[0001] 本发明涉及一种新型的超数排卵方法，具体地说，涉及来曲唑在用于制备成年牛超数排卵药物中的应用，可用于利用超排的卵母细胞生产转基因克隆家畜、家畜育种及濒危物种的保护。属于应用型胚胎生物技术领域。

[0002] 超数排卵技术最初是以啮齿类实验动物为研究对象发现的，通过埋植垂体前叶物质或注射孕马血清技术获取了大量的卵母细胞，以此奠定了超排技术基础，是胚胎移植技术中最重要的环节。采用超数排卵技术可以最大限度利用卵巢资源，获得大量整齐、优质的卵子，充分发挥优良母畜的繁殖潜力，为胚胎移植提供充足的胚源。该项技术的应用使得优良后代数量成倍增长，加快了优良品种扩繁和动物育种的步伐。基于该项技术的优势，目前已广泛应用于畜牧业生产，其中在牛单胎动物生产方面尤为突出。牛超数排卵同时结合胚胎移植集成的MOET技术，加速了优良牛品种扩繁，缩短了世代间隔，提高了畜牧业生产效率，获得了巨大的经济及社会效益。

[0003] 目前畜牧业生产中广泛使用的超排方案形成于20世纪80年代初，常用的激素主要有孕马血清促性腺激素(PMSG)和卵泡刺激素(FSH)。由于PMSG对卵巢影响较大，逐渐被FSH替代或与FSH结合使用，超排方法主要有FSH递减法、FSH恒量法、PMSG与FSH组合方法。另外由于FSH半衰期较短，连续注射增加了劳动强度，而且会对家畜产生应激，成本也较高，也有研究将FSH溶解在PVP等高分子聚合物中缓释的超排方法，同样获得了较好的超排效果。尽管超数排卵技术已广泛应用于生产，但是由于超排选用的激素种类、供体牛的生理状态、环境及营养等因素的影响，现有的超排方案在获卵率和可用胚数方面不稳定，严重地影响了胚胎移植技术的推广。

[0004] 同时，为提高超排效率，一些科研工作者将生长激素(GH)、胰岛素样生长因子I(IGF-I)、血管表皮生长因子(VEGF)等激素或因子也纳入家畜超排方案。虽有研究表明，添加一些生长相关的因子可以有效提高家畜的胚胎质量及增加可用囊胚的比例，但目前尚无有效提高家畜超排效果，明显提高单次排卵数的超排方案的报道。另据国际胚胎移植协会(IETS)的数据表明，近10年来，供体母牛单次超排获得的可用胚胎数平均保持在6枚左右，由此可见，目前现有的超排方法在获取的卵母细胞数量上没有获得较大的突破。

[0005] 哺乳动物出生后卵巢存在大量的卵母细胞，随着年龄的增长，这些卵细胞不断退化，到性成熟时大部分已消失，但卵巢上仍有相当数量的卵原细胞和初级卵母细胞存在。例如：青年母牛有5-7.5万个。但是家畜在一个性周期同时有一组卵泡启动发育，但最后只有一部分卵泡发育成熟。牛一般只有1个卵泡成熟排卵，而当前在生产中应用的超排方案结合人工受精平均仅能获取6枚胚胎，其它卵泡则闭锁，因此，卵巢中有大量的卵细胞并末得到利用，导致卵巢卵泡资源的巨大浪费。鉴于上述原因，畜牧业生产亟需新型的高效、稳定的超排技术来替代传统的超排方案。

[0006] 来曲唑(LE)为非甾体类第三代芳香化酶抑制剂，最早应用于人绝经期乳腺癌的临床治疗。近年来动物实验和临床研究表明，来曲唑具有促排卵作用。促排机理可能通过抑制芳香酶的活性，阻碍雄激素和雌二醇的转化，降低机体内雌激素水平，从而解除雌激素对下丘脑和(或)垂体的负反馈作用，使垂体促性腺激素分泌增加，促进卵泡的发育和排卵；另外卵巢内雄激素暂时性的增多，从而增加卵巢内卵泡对FSH的敏感性，同时卵巢内雄激素的增加能够刺激胰岛素样生长因子1(IGF1)以及内分泌、旁分泌因子与FSH协同作用促进卵泡发育和排卵。来曲唑为口服剂型，生物利用度高达99.9％，具有高度选择性，可阻断
98％以上的芳香化酶活性，且半衰期较短，代谢速度快，无副作用。大量的研究表明，LE与FSH联合使用提高了超排效率，是一种新型的促排卵药物，目前已广泛应用于人的促排卵治疗及实验动物研究。牛是单排卵动物，在卵巢生理、胚胎发育特点及辅助生殖技术方面与人具有相似的特点，而且在研究人卵母细胞发育领域是一个重要的模型动物。因此，鉴于牛与人繁殖生理特点的相似性，推测LE与FSH联合应用于超数排卵将有一定作用效果，但是在牛超排方案的改进方面尚无研究报道。

