一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法

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一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法
申请号	CN202110801772.5	申请日	2021-07-15	公开(公告)号	CN113519394A	公开(公告)日	2021-10-22
申请人	云南中医药大学;			发明人	黄衡宇; 董鲜; 孟庆红; 李宏哲; 梁永丽;
摘要	本发明提供一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，包括的步骤有：(1)将消毒灭菌处理后的种子接种于培养基A中，进行无菌萌发；(2)取无菌实生苗带叶茎尖经灭菌后的秋水仙素溶液浸泡，再转入培养基B中培养后转入培养基C中；(3)多倍体植株在培养基C中可增殖生根一步完成。本发明对红果参多倍体植株体外快繁的工艺进行优化调整，同步增殖和生根，简化组培过程，整个培养过程同时在一个培养基中进行，极大地提高了人工体外繁殖效率。此外，本发明建立了红果参同源多倍体诱导体系；在多倍体生长延缓的情况下采用直接器官发生方式增殖，同时保持又了较高的繁殖系数，大大缩短了培养周期，且成本低、周期短、质量和成活率高。
权利要求	1.一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的种子接种于培养基中，进行无菌萌发，然后取其茎尖通过一定质量浓度的秋水仙素溶液浸泡并转入含秋水仙素的培养基中培养，获得多倍体植株后再进行增殖生根一体化培养及炼苗移栽。 2.根据权利要求1所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其当年饱满果实； (2)将步骤(1)的果实进行消毒处理； (3)无菌实生苗的获取：将经过步骤(2)消毒灭菌好的果实切开，取其内种子为材料，接入下列培养基A中，所述培养基A，包括以下原料：MS基本培养液蔗糖琼脂粉控制光照度、温度、光照时间的条件下进行种子的无菌萌发； (4)浸泡处理：取步骤(3)带叶茎尖经高温灭菌后的秋水仙素溶液浸泡处理； (5)无菌实生苗带叶茎尖培养：取步骤(4)带叶茎尖经无菌水清洗后转入下列培养基B中，所述培养基B，包括以下原料：MS基本培养液秋水仙素 6‑苄胺基嘌呤 α‑萘乙酸蔗糖琼脂粉控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养； (6)取步骤(5)带叶茎尖，转入下列培养基C中，所述培养基C，包括以下原料：MS基本培养液 6‑苄胺基嘌呤 α‑萘乙酸蔗糖琼脂粉控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养，即可获得增殖和生根一体化试管苗； (7)炼苗和移栽：取步骤(6)中的生根植株置于室温下炼苗，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中消毒，后移栽至经消毒的腐殖质土中保温保湿培养，即得移栽苗。 3.根据权利要求2所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(2)中所述果实进行消毒处理的方法为：用自来水洗净表面后用质量百分比 10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理30s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌30min，最后无菌水冲洗 3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。 4.根据权利要求2所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(3)所述培养基A，包括以下原料：MS基本培养液：蔗糖 30000mg/L琼脂粉 4700mg/L。 5.根据权利要求4所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，所述培养基A的pH值为5.4‑5.8。 6.