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用于治疗乳腺炎的兽医用组合物和相关方法
申请号 CN201880026289.0 申请日 2018-04-19 公开(公告)号 CN110536679A 公开(公告)日 2019-12-03
申请人 硕腾服务有限责任公司; 发明人 C.L.布朗; D.J.希恩; J.M.海姆利希; T.福斯特; J.E.普赖斯; S.拉贾戈帕兰; A.塞里恩; O.苏亚雷斯; N.F.坎宁汉;
摘要 本公开整体涉及溶胶-凝胶聚合物复合材料，其包含合适介质中的壳聚糖、亲水性聚合物、聚硅氧烷和胶凝剂。优选地，溶胶-凝胶聚合物复合材料可以响应于一种或多种生理刺激而形成耐用密封或坚固固体。本公开还涉及所述复合材料的医学和兽医学用途，具体地，涉及用于降低或预防乳畜的乳腺病症的发病率的方法和递送系统。更具体地，本公开包括用于在非人动物的乳头表面上或者乳头管或乳头池中形成物理屏障以预防性治疗诸如乳腺炎的乳腺病症的方法和溶胶-凝胶聚合物复合材料组合物，其中所述溶胶-凝胶聚合物响应于一种或多种生理刺激而形成密封。
权利要求

1.一种用于预防或治疗雌性非人动物中的乳腺病症的产品，所述产品包含有效量的溶胶-凝胶聚合物复合材料，所述溶胶-凝胶聚合物复合材料包含壳聚糖、与壳聚糖分离的亲水性聚合物、胶凝剂和合适的介质，并且所述产品还包含聚硅氧烷。

2.根据权利要求1所述的产品，其中所述介质是乙酸水溶液。

3.根据权利要求1所述的产品，其中所述壳聚糖是酰化的。

4.根据权利要求1所述的产品，其中所述聚硅氧烷是二甲基聚硅氧烷(PDMS)。

5.根据权利要求1所述的产品，其中所述亲水性聚合物是水溶性多糖。

6.根据权利要求5所述的产品，其中所述水溶性多糖是纤维素或其衍生物。

7.根据权利要求1所述的产品，其中所述亲水性聚合物选自由以下组成的组：甲基纤维素、聚乙酸乙烯酯、聚乙酸乙烯酯酰化产物、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、乙基羟乙基纤维素、乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素、透明质酸、非离子三嵌段共聚物、聚乙二醇、藻酸钠和明胶。

8.根据权利要求1所述的产品，其中所述胶凝剂是选自由以下组成的组的盐：β-甘油磷酸二钠水合物、β-甘油磷酸二钠五水合物、焦磷酸四钠、磷酸氢二钾三水合物、六偏磷酸钠、四聚磷酸钠、六聚磷酸钠、七聚磷酸钠、八聚磷酸钠、三聚磷酸钠和聚磷酸钠、铁氰化钾及其混合物。

9.根据权利要求1所述的产品，其中所述胶凝剂是选自由以下组成的组的离子交联剂：亲脂性磷酸盐、增塑剂、阴离子表面活性剂、树胶、果胶、角叉菜胶(ι、κ和λ)、藻酸盐、环糊精及其混合物。

10.根据权利要求1所述的产品，其中所述胶凝剂是选自由以下组成的组的化学交联剂：京尼平、方酸二乙酯、辛二酸二琥珀酰亚胺、戊二醛、二羧酸、二异氰酸酯及其混合物。

11.根据权利要求1所述的产品，其中所述聚硅氧烷以约70重量％或更少的量提供。

12.根据权利要求11所述的产品，其中所述聚硅氧烷以约5-70重量％的量提供。

13.根据权利要求1所述的产品，其中所述溶胶-凝胶聚合物复合材料还包含一种或多种抗微生物剂。

14.根据权利要求13所述的产品，其中所述抗微生物剂选自由以下组成的组：大环内酯、头孢菌素、林可酰胺抗生素、氟喹诺酮、四环素、青霉素、大观霉素、磺胺、氯霉素、甲砜霉素的氟化合成类似物及其混合物。

15.根据权利要求14所述的产品，其中所述抗微生物剂为头孢菌素并且所述头孢菌素为盐酸头孢噻呋。

16.一种预防或治疗雌性非人动物中的乳腺病症的方法，所述方法包括将有效量的权利要求1-15中任一项所述的溶胶-凝胶聚合物复合材料施用到所述动物的乳头、乳头管或乳头池。

17.一种用于在非人动物的乳头管或乳头池中形成物理屏障以预防或治疗乳腺病症的系统，其中所述系统包括含有权利要求1-15中任一项所述的溶胶-凝胶聚合物复合材料的递送装置。

18.一种用于预防或治疗雌性非人动物中的乳腺病症的产品，所述产品包含有效量的溶胶-凝胶聚合物复合材料，所述溶胶-凝胶聚合物复合材料包含壳聚糖、与壳聚糖分离的亲水性聚合物、胶凝剂、合适的介质、油和至少一种两亲性表面活性剂。

19.根据权利要求18所述的产品，其还包含多种两亲性表面活性剂。

20.根据权利要求18所述的产品，其还包含至少一种亲水性表面活性剂和至少一种疏水性表面活性剂。
说明书全文

用于治疗乳腺炎的兽医用组合物和相关方法

技术领域

[0001] 本公开整体涉及独特的溶胶-凝胶聚合物复合材料及其新用途。更具体地，本公开涉及响应于生理刺激而形成坚固固体的溶胶-凝胶聚合物复合材料，所述坚固固体具有响应于生理刺激的预先确定的渗透性和机械特性。所述复合材料易于注射并具有剪切致稀的特性，使得其可用于广泛范围的人类和动物健康应用，其中理想的是注射一种在注射到受试者中之后快速固化的液体。本公开还涉及用于保护乳畜的乳腺免受病原负荷的新方法，所述方法通过利用复合材料作为乳头密封剂以减少或预防动物乳腺炎的发生。

背景技术

[0002] 本说明书中引用的所有专利和出版物的内容以引用的方式整天并入本文。
[0003] 水凝胶是高度水合的大分子网络，其分散在水或其他生物液体中。表现出随温度升高而粘度增加的特定性质的水凝胶被称为热致可逆、热敏性(或热固性)水凝胶。已知的是，热敏性水凝胶可以由诸如壳聚糖的天然来源的聚合物制备，所述壳聚糖是通过甲壳素的部分至大量碱性N-脱乙酰化获得的可商购获得的廉价聚合物，所述甲壳素是一种由N-乙酰氨基葡萄糖单元通过β-1,4-糖苷键连接所构成的线性多糖。一般使用热的、浓缩的氢氧化物溶液(通常是氢氧化钠)来进行脱乙酰化过程。
[0004] 壳聚糖是生物相容、无毒且非免疫原性的，从而允许其在医学、药学、化妆品和组织构建领域中使用。例如，已使用局部眼部应用和视网膜附近的眼内注射或移植。此外，壳聚糖被某些特定的酶(例如溶菌酶)分解代谢，并因此可以被认为是可生物降解的。此外，据报道，壳聚糖通过开放上皮紧密连接来充当渗透增强剂。壳聚糖还促进伤口愈合并表现出抗细菌、抗真菌和抗肿瘤的特性。
[0005] 诸如天然组织的生物结构的复杂性使得研究人员探索以液体的形式引入受试者皮肤上或体内的生物材料和医疗装置的使用，并且所述液体通过简单应用或注射变成固体或类固体。例如，壳聚糖水凝胶已示出可用于与急性和慢性软骨缺损相关的软骨再生以及膝关节疼痛的预防。壳聚糖基凝胶还示出通过包埋大量新型合成阴离子蛋白聚糖而变成并充当用于椎间盘(IVD)细胞包埋的支架。已知壳聚糖在诸如硫酸盐衍生物的若干多价阴离子的存在下形成热致可逆的凝胶。例如，在PCT国际公布号WO 99/07416和美国专利号6,344,488中已经描述了温度控制的pH依赖性的诸如壳聚糖/有机磷水性系统的离子多糖凝胶的形成。然而，由诸如壳聚糖的离子多糖制成的水凝胶较弱并且通常仅在混合聚合物和盐溶液后的相对较长的等待时间之后形成。这主要是由于这样的事实，由于壳聚糖的溶解度差，使用高浓度的壳聚糖，特别是高分子量的壳聚糖，难以获得均匀的、充分水合的壳聚糖溶液。此外，若干医学应用需要提供的不仅是简单的溶胶-凝胶转变，还是具有所需的大孔隙度和机械特性的固体结构。此外，温度是非特异性刺激并且可以由人体外部的因素(诸如热的天气，或者对于口服应用而言只是喝了热的饮料)触发。因此，需要仅在由特定生理刺激触发时才能实现所需的机械和/或渗透性特性的刺激响应性的植入物或贴剂。
[0006] 美国专利号9,034,348公开了可注射壳聚糖混合物形成水凝胶。存在对于在接近生理pH和37℃下形成水凝胶的壳聚糖组合物的描述，所述壳聚糖组合物包含至少一种类型的具有在约30％至约60％范围内的乙酰度的壳聚糖以及至少一种类型的具有至少约70％的脱乙酰度的壳聚糖。本发明还公开了一种在接近生理pH和37℃下形成水凝胶的壳聚糖组合物，所述壳聚糖组合物包括至少一种类型的具有至少约70％的脱乙酰度与10-4000kDa的分子量的壳聚糖以及至少一种类型的具有200-20000Da的分子量的壳聚糖。本发明还公开了壳聚糖组合物的制备方法和用途。
[0007] 美国专利申请公布号2010/0028434公开了温度控制和pH依赖性的自胶凝生物聚合物水性溶液。存在对于用于产生自胶凝系统和凝胶的生物聚合物液体水性组合物的描述，所述组合物包含酸性的水基介质、0.1至10重量％的pH胶凝酸溶性生物聚合物以及0.1至10重量％的具有碱性特征且pKa在6.0与8.4之间的水溶性分子或具有碱性特征且pKa在6.0与8.4之间的分子的水溶性残基或序列。所述液体组合物具有5.8与7.4范围内的最终pH并且在10℃至70℃的温度范围内形成稳定的固体和均匀的凝胶。还描述了用于制备组合物的方法及其用途。
[0008] 美国专利申请公布号2010/0285113公开了具有增强的稳定性的逆热胶凝复合水凝胶。存在对于复合水凝胶的描述，所述复合水凝胶包含阴离子多糖或其衍生物(诸如透明质素(通常也称为透明质酸)或其衍生物)的水性溶液与甲基纤维素或其另一种水溶性纤维素衍生物的水性溶液的共混物，其具有分散的聚合物颗粒，诸如其中的选自微颗粒和纳米颗粒的聚合物疏水性颗粒，并且其中水凝胶的稳定性相对于单独水凝胶的稳定性增强。聚合物颗粒可以包含至少一种治疗剂，在这种情况下，每种治疗剂均表现出线性缓释，其可通过选择适当的微颗粒和/或纳米颗粒的聚合物制剂来调节或改变。所述复合材料可以是可注射的，并且在不存在治疗剂的情况下可以用作重建和整容手术的填充剂或者可以充当用于随后递送治疗剂的平台。
[0009] 就兽医健康问题而言，乳腺炎通常是由细菌引起的乳腺炎症，所述细菌在大部分情况下通过乳头管口进入乳腺。在乳腺的非哺乳期或“干乳期”期间，角蛋白在乳头管口和条纹管中的沉积形成主要防御机制。在动物乳头中形成的角化栓形成保护屏障，并且乳头中的Furstenburg's Rosette的富含免疫组织以及不产乳母牛分泌的天然保护因子含有高水平的天然存在的抗细菌物质(阳离子蛋白)，所述抗细菌物质抑制细菌从乳头管口进入乳头池(乳头状窦)和腺乳池。然而，在动物进入泌乳期结束时的干乳期时、在动物的干乳期期间和/或在产犊期间，这种角化栓和这些天然免疫防御机制能够通过细菌侵入来战胜。因此，细菌侵入乳腺并在干乳期期间或更具体地在产犊之后立即引起乳腺炎。
[0010] 引起乳腺炎的主要病原体是葡萄球菌(Staphylococcal)物种，例如像，无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)等、牛棒状杆菌(Corynebacterium bovis)、支原体(Mycoplasma)；大肠杆菌群，例如像，大肠杆菌(Esherichia coli)、克雷伯氏菌属物种(Klebsiella spp.)、肠杆菌属物种(Enterobacter spp.)和柠檬酸杆菌属物种(Citrobacter spp.)；环境链球菌(Streptococcal)物种，例如像，停乳链球菌(Strep.dysgalactiae)、乳房链球菌(Strep.uberis)和肠球菌属物种(Enterococcus spp.)、假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)等。虽然乳腺炎主要由细菌引起，但是炎症产生还可以是由于病毒感染(例如牛疱疹病毒II和IV、诸如伪牛痘的副牛痘病毒等)，或具有或没有继发性细菌感染发生的像霉菌(例如假丝酵母属物种(Candida spp.)和曲霉属物种(Aspergillus spp.))或藻类微生物(例如原壁菌属物种(Protothecaspp.))的非典型病原体的感染。
[0011] 由于病原体存在的乳腺炎可以在乳牛场内成为高度传染的条件，其对乳品业造成巨大的产量损失。然后，由于有害病原体的影响或使得乳不适合人类饮用的各种处理，可饮用乳减少。虽然严重的情况最终会导致死亡，不受阻碍的发作也可以对动物乳房造成永久性损害。作为一种乳畜的主要地方病，乳腺炎危害动物的健康并且常常需要相当昂贵的兽医护理。保护早期泌乳期免受现有的和从干乳期延续的新感染的价值对于乳品业仍然是非常有价值的。很明显，治疗和控制乳腺炎是保持动物健康并降低乳品业中乳生产的高成本的重要目标。
[0012] 为此，为了密封动物的乳头以防止乳腺炎和其他病状，已经开发了产品，例如，屏障乳头浸液，其在产乳期间密封乳头的外表面和乳头的条纹管，以及内部乳头密封剂，其在干乳期期间堵塞或密封乳头管或堵塞乳头池，尤其是对于小母牛和先前经历过一次或多次妊娠的乳牛。
[0013] 除了这些产品以外，本领域还描述了若干种降低乳腺炎发病率的方法，例如，一种包括由单个递送装置将抗微生物制剂和密封制剂顺序地递送到非人动物的乳头管中的方法，其中所述密封制剂为无毒重金属盐，诸如铋(美国专利号8,353,877)；一种将包含外源性角蛋白的组合物施加到乳头管和/或乳头窦的方法(美国专利号8,226,969)；一种通过将一定量的乳头密封制剂注入动物的乳头管中而在乳头管中形成物理屏障用于在动物的干乳期期间预防的方法，其中所述乳头密封制剂包含无铋、无毒的钛、锌、钡的重金属盐或其组合并且所述物理屏障不引起由动物乳制成的乳制品的黑斑缺陷(美国专利号7,906,138)；一种在动物乳头管中形成无抗感染性的物理屏障用于在干乳期期间预防性治疗乳腺炎的方法，所述方法包括将密封制剂注入动物乳头管中而不使用抗感染剂的步骤，其中所述密封制剂包含无毒重金属盐，诸如具有载体(诸如液体石蜡)的硬脂酸铝凝胶基或包含聚乙烯凝胶的凝胶基中的铋(美国专利号6,254,881)等。
[0014] 然而，现有的密封制剂或外部浸液产品中的任一种都不能从外部密封乳畜的乳头足够长的时间以预防乳腺炎，特别是在动物像在小母牛中能够致命和/或极具传染性的形式。此外，虽然已经将乳头密封剂建立为一个可行的方法来为不论是抗生素选择还是施用提供更高水平的保护，但是当前市场上的产品不能满足对于易用性以及持久组织附着、易于清除、避免乳污染和预防陈年奶酪中的黑斑缺陷的需求。因此，所需要的是一种无毒的制剂，所述制剂对于动物驯养者管理来说容易且安全，并且优选地直接在组织上(即“原位”)形成有效、持久的密封。另外，密封制剂不妨碍乳畜的乳、由乳制成的酸奶或奶酪制品的质量是必要的，尤其是对于避免陈年奶酪中的黑斑缺陷的密封剂而言。实际上，兽医领域中存在对于找到一种持久、无毒、非刺激性密封制剂的明确的领域认可的需要，所述密封制剂在动物的乳头上形成足够的屏障以预防或显著地降低由病原体引起的乳腺炎的发病率，优选地不使用需要停止期的抗生素或其他药剂，以用于动物乳的公众消费。还存在对于找到一种持久的密封制剂的明确需要，所述密封制剂可以包含用于有效治疗或预防乳腺炎的抗生素等。
[0015] 因此，提供改善已知水凝胶的不便的溶胶-凝胶聚合物复合材料是本技术的一个目标。

