科学部门乳品研究中心(CDR)发出许多咨询，寻求关于成熟干酪尤 其是成熟切达干酪中出现新“黑点缺陷”的信息。历史上，干酪中灰色 至黑色污点是一些不同且相异的原因导致的，包括特定微生物(如某些 环境丙酸菌属或霉菌)的生长或干酪被食品级润滑剂碎屑污染。然而， 干酪制造者注意到的特定BSD并不适合细菌污染物或其他腐败菌的 特性，似乎也不是已被发现其进入乳流方式的润滑剂碎屑或干酪制作 过程期间引入的其他碎屑。
因此，第一步是确定黑点缺陷的化学结构。已开始大量工作去萃 取BSD干酪的受影响区域。使用各种极性、疏水性等的广谱有机溶剂 进行萃取，作为从干酪基质分离任何类型有机颜料物质的方法，萃取 工作显示没有结果。尽管用有机溶剂萃取BSD未成功，但萃取工作确 实给出有用数据。尤其是，由于颜料不溶于或分散于这些溶剂中，可 推断(可能性很高)黑点颜料同样不溶于或分散于干酪基质本身中。
目测检查越来越多显示缺陷的干酪样品(从商业干酪制造商积蓄 的样品)证实这个结论——黑点颜料充分地包含在干酪基质中，但显然 没有扩散在其中。见图1A和1B，为18kg典型受BSD影响的成熟白 切达干酪块的照片。图1A为干酪块外表面的照片。图1B为单一块斑 点的放大图，带有叠加在图像上的标尺以显示斑点的尺寸。如图1A 和1B所示的斑点一般均匀分布在整个干酪块，直径大小为<1mm至 约5mm。任何给定的18kg干酪块中出现斑点的频率宽范围的变化， 从<10个/块至大大超过100。
一些从干酪制造者那里得到的传闻报告中说，特定老化和贮藏策 略可帮助溶解或分散斑点成小点，使它们不再明显可见。(因为该缺陷 不伴随任何感官不足，“消褪”这些斑点会改善情况。)然而，这一结果 极不可能给予在萃取工作中所使用有机溶剂的颜料稳定性。简而言 之，由本发明发明人进行的萃取试验使用具有类似于乳酯疏水性的溶 剂。如果黑点颜料溶解或分散至干酪基质本身(经老化或贮藏方案)， 同样颜料应该迅速溶解或分散至具有类似于乳酯的物理特性的有机 溶剂内。那样的结果不会在实验室中出现。而且，给定干酪内一般的 pH/酸性环境，以及与大多数成熟切达型干酪相关的一般老化/货架期 (0.5-2年)，传闻证明经老化或贮藏方案改善缺陷是没有价值的。
然而，一个实验显示了最大启发：黑点颜料快速溶解在硝酸中。 这强烈提示颜料为无机盐。结合缺陷第一次出现的时间，制定了工作 假设，即ITS为BSD的病原体之一(或至少与之相关)。黑点颜料容易 地溶解在酸中的发现支持进一步的假设，颜料可能包含硫化铋III。因 此，推断在美国含65％重量的含铋盐的“ORBESEAL”牌产品有可能被 无意引入至乳流中。如上所述，“ORBESEAL”牌产品在商业上取得成 功，因为它形成密封的物理屏障以阻止病原体进入乳头管中。然而， 从所治疗动物中除去该产品需要剥离动物的乳头。在剥离之后似乎一 些ITS保留在乳头中，并发现其进入干酪乳的方式。
依据硫化铋III实际为BSD的病原体的假设继续下一阶段的研 究。碱式硝酸铋本身为白色，相对化学惰性。因此，在液体乳、莫泽 雷勒干酪和酸乳酪中其痕量存在显然不会明显可见。然而，在高香味 强度的成熟干酪中，黑点缺陷显著出现。因此，假定硫化铋III(黑色， 相对不溶性盐)为碱式硝酸铋(来自ITS)与硫化氢之间的反应产物，硫 化氢在成熟干酪中通过熟成微生物菌丛、酶和作用于干酪的蛋白质/ 氨基酸组分的某些辅因子的作用产生。
简而言之，假定由于在挤奶之前ITS没有完全被去除，碱式硝酸 铋进入乳流。然后按照方程1，碱式硝酸铋与硫化氢反应，得到硫化 铋III
4BiNO3(OH)2BiO(OH)+H2S→Bi2S3(不溶，黑色)(方程1)
产物硫化铋III(或简单硫化铋)为相对不溶性黑色盐。