[0007] 本发明的目的是提供一种来曲唑在用于制备成年牛超数排卵药物及辅助药物中的应用。

[0008] 本发明的另一目的是提供一种诱导牛超数排卵的方法。

[0009] 为了实现本发明目的，本发明提供来曲唑(LE)在用于制备成年牛超数排卵药物及辅助药物中的应用。

[0010] 本发明来曲唑与卵泡刺激素(FSH)联合用于制备成年牛超数排卵药物。

[0011] 本发明提供一种诱导成年牛超数排卵的方法，包括如下步骤：

[0012] 1)卵泡同期化发育处理：将成年母牛经孕酮持续处理6天，在第0天同时使用苯甲酸雌激素，在第6天使用前列腺素；

[0013] 2)卵泡刺激素、来曲唑联合处理：第4天开始每间隔12小时使用一次卵泡刺激素，在第5天联合使用来曲唑。

[0014] 其中，所述来曲唑的用量为0.1-0.8mg/kg体重，优选为0.2mg/kg体重。

[0015] 所述卵泡刺激素使用8次，用量为0.06-0.02mg/kg体重。

[0016] 步骤1)中所述孕酮的用量2.5-3.0mg/kg体重，所述苯甲酸雌激素的用量0.003-0.006mg/kg体重，所述前列腺素的用量0.04-0.1mg/kg体重。

[0017] 步骤1)中在使用苯甲酸雌激素的同时，还再使用0.15-0.2mg/kg体重量的孕酮。

[0018] 本发明研究人员经过研究发现，在传统成年母牛超排方案中增加使用LE，利用来曲唑对内分泌及旁分泌的影响及卵巢卵泡募集的作用，促进卵泡的发育，增加可利用的卵母细胞数量；另外其半衰期较短，代谢速度快，无副作用，能够成为家畜超排辅助药物在畜牧业生产上推广应用。

[0019] 而且利用来曲唑对内分泌及旁分泌的影响及卵巢卵泡募集的作用，在利用常规超排方法使用卵泡刺激素(FSH)的同时结合来曲唑，促进牛卵泡发育，提高超排效率，充分挖掘良种牛在卵泡闭锁前丰富的种质资源，加速良种选育及扩繁技术体系，大幅度提高育种效率和技术水平。

[0020] 本发明通过针对外源FSH注射牛后活化芳香化酶活性，增加雌激素的产量，导致负反馈作用于下丘脑和(或)垂体，使内源FSH分泌下降，影响了超排效果的问题，在注射后FSH使用来曲唑抑制芳香化酶活性。LE是一种强效的芳香化酶抑制剂，其选择性抑制雌激素的合成，显著降低血清中雌激素水平，解除雌激素对下丘脑和(或)垂体的负反馈作用，使内源垂体促性腺激素分泌增加，促进卵泡的发育，增加可利用的卵母细胞数量；另外其半衰期较短，代谢速度快，无副作用，能够成为家畜超排辅助药物在畜牧业生产上推广应用。

[0021] 以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

[0022] 实施例1

[0023] 本发明通过传统成年母牛超排方案使用FSH同时口服LE，通过口服不同剂量的LE确定牛最佳的LE使用剂量。FSH每天2次注射4天，时间为早晨8:00，晚上8:00，在第1次FSH注射24h后，即第3针FSH注射时使用不同剂量的LE处理(0.1mg、0.2mg、0.4mg及0.8mg/kg体重)，同时以未LE处理为对照；超排、人工授精后采集的胚胎通过胚胎移植技术植入经过同期发情处理后具有明显发情表现的受体牛，胚胎附植后经过全期发育产犊。

[0024] 具体地说，使用本发明来曲唑的牛超数排卵方案：

[0025] (1)卵泡同期化发育处理：选择体况良好、体重均一的成年荷斯坦母牛(10头，体重约为650kg)，在第0天早晨8:00插入1.9g阴道孕酮栓制剂(CIDR，新西兰)，CIDR处理6.5d，第6天取出。在第0天插入CIDR同时注射苯甲酸雌激素(EV)2mg和孕酮100mg，在第
6d早上8:00注射25mg前列腺素(PGF2α)。

[0026] (2)FSH、LE处理：第4d开始间隔12h连续注射FSH(加拿大，Folltropin)4d，早8:00，晚8:00，剂量为40，40，30，30，20，20，10，10mg。在第5d早8:00第3次注射FSH后口服LE，采用4个LE处理分别为0.1mg、0.2mg、0.4mg及0.8mg/Kg体重，同时以未LE处理为对照。

[0027] (3)人工授精及胚胎移植

[0028] 供体牛CIDR处理后第8d下午和第9d上午进行两次人工授精，第15d采集胚胎分级计数后，按照牛胚胎移植操作规程进行胚胎移植。超排、人工授精后采集的胚胎通过胚胎移植技术植入经过同期发情处理后具有明显发情表现的受体牛，胚胎附植后经过全期发育产犊。

[0029] (4)获取卵母细胞及胚胎数量

[0030] 实验结果表明LE联合FSH处理成年母牛提高了超排效果。其中LE0.2mg/kg处理效果最好，卵母细胞总数(11.4vs 8.0)和可移植胚胎数量(8.1vs 6.1)均显著(P＜0.05)高于未经LE处理的对照。

[0031] 表1LE联合FSH处理对牛超排的影响(平均数±标准误，n＝10)

[0032]