发明内容

[0016] 本公开涉及新型溶胶-凝胶聚合物复合材料，其包含合适介质中的壳聚糖、亲水性聚合物、聚硅氧烷和胶凝剂。优选地，溶胶-凝胶聚合物复合材料可以响应于一种或多种生理刺激而形成耐用密封或坚固固体。本公开还涉及溶胶-凝胶聚合物复合材料的多种医疗和兽医用途。具体地，本公开涉及在乳畜的乳头管中形成物理屏障以预防性治疗或预防主要在动物进入干乳期或在干乳期期间时发生的乳腺病症的新方法，所述方法包括将溶胶-凝胶聚合物复合材料从外部施加到动物的乳头或将所述复合材料注入到乳头管或池中的基本步骤。优选地，所述组合物响应于一种或多种生理刺激而快速胶凝或固化以形成坚固固体。本公开还提供用于在乳畜的乳头管中形成物理屏障以治疗乳腺病症的系统，所述系统包含溶胶-凝胶聚合物复合材料和用于将所述组合物注入动物的乳头池中的输注装置。此类系统允许乳头密封剂阻挡引起乳腺炎的微生物侵入乳腺，或减少感染的发生或反复发生。

附图说明

[0017] 本公开的背景技术及其背离领域将参考附图在下文进一步描述，在附图中：
[0018] 图1A示出对于F1-20141210制剂，在f＝0.1Hz且振荡应力τ＝1Pa下记录的温度从25℃跳到37℃时弹性模量(G')和损耗角正切(tanδ＝G”/G')的时间依赖性的图。
[0019] 图1B示出对于F4-20141210制剂，在f＝0.1Hz且振荡应力τ＝1Pa下记录的温度从25℃跳到37℃时弹性模量(G')和损耗角正切(tanδ＝G”/G')的时间依赖性的图。
[0020] 图2示出对于F1-20141210制剂，在f＝0.1Hz且振荡应力τ＝1Pa下的时间消毒后0和12周所记录的温度从25℃跳到37℃时弹性模量(G')和损耗角正切(tanδ＝G”/G')的时间依赖性的图。
[0021] 图3示出在振荡频率f＝0.1Hz和温度T＝25℃下对准的制剂F1-20140825(有菌的)和制剂F1-20141210(无菌且在室温下储存12周)的应力扫描结果的图。箭头指出剪切致稀区域的开始，两种样品相似。
[0022] 图4示出对于在1％重量/重量壳聚糖(CH)(pH约6)中的17％重量/重量F127的制剂，胶凝温度对纳米晶纤维素(NCC)的量的依赖性的图。
[0023] 图5示出作为时间的函数以及在不同温度下的6s-1下的PVA酰化产物的粘度的图。
[0024] 图6示出如所指出的那样，在振荡频率f＝0.1Hz和温度T＝25℃下溶胶-凝胶聚合物复合制剂F1-F4的应力扫描结果。箭头指示剪切致稀区域的开始。
[0025] 图7示出在f＝1Hz且振荡应力τ＝1Pa下记录的温度从25℃跳到37℃时弹性模量G'和损耗角正切tanδ＝G”/G'的时间依赖性。
[0026] 图8示出在T＝25℃和T＝37℃下阿莫西林从溶胶-凝胶聚合物复合制剂F2中的平均释放速率。误差条表示标准偏差(n＝3)。