除具有特定元素目标铋之外，假定在干酪基质中存在的条件或化 学环境下，Bi2S3分子会形成结晶结构，文献中称为纳米棒或纳米针状 单晶。见W.Zhang等(2001)Sol.State Comm.119：143-146和B.Zhang 等(2006)J.Phys，Chem.110：8978-8985。因此，这些含铋的纳米棒将 组成光衍射粒子，该粒子能够将灰色赋予在黑点缺陷中可见的黑色色 调。
然后，努力集中于证实：1)黑点缺陷中铋元素的存在；和2)证实 黑点缺陷中硫化铋III纳米棒结构的物理存在。
使用电感偶合等离子体质谱(ICPMS)，研究证实黑点中铋的存在。 使用AOAC国际(分析化学师协会)方法993.14。为了确定可能有助于 BSD的一些元素的存在，第一步工作筛选许多黑点。初步实验集中在 在乳汁和干酪处理/运输设备中发现的那些典型金属盐/氧化物，和食 品级加工中存在的其他残留金属衍生物。作为控制措施，进行干酪的 组分分析。尤其是，分别使用AOAC第17版(版权2000，ISBN： 0935584-67-6)的官方分析方法的方法2001.14、935.42和926.08，测 定蛋白质、灰分和水分。依照AOAC第17版官方分析方法中所描述 的方法测定脂肪。
按照以下方法进行透射电子显微镜(TEM)研究：向样品中加入约 100μl双蒸馏水，并用玻璃棒将混合物研磨成悬浮液。使悬浮样品的 约5μl等分试样沉积在聚乙烯醇-甲醛缩醛-涂布的300目铜TEM栅格 (Ted Pella，Inc.，Redding，CA)。过量的样品用小部分滤纸吸去，室温下 将剩余样品干燥至栅格表面。在一些情况下，在干燥样品上施加 NANO-W-牌TEM阴性着色剂(Nanoprobes，Incorporated，Yaphank， NY)，以增强对比度和可见度。用Philips CM 120电子显微镜观察试 样，并用MegaView 3数字照相机(来自SIS，Ringoes，NJ)收集图像。用 已知长度的参照样品校准的SIS-牌分析软件(Ringoes，NJ)进行测量。
ICPMS结果证明BSD区域中元素铬、铜、铁、镍和铋的存在。 尽管已发现元素铬、铜、铁和镍的逐渐增加，但是BSD区域的铋浓度 通常比非BSD区域测定的相同干酪的大三个数量级。这些结果显示铋 是足够数量存在以参与产生颜料的反应的唯一元素。
干酪样品BSD区域的几百张TEM图像得出一个一致结论。上述 引用文献中报道的那些典型纳米棒独特地存在于BSD干酪区域中。这 一图像的实例见图2所示。图2中显示的纳米棒结构太细小，以致于 不易用光学显微镜检测。图2中显示的纳米棒直径为约69nm至约 130nm。纳米棒对TEM的可能破坏条件非常稳定。棒看上去具有些微 斑驳的表面，它们具有沿纳米棒长度连续的特征线。见图3，为单一 纳米棒增大的放大图。这种结构的存在与干酪基质中存在的条件下形 成的硫化铋纳米棒的存在一致。
为了证实碱式硝酸铋作为形成硫化铋III纳米棒中反应物的反应 性，进行另外的试验以查看BSD是否可能在实验室有目的地再现。简 而言之，用已知量的ITS组分制备干酪，并经历老化干酪产生的真实 挥发性气体或直接暴露于假定的碱式硝酸铋共反应物——硫化氢气 体。在这两种情形下，反应是始终相同的：当含有碱式硝酸铋的干酪 样品或完整的ITS制剂暴露于真实的干酪挥发物或“化学标准”级H2S 气体时，各自形成伴有纳米棒结构存在的相同黑色颜料淀积，进一步 证实碱式硝酸铋是BSD中的原因。结果见图4中所示。当如此暴露时 无其他ITS组分形成黑点。此外，当暴露于真实干酪的挥发物或硫化 氢气体时，易受影响的位点形成同样的黑色颜料淀积，因此确定硫化 氢气体是可疑的共反应物。
