四倍体有壳水生动物

本发明涉及包括牡蛎的活四倍体有壳水生动物的生产。所说的四倍体是 通过使用染色体组操作技术生产的。

大多数有性生殖动物有2套染色体，因而被称为二倍体。减数分裂过程 将染色体数目减半以使在每次增殖加倍后保持染色体数目不变。减数分裂是 一个分两步的过程，由一个二倍体细胞产生四个单倍体细胞，每个有一套染 色体。这些单倍体细胞的一个或所有4个可成熟为有功能的卵细胞或精子细 胞，否则称为配子。

动物中的四倍体(即那些具有4套染色体的动物)一般对于包括三倍体生 产，杂交和其它育种计划的各种目的是重要的。然而，以前在包括牡蛎的软 体动物中生产活四倍体的尝试尚未成功。已推测在二倍体卵中诱导的四倍体 不能存活的部分原因可能是由于正常二倍体卵细胞的分裂产生的大型四倍体 细胞核引起的细胞数缺陷。非常需要形成一种在软体动物中产生能活过通常 的孵卵过程并发育成成体软体动物的四倍体受精卵的方法，以便提供四倍体 软体动物的可靠来源。而它接着可用于(例如)三倍体软体动物的商业量生 产。

下面将使用太平洋牡蛎(命名为Crassostrea gigas Thunberg)说明本发明。

对于太平洋牡蛎，尽管已通过包括有丝分裂I阻断(Guo 1991)，极体I 阻断(Guo et al.1992a，b)，分裂球融合(Guo 1991)和雌核发育(Guo et al.1993) 的一些方法生产四倍体胚，但都是在二倍体产生的卵中进行的，产生的胚不 能存活过变态期。如上所述，已推测诱导的四倍体不能存活可能是由于具有 大型四倍体核的正常卵的分裂引起的胚细胞数缺陷。另一方面，三倍体牡蛎 的卵明显比那些正常二倍体牡蛎的卵大(Stephens and Downing，1989)。

现在三倍体太平洋牡蛎可以从商业途径获得(Allen，1988)。这种三倍体太 平洋牡蛎已知有一些优于正常二倍体牡蛎的商业优势，包括较好的口味(Allen and Downing，1991)(特别是在二倍体的正常生殖期)和较高的生长率(Allen， 1988)。目前，通过使用一些染色体组操作技术从正常二倍体牡蛎生产商品三 倍体太平洋牡蛎，通过控制卵母细胞的减数分裂事件，使卵母细胞将第二极 体保留在其中而不在第二次减数分裂期间将其释放出去(Allen，1988)。因此， 这种三倍体牡蛎可称为诱导的三倍体。与此相反，作为本发明产生的直接优 势之一，通过简单地将成熟的四倍体与正常二倍体杂交可产生杂交三倍体。

根据本发明，处理三倍体软体动物卵中的第一极体以产生活的四倍体软 体动物(有壳水生动物)。典型地，通过解剖三倍体雌性获得卵，随后用过滤 的海水漂洗。用从正常二倍体雄性获得的精子使卵受精。在卵受精后的合适 的时间点(例如，受精后5分钟)进行阻断卵释放极体I的操作并进行一段适当 长的时间。接着，在标准孵化条件下温育卵。在本发明优选的实施方案中， 所说的阻断极体I(PB1)过程是通过用以合适浓度溶于过滤海水中的细胞松驰 素B(CB)或其它阻断剂处理受精卵来实现的，但该过程也可通过对受精卵进 行热或水压休克来实现。用本发明的方法，可生产出能生长至成体的活四倍 体有壳水生动物。

本发明可应用于一般软体动物。然而，本发明的详细描述将使用太平洋 牡蛎(Grassostrea gigas Thunberg)(它是双壳动物)在下面进行说明。双壳动物是 具有由两部分或两贝壳组成的以弹性韧带铰合在一起的壳的任何软体动物。