具体实施方式

[0027] 根据本公开，提供了新型溶胶-凝胶聚合物复合材料，其包含合适介质中的壳聚糖、亲水性聚合物和胶凝剂，所述合适介质理想地是水性介质并且更理想地是弱酸性水基介质。溶胶-凝胶聚合物复合材料具有剪切致稀特性使得所述复合材料能够在室温下在注射器中变形。溶胶-凝胶聚合物复合材料还能够使用单筒注射器等进行注射。有利地，所述复合材料能够响应于一种或多种生理刺激而形成固体，常常是特别坚固的固体，而不用添加任何其他试剂。响应于刺激，溶胶-凝胶聚合物复合材料常常快速固化。另一个优点是所述复合材料在生理条件下提供能够承受机械压力或液压的瞬间胶凝的坚固固体。另外，所述复合材料能够在注射到哺乳动物受试者中之后形成无渗漏、无滴漏的栓。
[0028] 本公开还提供从特别设计的制剂中受益的溶胶-凝胶聚合物复合材料的多种医学和兽医学用途。虽然人类应用从本公开将变得明显，但是优选用途涉及一种在乳畜的乳头管中形成物理屏障以预防性治疗通常在动物开始干乳期或在干乳期期间发生的乳腺病症的独特方法，所述方法包括将溶胶-凝胶聚合物复合材料施用到动物的乳头或乳头管内的步骤，所述复合材料优选地包含响应于一种或多种生理刺激而迅速胶凝或固化以形成耐用密封或坚固固体的组合物。另外，本公开提供了新的治疗方法，所述方法阻挡引起乳腺炎的微生物侵入乳腺并且降低或预防新感染或反复感染的发病率。
[0029] 本公开包括用于形成乳畜的物理屏障(优选地是乳头管内的内部屏障)以预防乳腺病症或减少感染的有害影响的系统，所述系统包括溶胶-凝胶聚合物复合材料和用于将所述组合物注入动物的乳头池中的递送装置。此类系统允许治疗以阻挡引起乳腺炎的微生物侵入乳腺，或降低感染的发生或反复发生的风险。更具体地，本公开提供了方法和系统，其中主要在动物开始干乳期或在乳畜动物的干乳期期间将溶胶-凝胶聚合物复合材料注入，所述乳畜动物优选地是小母牛或乳牛，但也可以包括诸如山羊、绵羊、水牛等的其他动物。在干乳期期间，溶胶-凝胶聚合物复合材料起到帮助预防和控制乳腺炎的作用，从而减少在干乳期期间和在泌乳的第一阶段(产犊后)中的临床和亚临床病例。通过在整个干乳期保留在乳头管中，溶胶-凝胶聚合物复合材料消除或减少微生物在高风险期期间通过乳头管入侵临产乳畜。
[0030] 一方面，本公开提供用于对抗乳畜中的微生物乳腺炎的方法，所述方法允许从所述动物获得的乳用于乳制品的生产，所述方法包括将溶胶-凝胶聚合物复合材料直接局部施加或注入乳畜的相关乳腺组织或乳头管内以形成乳头密封。通常通过乳房内施用将这种乳头密封剂在干乳期时施用到每个乳头。优选地，在健康动物感染之前施加或注入溶胶-凝胶聚合物复合材料。另一方面，本公开提供用于在乳制品生产允许公众消费之前，减少从正在针对乳腺炎进行治疗的动物中获得的乳的停止时间的方法，其中所述溶胶-凝胶聚合物复合材料局部施加或注入到动物的乳头管内。本公开还提供用于减少从正在进行预防治疗以预防或降低乳腺炎的频率的动物中获得的乳的停止时间以便提高乳制品产量的方法，其中溶胶-凝胶聚合物复合材料局部施加或注入到动物的乳头管内。
[0031] 甚至更具体地，本公开提供以上方法，其中所述乳制品是乳、酸奶或奶酪。当所述乳制品是乳时，所述方法包括干乳或液态乳。而且，本公开提供此类方法，其中所述溶胶-凝胶聚合物复合材料通过乳房内输注或通过浸渍乳头来施用。在所有的实施方案中，需要本公开的相关兽医用途的非人动物优选地是小母牛或乳牛，但也可以是另一种乳畜动物；并且所述施用优先在动物开始干乳期或在干乳期期间时通过乳房内输注来实现。此外，本公开提供此类方法，其中所述溶胶-凝胶聚合物复合材料在非泌乳动物的产后期期间施用或者其中所述溶胶-凝胶聚合物复合材料在动物的产前期期间施用。
[0032] 本公开的乳头密封剂通过增强的易用性(施用和移除)以及其新型质量特征的总和提供了超过当前市场上的密封剂的许多优点，例如，溶胶-凝胶聚合物复合材料的无毒性、生物相容性、生物降解性、弹性(柔韧性)、持久的组织附着、可注射性、室温下的流动性、响应于体温的固化能力、在37℃下快速的胶凝时间、无刺激性和惰性等。值得注意的是，不熔性水基热转化溶胶-凝胶水凝胶在室温下是独特的流体，但在体温下在乳头管中形成凝胶。溶胶-凝胶聚合物制剂表现出可定制的剪切致稀特征，其允许在宽温度范围内易于输注以及通过手动剥离从乳头管移除。在从体腔移除之后，溶胶-凝胶聚合物复合材料在室温下恢复到液相，这为乳品提供了真正的益处。此外，与当前的商业密封剂不同，本公开的乳头密封剂在乳的最初加工阶段期间不粘着到不锈钢管道(乳线)或集液罐并且在标准的冷水或热水洗涤期间是可清洗的(即，将易于从工业表面清洁)，这最终避免乳污染，从而防止常常见于陈年奶酪中的和由已知的常规乳头密封剂所引起的黑斑缺陷。
[0033] 同样有利地，本公开的乳头密封剂消除或显著减少从正在进行预防性治疗乳腺炎的非人动物中获得的乳的停止时间，从而避免或减少给动物抗生素时所需的标准弃乳期。同样实用的是，当通过改变溶胶-凝胶聚合物复合材料的盐组分来以相对中和的pH制备时，乳头密封剂可以被优先设计成与奶酪发酵剂完全相容。经治疗的动物的抗血清制备物对于喂养小牛也是安全的。
[0034] 定义
[0035] 应当理解，本文所用的全部科学和技术术语都具有与本领域普通技术人员通常所理解的相同的含义。给出下面的定义只是为了说明与本公开结合使用的主要术语的一般含义。
[0036] 术语“乳房”在本文是指诸如乳牛、山羊、绵羊、水牛等的雌性反刍动物的腺状乳腺结构。在乳牛中，其包括四个独立腺体，其中每个腺体具有一个乳头和一个出口导管，而绵羊和山羊具有两个腺体。术语“乳头”在本文是指包括部分乳窦或乳头窦的乳腺的突出部分。
[0037] 术语“乳头密封剂”在本文是指用于在动物乳头表面上或动物乳头内部形成物理屏障的组合物和装置。乳头密封剂可以在乳头表面上、乳头条纹管内部和/或乳头池内部。
[0038] 术语“抗微生物剂”在本文是指杀死诸如细菌、病毒、真菌、酵母或原生动物的微生物或者抑制所述微生物的生长或繁殖的物质。
[0039] 除非另外说明，否则术语“溶液”在本文是指溶液、悬浮液或分散体。如本文所用，术语“喷雾”是指雾化组合物，诸如包含小的或大的液滴，诸如出于递送组合物的广泛应用的预期目的通过气溶胶施加器或泵喷雾施加器来施加。
[0040] 术语“液流”在本文是指组合物的连续的、直接的和集中的应用。术语“输注”在本文是指将流体或溶液连续引入到腔体、血管或池中。
[0041] 术语“哺乳动物”在本文是指哺乳动物纲的温血脊椎动物，其包括人和动物两者，具有皮肤上的毛发或皮毛、由雌性从产乳的乳腺分泌的用于滋养幼崽的乳汁和四腔的心脏。
[0042] 对于涉及乳腺炎的本公开的实施方案，术语“动物”在本文是指具有泌乳期的雌性非人哺乳动物，其包括但不限于家畜动物，诸如乳牛、绵羊、山羊、马、猪、水牛等。优选地，所述动物是乳牛。虽然“乳牛”和“小母牛”都是雌性牛，但术语“小母牛”在本文是指未生产小牛的任何年轻雌性乳牛，所述小牛通常是已断奶且年龄在3岁以下。术语“乳牛”常常是指已生产小牛的年长雌性动物。
[0043] 术语“干乳期”是指乳牛或其他乳畜的泌乳周期的非泌乳期。其发生在一个泌乳周期的结束与下一个泌乳期开始之间。在每个泌乳周期结束时，随着动物进入干乳期，所以动物开始“干乳”阶段，其包括与动物非泌乳期(干乳期)停止产乳相关的通常的生理、代谢和内分泌变化。
[0044] 术语“乳制品”在本文是指含有任何量的液体或粉末形式的乳的产品。其还包括奶酪和酸奶。
[0045] 术语“产后”在本文是指在产犊之后立即开始并延续约六周的时间段。术语“产前”在本文是指在妊娠期间在产犊之前的时间段。术语“围产”在本文是指正好在产犊之前和之后的时间段。
[0046] 术语“回缩”在本文是指在乳牛停止产乳之后的前两至三周。
[0047] 术语“角化栓”在本文是指乳牛在干乳期停止产乳之后的乳头管/条纹管的基于角蛋白的堵塞。
[0048] 术语“微生物入侵”在本文是指例如像细菌、特别是形成脓疱或引起坏死的细菌、病毒、真菌、酵母、原生动物等的病原微生物的移动，其增殖进入体组织或体腔，从而导致可发展为感染和/或疾病的组织损伤。对于本公开而言，“微生物入侵”在本文通常是指“细菌入侵”。
[0049] 术语“溶胶-凝胶聚合物复合材料”在本文是指能够在一定条件下经历溶胶-凝胶过程以形成溶胶-凝胶状态的聚合物组合物，如本文所述。术语“固体”与“凝胶”和“固化”与“凝胶”在本文可互换使用，是指在响应于一种或多种生理刺激而发生溶胶-凝胶相变后形成的凝胶/固体。
[0050] 术语“聚合物”在本文是指包括一组大分子的材料。聚合物中包含的大分子可以是相同的或可以以一些方式彼此不同。大分子可以具有多种骨架结构中的任一种，并且可以包括一种或多种类型的单体单元。具体地，大分子可以具有线性或非线性的骨架结构。非线性骨架结构的实例包括支化骨架结构(诸如星形支化、梳状支化或树枝状支化的那些支化骨架结构)和网状骨架结构。均聚物中包含的大分子通常包括一种类型的单体单元，而共聚物中包含的大分子通常包括两种或更多种类型的单体单元。共聚物的实例包括统计共聚物、无规共聚物、交替共聚物、周期共聚物、嵌段共聚物、径向共聚物和接枝共聚物。
[0051] 如本文关于聚合物所用，术语“分子量(MW)”是指聚合物的数均分子量、重均分子量或熔融指数。
[0052] 术语“弹性模量”(也称为“杨氏模量”或储存模量(G'))在本文定义为材料中的应力随着所施加的应变的变化(即，剪切应力(单位面积的受力)与剪切应变(比例变形)的比率)。实际上，弹性模量是弹性材料的刚度的定量测量，其测量被测材料恢复到其初始形状和尺寸的能力。可以使用从胡克定律导出的公式来计算G'，所述胡克定律声明弹性模量等于应力与应变的比率(即，施加的压力与尺寸的分数变化的比率)。弹性模量的测量被报道为每单位面积上的受力(牛顿与单位面积的标准公制比率(N/m2)或帕斯卡(Pa)，其中一帕2
斯卡相当于一牛顿(1N)的力施加到一平方米(1m)的面积上)。帕斯卡单位是领域公认的术语，常常用于定义压力、拉伸强度、应力和弹性的单位。
[0053] 如本文所用，术语“剪切致稀”是指非牛顿流体的共同特征，其中流体粘度随剪切速率或应力的增大而减小。剪切致稀在悬浮液、乳液、聚合物溶液和凝胶中观察到。由于剪切致稀的属性，通过增加剪切速率可以降低聚合物、大分子或凝胶的粘度。基本上，由于增加剪切速率后粘度降低，“剪切致稀”特性是凝胶网络通过注射器活塞施加温和的手动压力而暂时变形的能力的量度。例如，可以使用这种剪切致稀现象来使刚性的生物相容性水凝胶变得不可熔。
[0054] 术语“损耗角正切tanδ”或“tanδ”在本文是指相位角的正切，即，粘性模量(G”)与弹性模量(G')的比率和对于流体中弹性的存在及程度有用的量词。tanδ值小于1指示弹性主导(即类固体)行为并且值大于1指示粘性主导(即类液体)行为。在弹性固体中，tanδ”＝0。
[0055] 如本文所用，“坚固”旨在表示弹性模量G'，其在生理温度下通常可以在约420Pa或更高、约600Pa至约10000Pa或约6000Pa至约10000Pa等的宽范围内。基于刚度水平，例如固体主体在其上被施加负荷时变形。如果材料是弹性的，则主体在移除负荷后恢复到其初始形状。“坚固固体”通常是溶胶-凝胶相转变后形成的凝胶或固体，其中在生理条件(例如，37℃和/或接近生理pH)下的G'通常高于约560Pa，虽然坚固固体可以根据制造、消毒或储存制剂的加工步骤中的其他因素在低于约560Pa或高于约10,000Pa下形成。
[0056] 本文所用的术语“生理温度”旨在表示哺乳动物的正常体温范围，例如，约35℃至约40℃、约36℃至约40℃、约37℃、约37.5℃等。
[0057] 术语“一种或多种生理刺激”在本文是指选择一个或多个刺激，其包括但不限于温度(例如体温，诸如约36℃至约40℃、或约37℃的温度)、pH(例如接近生理pH、碱性条件或酸性条件)、离子强度(例如低渗或高渗条件)等。其他类型的生理刺激包括暴露于体液，例如像，母乳或其他分泌物、血液等。另一种类型的刺激可以来自与身体化学物质或大分子的接触，诸如但不限于离子、电解质、钙、钠、细胞毒素、巨噬细胞、酶、抗原、葡萄糖、雌激素等。
[0058] 组合物的组分和特征
[0059] 一般来讲，本公开的溶胶-凝胶聚合物复合材料包含合适的酸性水基介质中的壳聚糖、亲水性聚合物、聚硅氧烷和胶凝剂。任选地，溶胶-凝胶聚合物复合材料还包括乳化剂、诸如合适的纳米晶填料的增强剂、固体微粒或水溶性添加剂、和/或一种或多种抗微生物剂。优选地，溶胶-凝胶聚合物复合材料响应于一种或多种生理刺激形成耐用密封或坚固固体。制剂表现独特的递送性、溶胀性和粘附性的组合。
[0060] 对于新型溶胶-凝胶聚合物复合材料的元素，壳聚糖在一些情况下是酰化的，例如，壳聚糖包含酰基壳聚糖，其包括但不限于羧甲基壳聚糖(CMCh)。在一些实施方案中，壳聚糖具有的脱乙酰度(％DDA)为至少约75％、至少约77％、至少约80％或至少约90％。在一些实施方案中，壳聚糖具有的％DDA为约75％、约77％、约80％、约95％、约96％、约97％、约98％、约99％或更高。亲水性聚合物包括但不限于甲基纤维素(MC)(诸如甲基纤维素醚或纤维素醚)、聚乙酸乙烯酯(PVA)、PVA酰化产物、羟丙基纤维素(HPC)、乙基羟乙基纤维素(EHEC)、羟丙基甲基纤维素(HPMC)、乙酸琥珀酸羟丙甲纤维素(HPMC-AS)、透明质酸(HA)、泊咯沙姆(非离子三嵌段共聚物)(诸如 (例如 F127和P123))、聚乙二醇
(PEG)、明胶、藻酸钠或能够形成高粘性热敏凝胶的另一种水溶性多糖。亲水性聚合物可以是酰化的。理想地，溶胶-凝胶聚合物复合材料包含甲基纤维素或PVA酰化产物，其在冷水中溶解后形成烯的混合物(浆液)并在生理温度下形成稠的凝胶。
[0061] 通常，胶凝剂是响应于刺激(例如温度)发生物理交联的热胶凝元素。在一些实施方案中，胶凝剂是盐，诸如β-甘油磷酸二钠水合物或五水合物、焦磷酸四钠、磷酸氢二钾三水合物、六偏磷酸钠、四聚磷酸钠、六聚磷酸钠、七聚磷酸钠、八聚磷酸钠、三聚磷酸钠、聚磷酸钠、铁氰化钾、其混合物等。优选地，胶凝剂是焦磷酸四钠和磷酸氢二钾三水合物盐的混合物。根据一些方面，胶凝剂是选自由以下组成的组的离子交联剂：亲脂性磷酸盐(包括辛基-和十二烷基-磷酸盐)、增塑剂(包括柠檬酸乙酰基三丁酯)、阴离子表面活性剂(辛基硫酸盐、月桂基硫酸盐、十六烷基硫酸盐、鲸蜡基硬脂基硫酸盐)、树胶(包括黄原胶)、果胶、角叉菜胶(ι、κ和λ)、藻酸盐、环糊精及其混合物。根据一些方面，胶凝剂是化学交联剂，诸如京尼平、方酸二乙酯、辛二酸二琥珀酰亚胺、戊二醛、二羧酸(包括辛二酸、谷氨酸、琥珀酸)、二异氰酸酯、其混合物等。术语“胶凝剂(gelation agent)”和“凝胶剂(gelator)”在本文中可互换使用。
[0062] 使用壳聚糖溶液(pH＜6)后，随着多个不同的多价抗衡离子发生凝胶形成。通过将壳聚糖溶液(pH＜6)与阴离子交联溶液(pH＞6)混合，可以形成真正的离子型凝胶。壳聚糖的NH2基团是质子化的并发生离子交联。
