一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法

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一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法
申请号	CN202011061629.9	申请日	2020-09-30	公开(公告)号	CN112075339A	公开(公告)日	2020-12-15
申请人	北京林业大学;			发明人	于晓南; 朱炜; 陈曦; 孙慧仪; 孟子卓; 程堂仁; 张启翔;
摘要	本发明提供了一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法，包括如下步骤：1)确定诱导时期；2)秋水仙素溶液配置；3)注射秋水仙素溶液；4)花粉采收；5)多倍体花粉的鉴定；6)杂交授粉；7)种子采收与播种；8)多倍体子代鉴定。本发明方法简单易行，多倍体花粉诱导率高，达47.4％，与现有方法相比，本发明不需组培及无菌的操作环境，成本低，直接可获得多倍体种子，有效避免了多倍体离体诱导等技术过程中容易污染、操作条件严格、产生嵌合体和过程繁琐等问题，便于推广，可以作为芍药多倍体新种质创造的一种重要手段，应用前景十分可观。
权利要求	1.一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法，其特征在于，包括以下步骤： 1)确定诱导时期在芍药现蕾后，每隔2d取花蕾中的花药即时压片，观察花粉母细胞减数分裂进程，并测量相应花蕾的直径大小。待观察到大部分花粉母细胞进入到减数分裂前期至中期时，记录相应的花蕾直径作为选择诱导时期的标准； 2)秋水仙素溶液配置将秋水仙素粉末溶解于无菌水中配置成浓度为0.1％～0.5％的溶液，得到秋水仙素溶液； 3)注射秋水仙素溶液根据步骤1)，选择合适花蕾直径的花蕾作为诱导材料，用1ml的注射器往花蕾中注射步骤2)中配置好的秋水仙素溶液，从花蕾下端扎入往上注射，直至药剂渗出花蕾为止，注射次数优选为2次(每天1次，两天完成)； 4)花粉采收待步骤3)中被注射花蕾的花药成熟时(花蕾开放前1-2天)，取花药置于阴凉处晾干1～ 2天，用筛子筛得花粉倒入装有硅胶的10ml的离心管中，4℃冰箱保存备用； 5)多倍体花粉的鉴定将获得的花粉用醋酸洋红染色置于显微镜下观察，花粉直径大于正常花粉粒直径1.3倍的花粉粒为多倍体花粉； 6)杂交授粉将步骤5)中鉴定过的多倍体花粉授于二倍体芍药品种的柱头上杂交； 7)种子采收与播种于8月中旬采收步骤6)中杂交的果荚，获得种子，并播种； 8)多倍体子代鉴定对步骤7)中播种后获得幼苗的新根进行倍性鉴定，挑选多倍体植株，即通过诱导多倍体花粉杂交得到多倍体芍药。 2.根据权利要求1所述高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法，其特征在于，步骤 1)和步骤3)所述的花蕾直径为11～12cm。 3.根据权利要求1所述高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法，其特征在于，步骤 3)所述的秋水仙素溶液的浓度为0.4％。
说明书全文	一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法技术领域 [0001] 本发明属于植物多倍体育种的技术领域，具体涉及一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法。背景技术 [0002] 芍药为芍药科芍药属多年生草本花卉，是我国传统的名花，具有重要的药用和观赏价值，备受我国和世界人民的喜爱。全世界共有20余种芍药组植物，其中我国原产有7种、2亚种。从芍药品种来看，根据种源的不同主要分为三大类群：中国芍药品种群、杂种芍药品种群和伊藤芍药品种群。我国芍药品种的种源单一，主要为芍药(Paeonia lactiflora)这个种，均属于中国芍药品种群，故基本为二倍体(2n＝2x＝10)。而众多的中国芍药品种存在茎秆较细、花色单一、花朵垂头、花期茎秆易倒伏等缺点。 [0003] 通常来说，与普通二倍体植物相比，多倍体植物在形态上表现为植株高大、茎秆粗状、叶片肥厚、花色纯正、花大且花期延长、生长势和抗逆性增强等优良性状，不仅可提高花卉的观赏价值和商业价值，也可为种质资源创新提供了更多的可能性。 [0004] 由于秋水仙素可以使生物染色体数目加倍，故其在植物多倍体诱导中应用非常广泛，极大地促进了多倍体育种工作的开展。根据诱导植物部位的不同，可以分为配子诱导加倍和体细胞诱导加倍两种方式。诱导配子加倍然后再作为亲本进行杂交获得三倍体后代；而通过体细胞诱导直接获得四倍体植株。在芍药的多倍体诱导和选育上，国内外研究较少，仅朱炜等，秋水仙素诱导芍药2n花粉研究初报，中国观赏园艺研究进展，2017，188～192；张滕等，芍药种子和地下芽多倍体诱导初步研究，中国观赏园艺研究进展，2017，225～229。其中主要包括：直接用浓度为0.05％～0.2％的秋水仙素溶液浸泡芍药的种子(6～18h)和地下芽(一周)，然后再接种到萌发培养基中，培养获得植株，但上述方法必须与组培相结合，操作要保持无菌的环境，实验条件严格，周期较长，同时芍药的组培体系尚未建立，获得植株也无法后续培育成活，此外容易形成嵌合体，无法形成真正的多倍体植株；发明专利CN104855280A公开了一种芍药2n配子的诱导方法，以0.02％～0.1％的秋水仙素溶液处理芍药1.5cm-3cm的花蕾，然后待花蕾成熟后取成熟花粉中粒径较大的为芍药2n配子，然而上述方法的2n配子诱导率非常低，最高仅5.26％，诱导率低的原因主要在于操作方法具有盲目性，忽视了植物器官本身的生物学特性。目前的方法均不足以在芍药多倍体育种工作中进行应用，因此需要寻找一种操作简单、诱导率高且适合芍药多倍体诱导的方法。发明内容 [0005] 针对现有存在的上述不足，本发明的目的在于提供一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法，主要解决芍药多倍体诱导存在诱导率低、操作繁琐、技术要求高、容易形成嵌合体等技术问题。 [0006] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法，包括以下步骤： [0007] 1)确定诱导时期 [0008] 在芍药现蕾后，每隔2d取花蕾中的花药即时压片，观察花粉母细胞减数分裂进程，并测量相应花蕾的直径大小。待观察到大部分花粉母细胞进入到减数分裂前期至中期时，记录相应的花蕾直径作为选择诱导时期的标准； [0009] 2)秋水仙素溶液配置 [0010] 将秋水仙素粉末溶解于无菌水中配置成浓度为0.1％～0.5％的溶液，得到秋水仙素溶液； [0011] 3)注射秋水仙素溶液 [0012] 根据步骤1)，选择合适花蕾直径的花蕾作为诱导材料，用1ml的注射器往花蕾中注射2)中配置好的秋水仙素溶液，从花蕾下端扎入往上注射，直至药剂渗出花蕾为止，注射次数优选为2次(每天1次，两天完成)； [0013] 4)花粉采收 [0014] 待步骤3)中被注射花蕾的花药成熟时(花蕾开放前1-2天)，取花药置于阴凉处晾干1～2天，用筛子筛得花粉倒入装有硅胶的10ml的离心管中，4℃冰箱保存备用； [0015] 5)多倍体花粉的鉴定 [0016] 将获得的花粉用醋酸洋红染色置于显微镜下观察，花粉直径大于正常花粉粒直径1.3倍的花粉粒为多倍体花粉； [0017] 6)杂交授粉 [0018] 将步骤5)中鉴定过的多倍体花粉授于二倍体芍药的柱头上杂交； [0019] 7)种子采收与播种 [0020] 于8月中旬采收步骤6)中杂交的果荚，获得种子，并播种； [0021] 8)多倍体子代鉴定 [0022] 对步骤7)中播种后获得幼苗的新根进行倍性鉴定，挑选多倍体植株，即通过诱导多倍体花粉杂交得到多倍体芍药。 [0023] 这样，本发明不需要组培和无菌操作，只需要对处在减数分裂前期至中期的花粉母细胞进行诱导，再将获得的多倍体花粉用于杂交即可，避免了一般多倍体诱导过程中诱导率低、容易受污染、环境要求严格和操作步骤繁琐等问题。 [0024] 进一步，所述的花蕾直径为11～12cm。 [0025] 这样，11～12cm的芍药花蕾基本处于大部分花粉母细胞减数分裂的前期至中期阶段，是秋水仙素溶液发挥作用的时期，大大的提高了多倍体花粉的诱导率。 [0026] 进一步，所述筛子的大小为80目(孔径0.2mm)。 [0027] 这样，可以将花粉与花药残渣较完整的分离开，获得较纯净的芍药花粉。 [0028] 进一步，所述幼苗的新根为根尖1～2cm。 [0029] 这样，既可以保证多倍体植株的正常生长，又能够较清晰的观察幼苗的染色体条数，来鉴定是否为多倍体植株。 [0030] 本发明提供了完整的高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的具体流程，利用该方法能获得多倍体芍药植株，为芍药多倍体新种质的培育及开发利用提供了一种新方法。 [0031] 相比现有技术，本发明具有如下优点： [0032] 1、本发明先通过诱导多倍体花粉，再用来杂交授粉获得多倍体芍药新种质，方法简单易行，处理时间短，与现有直接诱导多倍体方法相比，本发明不需要组培及无菌的操作环境，成本低，直接获得多倍体种子种植在大田，有效避免了多倍体离体诱导等技术过程中容易污染、操作条件严格和过程繁琐等问题，便于推广，可以作为芍药多倍体新种质创造的一种重要手段，应用前景十分可观。 [0033] 2、本发明先通过减数分裂观察方法确定了最佳的诱导时间为芍药花蕾直径在11～12cm的时候，此时的花粉母细胞基本处于减数分裂前期至中期，是秋水仙素溶液发挥作用的最佳时期，因此增加了多倍体花粉的诱导率，本发明中多倍体花粉诱导率达到47.4％，大大的高于目前多倍体花粉的诱导效率，取得了意想不到的效果。附图说明 [0034] 图1为最佳诱导时期芍药花蕾直径为11～12cm的花蕾图片； [0035] 图2为最佳诱导时期芍药花蕾直径为11～12cm的花药图片； [0036] 图3为芍药花蕾直径为11～12cm时的减数分裂前期图片； [0037] 图4为芍药花蕾诱导多倍体花粉的图片； [0038] 图5为二倍体芍药的染色体图片； [0039] 图6为芍药多倍体花粉杂交后获得的三倍体子代染色体图片。具体实施方式 [0040] 下面结合具体实施例和附图对本发明进一步详细说明。以下附图用于说明本发明，但不用来限制本发明的保护范围，本发明的保护范围以权利要求书为准。以下实施例中试剂和方法若无特别说明均按照常规方法配制和操作。 [0041] 供试材料均种植于国家花卉工程中心小汤山基地(北京，昌平区，小汤山镇)。芍药植株均生长强壮、生长势基本一致，无病虫害植株。 [0042] 多倍体鉴定方法(根尖压片法)： [0043] 于9～10月份挖出植株，切取白色新根根尖部位1～2cm，放入饱和对二氯苯溶液中预处理24h(4℃)，再用卡诺固定液(无水乙醇：冰醋酸＝3:1)固定24h(4℃)，然后用1mol/L盐酸溶液于60℃恒温水浴锅中解离9～11min后清洗，置于载玻片上用卡宝品红染色5min后压片，最后在显微镜100X油镜下观察并拍照。 [0044] 实施例1 [0045] 本实施例涉及一种高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法，包括如下步骤： [0046] 1)确定诱导时期 [0047] 选择健壮的芍药植株，在芍药花蕾开始出现后，每隔2d摘取花蕾并用游标卡尺测量花蕾的直径，做好记录。随机取得花药5～8个，置于载玻片上，滴1～2滴卡宝品红试剂，用镊子夹碎花药使花粉母细胞尽量脱离出来，再将可见花药残渣除去，染色3～5min，压片，在显微镜40X下观察减数分裂进程。待观察到大部分花粉母细胞进入到减数分裂前期至中期时，以相应的花蕾直径作为诱导时期的标志，此时花蕾直径为11～12cm； [0048] 2)秋水仙素溶液配置 [0049] 将秋水仙素粉末溶解于无菌水中配置成浓度为0.1％的溶液，即得到0.1％的秋水仙素溶液； [0050] 3)注射秋水仙素溶液 [0051] 根据步骤1)，用游标卡尺测量选出直径为11～12cm的花蕾作为诱导材料，用1ml的注射器往花蕾中注射步骤2)中配置好的秋水仙素溶液，从花蕾下端扎入往上注射，直至药剂渗出花蕾为止，注射一次； [0052] 4)花粉采收 [0053] 待步骤3)中被注射花蕾的花药成熟时(花蕾开放前1-2天)，取花药置于阴凉处晾干1～2天，用80目花粉筛筛出花粉倒入装有硅胶的10ml的离心管中，4℃冰箱保存备用； [0054] 5)多倍体花粉的鉴定 [0055] 用解剖针蘸取花粉均匀的洒在载玻片上，滴1～2滴醋酸洋红染液，用解剖针搅拌均匀，染色3～5min，盖片，置于显微镜40X下观察并拍照，用Image-plus软件测量花粉粒的直径，其中花粉粒直径大于正常花粉粒直径1.3倍的为多倍体花粉； [0056] 6)杂交授粉 [0057] 选择芍药品种‘莲台’作为母本，在其花蕾开放前1～2天去雄套袋，于去雄后3天早上9:00-11:00对柱头授以步骤4)中采收的花粉，连续授粉三天，10天后去除硫酸纸袋更换为网袋； [0058] 7)种子采收与播种 [0059] 于8月中旬，待芍药果荚变成蟹黄色开始采收，剥开果荚获得杂交种子，将种子播种于大田； [0060] 8)多倍体子代鉴定 [0061] 对步骤7)中播种后获得幼苗的新根进行倍性鉴定，挑选多倍体植株，即通过诱导多倍体花粉杂交得到多倍体芍药。 [0062] 实施例2 [0063] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.2％。 [0064] 实施例3 [0065] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.3％。 [0066] 实施例4 [0067] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.4％。 [0068] 实施例5 [0069] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.5％。 [0070] 实施例6 [0071] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为两次(1天1次两天注射完)。 [0072] 实施例7 [0073] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.2％，步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为两次(1天1次两天注射完)。 [0074] 实施例8 [0075] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.3％，步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为两次(1天1次两天注射完)。 [0076] 实施例9 [0077] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.4％，步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为两次(1天1次两天注射完)。 [0078] 实施例10 [0079] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.5％，步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为两次(1天1次两天注射完)。 [0080] 实施例11 [0081] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为三次(1天1次三天注射完)。 [0082] 实施例12 [0083] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.2％，步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为三次(1天1次三天注射完)。 [0084] 实施例13 [0085] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.3％，步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为三次(1天1次三天注射完)。 [0086] 实施例14 [0087] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.4％，步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为三次(1天1次三天注射完)。 [0088] 实施例15 [0089] 与实施例1相比，其区别在于，本实施例中步骤2)所配置的秋水仙素浓度为0.5％，步骤3)所注射秋水仙素溶液的次数为三次(1天1次三天注射完)。 [0090] 实施例1-15的高效诱导多倍体花粉培育芍药多倍体的方法所得到的结果如下表1所示。 [0091] 表1 [0092] [0093] 结果由表1可知，随着秋水仙素浓度的升高，诱导率一直升高，但同时花蕾存活率下降；随着注射次数的增加，诱导率并不是一直呈增加的趋势，而是在注射两次时达到最高，同时花蕾存活率也呈下降的趋势。0.5％秋水仙素注射1次和0.4％秋水仙素注射2次的诱导率较高，分别达到45.70％和47.40％；0.4％秋水仙素注射3次，花蕾存活率最低，仅20.00％。所以，0.4％秋水仙素注射2次的诱导效果最佳。 [0094] 虽然，上文中已经用一般性说明、具体实施方式及试验，对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均属于本发明要求保护范围。