为了帮助了解本发明，在本说明书正文末尾提供了一些技术术语的简短 定义。然而，这些定义并非试图限制或放弃为本领域的技术人员所普通接受 的通常的定义。

太平洋牡蛎是自然分布于日本，朝鲜和中国沿海的底栖海洋双壳动物。 太平洋牡蛎是主要以微型藻类和小有机碎片为食的滤食动物。它雌雄异体且 受精发生在体外。没有可鉴别的第二性征，仅通过检查生殖腺组织确定性别。 在产卵季节，太平洋牡蛎可将其超过一半的体重用来生产配子(Perdue， 1983)。一个平均市售大小的雌性太平洋牡蛎可产生50-100百万的卵(Quayle 1988)。太平洋牡蛎新释放的卵为梨形，受精后，它们为直径大约50μm的 球形。受精卵进行迅速变化并在25℃下受精后6-7小时内孵化为游动的担 轮幼虫。受精后大约24小时时，担轮幼虫形成两个贝壳并形成“D”形幼 虫(larvae。幼虫的自由游动阶段可持续大约3-5周，其间它们随水流广泛 扩散。当它们达到大约0.3mm大小时在自由游动末期，幼虫变态并永久附着 于一个坚硬的表面上。根据温度和食物的可获得性。在1-2年达到性成熟。

与Grassostrea属的所有种类一样，正常太平洋牡蛎二倍体有20条染色 体。太平洋牡蛎的成熟卵停止在第一次减数分裂前期(Lu，1986)。以显微镜 观察在新受精卵中可见10个联合四分体。受精或激活后，在正常情况下10 个四分体将进行2次减数分裂并释放2个极体，称为极体I(含20个2分体) 和极体II(含10个染色单体)。卵母细胞中剩余的10个染色单体与精子的10 个染色单体结合形成二倍受精卵。对正常二倍体牡蛎观察到的上述正常的减 数分裂和受精过程在图1中以图解表示。

对于图1和其中描述的(a)到(h)各个步骤：(a)减数分裂前，两套染色体加 倍形成两套复制的染色体；复制的染色体以着丝粒连在一起；(b)受精激活卵 并恢复减数分裂；(c)第一次减数分裂导致第一极体中全套复制的染色体消 失；(d)第二次减数分裂将以着丝粒连在一起的剩下的染色体分开；(e)在第二 极体中的一套染色体消失；(f)在称为配子配合的过程中，卵和精子的剩下的 单倍染色体组结合起来使细胞恢复二倍体；(g)复制二倍染色体组；(h)分裂产 生二倍体胚。

根据本发明，借助于染色体组操作以三倍体雌性和二倍体雄性生产四倍 体牡蛎。为此目的，将三倍体雌性放在高温和充足食物的环境条件下适应。 优选立即在冬眠之后的配子形成的早期开始适应。如上所述，三倍体牡蛎现 在可在市场上买到。它们一般是用二倍体牡蛎通过在减数分裂期间阻断受精 卵极体II的释放生产的。(作为本发明的结果，开辟了一条生产三倍体牡蛎的 新途径。它具有优于现有技术的一些优势。然而，为了实现本发明，以现有 技术作起点，将现有技术的雌性三倍体牡蛎用作起始材料。随后通过将本发 明的四倍体牡蛎(雌性)与正常二倍体雄性牡蛎配种可生产新型三倍体牡蛎这 将是显而易见的。通过自然配种而不涉及受精过程的任何人工处理生产的这 种新型三倍体牡蛎预期具有优于以涉及极体II阻断的人工受精过程生产的现 有技术三倍体牡蛎的一些优势。见下面的进一步讨论。)在产卵前以流式细胞 光度术(Guo，1991)逐个检查三倍体动物以证实其倍性。

下一步经解剖从三倍体雌体中收集卵(剥离产卵组织)。用过滤的海水漂 洗卵并在合适的筛(如25μm筛)上保持。

然后用来自正常二倍体雄性的精子使卵受精。用于受精的精子量典型地 是每1个卵细胞大约10个精细胞。

受精后必须在合适的时间点开始抑制极体I从受精卵中释放。通过应用 热休克或水压休克或借助于诸如细胞松驰素B或6-二甲氨基嘌呤的化学试 剂可实现对PB1的抑制。在本发明中优选借助于细胞松驰素B(CB)实现所说 的PB1抑制。需要调节受精卵化学处理的时间以获得最佳结果。典型地， CB处理的时间相应地为在缺乏化学试剂的相应条件下半数未处理的三倍体 卵释放其极体I花费的统计平均时间的大约60-80％。在大多数情况下， 所说的统计平均时间可通过显微镜检查测定，在25℃下在太平洋牡蛎中约为 25分钟。因此，CB处理在25℃下典型地持续大约15-20分钟。还必须调 节CB处理的开始时间以便获得最佳结果。典型地是，CB处理的开始时间 为受精后大约5分钟。