[0063] 壳聚糖与高分子量抗衡离子的交联产生胶囊，而与低分子量抗衡离子的交联产生小球。高分子量抗衡离子的实例包括但不限于聚(1-羟基-1-磺酸-2-丙烯)、聚(醛碳酸盐)、苍耳烷、果胶等。低分子量抗衡离子的实例包括但不限于焦磷酸盐、三聚磷酸盐、四聚磷酸盐、八聚磷酸盐、六偏磷酸盐、铁氰化物、六氰合铁(III)酸盐、铁氰酸钾等。使用更多疏水性抗衡离子可以制备疏水性系统。此类疏水性抗衡离子的实例包括但不限于辛基硫酸盐、月桂基硫酸盐、十六烷基硫酸盐、鲸蜡基硬脂基硫酸盐等。
[0064] 代表的聚磷酸盐可以是线性的或环状的并且可以与H O或Na O偶合。能够与本发明一起采用的聚磷酸盐的具体实例可以包括六偏磷酸钠、四聚磷酸钠、三聚磷酸钠、六聚磷酸钠、七聚磷酸钠、八聚磷酸钠等。
[0065] 优选地，在弱酸性水基介质(例如像，0.1M的乙酸水溶液)中制备溶胶-凝胶聚合物复合材料。
[0066] 溶胶-凝胶聚合物复合材料的制剂可任选地包括诸如碳酸钙或氧化铝的密度调节剂。所述材料可以添加到溶胶-凝胶聚合物复合材料中以增加组合物的比重。实例包括但不限于氯化钙、碳酸钙、硫酸钙、氧化钛、二氧化硅、硫酸铬、氯化铬、氧化锌、硫酸铁、其混合物等。
[0067] 溶胶-凝胶聚合物复合材料的制剂可任选地包括诸如纳米晶填料的增强剂。称为“纳米晶填料”的增强材料通常是纳米晶材料，例如纳米晶颗粒或聚合物，其能够通过非共价物理相互作用(诸如但不限于氢键或静电吸引)来为溶胶-凝胶聚合物复合材料提供机械增强。实例包括但不限于纳米晶纤维素(NCC)、无机粘土、有机粘土、炭黑、气相二氧化硅、石墨烯、石墨等。优选地，纳米晶填料是纳米晶纤维素(NCC)。另选地，纳米晶填料包括例如，纳米晶淀粉、纳米粘土、石墨烯、碳纳米管、有机纳米粘土或有机粘土。对于另一实例，纳米晶填料可以是蒙脱土、膨润土、高岭石、水辉石、多水高岭土等。
[0068] 在一些实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料包含增强剂，诸如无机填料，例如二氧化硅(SiO2)、二氧化钛(TiO2)。
[0069] 在一些实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料还包含磷酸钙作为增强剂。在其他实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料形成用于增强坚固固相的双网状水凝胶。双网状凝胶的特征在于特定的网状结构，其由两种类型的聚合物组分组成并且具有高含水量(约90％重量/重量)和高机械强度及韧度。
[0070] 溶胶-凝胶聚合物复合材料的制剂可以包含固体微粒添加剂、水溶性添加剂或聚合物添加剂以改善机械特性。这些添加剂能够通过非共价物理相互作用(诸如但不限于氢键或静电吸引)来为溶胶-凝胶聚合物复合材料提供机械增强。实例包括但不限于水溶性聚(环氧乙烷)、聚丙烯酸、 交联的聚丙烯酸聚合物、聚乙烯吡咯烷酮、聚(乙烯醇)、脂肪酸(包括硬脂酸)、乳化剂(包括单硬脂酸甘油酯、甘油单月桂酸酯)、聚丙烯酰胺、双丙烯酰胺、 R 972疏水性二氧化硅、诸如二甲聚硅氧烷(PDMS)的聚硅氧烷等。
[0071] 聚硅氧烷可以是有机硅材料，其在一些情况下包括填料。根据一个方面，聚硅氧烷可以是购自Wacker Chemie AG的 可以提供聚硅氧烷作为疏水性添加剂，用于所形成的栓的粘结性和稳定性。在一些情况下，可以使用 RT 625A，其
包含专有量的聚二甲基氢化甲基硅氧烷、硅氮烷处理的二氧化硅HDK和乙烯基封端的聚二甲基硅氧烷。
[0072] 根据本公开的组合物可以包括聚硅氧烷，其以组合物的约70重量％或更少的量存在，并且优选地以组合物的约5重量％至约70重量％的量存在，并且更优选地以组合物的约30重量％至约70重量％的量存在，并且更优选地以组合物的约45重量％至约55重量％的量存在，并且甚至更优选地以组合物的约50重量％至约51重量％的量存在。包括聚硅氧烷的此类组合物还可以包含组合物的约0.25重量％至约0.35重量％的量的盐溶液(包括盐混合物)、组合物的约0.5重量％至约1.5重量％并且更优选约1％重量的量的壳聚糖、组合物的约0.4重量％至约0.6重量％并且更优选地0.5重量％的量的乙酸以及组合物的约4.5重量％至约5.5重量％的量的亲水性聚合物(例如甲基纤维素)。在一些情况下，可以提供第一盐组分和第二盐组分。
[0073] 具有聚硅氧烷的此类组合物可以具有以下物理特性：最大初始(剪切前)粘度范围为约400-1400Pa-s；平均剪切粘度范围为约10-25Pa-s；结构恢复范围为约96％-250％；比重(密度)在约1.03–1.1g/mL范围内；注射力为约130–150N；以及pH在约4.0-6.2范围内。
[0074] 所述组合物还可以任选地包含一种或多种药剂，特别是具有抗细菌、抗病毒、抗真菌或抗寄生虫活性等的抗微生物剂。一种或多种抗微生物剂将在组合物形成时被捕获在所述组合物中并且立即或在一段时间之后从所述组合物中释放。
[0075] 由于乳腺炎的典型的攻击病原体是细菌，所以溶胶-凝胶聚合物复合材料可以有利地包含抗细菌剂。存在可用于动物中的许多抗细菌剂。这些抗细菌剂包括但不限于以下各项：大环内酯类，例如托拉霉素( )、泰地罗新( )、替米考星()、磷酸泰乐菌素( )和加米霉素( )；头孢菌素类，例如头孢噻呋
钠(例如， 和 )、盐酸头孢噻呋(例如，Excenel Excenel RTU
)、头孢噻呋晶体游离酸( )、头孢维星钠( )和
头孢泊肟酯( )；林可酰胺类抗生素类，例如林可霉素( )、盐酸吡利
霉素( )和盐酸克林霉素( )；氟喹诺酮类，例如达氟沙星( )、
恩诺沙星( )和马波沙星( )；以及四环素类，例如氯四环素、氧四环素
和强力霉素。其他抗细菌剂包括但不限于青霉素衍生物，诸如单独或与克拉维酸()一起的阿莫西林三水物、大观霉素( )；增效磺胺类，包括甲氧苄氨
嘧啶/磺胺嘧啶( )和磺胺地索辛/奥美普林( )；氯霉素及其衍生物，诸
如甲砜霉素和甲砜霉素的氟化合成类似物(诸如氟苯尼考(例如 和
Gold))。抗微生物剂可以与本公开的组合物同时或依次施用。
[0076] 根据一些方面，根据本公开的组合物可以包含连续水性溶胶-凝胶聚合物相和不连续油相的不混溶的混合物。如本文所用，“连续水性溶胶-凝胶聚合物相”是指乳液中分散有不连续油相的部分。因此，“不连续油相”是指分散在连续水性液相内且不与其混溶的离散元素的多重性。
[0077] 根据本公开的稳定的水包油乳液可以包括油、一种或多种乳化剂和溶胶-凝胶聚合物复合材料，其中所述溶胶-凝胶复合材料以乳液的约55体积％至约90体积％存在，并且其中所述油以乳液的约10重量％至约45重量％的量存在。
[0078] “乳化剂”是指促进水包油乳液的稳定性的材料，使得不连续的油相在连续的水性液相中基本上保持分散。通常，乳化剂至少部分地可溶于至少连续的水性液相或不连续的油相中。根据一些实施方案，乳化剂部分地可溶于连续的水性液相和不连续的油相中。根据本公开所用的乳化剂可以包括两亲性表面活性剂或亲水性及疏水性表面活性剂的组合。特别感兴趣的乳化剂包括但不限于阿拉伯胶、改性阿拉伯胶、卵磷脂、琼脂、印度树胶、改性印度树胶、果胶、角叉菜胶、黄原胶、改性淀粉特别是改性食品淀粉(例如，改性玉米淀粉)、改性藻酸盐(例如藻酸的酯，诸如藻酸丙二醇酯)、聚氧乙烯山梨醇酐、聚氧乙烯山梨醇酐酯(例如聚山梨醇酯20、聚山梨醇酯80等)、糖酯(例如蔗糖单硬脂酸酯等)及其组合、脂肪醇(例如十六十八醇、十六硬脂酸酯、十六基硬脂醇等)、单和/或二甘油酯、蛋白质及其组合。
[0079] 本公开的溶胶-凝胶聚合物复合材料通常在约37℃的温度下，可以响应于一种或多种生理刺激而形成耐用密封或坚固固体。理想地，“坚固”固体溶胶-凝胶聚合物意味着弹性模量G'(也称为存储模量(G'))在生理温度下至少为约420Pa或更高。“坚固固体”通常是溶胶-凝胶相变后形成的凝胶或固体，其中在生理条件(例如，37℃和/或接近生理pH)下的G'通常为高于约560Pa、常常为约600Pa或更高，但也包括约450Pa至约10000Pa并且包括但不限于约490Pa、约560Pa、约650Pa、约800Pa、约1700Pa、约1900Pa、约2500Pa、约5500Pa、约6000Pa、约6500Pa、约7000Pa、约7500Pa、约8000Pa、约8500Pa、约9800、约9000Pa、约9500Pa、约10,000Pa或更高的值等。在一些实施方案中，G'为约450Pa至约600Pa、约500Pa至约
1000Pa、约1000Pa至约6000Pa、约5000Pa至约9800Pa、约7000Pa至约10,000Pa、约8500Pa至约10,000Pa等。本公开的“坚固”固体溶胶-凝胶聚合物复合材料通常比已知较弱的已知壳聚糖水凝胶更坚固(换句话讲，坚固固体溶胶-凝胶聚合物复合材料具有比已知壳聚糖水凝胶更坚固或更高的机械特性)。在其他实施方案中，可用作乳头密封剂的溶胶-凝胶聚合物复合材料的G'可以为约420Pa至约9800Pa或以上，其中所述聚合物复合材料被出乎意料地发现不熔化且不渗漏并且响应于生理刺激而形成耐用密封，与本文所述的更坚固的聚合物复合材料相似。
[0080] 优选地，溶胶-凝胶聚合物复合材料具有热增稠特性，使其能够响应于一种或多种生理刺激(诸如生理温度)而快速胶凝或固化，以在不添加任何其他试剂的情况下形成耐用密封或坚固固体。此外，如本文所述，溶胶-凝胶聚合物复合材料响应于一种或多种生理刺激而非常快速地胶凝或固化，并且形成具有机械或粘弹性特性的密封或固体块，其中所述固体具有足够的强度以独特地使其能够在动物的生理条件下承受机械压力或液压。在一些情况下，溶胶-凝胶聚合物复合材料可以在几秒钟内胶凝或固化，即在暴露于生理刺激后(例如，在注入到乳畜中后)，瞬间或几乎瞬间胶凝或固化。本文提供的溶胶-凝胶聚合物复合材料响应于生理刺激而经历如此快速的液-固相变，以致注射部位快速形成栓。溶胶-凝胶聚合物复合材料示出良好的剪切致稀特性，即当剪切速率增加时，其粘度将降低，这有利地允许即使固化已经发生，所述溶胶-凝胶聚合物复合材料也能够在室温下容易地注入或在注入前在注射器中变形。由于有益的剪切致稀特性，溶胶-凝胶聚合物复合材料可以包括具有高孔隙度和/或弹性的固体结构，以便更好地操纵材料以密封乳头区域，但允许释放治疗乳腺炎所需的药剂。
[0081] 与使用本领域已知的在动态生理环境下容易扩散和渗漏的弱凝胶的缺点相反，本发明的溶胶-凝胶聚合物复合材料的另一优点在于其能够快速固化使得所述复合材料能够提供瞬间胶凝、弹性密封或坚固固体，其允许容易通过注射器输注而不渗漏或滴漏并且在注入到乳畜的乳头管或乳头窦之后快速形成无渗漏、无滴漏的溶胶-凝胶栓。在一些情况下，溶胶-凝胶聚合物复合材料能够使用单筒注射器来施用。
[0082] 由于溶胶-凝胶聚合物制剂响应于温度、pH和离子强度的变化的特性，在不施加力的情况下，它们可以形成持久的密封或坚固的凝胶/固体，但是在施加外力的情况下，例如在注射器中，它们可以流动并且是可注射的。所述复合材料还可以在输注后形成耐用的弹性凝胶、泡沫或多孔固体。
[0083] 在特别设计的溶胶-凝胶聚合物复合材料中看到的其他有价值的技术效果是形成用于增加粘度的聚合物中的疏水性取代物、能够在生理流体中交联的微凝胶球和能够用于药物释放的微凝胶球的能力，以及控制动物退化的速率和形成在生理温度下具有在受试者中的特定孔尺寸和理想的粘弹性特性的多孔固体的能力。
[0084] 有利地，水基溶胶-凝胶聚合物制剂能够被直接注入到产乳动物的乳头管中并且在干乳期期间形成牢固的密封剂。所述制剂能够在乳的存在下和在通常见于乳腺的干乳期时的高离子含量下在37℃下形成这种不可渗透的密封。
[0085] 用于制备溶胶-凝胶聚合物复合材料的方法
[0086] 溶胶-凝胶工艺是广泛应用于材料科学和工程领域的湿化学技术。此类方法主要用于从胶体溶液(溶胶)开始制造材料，所述胶体溶液充当离散颗粒或网状聚合物的集成网络(或凝胶)的前体。在溶胶-凝胶工艺中，胶体固体(溶胶)的流体悬浮液逐渐演化形成凝胶状的双相系统，所述系统包含液相和固相，其形态在从离散颗粒到连续的聚合物网络之间(对于一般信息，参见C.J.Brinker和G.W.Scherer,1990,Sol-Gel Science：The Physics and Chemistry of Sol-Gel Processing,Academic Press,ISBN 0121349705；L.L.Hench和J.K.West,1990,The Sol-Gel Process,Chemical Reviews 90:33)。
[0087] 在一些情况下,聚合物的反应性和功能性可以通过增加一组官能团来改变，所述官能团包括但不限于酸酐，氨基酸或盐，N-取代的氨基，酰胺，羰基，羧基或盐，环己基环氧树脂，环氧树脂，缩水甘油基，羟基，异氰酸酯，尿素，醛，酯，醚，烷基，烯基，炔基，硫醇，二硫化物，甲硅烷基或硅烷，或选自乙二醛、氮杂环丙烷、活性亚甲基化合物或其他β-二羰基化合物(例如，2,4-戊二酮、丙二酸、乙酰丙酮、丙酮乙酸乙酯、丙二酰胺、乙酰基乙酰胺及其甲基类似物、乙酰乙酸乙酯和乙酰乙酸异丙酯)的基团，卤素，氢化物，或其他极性的或H键合的基团，及其组合。此类官能团可以沿着聚合物添加在各种地方，诸如随机或有规律地沿着聚合物分散在聚合物的末端，结晶侧链上的一侧、末端或任何位置上，作为聚合物的独立悬空侧基附接或者直接附接到聚合物的骨架。此外，聚合物能够交联、缠结或氢键合以便提高其机械强度或其在环境或工艺条件下对降解的抗性。
[0088] 如应当理解，聚合物可以具有不同分子量的多种形式来提供，因为聚合物的分子量(MW)可以取决于用于形成所述聚合物的工艺条件。因此，聚合物在本文可以称为具有特定的分子量或分子量的范围。
[0089] 溶胶-凝胶聚合物复合材料依赖于快速、盐诱导且热致可逆的基于壳聚糖的胶凝系统，所述系统是通过将壳聚糖与形成高粘性热敏凝胶的亲水性聚合物(例如水溶性多糖)混合来形成的。这些水溶胀性聚合物复合制剂在温度、pH和离子强度增加后发生快速胶凝。所述复合材料通常包含两种亲水性聚合物和离子凝胶剂。第一聚合物发生由温度引起的胶凝并且使得能够在生理温度下，例如在约37℃下，在乳头管中形成弹性凝胶。第二聚合物在与引入到制剂的离子凝胶剂(胶凝剂)接触后形成凝胶。添加凝胶剂(即热胶凝元素)后，所述系统产生物理交联。胶凝基本上是由于作为产品中的主要成分的聚合物的物理构象变化，其中聚合物之间不形成共价交联键。第二聚合物的凝胶强度取决于添加的凝胶剂的量，以及制剂的pH和离子强度，所述制剂通常具有约5.1至6.8的pH和约5g/L的离子强度。所述两种亲水性聚合物对壳聚糖的胶凝有深远的影响，从而导致快速响应于诸如盐添加和体温的刺激。因此，在干乳的乳头管中的pH和离子含量变化时，凝胶被增强。
[0090] 通过仔细调节系统中的聚合物、盐和胶凝剂浓度，可以微调所述系统的胶凝温度以及机械特性或完整性，二者都低于和高于胶凝阈值，包括在生理条件(例如温度)下凝胶形成的速度和可逆性以及生物相容性、粘弹性特性(例如G')、系统的渗透性/孔隙度和在胶凝后形成的密封或坚固固体的耐久性。例如，可以操纵聚合物、盐添加和胶凝剂以使溶胶-凝胶聚合物复合材料适用于需要具有特定孔尺寸并具有耐用的弹性特性的大孔固体的特别设计的人类或兽医用途，或者适用于需要具有高孔隙度或具有特定孔尺寸以允许诸如抗生素的生物分子自由通过的固体的结构的应用。