根据权利要求2所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(4)所述带叶茎尖长度为1.0‑1.5cm；秋水仙素溶液浓度为0.05％(质量比)，处理时间为84‑96h。 7.根据权利要求2所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(5)中所述带叶茎尖无菌水冲洗3次，每次不低于3min，所述培养基B，包括以下原料： MS基本培养液： 8.根据权利要求7所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，所述培养基B的pH值为5.4‑5.8。 9.根据权利要求2所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，步骤(6)中所述培养基C，包括以下原料：MS基本培养液。 10.根据权利要求8所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，所述培养基C的pH值为5.4‑5.8。
说明书全文	一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法技术领域 [0001] 本发明属于生物技术领域，尤其涉及一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法。背景技术 [0002] 红果参(Campanumoea lancifolia(Roxb.)Merr.)，为桔梗科(Campanulaceae)金钱豹属(Campanumoea)多年生植物，学名长叶轮钟草，别名红果参、肉算盘、山荸荠等(本发明均称红果参)，主要分布在东南亚部分国家，如菲律宾、越南等，在我国仅产于长江以南的部分地区如云南、四川等地，生长于海拔1500m以下的林中、灌丛下及草地上。红果参以根入药，味甘、微苦、性平，具有补虚益气、祛瘀止血的功效；主治劳倦气虚乏力，跌打损伤等症，收录于《中华本草》。另有研究表明，红果参的叶中富含黄酮类物质，黄酮类化合物是广泛存在于植物体内的一类极具开发前景的天然抗氧化剂，具有抗真菌、抗病毒、增加内源性抗氧化剂功能即抗衰老、抗炎和抗血栓形成等作用。此外，红果参的果实所含营养成分丰富，主含多糖、天然纤维、粗蛋白、粗脂肪和矿质素等，其多糖含量更是高达45.80％；而多糖能很好的清除羟基自由基和超氧阴离子自由基，对油脂的氧化有明显的抑制作用，极具新型水果的开发潜力。这些研究结果展示了红果参广阔的应用前景，亦为其进一步综合开发利用提供了科学依据。 [0003] 多倍体对植物育种最重要的贡献是细胞大小的增加(“Gigas”效应)、有害突变的缓冲、杂合度的增加、以及杂种优势(杂交优势)的利用等。植物多倍体促进的这些变化使多倍体个体在极端环境中生存下来，并在竞争中可能胜过许多二倍体祖先；同时，这些变化也使人们对开发应用于植物育种目的的多倍体产生了越来越大的兴趣；研究者们利用多倍体的这些特性选育出了产量较高、品质较好的品种，增强了对生物和非生物胁迫的耐受性。对植物多倍体的研究至今已有100多年的历史，发现多倍体在植物中是普遍存在的，且多倍体被普遍认为是一种常见的物种形成模式，对植物进化和生态学产生了极其深远的影响。尽管如此，由于多倍体植株的数量有限，难以提供多倍体育种所需要的有着丰富遗传背景的大量群体。为了解决这一问题，育种学家通常会选择合适的材料，以人工诱导的手段来达到扩大多倍体植株基数的目的。秋水仙素诱导是人工诱导多倍体最常用的方法之一，其可阻碍细胞分裂中期纺锤丝的形成，使有丝分裂被迫中断，但细胞和细胞质并不分离，从而使染色体加倍。目前，人工诱导多倍体在植物方面已得到越来越广泛的应用，如在麻疯树 (Jatropha curcas L.)、拟南芥Arabidopsis thaliana(L.)Heynh.、尖瓜(Trichosanths dioica Roxb.)、玫瑰(Rosa rugosa Thunb.)、小麦(Triticum aestivum L.)、紫锥菊 (Echinacea purpurae L.)等植物中都进行了多倍化尝试。尽管多倍体存在着种子不育性增加和生长周期延长、开花延迟等不足和缺点，但人工诱导的多倍体依然被用于植物育种遗传改良实验，因为这种技术一方面通常会提高植物相关经济部分的生物量；另一方面，染色体的加倍明显促进了次生代谢物的产生和增加，有助于目标植物增加商业价值，特别是能提高有效成分含量。 [0004] 近年来，红果参在云南、湖南、四川、湖北、江西、安徽等省份均有人工栽培，并已形成一定规模的红果参产业，除了传统的入药、鲜食(果、嫩叶)外，又开发出保健茶、保健酒、冻干粉等多种产品。