实现PB1阻断过程后，将这些卵脱离该过程的影响，然后进入标准的有 壳水生动物孵化工业随后的步骤。

提供下面的实施例以说明本发明。 实施例1

用于本实验的三倍体太平洋牡蛎年龄为2岁并通过阻断PB2的释放来生 产。在产卵前以流式细胞光度术逐个证实三倍体动物。经剥离产卵组织获得 配子。将卵通过85μm的滤网以去掉大组织碎片并在25μm滤网中漂洗。 使用过滤(2μm)的海水在25-28℃下进行全部受精和处理。用于本实验的 海水盐度大约为20-22ppt。

用来自二倍体的单倍体精子使来自三倍体的卵受精。受精后卵分成两 组：TD和TDCB组。在TD组中，受精卵未用任何化学物质处理并培养作 为对照组。在TDCB组中，受精卵用细胞松驰素B(CB)处理以阻断PB1的释 放。在二甲亚砜(DMSO)中制备CB并加入受精卵中达到终浓度为0.5mg/升， 含0.5％DMSO。CB处理在受精后(PF)5分钟时开始并持续15分钟。CB 处理后，用DMSO-海水(1％)漂洗卵并以65卵/ml的密度培养。使用3对 牡蛎作亲本制备一式三份。由于三倍体雌性产卵力低且预测实验组的存活率 低，所以使用了全部可得的卵，在三份中的卵数未标准化。另外，将更多的 卵用于TDCB组以保证四倍体的存活。但培养密度维持大约相同。

在受精后90-120分钟测定TD和TDCB组的分裂百分比。记录两组 中分裂胚到D期(第1天)，第7天和幼体(第35天)的存活率。在取样日期也 通过流式细胞光度术测定存活幼体的倍性组成。

在受精后3个月，取样存活牡蛎进行体重和染色体计数。为进行染色体 分析，牡蛎先用秋水仙碱(0.005％)处理12小时并伴随着加强摄食。从壳中 分离牡蛎的内脏部分并称重。然后将整体剁碎并在乙酸/甲醇混合液(1∶3)中固 定。将适量的固定样品倾注到玻片上并空气干燥。用Leishman氏染料染色玻 片。每个牡蛎最少计数10个显示出无明显染色体丢失迹象的中期分裂相。分 析中仅包括确信测定了染色体数目的那些个体。具有20，30和40条染色体的 牡蛎被分别分类为二倍体，三倍体和四倍体。

三倍体卵直径平均比二倍体大15％，也即体积大54％。在三份中从三 倍体获得的卵数目不同。因此，三个三倍体雌体分别产生8.2，0.4和0.8百万 的卵。CB处理对早期有丝分裂没有任何明显的影响，在TD和TDCB组中 分裂百分数近似相等，见表1。

分裂的卵到D期(24小时PF)的存活率在三份中各不相同(表1)。在第1 份中，TDCB组存活百分率比TD组低。在第2份中，2组大约相同。然而 在第3份中，TDCB组存活百分数比TD组更高。当在后期进行比较时，很 明显TDCB组最终比相应的TD组具有更高的存活率。在第2份和第3份中， TDCB组比TD组在第7天表现出更高的存活率。尽管在第35天两份的TD 或TDCB组中均没有存活个体。在第1份中，在第7天TDCB组比TD组显 示出更低的存活率。然而经变态和附着后，TDCB1组(指第1份的TDCB组) 比TD1组(指第1份的TD组)产生明显更多的幼体。在从TDCB1收获的总共 2,500幼体代表0.0738％的分裂卵，而从TD1仅获得的2个幼体，代表0.0003 ％的分裂卵。