[0091] 此外，溶胶-凝胶聚合物制剂可以优先出于相容性来设计并与例如乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)、乳酸乳球菌乳脂亚种(L.lactis subsp.cremoris)、嗜热链球菌(Streptococcus thermophilus)等的奶酪发酵剂一起使用。由于活性发酵剂需要实现制造奶酪的工艺的正确酸化来起作用，所以可以通过改变盐组分分来适当地调节聚合物制剂的酸度，以避免干扰培养活性和生长。因此，为了使溶胶-凝胶聚合物制剂与奶酪发酵剂有利地相容，容易地改变盐组分以中和最终产品的酸度。例如，通常，pH为约6.8(相对中性)的制剂不抑制标准的细菌培养并将发现与奶酪发酵剂一起使用。
[0092] 为了示出本公开的某些制剂，溶胶-凝胶聚合物包含约7.3％质量/质量的甲基纤维素、约1.8％质量/质量的壳聚糖、约9.4％质量/质量的焦磷酸钠(作为溶解盐)、约0.05％质量/质量的焦磷酸四钠(作为固体盐)和约82％质量/质量的0.1M乙酸水溶液。这种复合材料在本文称为“F1”或“F1-20141210”制剂。在第二实施方案中，所述溶胶-凝胶聚合物复合材料包含约7.3％质量/质量的甲基纤维素、约1.8％质量/质量的壳聚糖、约9.1％质量/质量的β-甘油磷酸二钠(作为溶解盐)、约3.0％质量/质量的β-甘油磷酸二钠(作为固体盐)和约82％质量/质量的0.1M乙酸水溶液。这种复合材料在本文称为“F4”或“F4-20141210”制剂。为了比较，制备另一溶胶-凝胶聚合物复合材料，诸如下表B和表C所示的F2或F3制剂。在另外的例子中，溶胶-凝胶聚合物复合材料包含在乙酸中的0.5％质量/质量、1％质量/质量或2％质量/质量的壳聚糖溶液中的约16％质量/质量、17％质量/质量或18％质量/质量的F127。在另一个实施方案中，所述溶胶-凝胶聚合物复合材料包含下表4列出的壳聚糖- F127溶液中的一种。
[0093] 作为一般规则，本公开的溶胶-凝胶聚合物复合制剂中的成分的量可以一定程度地改变。例如，在上文示出的F1至F4制剂中，甲基纤维素的量可以在约4％质量/质量至约12％质量/质量之间的范围内，壳聚糖可以在约0.5％质量/质量至约4％质量/质量之间的范围内，溶解盐或胶凝剂可以在约6％质量/质量至约12％质量/质量之间的范围内，固体盐可以在约0.01％质量/质量至约4％质量/质量之间的范围内，并且可以使用大于0.1M的较高浓度的乙酸水溶液。然而应当理解，某些组合的范围可以易于调节，包括比所述范围高或低的量，以便形成本文所述的具有所需特性的凝胶或水凝胶。
[0094] 溶胶-凝胶聚合物复合材料的用途
[0095] 本文提供的溶胶-凝胶聚合物复合材料响应于一种或多种生理刺激而发生液固相变。因此，它们可以具有在广泛范围的动物和人类健康应用中的用途，其中理想的是注射一种在注射到受试者中之后快速固化的液体。特别地，溶胶-凝胶聚合物可以用于理想地设置有固体结构的应用，所述固体结构具有高孔隙度、弹性或足够的强度以承受在受试者的生理条件下的机械压力或液压。
[0096] 应当理解，用于特定应用的溶胶-凝胶聚合物复合材料的适用性将取决于多个因素，诸如它们的生物相容性、机械完整性、在生理条件(例如温度)下形成凝胶的速度和可逆性、机械或粘弹性特性(例如G')、孔隙度/渗透性和耐久性。如本文所述，根据目前的技术，可以通过调节系统中的聚合物和胶凝剂的浓度来确定此类特性。例如，在一些实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料适用于需要具有特定孔尺寸并具有耐用的弹性特性的大孔固体的应用，或者需要具有高孔隙度或特定孔尺寸以允许诸如葡萄糖、氧气或胰岛素的生物分子自由通过的固体的结构的应用。
[0097] 在一些实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料适用于需要在受试者的管口内部形成无渗漏、无滴漏的栓的应用。例如，可以发现它们用作黏膜粘着植入物、眼部滴剂、透皮药贴、牙齿植入物、阴道栓剂等，这些需要无渗漏、无滴漏的栓，人造椎间盘和软骨也一样。
[0098] 对于其他实施方案，所述溶胶-凝胶聚合复合材料适用于组织工程，其中植入物可替换关节内的恶化的或以其他方式损害的软骨。就这一点而言，所述复合材料适用于人造软骨。由于软骨组织对于正常的关节功能是重要的，所以存在对于用于替换因损伤或老化而受损的组织的治疗用途的人造软骨的需要。用于人造软骨的潜在材料需要是粘弹性、坚固且耐用的，类似本文提供的溶胶-凝胶聚合物复合材料。因此，溶胶-凝胶聚合物复合材料可用于关节手术，植入膝关节，用作角膜修复材料，或用于修复、替换或治疗性治疗组织和身体部分。溶胶-凝胶聚合物复合材料可以在注射后形成耐用的弹性凝胶，并且在滑液和骨中的离子存在下，形成人造软骨、半月板或髓核。
[0099] 所述复合材料还可以有利地用作可注射的植入物来治疗骨关节炎、类风湿性关节炎、其他炎性疾病、全身性关节疼痛或其他关节疾病，用于创伤愈合或用作栓剂。在一些实施方案中，可以注射溶胶-凝胶聚合物复合材料以在受试者中快速形成栓，特别是在液-固转换响应于生理刺激而如此快速地发生以至于在注射部位处瞬间形成栓的情况下。例如，可以将溶胶-凝胶聚合物复合材料注射到胰腺的胰岛中以便免疫隔离胰岛细胞并允许葡萄糖和氧气的自由通过。
[0100] 在某些实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料可用作栓塞剂或闭塞剂以例如阻塞动脉或饿死癌细胞。在其他实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料可用作超声造影剂。在又其他实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料适用于与能够形成大孔或微孔基质的细胞一起注射用于组织工程。
[0101] 另选的实施方案发现，溶胶-凝胶聚合物复合材料适于用作重建或整容手术的填充剂；用于药物递送系统，例如作为治疗剂缓慢释放递送的平台；或者用于治疗静脉曲张，例如形成可注射的泡沫。在一些实施方案中，溶胶-凝胶聚合物复合材料适于用作治疗子宫肌瘤的填充剂或用作牙齿植入物。所述复合材料还适用于伤口的止血，例如在注射后形成多孔固体以阻断血流，例如阻塞牙小管，并且适于用作脑植入物以及用作牙齿上的成膜性聚合物。
[0102] 用作动物的乳头密封剂的溶胶-凝胶聚合物复合材料
[0103] 应当理解，包括本公开的溶胶-凝胶聚合物复合材料的乳头密封剂的所需特征将根据密封剂的预期使用而改变，诸如其将应用的地方(例如，乳腺组织外部或乳头腔内)、密封剂的配方和其他因素。然而，可以陈述乳头密封剂的一些一般特征。例如，在密封剂被放置在乳房内的乳头管中的情况下，可定制的剪切致稀特征使得易于输注以及通过从乳头管中手动剥离的移除。有利的是，附着的乳头密封剂易于从乳头移除。通过调节乳头密封剂的配方，可以使溶胶-凝胶聚合物复合材料足够坚固使得密封剂可以容易地从乳头上脱落，并在第一次剥离中以一个粘结单元移除且几乎不留下材料。当溶胶-凝胶聚合物复合材料用作宏观或微观水平的栓时，它们可以被配制成具有适当范围的粘附性，其组合物允许原位形成以粘附到组织并尽可能长时间地保持在适当的位置，同时仍然易于从部位处手动移除。另外，如果这些组合物栓塞在需要屏障保留或吸收流体的位置中，则组合物可以被配制成在保留在其所需位置的同时天然地吸收流体。
[0104] 还有利地，本公开的原位形成的乳头密封剂可适形于乳头或乳头管的形状。所述溶胶-凝胶聚合物复合材料的柔软特性使所述密封剂适形于乳头表面或乳头管以及乳头周围的组织表面的形貌以良好贴合。此类适形能力还延伸乳头密封剂的保质期、舒适度和功效。
[0105] 本公开的可用作乳头密封剂的溶胶-凝胶聚合物复合材料还是安全且稳定的。所述密封剂的无毒特性为目标动物以及动物的人类驯养者和在动物上的密封剂施加器提供了安全性。因为乳头密封剂在乳线或相关的室内设备中不产生残余密封剂的积聚，所以密封剂的无毒性还确保能够安全食用人类食物产品，诸如乳和从经治疗的动物获得的乳制成的乳制品。在一些情况下，以最终乳头密封剂制剂中存在的量，所有的组合物成分都是非重金属性质的、生物相容的、可生物降解的、组织附着的并对动物无刺激。而在一些其他情况下，所述组合物成分可以包括不可生物降解的合成材料。由于溶胶-凝胶聚合物复合材料适用于注入动物乳腺，所以可以使它们不含有毒材料、刺激物等，并适于在温度、pH、离子强度等的生理条件下使用。此外，溶胶-凝胶聚合物复合材料能够易于通过标准蒸汽、干式灭菌器(高压釜)、γ射线照射、电子束灭菌法(电子束消毒)等来进行消毒。防腐剂也可以包括在所述组合物中，而不改变乳头密封剂的有益特性。
[0106] 根据递送方法，乳头密封剂的配方中特别设计了粘度，以使其适用于局部应用、输注等。因此，控制溶胶-凝胶聚合物复合材料的粘度使得可以将所述组合物以形成优异屏障的方式喷雾或液流到乳头上或乳头中。所述溶胶-凝胶聚合物复合材料还易于穿过注射器，并具有优异的剪切致稀特性，其对于在室温下在注射器中模塑所述复合材料是必要的，以便于动物驯养者快速而方便地使用产品。特别地，溶胶-凝胶聚合物复合材料有利地能够使用单筒注射器来注入。当直接注入乳头时，所述制剂具有填充乳头管并在体温下迅速转变成凝胶的能力。所述制剂的剪切致稀特性允许易于注入和易于移除。
[0107] 所述组合物在乳头上的胶凝优选为快速的，以避免组合物从施加的地方流失或损耗。胶凝时间可以为约5分钟或更少、优选少于约三分钟、更优选地少于约30秒，并且在一些情况下，特别是在外部施用溶胶-凝胶聚合物复合材料时，低至约10秒或更少。
[0108] 通过调节溶胶-凝胶聚合物复合材料中的聚合物和胶凝剂浓度以改变耐用密封或坚固固体的机械特性和渗透性/孔隙度，来获得本公开可用的乳头密封剂的若干所需的上述特征。基本上，通过特别设计所述制剂来控制乳头密封剂的粘附性和溶胀特性。具有粘附性和溶胀特性的特定组合的溶胶-凝胶聚合物复合材料表现出无比且新的特性，诸如延长附着到动物组织上的时间段但在预防性治疗结束时容易作为乳头屏障被移除，或足够坚固以从动物乳头完整剥离或容易以半固体或液体形式移除但足够柔性以舒适适形于动物身体并且作为有效屏障保持在适当位置以预防或降低乳腺病症的发病率。
[0109] 乳头密封剂复合材料的递送
[0110] 适当的粘度取决于所采用的递送方式。一般来讲，在室温下或使用条件期间(即，不在动物中)，组合物应具有小于约800cps、优选小于300cps、更优选小于200cps的粘度以通过气溶胶递送。通过泵喷雾进行递送正常需要较低粘度，诸如小于约150cps。在无气溶胶的情况下喷雾需要小于约50cps的粘度。
[0111] 所述乳头密封剂制剂通过例如像，从注射器、泵、喷雾嘴、气溶胶、浸液或其他类型的装置的喷雾或液流的常规方式施加到乳头。喷雾和液流的组合可以类似于淋浴头的方法试施加，由此多个液流提供模拟的喷雾应用的广泛覆盖。溶胶-凝胶聚合物复合材料从外部被喷射或流到乳头组织上，它们在其上形成屏障密封。
[0112] 为了通过注入乳头内(诸如乳头窦或乳头池中)的施加，可使用专门为将溶液插入乳头管而制成的具有锥形注射器端部、乳头针或乳房内尖端的任何兽医注射器。例如，可以使用标准的5mL或6mL注射器通过常规的输液插管或输液喷嘴来插入凝胶。将在乳头管中形成所需的物理屏障以便预防或治疗乳腺病症的乳头密封剂的有效量取决于乳畜物种及其乳头尺寸。通常，2mL与3mL之间的体积满足充分填充乳头管，但是所述量可以改变并能够容易地由驯养者滴定，从而将密封剂注入乳头中。
[0113] 一般来讲，约0.5mL至5.0mL、优选约1.0mL至4.0mL、更优选约2.0mL或更高、并且甚至更优选约3.0mL的组合物将被施用到动物乳头。制剂可以预加载到注射器中以易于单位剂量施用。有利地，当乳畜进入泌乳周期结束时的干乳期或处于动物的干乳期期间时，特别是在所述乳畜是小母牛或乳牛时，施用所述组合物。
[0114] 还可以从喷雾装置或液流装置将所述组合物从外部或直接地递送到乳头。喷雾装置可以包括具有用于喷雾递送液体组合物的分配器的容器。所使用的容器类型是可变的，这取决于与组合物的相容性以及喷雾分配器，并且可以是玻璃、塑料或金属。如果溶液具有足够低的粘度，喷雾递送则可以使用简单的机械力来实现，诸如在手动压制注射器的柱塞通过适当设计的喷嘴时获得的那些机械力。可能理想地将组合物的若干个层施加到乳头以确保乳头的足够覆盖。在任何情况下，通过密封剂在乳头上的视觉外观可以容易地确定形成物理屏障的有效量。
[0115] 所述组合物还可以使用装备有喷头的注射器来递送。通常，用于将液体组合物作为喷雾从容器中推进的任何化学、机械或电子方法是适当的。一方面，将相容性液体或气体气溶胶推进剂连同组合物一起放置在适当的容器中，并且分配器包括使液体组合物能够汽化喷雾递送的阀门机构。理想地，可以使用乳房内输注装置将乳头密封剂组合物直接递送到乳头。所述装置可以具有单个分配器，诸如来自Nordson Corporation(Westlake,Ohio,U.S.A.)的喷雾尖端。所述装置可以包括计量器，使得组合物的量可以得到控制。
[0116] 可以使用或修改用于递送组合物(诸如乳头密封剂)的装置的实例包括描述于以下中的装置：WO 2015/038281(Zoetis)、美国专利申请号2015/0080841(C.M.Bradley等人)、美国专利号5,989,215(Y.Delmotte等人)、美国专利号8,353,877(S.Hallahan等人)、WO 2003/022245(Bimeda Research&Development Limited)和WO 2013/021186(Norbrook Laboratories Limited)。
[0117] 上述描述示出如何制备新型溶胶-凝胶聚合物复合制剂及其在本公开中使用的独特特性。以下实施例展示本公开的其他方面。然而，应当理解，这些实施例仅用于说明并且不声称完全确定的本公开的条件和范围。除非另有说明，否则化学品均购自St.Louis,Missouri的Sigma-Aldrich。应当理解，制备溶胶-凝胶聚合物复合材料中的步骤顺序不是关键的并且可以随实施例而变化。例如，可以改变将原料引入罐中的顺序(诸如首先添加甲基纤维素而不是首先添加壳聚糖等)而不损害最终产品。还应当理解，当给定典型的反应条件(例如，温度、反应时间等)时，虽然通常不太方便，但是也可以使用高于和低于指定范围的条件。除非另有说明，否则实施例均在室温(约23℃至约28℃)和在大气压下进行。除非另有说明，否则本文所引用的所有份数和百分比均以重量为基础并且所有温度均以摄氏度表示。
[0118] 可从以下非限制性实施例获得对本公开的进一步理解。
[0119] 实施例1
[0120] 溶胶-凝胶聚合物复合材料的制备及特性
[0121] 如下制备四种聚合物复合制剂(F1、F2、F3和F4)。表A、表B、表C和表D分别示出F1制剂、F2制剂、F3制剂和F4制剂。如表中所示，制剂分别以约30g、110g或165g的批次制备。
[0122] 表A.F1制剂
[0123]
[0124]
[0125] 表B.F2制剂
[0126]
[0127]
[0128] 表C.F3制剂