从干酪制作和老化或熟成观点来看，认为将作为控制BSD的方 法消除硫化氢气体的产生作为目标是不合理的。硫化氢是非常芳香的 活性化合物，是抵抗含硫氨基酸如半胱氨酸的微生物、酶和辅因子活 性产物。见Arfi等，(2002)Appl.Microbiol.Biotechnol.58：503-510。 有大量研究支持硫化氢气体是一般成熟切达干酪香味的必要和/或重 要组分的主张。见Burbank & Qian(2005)J.Chrom.1066：149-157。即 使设计方案以(通过阻断许多复杂的代谢途径)避免硫化氢的产生，所 得最终产物有香味特征不为干酪分级师和消费者接受的风险。
因此，在本发明中，改变ITS的制剂以排除含铋的盐。如上述实 验中所示，正是商业上购买的ITS中的碱式硝酸铋引起BSD。因此， 使用ITS消除BSD，该ITS不含铋，也不含与硫化氢反应产生黑色不 溶性颜料的任何其他重金属盐。
实施例
仅为了对本文中公开和要求保护的本发明提供更完全的描述而 包括以下实施例。这些实施例不以任何方式限制本发明。
实施例1：
配制依照本发明的试验ITS。试验ITS与“ORBESEAL”牌制剂相 同，不同之处在于它不含任何铋或含铋的盐。试验ITS含有氧化锌、 二氧化钛、矿物油(30-40％)和硬脂酸铝。
为了制备一批ITS，将液态石蜡(例如矿物油)释放至配备有搅拌 器的合适容器中。加入硬脂酸铝，搅拌该混合物，加热至约160℃直 至均匀(约2小时)。然后搅拌下向该混合物中分批加入非毒性、不含 铋的盐，直至已加入所需量的金属盐。然后搅拌该混合物，直至均匀。 然后，将该产物转移至用于乳头内给药的传统注射器管中。
实施例2：
该实施例的目的是与“ORBESEAL”牌产品相比，比较本发明ITS 在非泌乳期奶牛乳头中的保留。
该研究在德州威斯康星的威斯康星大学麦迪逊分校(UW)的 Blaine牛奶场进行。在停奶的当天登记16只奶牛(n＝64个乳头)。要求 所有登记的奶牛具有四个功能区，没有可见的乳腺炎迹象。所有奶牛 停奶，依据标准UW乳畜群方案接受乳房内抗生素干乳期奶牛治疗 (DCT)。记录各奶牛的经产状况和(干乳期)产乳量。开始登记后，根据 乳头和过度角化的形状、长度、直径和程度对乳头进行记分。各奶牛 中，分配两只乳头接受“ORBESEAL”牌ITS，分配两只乳头接受试验 ITS。设计给药方案以确保在乳头位置中均匀给予各产品，八只乳头 各自在每一位置(右后方、右前方、左后方、左前方)给予产品。在给 药之前和之后称量密封管以确定给药的净体积。在接受DCT和内部 乳头密封剂之前，使用单一70％异丙醇的醇擦拭物将乳头末端清洁， 使用部分插入技术减少引入乳头皮肤病原体的可能性。在给予内部密 封剂之后，乳头用外部乳头消毒剂浸渍。
在第1、2、3、4、5、6、7、14、28、42天和产犊时观察乳头， 以检测是否发红、肿胀和/或密封剂漏出。在第14、28、42天和产犊 时，通过手工剥离从各奶牛的一只乳头除去密封剂(每天除去八只乳头 的各密封剂)。收集除去的密封剂，初乳装入有刻度的50ml塑料小瓶 中。将这些小瓶离心(3000rpm×5-7分钟)，冲洗上清液，称重回收的 密封剂。比较在各时间试验ITS治疗的乳头和“ORBESEAL”牌ITS治 疗的乳头之间回收的密封剂量。随后，使用同样的方法在产犊之后的 第1天收集样品。在所有取样时期，除去密封剂之后用外部乳头消毒 剂浸渍乳头。产犊之后，从所有区域无菌收集四份乳样品，并培养以 鉴别乳房内感染。
组特征——乳头长度和体积：
研究中登记了共16头奶牛，总数共64只乳头；32只乳头接受试 验ITS，32只乳头接受“ORBESEAL”牌ITS。试验群体乳头的长度和 体积如表1中所示：