在受精后24小时，以流式细胞光度术分析在TD组中分离的胚主要由 2.5 n非整倍体细胞(n是单倍体数，在本例中指10)组成。在TDCB组中，2 个非整倍体细胞群较明显。一个群体落在三倍体和四倍体之间，另一个落在 四倍体和五倍体之间。在受精后24小时整倍体峰不明显。在第7天，来自 TD组存活幼虫的细胞仍主要是非整倍体，但在2.5n处的峰值不再明显。相 反，在TD组的非整倍体峰倾向于二倍体。在TDCB组中，在第7天存活幼 虫的细胞占优势的是四倍体或接近四倍体的非整倍体。有一个三倍体或接近 三倍体的非整倍体小峰。

在第13天，在第2和3份的TD和TDCB组中没有幼虫保留下来。在 TD1中的存活者太少不能取样用于流式细胞光度术测定。在第13天从TDCB1 收集到有眼幼虫的样品，将大约100个的聚集体分离成单细胞悬液进行流式 细胞光度术。我们估计细胞中2n，3n和4n类型的比例分别为4％，16％和 80％。在第22天，分析了TDCB1的12个变态幼虫：发现8个四倍体(67 ％)，2个三倍体(17％)和2个嵌合体(17％)。在TD1中，在第35天处死存 活的2个幼体：一个是二倍体，另一个是三倍体。由于难以用流式细胞光度 术检测DNA含量的小差异，这里列出的整倍体(来自TDI)可包括加上或减去 一些染色体的非整倍体。

附着后实际上无死亡。受精后第3个月，TDCB1的牡蛎长度达到1-4 cm长。从TDCB1中取样31个牡蛎用于体重测量和染色体计数。从30个牡 蛎中获得了明确的染色体计数，剩下的一个牡蛎没有足够可计数的中期分裂 相并从分析中排除。在30个牡蛎中，一个有20条染色体，1个有30条染色 体，它们分别被分类为二倍体(3.3％)和三倍体(3.3％)。20个牡蛎刚好有40 条染色体，分类为四倍体(66.7％)，7个牡蛎为具有21，31，32，33，38(2)，39 和41条染色体的非整倍体。一个牡蛎为具有32条染色体的细胞占73％， 40条染色体的细胞占27％的嵌合体。

四倍体牡蛎平均体重(内脏)为284mg，从15mg到610mg间变动(见表 2)。平均非整倍体牡蛎显著(P＜0.05)小于四倍体。然而，一个具有38条染 色体的非整倍体牡蛎重479mg，它是小组中第四大的牡蛎，且总体量(包括 壳)为最大。与四倍体相比，二倍体和三倍体牡蛎较小。

表1.在3份实验组中所用的卵数目，分裂百分数和分裂的受精卵在D 期(第1天)，第7天和幼体(第35天)的存活率。           卵       分裂    D-期    第7天  幼体(spat) 组     (×1000)    (％)    (％)    (％)    (％) TD1    700         86.4    21.7     5.7    0.0003 TDCB1  3998        84.6    5.4      2.1    0.0739 TD2    144         79.3    5.1      0.3    0 TDCB2  217         70.8    5.7      1.1    0 TD3    217         87.7    29.5     1.0    0 TDCB3  444         89.2    35.2     1.2    0

表2.在用单倍体精子受精的三倍体卵中经抑制极体I而产生的三月龄 太平洋牡蛎的倍性分类和体重(mg)。 倍性      数目(％)   体重(SE) 二倍体    1(3.3)     65 三倍体    1(3.3)     92 四倍体    20(66.7)   284(33) 非整倍体  7(23.3)    160(49) 嵌合体    1(3.3)     62 总计      30(100)    237(28) 实施例2