[0129]
[0130]
[0131] 表D.F4制剂
[0132]
[0133]
[0134] F1和F4制剂的制备如下：首先，对于F1，通过添加0.813g(0.772mL)AcOH到135.5mL水中来制备0.1M AcOH。对于F4，添加0.81g(0.77mL)AcOH到135.0mL水中。接着，制备在0.1N(0.1M)AcOH中的甲基纤维素(12g)、壳聚糖(3g)的溶液(对于F1为135.5mL，并且对于F4为135.0mL)。通过将聚合物粉末添加到在剧烈搅拌下加热至85℃-90℃的0.1N(0.1M)AcOH中来制备溶液。继续加热直到得到均匀分散体(约5分钟)。然后，在搅拌下(300rpm)将溶液冷却至室温。冷却后，溶液澄清且变得非常粘稠，需要降低搅拌速度至60-100rpm。冷却和澄清需要约1小时。随后将所述溶液储存于4℃下直至以后使用。
[0135] 然后，通过将粉末形式的盐与水混合来制备在水中的胶凝剂(盐在制剂中起胶凝剂的作用，在本文中也称为“凝胶剂”试剂)的溶液。盐溶液的浓度如下：对于F1，通过将100mg焦磷酸四钠添加到20mL水中并搅拌至完全溶解，来制备焦磷酸四钠(5g/L)。对于F4，通过将22g的β-甘油磷酸二钠水合物(作为44％重量/重量的水性溶液)添加到33mL水中并在搅拌下在45℃加热至完全溶解，来制备β-甘油磷酸二钠水合物(作为44％重量/重量的水性溶液)(每66g水中44g)。
[0136] 将由此制备的凝胶剂溶液在缓慢的机械搅拌(使用100rpm下的搅拌器)下加入到冷的聚合物溶液，直到均匀。观察到显著的粘度增强和气泡形成。然后，溶液在4℃下静置过夜。制剂通过在液体循环中高压灭菌来消毒。
[0137] F2和F3制剂的制备如下：通过添加0.6g(0.57mL)AcOH到100mL水中来制备0.1M AcOH。制备在0.1N AcOH(90mL)中的甲基纤维素(8g)、壳聚糖(2g)和叠氮化钠(0.025g)的溶液。对带有搅拌器的烧杯进行称重。通过在搅拌下将粉末(一次性)加入到加热至沸腾(85-90℃)的0.1N AcOH中来制备溶液。停止加热并通过使用小铲搅拌约3分钟来获得均匀的分散体。加入AcOH直到实现最终重量(无盐)来完成。然后，将溶液冷却至室温。冷却后，溶液澄清且变得非常粘稠。冷却和澄清需要约1小时。使用石蜡膜覆盖烧杯并在4℃下储存24小时(或直到下一步使用)。
[0138] 然后，通过将粉末形式的盐与水混合至所需浓度来制备在水中的胶凝剂的溶液(盐作为胶凝剂或凝胶剂)。在缓慢的机械搅拌下(使用100rpm下的小铲或搅拌器)将胶凝溶液加入到冷的聚合物溶液中。观察到显著的粘度增强和气泡形成。溶液在4℃下静置过夜。将溶液以4000rpm离心10分钟以便消除气泡。
[0139] 中测试制剂中的在各种浓度下的若干种聚合物，以选择对制剂性能最有利的聚合物及其浓度。还测试各种胶凝剂以调整制剂的温度响应性、其可注射性和其流动特性。然后，选择具有宽范围的流动特性的四种溶胶-凝胶聚合物复合制剂(F1-F4)，进行进一步测试。
[0140] 表E示出F1-F4样品的初步表征。注意凝胶的pH在约6与7之间。在此实验中，示出凝胶可以使用6mL注射器通过标准的16号针头来注射，这证明了它们通过乳头针或喷嘴进行输注以用作乳头密封胶的独特能力。对于表E中的数据，测试的制剂是使用表A-D中的总计110g的成分和量来制备的制剂。
[0141] 表E.聚合物复合制剂F1-F4的特性
[0142]
[0143] 在37℃下，通过将所述制剂方(1.5-2mL)加入到含有0.5mL乳(3.5％脂肪)的试管中，来测试在乳存在下的栓形成。所有制剂均在乳表面形成凝胶栓。对乳与凝胶之间界面的检测示出，虽然在添加凝胶到乳后制剂与乳之间预期会有一定程度的混合，但是在形成栓后，样品出乎意料地示出与乳的非常有限的混溶性。结果指出，所述制剂能够在乳的存在下形成凝胶并防止从试管渗漏。
[0144] 进行应力扫描测试(即测量作为应力在固定频率下的函数的弹性模量和损耗模量)来确认样品的剪切致稀特征。结果示于图6中。对于图6中的数据，测试的制剂是使用表A-D中的总计110g的成分和量来制备的制剂。
[0145] 在低施加应力下，弹性模量G'的值为常数。样品的弹性覆盖宽的范围，在F1的约10Pa至F4的约440Pa范围内。在较高的应力值下观察到剪切致稀行为(即作为施加应力的函数的弹性模量G'的减小)。剪切致稀区域从F2制剂的最低应力开始，之后是F1、F3和F4。这些结果确认样品是可注射的并且它们的输注是可行的。由于在制剂输注和治疗后的乳头剥离期间施加的力远远超过300Pa，所以所有制剂都不会发生任何递送或回收问题。
[0146] 接下来，当温度从室温突然跳到体温时，对制剂的流变特性进行监测。随后是在1Pa的恒定应力(即在平台区)和频率(f＝0.1Hz)下作为时间的函数的弹性模量和存储模量的值。在实验的第一步骤(10分钟)中，温度保持在25℃。在第二步骤(10分钟)中，温度固定在37℃。两个步骤之间的加热过程花费约20秒。结果示于表F和图7中；它们表示为弹性模量G'和损耗角正切tanδ＝G”/G'，弹性与粘性特性的比率示出哪个占主导。在tanδ值为1的情况下，材料的弹性和粘性特性相等。损耗角正切越小，材料的弹性越大。对于物理凝胶，G'＞G”且tanδ＜1。对于粘性液体，G”＞G'且tanδ＞1。对于表F和图7中的数据，测试的制剂是使用表A-D中的总计110g的成分和量来制备的制剂。应当理解，值可以基于设备和采用的流变学方法变化；并且此外，根据特定的测试协议，这些值彼此相对。
[0147] 表F.溶胶-凝胶聚合物复合自己F1-F4的流变学测试的结果(在施加应力之后10分钟记录G'和tanδ的值。角频率f＝0.1Hz，振荡应力τ＝1Pa)
[0148]
[0149] 如从53(F1)至20(F4)变化的G'(37℃)/G'(25℃)的比率的值(表E)所证实的那样，F1-F4的弹性随温度的升高而显著增加。在室温下，F1的作用类似粘性液体(tanδ＞1)。三种其他制剂示出以F3＜F2＜F4的顺序变得更明显的类固体行为。
[0150] 在37℃时，弹性模量显著增加。这伴有损耗正切角的快速减小，表明凝胶结构的增强。F2、F3和F4的这个过程花费约1-2分钟。对于F1制剂，时间稍微更长(约5分钟)。
[0151] 总之，制备并表征覆盖宽范围的流动特性的四种溶胶-凝胶聚合物复合制剂。所述聚合物复合制剂在温度、pH和/或离子强度增加后发生快速胶凝。所述复合材料包含两种亲水性聚合物和离子凝胶剂。如所述的那样，第一聚合物发生由温度引起的胶凝并且使得能够在约37℃下形成弹性凝胶。第二聚合物在与引入到制剂中的离子凝胶剂接触后形成凝胶。第二聚合物的凝胶强度取决于加入的凝胶剂的量，以及制剂的pH和离子强度。
[0152] 由于其剪切致稀特性，样品是不可熔的。它们示出温度引起的增稠，即在温度升高后，其凝胶结构变得更坚固。结果指示制剂的弹性、剪切致稀的开始、温度引起的增稠程度以及这些过程的时间范围取决于制剂中使用的胶凝剂，从而潜在地允许精确调整流动特性。
[0153] 表G.复合制剂F1、F2和F4的组合
[0154]  F1 F2 F4
F3 50％ 50％  
F11 100％ 100％  
F12 50％   100％
F13 50％   50％
F14 100％   100％
F16 100％ 100％ 100％
[0155] 如表G所示，使用制剂F1、F2和F4的组合来制备另外的制剂。这些制剂根据用作交联剂的盐的量和类型而变化。基于F3是50％F1盐与50％F2盐的组合，所述量以如本文所公开的制剂中使用的浓度百分比而变化(即，100％为所公开的浓度、50％为浓度的一半)。
[0156] 实施例2
[0157] 消毒对溶胶-凝胶聚合物复合制剂的影响
[0158] 作为一种消毒方法来测试高压灭菌。已知的是，与上述制剂中使用的聚合物相似的聚合物在用电离辐射或环氧乙烷消毒后可能发生显著降解。这种降解可以通过使用高温对样品进行消毒来减少。
[0159] 在121℃下进行消毒10分钟。循环总长度，包括加热和冷却部分，为约45分钟。表1示出由两种不同的凝胶剂制备的制剂(F1和F4)在消毒前和消毒后的特性的比较。对于表1中的数据，使用表A和表D中的总计165.5g和165g的配方分别制备测试制剂。
[0160] 表1.聚合物复合制剂在消毒前和消毒后的特性
[0161]
[0162] 消毒后，所有的制剂都可以使用6mL注射器通过标准的16号针头来注射，这示出所述制剂可以作为乳头密封剂通过乳头针或喷嘴来注射。消毒后，制剂的pH不显著变化。然而，目视观察指示两种制剂在高压灭菌后均示出更明显的黄色/棕色并且它们的流动特性发生变化。就F1-20141210而言，在25℃下存在“凝胶”到“液体”的变化。
[0163] 接着，当温度从25℃跳到37℃时，所检测的无菌和非无菌制剂的流动特性的变化更接近。随后是在恒定应力(1Pa)和频率(f＝0.1Hz)下，作为时间的函数的弹性模量和存储模量的值。在实验的第一步骤(10分钟)中，温度保持在25℃。在第二步骤(10分钟)中，温度固定在37℃。两个步骤之间的加热过程花费约20秒。结果示于表2和图1中，其中它们表示为弹性模量G'和损耗角正切tanδ＝G”/G'，弹性与粘性特性的比率示出哪个占主导。当tanδ值为1时，材料的弹性和粘性特性相等。损耗角正切越小，材料的弹性越大。对于物理凝胶，所述值为G'＞G”且tanδ＜1。对于粘性液体，所述值为G”＞G'且tanδ＞1。对于表2和图1中的数据，使用表A和表D中的总计165.5g和165g的配方分别制备测试制剂。
[0164] 表2.聚合物复合制剂在消毒前和消毒后的流变学测试的结果。在施加应力之后10分钟记录G'和tanδ的值。角频率f＝0.1Hz，振荡应力τ＝1Pa。
[0165]
[0166]
[0167] 无菌制剂相较于其对应的非无菌制剂的特征在于弹性模量的值稍微较小。然而，特别是就F4-20141210而言，此差值很小。在37℃时，弹性模量显著增加。这伴有损耗正切角的快速减小，表明凝胶结构的增强。对于制剂F4-20141210，这个过程花费约1-2分钟，并且对于样品F1-20141210，稍微更长(约5分钟)。在37℃下，样品的消毒不显著影响粘度增强的动力学也不显著影响由样品实现的G'与tanδ的最终值(图1)。
[0168] 总之，测试两种复合凝胶。由于其剪切致稀特性，所述复合材料是不可熔的。它们示出温度引起的增稠，即在温度升高后，其凝胶结构变得更坚固。虽然样品的消毒使样品的外观发生了一些细微的变化，但是消毒过程不会显著影响制剂的弹性、温度引起的增稠的程度和这个过程的时间范围。
[0169] 实施例3
[0170] 对于聚合物复合制剂的消毒的进一步研究
[0171] F1制剂和F4制剂是在温度、pH和/或离子强度增加后发生快速胶凝的水溶胀性聚合物复合材料。所述复合材料包含两种亲水性聚合物和离子凝胶剂。第一聚合物发生由温度引起的胶凝并且使得能够在约37℃下形成弹性凝胶。第二聚合物在与引入到制剂的离子凝胶剂接触后形成凝胶。第二聚合物的凝胶强度取决于添加的凝胶剂的量，以及制剂的pH和离子强度(通常，pH为约5.1至6.8并且离子强度为约5g/L)。
[0172] 在实施例2中，示出消毒对制剂流动特性没有显著影响。此进一步研究示出消毒对水溶胀性聚合物复合材料的影响。
[0173] 对于样品F1-20141210，在消毒后十二周重复流变学测量。在此期间，样品在室温下储存在黑暗中的密封塑料小瓶中。目视观察确认，在储存12周后样品的外观和稠度未发生显著变化。此外，样品中未检测到微生物生长的视觉迹象。
[0174] 首先，监测在温度从25℃跳到37℃时流动特性的变化。随后是在恒定应力(1Pa)和频率(f＝0.1Hz)下作为时间的函数的弹性模量和存储模量的值。在实验的第一步骤(10分钟)中，温度保持在25℃。在第二步骤(10分钟)中，温度固定在37℃。两个步骤之间的加热过程花费约20秒。结果示于表3和图2中；它们表示为弹性模量G'和损耗角正切tanδ＝G”/G'；弹性与粘性特性的比率示出哪个占主导。在tanδ值为1的情况下，材料的弹性和粘性特性相等。损耗角正切越小，材料的弹性越大。对于物理凝胶，所述值为G'＞G”且tanδ＜1。对于粘性液体，所述值为G”＞G'且tanδ＞1。对于表3和图2中的数据，使用表A和表D中的总计
165.5g和165g的配方分别制备测试制剂。
[0175] 表3.F1-20141210制剂在消毒后立即和12周后的流变学测试的结果。在施加应力之后10分钟记录G'和tanδ的值。角频率f＝0.1Hz，振荡应力τ＝1Pa。
[0176]
[0177] 数据示出储存F1-20141210样品12周对流动特性或热增稠效果的程度没有显著影响(图2)。在25℃下，样品示出的损耗角正切为约1。加热至37℃伴有tanδ的快速减小，表明凝胶结构的增强。对于新鲜消毒和消毒12周的样品，这个过程的动力学相似。
[0178] 进行应力扫描测试(即测量在固定频率下作为应力的函数的弹性模量和损耗模量)以便确认储存12周的样品的剪切致稀特征。结果在图3中示出。在低施加应力下，弹性模量G'的值为常数，并且相似于由F1-20140825样品(使用表A中的总计110g的配方制备)(即在与以总计165.5g的批次制备的F1-20141210的条件相似的条件下制备的非无菌样品)所获得的值。观察两种制剂在约80Pa的相似值下的剪切致稀行为(即作为施加应力的函数的弹性模量G'的减小)。这些结果确认，在室温下储存12周后，样品的可注射性将不受到显著影响。
[0179] 总之，在室温下储存12周(在密封的容器中，在黑暗中)后评估复合凝胶样品中的一个的物理化学稳定性。结果示出在12周的储存时间后，样品的流动特性和可注射性不受到显著影响。
[0180] 实施例4
[0181] 使用纳米晶纤维素增强的 F127凝胶的制备
[0182] 开发根据以下执行：(1)在接近体温/皮肤温度(32-35℃)的温度下制剂的胶凝的开始、(2)在室温下制剂的可注射性和(3)在35℃下诱导凝胶形成所需的时间。
[0183] 使用以下程序制备所有制剂： F127聚合物在加热和搅拌下熔融于20mL的玻璃小瓶中(1.6g至1.8g)。如果需要，添加填料(纳米晶纤维素(NCC))(100mg或200mg)。
继续搅拌和加热约5分钟。在搅拌下将2％水性AcOH中的壳聚糖溶液在搅拌下添加AcOH至样品的最终重量为10g。样品在剧烈搅拌下过夜(不加热)。
[0184] 通过在水浴中加热样品至所需温度来测量胶凝的开始。对于若干种制剂，在室温下通过从10mL塑料注射器穿过16号针头传递约3mL制剂来验证可注射性/流动能力。
[0185] 在独立的实验中，通过将在室温下保存的一滴样品穿过16号针头沉积到加热至37℃的塑料离心管壁来估计胶凝时间。将停止溶液流动所需的时间作为胶凝时间的近似值。
[0186] 壳聚糖溶液的制备如下：通过过夜剧烈搅拌悬浮于2％AcOH中的壳聚糖粉末从而导致形成透明且均匀的淡黄色溶液，来制备壳聚糖的溶液(CH，2％重量/重量)。使用水将此溶液稀释至1％和0.5％的浓度，随后加入0.5％NaOH溶液至pH为约6。壳聚糖溶液在表4中示出。
[0187] 表4.壳聚糖溶液
[0188]