表1.由化合物导致的乳头长度和体积的均值、标准偏差和标准 误差

对于组A或组B中的乳头，乳头的长度或体积没有显著性差异(p >0.36)。全部乳头长度为5.11cm，范围为3.3cm至7.3cm。组A中平 均乳头长度为5.12cm，组B的为5.11cm；组A的范围为3.3cm至7.3cm， 组B的为3.5cm至7.10cm。进行两个样品的配对t检验以检验两个治 疗组中平均乳头长度没有差异的虚假设。在随机接受任一产品的乳头 之间乳头长度没有显著性差异(p＝0.95)。
全部的乳头体积为24.66cm3，范围为12.47cm3至54.34cm3(标准 偏差9.17cm3)。组A中平均乳头体积为23.6cm3，范围为12.54cm3至 54.34cm3(标准偏差8.60cm3)。组B中平均乳头体积为25.71cm3，范围 为12.47cm3至48.25cm3(标准偏差9.73cm3)。使用两个样品的配对t 检验以检验两组中乳头的体积没有差异的虚假设。在随机接受任一产 品的乳头之间乳头体积没有显著性差异(p＝0.95和p＝0.35；对数转换分 析)。
过度角化：使用以下等级用过度角化对乳头末端的健康记分：无 环(N)、平滑环(S)、粗糙(R)、非常粗糙(VR)。乳头记分分布为：N(n＝21； 32.8％)、S(n＝31；48.4％)、R(n＝11；17.2％)和VR(n＝1；2％)。X2检验 证实过度角化记分的分布与治疗组不相关(p＝0.13)。
表2.对过度角化的描述统计

密封剂的给药量、回收量和损失量：使用配对t-检验进行统计分 析以确定基于治疗组密封剂的给药量、回收量或损失量(未回收的)是 否没有差异。
表3.用于给予、回收和损失的产品密封剂均值的两个样品配对 t-检验

其中每管4g中，密封剂给予的全部量为3.62g。在“ORBESEAL” 牌ITS(3.46g)或试验ITS(3.62)的给药量中没有显著性差异(P＝0.12)。
总之，密封剂的回收量为0.82g，基于治疗上没有显著性差异 (P＝0.89)。密封剂的损失总量为2.88g，与治疗组没有差异(P＝0.40)。 密封剂的回收量倾向于与回收日期有关(P＝0.08)，与其他回收期比较 第14天有更多的密封剂被回收(第14天，回收量＝1.6g；第28天回收 量＝0.68g；第42天回收量＝0.65g；产犊期回收量＝0.33g)。
使用简单线性回归以确定给予的密封剂量与乳头体积之间没有 显著性关系(p＝0.59，p＝0.53)。
对于回收的密封剂，进行简单线性回归检验以检验回收的密封剂 量与乳头体积之间没有显著的线性关系的虚假设。乳头体积说明仅6％ 的回收密封剂(P＝0.05)。
给予的密封剂比例与乳头体积不显著性相关，而回收的密封剂与 乳头体积显著性相关，但只是很小的比例(6％)。
使用单向ANOVA以确定给药量与回收密封剂以及乳头位置、产 品、奶牛之间的单变量关系。
表4.给予与回收体积的单变量相关性表(P值)
             给予体积                 回收体积
             (p)                      (p)
乳头体积     0.53                     0.13
乳头位置     0.56                     0.52
产品         0.19                     0.88
天           -                        0.07
奶牛         0.05                     0.17