蓝贻贝(Mytitus edulis)的四倍体基本上按照实施例1的方法使用相应的 三倍体卵和来自二倍体的单倍体精子来生产。 实施例3

珍珠贝(Pinctada magaratifera)的四倍体基本上按照实施例1的方法使用 相应的三倍体卵和来自二倍体的单倍体精子来生产。 实施例4

Kumomoto牡蛎(Crassostrea sikamai)的四倍体基本上按照实施例1的方 法使用3倍体卵和来自二倍体的单倍体精子来生产。 实施例5

Suminoe牡蛎(Crassostrea rivularis)的四倍体基本按照实施例1的方法， 使用相应的三倍体卵和来自二倍体的单倍体精子来生产。 实施例6

美国牡蛎(Crassostrea virginica)的四倍体基本上按照实施例1的方法使用 三倍体卵和二倍体的单倍体精子来生产。 实施例7

海湾扇贝(Argopectin irradians)的四倍体基本上按照实施例1的方法使用 相应的三倍体卵和二倍体的单倍体精子来生产。 实施例8

Chlamys属，特别是中国扇贝(Chlamys farrari)的四倍体基本上按照实施 例1的方法使用相应的三倍体卵和二倍体的单倍体精子来生产。 实施例9

马尼拉蛤(Tapes philippinarum)的四倍体基本上按照实施例1的方法，使 用相应的来自三倍体的卵和二倍体的单倍体精子来生产。 实施例10

Patinopecten属，特别是日本扇贝(Patinopecten yessoensis)的四倍体基本 上按照实施例1的方法使用相应的三倍体卵和二倍体的单倍体精子来生产。 实施例11

Haliotus属腹足类软体动物，特别是鲍的四倍体基本上按照实施例1的 方法，使用三倍体的相应的卵和二倍体的单倍体精子来生产。 实施例12

本实施例的资料表明，本发明的四倍体对于生产三倍体非常有用且有 效。象正常的二倍体，四倍体牡蛎一年时间达到成熟。在成熟时，取样四倍 体太平洋牡蛎(Crassostrea gigas Thunberg)。它们是性别比例近似正常的雌体 或雄体。与生殖力严重下降的三倍体相反，四倍体表现出与二倍体相近的生 殖力。在四倍体和二倍体之间进行交配。以流式细胞光度术检查迄今所有来 自四倍体×二倍体(和反交)杂交的幼体均是三倍体。

在二倍体(D)和四倍体(T)间进行了所有4种可能的杂交：DD，DT，TD和 TT(雌性列在前面)。二倍体雌性有8.9百万卵，四倍体雌性有6.4百万卵。在 各组中受精水平较好，变化范围从92.3到97.8％(表1)。与正常二倍体对照 (DD)相比较，在DT和TD杂交中，存活到幼体时期的受精卵数较多。 TT交配存活率很低。

在受精后50天，以DD，DT和TD交配的牡蛎(每组30个牡蛎)中取样 以流式细胞光度术进行倍性测定。DD的所有30个牡蛎均是二倍体，所有 60个DT和TD交配的牡蛎均是三倍体。从TT交配中分析到的3个牡蛎是 四倍体。 表1.受精水平，受精卵数，到D和幼体期的累积存活率 组    受精水平    受精卵数  到D期的存活率  到幼虫期的存活率

   (％)       (x106)       (％)              (％) DD     97.0        2,688        32.2              0.89 DT     92.3        2,986        11.4              0.50 TD     97.5        2,465        29.3              0.87 TT     97.8        2,442        9.5               0.001

使用本发明的四倍体Crassostrea virginica牡蛎和二倍体Crassostrea virginia牡蛎重复上述方法。获得较好的DT及TD杂交的三倍体Crassostrea virginica牡蛎产率。

被认为在以PB1抑制为特征的从三倍体雌性和二倍体雄性形成四倍体 牡蛎的本发明的上述方法中发生的各种生物学事件在图2中进行了图解说 明。应将这些事件与在图1中所述的通常情况进行对照。

上面说明的用从三倍体获得的卵生产活的四倍体支持了细胞数目缺陷 假说。三倍体卵体积比从二倍体获得的卵大54％，且卵体积增加可能导致细 胞数的明显增加。

一旦根据本发明生产出成熟的四倍体牡蛎，它们即可用于与正常二倍体 牡蛎交配以产生三倍体-4n×2n-＞3n。简单地说，由于三倍体生殖能力 比正常二倍体低，对于商品生产者来说它们有一些可变成市场利益的生理优 势(Allen，1988)。三倍体牡蛎广泛地在西海岸培养且在美国东海岸的培养也不 断增加。三倍体也在欧洲(例如，法国、爱尔兰)和亚洲(例如，日本、中国、 朝鲜)培养。