[0189] *对于这些样品，估计胶凝时间；在与离心管的壁接触后，制剂的液滴几乎立即形成凝胶。
[0190] 图4示出对于在1％CH(pH约6)中的17％ F127的制剂，胶凝温度对纳米晶纤维素(NCC)的量的依赖性的图。
[0191] 通过调节 F127的浓度可以调节制剂的胶凝温度。CH的存在对胶凝不产生影响。所有样品在室温下都是可注射的。对于具有在1％或2％CH溶液中的18％
F127的制剂，估计的胶凝时间是几乎立即。NCC的添加导致胶凝温度降低。NCC强
化凝胶并且引起温度滞后(即所述样品在加热到低于在加热时所确定的它们的胶凝点时变成液体)。
[0192] 实施例5
[0193] 改性壳聚糖凝胶的合成
[0194] 羧甲基壳聚糖的制备如下：通过搅拌在20％的NaOH(重量/体积100mL)中的壳聚糖(2g)15分钟来进行羧甲基化。然后，将一氯乙酸(15g)滴加到反应混合物并且所述反应在40+/-2℃下在搅拌下持续2小时。然后，使用10％的乙酸中和反应混合物，并接着倾注到过量的70％的甲醇中。使用G2烧结漏斗过滤产生的羧甲基壳聚糖并用甲醇洗涤。在55℃下在真空中将产物干燥8小时以得到6 .5g干燥的羧甲基壳聚糖。使用所述方法(Biomacromolecules，第5卷，第2期，2004)确定羧甲基壳聚糖(CMCh)的取代度为0.75。
[0195] 在45℃下，将聚乙酸乙烯酯(PVA)(1g)溶于水(85mL)。在PVA-水溶液冷却到室温后，将丙酮(15mL)滴加到剧烈搅拌15分钟的PVA溶液中以形成约1％(重量/体积)PVA溶液。然后，在5℃下保存溶液24小时直到其变成淡黄色，这表明PVA的长链已收缩成纳米颗粒。然后，将不同量的CMCh(0.5、1和2重量％)加入到溶液中。用N2吹扫溶液30分钟，然后将
4.0mmol亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、0.4mmol过硫酸钾(KPS)和0.67mmol四亚甲基乙二胺(TEMED)加入到溶液中并且在30℃下进行聚合15小时。形成的纳米凝胶直接使用，或可以在使用前冷冻以形成冷冻干燥的粉末，其容易在水中预分散，从而形成纳米颗粒分散体。
[0196] 酰基壳聚糖的制备如下：使用MeSO3H作为壳聚糖的溶剂以便帮助保护壳聚糖分子上的氨基不发生酰化反应。通常，壳聚糖在室温下溶解在MeSO3H中1小时，并且然后在搅拌下滴加辛酰氯，其中辛酰氯与壳聚糖的重复单元的摩尔比等于0.66:1。所述反应允许在环境温度下持续5小时，之后通过加入碎冰来停止。透析所得溶液一天以除去大部分酸，并且随后使用NaHCO3中和剩余的酸和铵盐。将最终混合物针对Milli-Q水进行透析超过3天，然后冻干成酰基壳聚糖(AC)粉末。
[0197] 实施例6
[0198] PVA酰化产物的合成
[0199] 材料：聚乙烯醇(PVA)，186K，87％-89％水解的：10g。R-COCl(即月桂酰氯、棕榈酰氯、辛酰氯)：1.68g。三乙胺(ET3N)：2.25mL。1-甲基-2-吡咯烷酮(NMP)：100g。
[0200] 在另选的实验中，材料如下：10g PVA，186K，87-89％水解的：3.36g。R-COCl(月桂酰氯/棕榈酰氯或辛酰氯)；4.50mL ET3N；以及150mL NMP。
[0201] 合成程序：将PVA加入热的NMP中；如果太粘稠就接着加入更多的NMP，至多达最终体积50mL。在完成溶解后，添加R-COCl，之后添加ET3N。混合物在室温下搅拌过夜。然后，将PVA酰化产物通过添加3倍水进行稀释，搅拌并接着通过透析超过5天来纯化，并且然后进行冻干。收率：90％。
[0202] 图5示出由此制备的6s-1下的PVA酰化产物的粘度。
[0203] 实施例7
[0204] 对于注入乳牛的乳头密封剂的保存性和耐受性的评价
[0205] 此研究的目的是对在乳牛的干乳期期间作为乳房内乳头密封剂(ITS)的两种溶胶-凝胶聚合物复合制剂(F1和F4，其分别使用表A和表D中的合计165.0g的配方来制备)的新型用途的保存性和耐受性进行评价。
[0206] 在研究开始时，八头乳牛(成年泌乳妊娠荷斯坦乳牛)干乳并且每个乳区分配两个治疗组T01和T02中的一个组。T01组接受用F1的治疗，而T02组接受用F4的治疗。在密封剂注入之前，将 DC(盐酸头孢噻呋)干乳乳牛疗法按每个标签指令施用到每个乳区。在注入之前对制剂进行蒸汽灭菌。所有剂量的ITS均作为乳房内输注施用到指定乳牛的所有可用乳区。在整个研究期间，所有八只动物都被分配在限定时间进行一致的超声评价。
在施用后约60天，在产犊后，所有测试的ITS均通过手动剥离来移除。在整个研究中进行并记录一般健康观察和可视乳房/乳区观察。
[0207] 通过注射器与专门的混合尖端附接件或即用型石膏(plastet)向乳房内(IMAM)递送ITS制剂2.0mL。使用部分插入施用方法。以2.2g+/-0.5g注入F1和F4。虽然由于基质的剪切致稀特性注意到引发的初始阻力，但是两种制剂都容易注入。相较于F1，F4需要更大的力来注入。然而，一旦引发流动，F4变得更容易注入。在注入之前，已对所有的注射器进行高压灭菌。将基质注入到动物的所有测试乳头是容易完成的。没有注射器表现出缺陷。没有注射器表现出输注困难。
[0208] 应当理解，小牛在出生时被立即带走，并因此不被允许喂奶。施用后约60天时，在产犊后动物的第一次产乳，通过手动剥离容易地从所有乳头移除基质。在从任何动物的乳头移除任何基质时都未表现出困难。
[0209] 收集产犊后第一次产乳的样品以分析密封剂基质的存在。由于无法辨别乳头密封剂材料与初乳，所以不确定去除后的样品重量。由于乳头密封剂的剪切致稀和温度敏感的特性并且因为在制剂上施加剪切力以将其从乳头池移除，所以在从乳头移除时所述制剂变稀。另外，因为这些制剂在较热温度下胶凝并且在较冷温度下变成液体，所以在收集后立即将收集的初乳剥离样品放置到冰箱，以进一步使制剂变稀。当制剂在冰箱的低温下恢复到液体形式时，通过常规方式难以从初乳分离中密封剂基质来帮助测量移除的总基质的准确回收率。
[0210] 为了制剂的安全性，病理学家检查了乳头管的内部。未发现与乳头基质或制剂相关的任何肉眼可见的病变。注意到一个乳头有轻微的上皮纤维变性和单核细胞浸润的一种发病。这个发现不可能与测试的基质相关。所有检查的其他乳头均正常无不良发现。如果任何区域的肉眼可见病理问题都被发现，则将组织送去切片以排除任何基质问题，但没有发现任何问题。这种保留研究的显微组织评估的结果是无基质相关的发现。
[0211] 所述制剂被保留在乳头中直到产犊，并且在整个保留期间通过超声评分进行目视评估。由受过训练的工作人员进行超声观察以在第0天、第1天、第4天然后之后每周直到产犊评估密封剂的存在。数字记录在0(乳头池中无明显密封剂)至5(乳头池似乎完全被密封剂阻塞)的视觉范围内。任何不寻常的观察都记录在每日观察表上。所有的制剂在整个干乳期期间都保持在乳头中，而无发病。
[0212] F1和F2的超声评分的结果分别在下表5和表6中示出：
[0213] 表5.F1制剂超声评分
[0214]
[0215]
[0216] 表6.F4制剂超声评分
[0217]
[0218]
[0219] 综上所述，本研究示出溶胶-凝胶聚合物复合制剂易于通过乳房内输注来施用并且易于通过手动剥离来移除。结果还指示乳牛耐受乳头密封剂而无不良副作用。最后，结果证明，在乳牛的干乳期期间，乳头密封剂保留直到密封剂在研究结束时被物理地移除。
[0220] 实施例8
[0221] 对于注入乳牛的乳头密封剂的保存性和耐受性的评价
[0222] 此研究的目的是对在乳牛的干乳期期间作为乳房内乳头密封剂(ITS)的两种溶胶-凝胶聚合物复合制剂(F1和F4，其分别使用表A和表D中的合计165.0g的配方来制备)的新型用途的保存性和耐受性进行评价。
[0223] 在研究开始时，三十头乳牛(成年泌乳妊娠荷斯坦乳牛)干乳并且每个乳区分配四个治疗组T01至T04中的一个组。每种制剂中注入2.0mL和3.0mL的两种剂量体积以评价体积是否对保留产生影响。组T01和组T02分别接受用约2.0mL(实际递送：平均1.99+/-0.19)和约3.0mL(实际递送：平均2.88+/-0.15)体积的F1的治疗。组T03和组T04分别接受用约2.0mL(实际递送：平均1.54+/-0.37)和约3.0mL(实际递送：平均2.24+/-0.55)体积的F4的治疗。首先使动物适应设施，在研究开始之前禁食和禁水源至少10天。在研究的第-1+/-2天，在早晨产乳之前，取走乳区样品用于体细胞计数分析和细菌评估。
[0224] 在密封剂注入之前，将 DC(盐酸头孢噻呋)干乳乳牛疗法按每个标签指令施用到每个乳区。所有剂量的ITS均作为乳房内输注施用到指定乳牛的所有可用乳区。在整个研究期间，在限定时间完成对所有三十只动物的乳头的每周超声评价，以确定密封剂作为物理屏障的保留和评价。
[0225] 在整个干乳期期间和施用乳头密封胶与干乳乳牛疗法后，十五只动物的所有四个乳区的乳头末端每周暴露于细胞悬浮液以模拟乳牛场中的差的卫生条件。使用冷冻的大肠杆菌来制备在胰蛋白胨大豆肉汤中1x106个菌落形成单位/mL(CFU/mL)的细菌悬浮液。从第7天开始，每周一次将动物的所有四个乳头末端通过从浸杯单次浸渍来暴露于大肠杆菌制备物。产犊或移除乳头密封剂后停止暴露于大肠杆菌。
[0226] 施用后约60天且在产犊后第一次产乳时，通过手动剥离来移除测试的ITS。在室温下储存回收的密封剂样品。从产犊后的第一次产乳当天开始，观察每只乳牛的乳腺炎的临床体征。在产犊后第1、2、3、7、10和14天时，仔细清洗并预剥离每个单独乳头后从每个乳房乳区收集无菌乳区样品，用于细菌培养。在整个实验期间在各种时间收集乳和初乳样品以便测量潜在的残余物或代谢物。还记录体细胞计数和乳重以评估乳房状况、乳腺炎的存在和乳质量。
[0227] 对所有基质的超声分析指示整个干乳期期间材料的显著量的存在而不考虑剂量体积。在第14-35天之间观察到基质发生外观变化。两种制剂在整个干乳期期间似乎都持续存在于乳头管中并且作为保护屏障保留，直到物理移除乳头密封剂。通过手动剥离从乳头去除产犊后的基质。
[0228] 在回到泌乳期后，对保留在研究中的所有动物的乳房健康、乳外观和细菌存在进行监测超过两周的时间段。虽然在整个14天期间，注意到所有治疗组的少数个体乳牛的异常的(升高的)乳房健康评分，但是这些不能归因于乳头密封剂的失效。治疗组之间的乳房健康或乳质量评分均无统计学差异。
[0229] 将需要进行适当设计和监测的实地研究以确认乳腺炎的预防。然而，基于这项保留研究，可以得出结论，溶胶-凝胶聚合物复合材料提供一种能够保护健康乳畜动物免受新的感染或反复感染的足够的持久的物理屏障。
[0230] 综上所述，通过超声评价，所有治疗保持在整个干乳期期间并且似乎来保护乳头。所有基质都容易移除并且在进行对组织的肉眼及微观评价后未注意到治疗相关的影响。总的说来，在整个干乳期期间，制剂F1和制剂F4都表现出良好的保留。
[0231] 实施例9
[0232] 对于用于药物释放的溶胶-凝胶聚合物复合材料的用途的评价
[0233] 此研究的目的是通过溶胶-凝胶聚合物复合制剂来评价抗细菌剂的释放和抗微生物活性。使用如上所述制备的制剂F2，并且每克制剂负载有20mg的阿莫西林而不影响其流变学特性，所述流变学特性通过延伸与乳头密封的栓形成相关。
[0234] 阿莫西林负载：通过将甲基纤维素(8.0质量％)、壳聚糖(2.0质量％)、三水合阿莫西林(2.0质量％)和磷酸二氢钾(0.76质量％)彻底混合到0.1M乙酸中直到得到均匀的灰白色乳膏，来制备负载的F2溶胶-凝胶聚合物复合制剂。
[0235] 将负载的F2溶胶-凝胶的流变学数据与未负载的F2溶胶-凝胶聚合物复合材料的流变学数据进行比较(表7)。表7的数据代表未负载(n＝6)或负载(n＝3)的溶胶-凝胶的若干个批次(来自相同的原材料)的平均特性。两种溶胶-凝胶制剂之间的剪切存储模量G'和剪切损耗模量G”的值在统计学上相等；因此tanδ值也简单地相等。这证明溶胶-凝胶聚合物复合材料的这些相关物理特性不受2质量％阿莫西林引入的影响。
[0236] 阿莫西林定量：为了监测阿莫西林从负载的溶胶-凝胶聚合物复合材料中质量释放，采用简单的分光光度法来对药物进行定量。274nm处的吸光度与磷酸盐水性缓冲液中的阿莫西林浓度相关，使用ε274＝1.2mM-1cm-1(Cary 60UV-V为分光光度计，Agilent Technologies)。此消光系数与文献中发现的其他值(ε274,乙醇＝1.4mM-1cm-1且ε272,HCl 0.1M＝1.1mM-1cm-1；默克索引在线)一致。
[0237] 阿莫西林释放。首先将一定量的负载的溶胶-凝胶聚合物复合材料沉积在石英比色杯的最底部，在T＝37℃或T＝25℃下保持。然后，使用已知体积的磷酸盐缓冲液(100mM KH2PO4，100mM NaCl，pH＝6.5)填充比色杯。此时，阿莫西林开始从溶胶-凝胶中扩散出来。通过在274nm处溶胶-凝胶试样上方的溶液的吸光度来监测这种释放。通过以下来计算阿莫西林释放(图8)：
[0238] 释放％＝(A/εl)·(namox/V)。
[0239] 其中A是在274nm处的吸光度，ε是阿莫西林在274nm处的消光系数(1.2mM-1cm-1)，l是比色杯的路径长度，namox是最初包含在沉积于比色杯底部的溶胶-凝胶的阿莫西林的量，并且V是比色杯中的总体积(即V缓冲液+V凝胶)。图8的曲线表示对3个溶胶-凝胶聚合物复合材料批次所执行的实验的平均释放。37℃曲线(即生理温度)描绘了溶胶-凝胶的早期释放行为，其中50％的药物释放超过约1小时，随后持续释放直到在约6小时后100％阿莫西林被释放，这将有利于实现抗微生物剂的快速且持续的血液水平。在25℃下，释放慢得多，在5小时后，溶胶-凝胶聚合物复合材料只释放约20％的阿莫西林。这些结果证明，在生理温度下，负载的溶胶-凝胶制剂所释放的量呈相当缓慢的释放曲线。此外，发现释放速率与样品温度呈正相关。
[0240] 表7.负载的溶胶-凝胶和未负载的溶胶-凝胶的流变学特性的比较
[0241]
[0242] 抗微生物活性：通过Kirby-Bauer纸片药敏测试来评价阿莫西林负载的溶胶-凝胶聚合物复合材料的抗微生物活性。评价其抑菌圈并与未负载的凝胶的抑菌圈进行比较。
[0243] 将如上所述制备的1g阿莫西林负载的F2溶胶-凝胶的试样分散在25mm纤维素纸片(Millipore)上。然后，将所述纸片沉积于TSA II血琼脂平板(Oxoid)上，所述平板接种有在肉汤培养物中并稀释以匹配0.5麦氏浊度标准的100μL大肠杆菌(Escherichia coli)ATCC 25922。对对照实验使用相同的程序，所述对照实验使用未负载的F2溶胶-凝胶进行。
[0244] 培养24小时后，负载的凝胶的纤维素纸片周围可见d＝42mm的抑菌圈(表8)，而对照未表现出抑菌圈。在抑制区大于纸片尺寸16mm的情况下，观察到阿莫西林对大肠杆菌ATCC 25922的有效抗微生物作用。
[0245] 表8.Kirby-Bauer纸片药敏测试结果的总结
[0246]