目前三倍体商品生产的重要特征在于它们使用抗生素细胞松驰素B(CB) 来生产。已发现CB在许多人类和动物实验中引起畸形和致突变。由于它用 于牡蛎卵上，CB在市售大小的牡蛎中不存在，所以没有组织残留的危险。 然而，该药品的固有毒性促使卫生部门和兽医药的人类服务中心将CB放在 “优先非低水平管理”中。很可能其它国家也在关注关于使用CB和其它化 学物质。由本发明提供的从四倍体生产三倍体牡蛎的新途径可避开这类世界 关注的问题。

经交配生产三倍体比经诱导(用药品或其它方法)至少具有三个其它的优 势。(i)用四倍体与二倍体杂交生产的三倍体可证明比经药物处理生产的三倍 体更健壮，因为四倍体卵的大小比二倍体卵要大得多。(三倍体卵的大小是二 倍体卵体积的大约1.5倍。四倍体卵是二倍体的大小的两倍)。卵体积增大具 有优势，因为在幼虫早期它给发育的胚更多的能量储备。在实施本发明中， 已经证明四倍体有壳水生动物产生配子且四倍体卵较大。(ii)从4n×2n交配 产生的三倍体没有由于抑制第二极体而产生的近亲交配衰退。(iii)从理论上 说，4n×2n交配的后代为100％三倍体，而诱导方法永远不能达到这一程 度。纯三倍体牡蛎对具有不定数二倍体和嵌合体污染的三倍体的优势是非常 明显的。纯三倍体牡蛎对群体控制也具有优势。由于三倍体群体在功能上是 不育的(3n×3n交配后代不能存活)，它们可用于避免在生态系统(如含有非 天然种类或遗传修饰的生物)中繁殖。

四倍体有壳水生动物对水产养殖来说是有潜力的候选者。本发明人初步 观察表明，四倍体牡蛎具有反常的大型闭壳肌，在扇贝中它是市售产品。

除了上面描述的四倍体的优势和应用外，还有许多其它优势和应用。因 此，四倍体可用于在正常情况下不能杂交的两个种类间进行过渡性杂交。四 倍体对于产生更多的四倍体(4n×4n-＞4n)也是有用的。通过称为雌核发 育的过程可将四倍体用于生产单一的二倍体组合。仔细阅读本发明说明书 后，本发明的其它优势和应用对本领域的技术人员来说是显而易见的。

尽管本发明上面的描述重点放在本发明的优选实施方案上面，但本发明 的范围不受优选实施方案的任何限制，而仅以本说明书所附的权利要求来限 定其范围。

正如前面所述，下面提供了一些技术术语的简短定义以便帮助理解本发 明。

非整倍体：与正常二倍体相比，丢失或获得了一个或多个单条染色体(与 完整的染色体组相反)的形式。

着丝粒：染色体上包括有丝分裂、减数分裂纺缍体附着位点的结构区。

染色单体：经复制产生的染色体拷贝。

二倍体：具有双倍于基数(n)(单倍体数)的染色体组的一种形式。

整倍体：具有基础染色体组整数倍的一种形式。

单倍体：具有基础染色体组的一种形式。

减数分裂：一种特殊的细胞分裂过程、发生在性细胞成熟期、其中每个 子核获得半数的染色体。因此它是与受精相反的过程。在正常情况下它补偿 了由受精引起的染色体数目加倍。

有丝分裂：一种涉及纺缍体和染色体的细胞核分裂。这一过程产生两个 彼此相同并与亲代核相同的子核。

四倍体：具有4倍于单倍体数的染色体组的一种形式。

三倍体：具有3倍于单倍体数的染色体组的一种形式。 参考文献 Allen，Jr.，S.K.(1988)；Oceanus 31，58-63. Allen，Jr.，S.K.and Downing，S.L.(1991)；J.Shellfish Research 10，19-22. Guo，X.(1991)；Ph.D.Dissertation，University of Washington，Seattle，

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