[0247] 综上所述，分光光度法示出阿莫西林在37℃下在6小时内完全从溶胶-凝胶聚合物复合材料中释放，而在25℃下仅释放25％。最后，如由Kirby-Bauer药敏纸片法所评价的，与未负载的溶胶-凝胶相比，负载阿莫西林的溶胶-凝胶聚合物复合材料表现出明显的抗微生物活性。
[0248] 实施例10
[0249] 对于溶胶-凝胶聚合物复合材料作为细菌迁移的屏障的评价
[0250] 此研究中的两个测试的目的是示出溶胶-凝胶聚合物复合制剂充当针对模拟的玻璃乳牛乳头中的细菌迁移的屏障的能力。
[0251] 如上所述制备表9所示的溶胶-凝胶复合物制剂F1-F4。
[0252] 表9.溶胶-凝胶聚合物复合材料组合物。
[0253]
[0254] 不同的溶胶-凝胶制剂可以由其各自的流变学特性以tanδ、G'和G”的形式来定义，如表10所示。
[0255] 表10.溶胶-凝胶聚合物复合材料的流变学特性、pH和外观。
[0256]
[0257] 此外，通过将胰蛋白胨10.0g/L与氯化钠5.0g/L混合、然后通过加入琼脂5.0g/L来硬化来制备对照运动性测试培养基，标记为“BAM 103”。
[0258] 测试1-溶胶-凝胶聚合物复合材料对细菌的抗渗性的评价：测试1基于标准细菌运动性测试来测试细菌迁移穿过包含溶胶-凝胶聚合物复合材料样品的凝胶介质的能力。为了此目的，运动细菌大肠杆菌ATCC 25922作为1/10稀释的胰蛋白胨大豆肉汤(TSB)中的匹配0.5麦氏浊度标准的过夜培养物进行接种。在15mL聚丙烯测试管中，首先添加10mL正在研究的凝胶栓，然后在每种测试试剂的顶部添加一层氯化三苯基四氮唑(TTC 0.5g/L)。TTC是细菌敏感的染料，其在与细菌接触还原后形成红色沉淀。
[0259] 将在TSB中过夜培养的细菌溶液作为第三层加入。将1mL这种接种物添加到TTC中，并且将所述测试管在37℃下温育24小时和48小时。
[0260] 通过在测试管中测量下方溶胶-凝胶层的从顶部到底部的红色的深度，来评价细菌在溶胶-凝胶聚合物复合制剂中迁移的能力。检查测试管的颜色，其根据潜在的细菌迁移可能从顶部扩散到底部。由于在培养基中的部分渗透(TTC还原)，细菌-凝胶界面处出现初始红色。如表11所示，本公开的F1-F4溶胶-凝胶聚合物复合制剂不允许细菌渗透，而BAM103对照在48h内允许细菌渗透。仅在F1-F4凝胶与管之间的界面处观察到硬琼脂对照的细菌渗透，琼脂的薄界面水层在此处形成。
[0261] 表11：测量的细菌渗透(n＝3)到不同的溶胶-凝胶聚合物复合制剂和对照中的结果。
[0262]
[0263] *凝胶内未检测到渗透，但在琼脂-试管界面发现渗透至多达30mm
[0264] 前面的实验证明了溶胶-凝胶聚合物复合制剂对运动性细菌不可渗透的能力。
[0265] 测试2-对于在人造玻璃乳牛乳头中的溶胶-凝胶聚合物复合材料的屏障特性的评价：测试2用于评价溶胶-凝胶聚合物复合材料防止两个容器之间的细菌迁移的能力。对于此实验，底部的第一容器1填充有营养肉汤和细菌。顶部的第二容器2填充有无菌营养肉汤。所述两个容器由模拟的玻璃乳头( 26mm、长度6cm、洞 2.6mm)连接，所述玻璃乳头填充有如上所述制备的溶胶-凝胶聚合物复合制剂F3。所述实验包括对可以在37℃下随时间向上迁移到容器2中的细菌污染的存在或不存在进行追踪。
[0266] 选择表12所示的细菌菌株作为将代表牛乳腺炎的来源的混合培养物用于测试。
[0267] 表12.选择用于在TSB中的混合培养物中作为牛乳腺炎的代表性来源的菌株。
[0268]
[0269] 在此实验中，玻璃与溶胶-凝胶聚合物复合栓之间的粘附性似乎对于屏障性能很重要。气泡的存在、不均匀的粘附或连续的溶胶-凝胶聚合物复合材料转换通过降低玻璃-凝胶的粘附性而降低性能。这种现象在实验开始时特别显著，从而促使两个容器直接合并。通过添加细菌敏感的染料氯化三苯基四唑(TTC 0.5g/L)(其在与细菌接触还原后形成红色沉淀)，来进行对玻璃-凝胶粘附失败的追踪。
[0270] 对TTC标记的F3随时间保持细菌屏障特性的能力的研究进行评价。在第0、2、5、6、9、12和18天时，在无菌的和污染的培养基室中评价细菌污染。在第0、3、6、14和15天记录观察结果。在第3、6、9和13天时将培养基替换物和新鲜接种物添加到污染室。在第12天时，部分粘附失败的迹象开始示出玻璃-凝胶粘附的减少。在第12天和第17天，在玻璃乳牛乳头与F1-F4溶胶-凝胶聚合物复合材料样品的界面处观察到粘附失败。在第15天，进行对于凝胶栓上方的上部容器2中的污染的目视检测(即粘附良好的栓在第0天失去与玻璃的粘附力时，TTC染料扩散在最初未被污染的室中表现出红色)。在第17天时，栓停止完全粘附到玻璃上。到第18天，当对玻璃的粘附丧失允许细菌迁移通过溶胶-凝胶界面从而导致容器2污染时，通过平板计数对细菌污染进行定量来证明无菌破坏。
[0271] 由于已知溶胶-凝胶对玻璃的粘附破坏的高风险，因此这种测试对溶胶-凝胶性能非常不利。在粘附失败之前，在第1与15天之间的实验中的若干次测试所报道的并结合在表13中的实际性能表明F3防止细菌污染。凡士林/固体石蜡1:5的对照是基于已知完全不可渗透细菌的疏水性栓的，但是所述对照还会出现与溶胶-凝胶复合物中观察到的相似的与玻璃的粘附问题。结果表明这种不可渗透的对照与本公开的溶胶-凝胶聚合物制剂的相似性能。F3在第8天与第15天之间在保持对玻璃的粘附能力并充当细菌的屏障期间所获得的性能显著高于可渗透的对照BAM103所观察到的性能，所述对照在24h后不能阻止细菌污染。因此，测试2证明，本公开的溶胶-凝胶复合制剂具有成为针对细菌迁移的有效屏障的能力。
[0272] 表13.于基于15天的温育实验的不同溶胶-凝胶和对照的屏障特性的总结。
[0273]
[0274] 综上所述，测试1证明了与允许运动性细菌迁移的对照凝胶BAM103相比，溶胶-凝胶聚合物复合制剂在48小时内阻止细菌迁移的能力。不同溶胶-凝胶聚合物复合制剂的结果表现出对细菌的完全不可渗透性，从而阻止细菌渗透进入凝胶。在测试2中，表明只要玻璃(模拟基质)与溶胶-凝胶栓之间的粘附维持，人造玻璃乳牛乳头针对细菌迁移的屏障特性就能持续。性能示出与石蜡/凡士林的不可渗透的对照相似，并且显著地长于可渗透的对照BAM103。由于在实施例7和实施例8中描述的体内研究中观察到了长期保留，所以应当理解，在乳牛的干乳期直到密封剂被物理移除期间，本公开的溶胶-凝胶聚合物复合制剂都将充当针对运动性和非运动性细菌迁移的有效的乳头密封剂屏障。
[0275] 实施例11
[0276] 对于无机填料对溶胶-凝胶流变学的影响的评价
[0277] 如上文实施例1中所述制备溶胶-凝胶聚合物复合制剂F2(1.5L)，然后将其与填料(二氧化硅(SiO2)或纳米晶纤维素(NCC))以各种浓度(1重量％、5重量％和20重量％)混合。评价填料对溶胶-凝胶聚合物复合制剂的密度和流变学特性的影响。结果示于表14中。
[0278] 表14.有填料和不具有填料的溶剂-凝胶聚合物复合制剂的流变学特性的比较。
[0279]
[0280] 结果表明，通过增加溶胶-凝胶聚合物复合制剂中填料的量来增加存储模量(G')，这表明在37℃下制剂中的固体含量越高，凝胶将会越硬。在SiO2为1重量％和5重量％时，与原始制剂(“无”)相比，所述损耗模量保持略微相同。相同的观察结果也适用于除5重量％以外的NCC，其中与主要材料，G”在两种温度下都增加。关于25℃下的tanδ，其在1重量％的SiO2时增加，这表明与原始批次(“无”)相比，凝胶在室温下流动更好。然后，由于与先前关于固体含量所述的相同的原因，其随着填料含量的增加而降低。对于NCC，可见相同的行为。20重量％的NCC未明显观察到凝胶转换。最终，由于溶胶-凝胶内气泡的存在，原始批次具有的密度(0.96g/ml)比水低。向溶胶-凝胶制剂中添加至多达20重量％的填料使得产品在不含气泡的F2制剂的误差容限内达到约1.10g/ml的密度。综上所述，结果表明，二氧化硅无机填料的添加使得溶胶和凝胶状态的G'都显著增加(至多达约双倍)，但不影响制剂的溶胶到凝胶的转换和剪切致稀。
[0281] 实施例12
[0282] 对于壳聚糖的脱乙酰度(DDA)对溶胶-凝胶特性的影响的评价
[0283] 如上文实施例1中所述的使用具有变化的脱乙酰度(％DDA)的壳聚糖来制备溶胶-凝胶聚合物复合制剂F2。结果示于表15中。
[0284] 当制剂F2中壳聚糖的％DDA降到低于76％时，所述制剂开始丧失其溶胶-凝胶特征。特别地，在25℃和37℃下观察到的tanδ值，并且尤其是tanδ比率(25℃下的tanδ/37℃下的tanδ)，提供溶胶-凝胶转换的指示和规模。在转变到低％DDA源的壳聚糖(从90％到75.5％DDA)时，观察到F2性能的明显降低，其中tanδ比率从3.3-6.4降到1.2，如下表15所示。
[0285] 表15.实验室规模与2L规模工艺之间％DDA变化的比较结果。
[0286]
[0287] *使用试剂级壳聚糖的同一规格的不同批次来确定％DDA。
[0288] 为了解释溶胶-凝胶性能的降低，设计双因数实验设计(DOE)。考虑壳聚糖的两个参数，即脱乙酰度(％DDA)和分子量(MW)。
[0289] 在37℃下保持可接受tanδ值的情况下，最显著的输出因数及其针对最佳F2制剂的预期值如下：25℃下的复数粘度；25℃下的tanδ；以及胶凝的振荡应力。
[0290] 复数粘度应当低并且25℃下的tanδ值应当高以便F2制剂表现出尽可能最“液体”的特征；这将期望最大限度地增加制剂的可加工性。胶凝的振荡应力应当低以便增加产品的“可注射性”，最终用于由最终使用者通过注射器反复递送产品。DOE结果汇总在表16中。
[0291] 表16.对双因数实验设计(DOE)的结果的总结。
[0292]
[0293]
[0294] 表16示出的结果表明％DDA是降低复数粘度、增加25℃下的tanδ以及降低制剂可注射性的最显著的因数。此DOE结果还表明高分子量/高％DDA(404580kDa，97.6％DDA)的壳聚糖根据这些特性产生最佳制剂。当在37℃下保持适当的粘性凝胶(37℃下的tanδ)时，所得的制剂在所有检查的样品中产生粘性最小(复数粘度)、粘性最大的液体(与凝胶状相反)性质(25℃下的tanδ)以及可注射性最大的制剂(振荡应力)。结果表明，在一些实施方案中，需要具有约77％或更高％DDA的壳聚糖来获得功能性溶胶-凝胶。
[0295] 实施例13
[0296] 溶胶-凝胶聚合物复合材料的制备及特性
[0297] 聚合物复合制剂的制备如下。表A示出了制剂。以约220克的批次制备制剂。
[0298] 表A
[0299]
[0300] 将去离子水和壳聚糖ChitoClear与冰乙酸混合直到得到均匀的混合物。在室温下加入甲基纤维素A15 Premium(购自Dow)直到得到均匀的混合物。然后，在室温下将磷酸氢二钾的盐溶液和β-甘油磷酸二钠盐水合物添加到此混合物直到得到均匀的混合物，从而形成壳聚糖组合物(F3V2)。
[0301] 在室温下将 RT 625A添加到壳聚糖组合物，并且然后在60℃下加热至少10分钟直到获得均匀的混合物。最终组合物包括约50％的 RT 625A
和约50％的壳聚糖组合物。
[0302] 形成的组合物在25℃下具有的外观为米黄色粘性液体。固体含量为约57.3％且pH为约5.3。
[0303] 初始体内测试表明，F3v2+PDMS(示于上表A中)具有从16个乳区中的12个(75％)中回收的显著材料，而阳性对照物具有发现于16个乳区中的15个(93.8％)的显著材料。
[0304] 样品经高压灭菌而蒸汽消毒，并且进行测试以确定各种物理特征。这种材料保持热胶凝特性，其中胶凝点发生在约33-35℃。在室温(20℃)下材料的存储模量为900-1200Pa，而在生理温度(37℃)下的存储模量增加到3000-8000Pa。
[0305] 注射器力
[0306] 使用TA.XT plus质构分析仪来测量在约一秒内用标准乳房内插管(～1.3-1.5mm ID)从注射器排出大部分材料所需要的力。在施用F3v2+PDMS期间实现的最大力的平均值为130-150N。
[0307] 比重
[0308] 通过容积排量来测量材料的比重。5mL带刻度量筒填充有3mL(a)水并且记录重量(c)。加入材料直到体积为5mL(b)并且记录重量(d)。通过以下公式测定比重：
[0309]
[0310] F3v2+PDMS制剂具有1.03-1.10g/mL的平均比重。
[0311] 粘度
[0312] 对于此测试，使用Anton-Paar流变仪和CP25-2，通过增加剪切速率、测量剪切应力并计算20℃下的粘度来确定最大初始粘度和平均剪切粘度。最大初始粘度为1100-1400Pa-s，而平均剪切粘度为20-25Pa-s。
[0313] 结构恢复
[0314] 结构恢复代表产品在高剪切条件(诸如通过乳房内插管施用)下恢复到其原始状态的能力。对于这种测试，使用Anton-Paar流变仪和PP25，在静态下测量材料，随后进行简单的剪切事件，代表施用。允许材料在生理温度下恢复十分钟并且通过差值确定恢复百分比。F3v2+PDMS样品具有大于100％的结构恢复。
[0315] F3v2+PDMS：比率和组合物
[0316] 下面是F3+PDMS或F3v2+PDMS的各种比率的制剂工作和测试。
[0317] 用于测试的F3和F3v2组合物的比较：
[0318] 表B
[0319]
[0320] 使用30-60％Wacker RT 625A来进行对F3和Wacker RT 625A的测试，并且结果示于下表中：
[0321] 表C
[0322]
[0323] 使用25-50％Wacker RT 625A来进行对F3v2和Wacker RT 625A的测试，并且结果示于下表中。
[0324] 表D
[0325]
[0326]
[0327] 使用 M4600and M4601来进行对F3v2与WackerRT 625A的食物级替代品的测试，并且结果示于下表中。
[0328] 表E
[0329]
[0330] 上面制备的每种测试制剂都进行应力扫描测试以测定在固定频率下作为应力的函数的存储模量和损耗模量。在低施加应力下，存储模量(G')的值是恒定的并且覆盖354至20000Pa范围内的宽范围。在较高的应力值下观察到剪切致稀行为，其通过作为施加应力的函数的存储模量(G')的减小来测量。根据组合物，剪切致稀区域还覆盖从2-100Pa开始的宽范围。
[0331] 在测试制剂的平均剪切粘度为10-25Pa-s的情况下，用于确定粘度的对照剪切方法提供400-1400Pa-s的的最大初始粘度范围。
[0332] 对测试制剂收集的另外的物理特性数据如下：
[0333] 表F
[0334]
[0335] 表G
[0336]F3v2:RT625A pH 施用的容易度 粘度
50:50 4.6 中等困难的 280Pa-s
75:25 5.0 中等的 62Pa-s
[0337] 表H
[0338]
[0339]
[0340] 在前述内容中，出于说明而不是限制的目的，提供了本公开的具体实施方案的详细描述。应当理解，对于本领域技术人员来说显而易见的基于本公开的所有其他修改、分枝和等效物旨在被包括在如所要求的本公开的范围内。

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