本发明课题组自2017年3月开始与相关企业合作先后在云南省曲靖市炎方乡(104°9`24.64``E，26°19`10.3``N；Alt：2340m)、曲靖市陆良县(103°35`2.92``E， 24°56`28.91``N；Alt：1950m)、保山市潞江坝(98°53`53.31``E，24°53`51.37``N；Alt： 667m)、丽江市永胜县(101°1`8.57``E，26°28`7.21``N；Alt：1380m)、大理市漾濞县(99°57` 25.71``E，25°40`23.2``N；Alt：1571m)等地布点种植红果参无性系种苗，面积达1000余亩。在种植过程中发现，红果参种植400株/亩，每株果实产量1000g左右，根一年生产量1500g左右。本发明课题组认为红果参多倍体化在营养器官巨型化和生产应用上有较大的优势，尽管其果实不育性较高，但因籽少而有可能出现更好的口感；同时，倍性水平的变化往往能导致次生代谢产物含量的变化，有可能获得有效成分含量提高的红果参新品质。而多倍体植物面临种子育性低，而扦插繁殖存在系数低、易染病而具较高死亡率等问题。组织培养技术不仅有生长快、周期短、可重复性强等优点，且材料来源单一，可保留植株原有的优良性状，短期能获大量遗传性质高度一致的种苗。植物离体培养技术的发展，为药用植物资源稀缺提供了有效的保障。红果参仅有一篇对组织培养的报道，采用外植体‑愈伤组织‑不定芽的方法，而并未实现直接器官发生以最大程度保证植株优良性状的传递。因此，需要寻求一种新的成本低、时间短、质量和成活率高，且能将多倍体性状固定下来的无性繁殖方法来扩大红果参多倍体种苗的繁殖量，进行高品质种苗的工厂化生产，以满足种植需求。发明内容 [0005] 本发明的目的在于通过多倍体的诱导解决红果参药用部位—根产量的大幅提高，并提供一种能够提高红果参多倍体快速繁殖效率的方法，该方法可为固定多倍体优质性状、发展人工种植奠定技术基础。通过本发明，可提供基因型背景一致的优质多倍体种苗以满足人工种植的需求。 [0006] 为了解决以上技术问题，本发明采用以下技术方案： [0007] 一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，其特征在于，包括的步骤有：将消毒灭菌处理后的种子接种于培养基中，进行无菌萌发，然后取无菌实生苗茎尖通过一定质量浓度的秋水仙素溶液浸泡并转入含秋水仙素的培养基中培养，获得多倍体植株后再进行增殖生根一体化培养及炼苗移栽。 [0008] 进一步地，所述的红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，包括以下步骤： [0009] (1)外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其当年饱满果实； [0010] (2)将步骤(1)的果实进行消毒处理； [0011] (3)无菌实生苗的获取：将经过步骤(2)消毒灭菌好的果实切开，取其内种子为材料，接入下列培养基A中，所述培养基A，包括以下原料： [0012] MS基本培养液 [0013] 蔗糖 [0014] 琼脂粉 [0015] 控制光照度、温度、光照时间的条件下进行种子的无菌萌发； [0016] (4)浸泡处理：取步骤(3)带叶茎尖经高温灭菌后的秋水仙素溶液浸泡处理； [0017] (5)无菌实生苗带叶茎尖培养：取步骤(4)带叶茎尖经无菌水清洗后转入下列培养基B中，所述培养基B，包括以下原料： [0018] MS基本培养液 [0019] 秋水仙素 [0020] 6‑苄胺基嘌呤(6‑BA) [0021] α‑萘乙酸(NAA) [0022] 蔗糖 [0023] 琼脂粉 [0024] 控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养； [0025] (6)取步骤(5)带叶茎尖，转入下列培养基C中，所述培养基C，包括以下原料： [0026] MS基本培养液 [0027] 6‑苄胺基嘌呤(6‑BA) [0028] α‑萘乙酸(NAA) [0029] 蔗糖 [0030] 琼脂粉 [0031] 控制光照度、温度、光照时间的条件下进行培养，即可获得增殖和生根一体化试管苗； [0032] (7)炼苗和移栽：取步骤(6)中的生根植株置于室温下炼苗，从培养基中取出幼苗，将残留培养基清洗干净，放入多菌灵溶液中消毒，后移栽至经消毒的腐殖质土中保温保湿培养，即得移栽苗。 [0033] 进一步地，步骤(2)中所述果实进行消毒处理的方法为：用自来水洗净表面后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理30s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌30min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。 [0034] 进一步地，步骤(3)中所述培养基A，包括以下原料： [0035] MS基本培养液： [0036] 蔗糖 30000mg/L [0037] 琼脂粉 4700mg/L。 [0038] 进一步地，所述培养基A的pH值为5.4‑5.8。 [0039] 进一步地，步骤(4)所述带叶茎尖长度为1.0‑1.5cm；秋水仙素溶液浓度为0.05％(质量比)，处理时间为84‑96h。 [0040] 进一步地，步骤(5)中所述带叶茎尖无菌水冲洗3次，每次不低于3min。 [0041] 进一步地，步骤(5)中所述培养基B，包括以下原料： [0042] MS基本培养液： [0043] [0044] 进一步地，所述培养基B的pH值为5.4‑5.8。 [0045] 进一步地，步骤(5)所述培养时间为60‑72h。 [0046] 进一步地，步骤(6)中所述培养基C，包括以下原料： [0047] MS基本培养液 [0048] [0049] 进一步地，所述培养基C的pH值为5.4‑5.8。 [0050] 进一步地，所述多菌灵溶液的质量浓度为0.1‑0.5％。 [0051] 本发明具有以下有益效果： [0052] (1)多倍体特别是同源多倍体在染色体加倍后可带来营养器官的巨大性变化，通过多倍体育种培育更为速生、优质的红果参品种，可缩短栽培利用周期，提高产业价值； [0053] (2)由于多倍体的基因剂量倍增，使植物的一些生理生化过程随之加强，新陈代谢旺盛，其体内的某些生化成分的含量也相应提高。在红果参育种中，多倍体育种可望使利用组织代谢产物的相关品质性状得到改善提高，如黄酮等，从而提高其利用价值，降低生产成本； [0054] (3)多倍体植株生活力强，对环境适应性和抗逆力很强。从植物地理分布上看，多倍体大多出现在高纬度、高海拔以及北极、沙漠等气候环境变化剧烈的地区，进一步说明多倍体植株比通常的二倍体具有更强适应不利自然条件的能力；通过多倍体育种可提高红果参种苗的抗逆性，扩大其栽植范围； [0055] (4)本发明用组织培养技术在培养室内可实现周年生产，既节约了土地资源，又提高了经济效益，克服了传统营养繁殖方式无法周年进行生产的难点； [0056] (5)本发明实现了高效快繁的目的，40d为一个增殖培养周期，繁殖系数可达7.0以上； [0057] (6)本发明仅需一株加倍成功的多倍体植株，便可在同一培养基中利用直接器官发生方式完成增殖和生根过程，既可在满足大规模生产需要的同时，又保持了多倍体的优良性状，为其人工快繁最有效的增殖方式，且提高了种苗质量； [0058] (7)本发明简化了培养程序，在多倍体诱导成功后，整个快速繁殖过程只需1种培养基就解决了从增殖到生根的过程，利于后期生产计划的安排； [0059] (8)本发明无菌苗移栽成活率高，且生长迅速，目前已在云南省文山州普者黑进行示范栽培，效果很好； [0060] (9)本发明对红果参种质改良和快速繁殖具有重要意义和价值，同时也可为其他多年生草本类药用植物的离体加倍和快速繁殖提供技术参考。附图说明 [0061] 图1为二倍体和四倍体染色体的图 [0062] 其中图1A‑C为二倍体染色体图；图1D‑F为四倍体染色体图。 [0063] 图2多倍体植株扩繁及驯化移栽的图 [0064] 其中图2‑A为培养10d后，材料基部出现密集的不定根点图；图2‑B为20d后，植株生长迅速，新叶出现，不定根开始生长图；图2‑C为30d后，植株叶片伸展，大而肥厚，茎上有侧芽出现，不定根生长迅速图；图2‑D、E为50d后，植株高大粗壮，具发达的簇状不定根系，此时增殖系数可达7.0以上图；图2‑F为移栽60d后的多倍体植株图。具体实施方式 [0065] 为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。 [0066] 实施例1 [0067] 一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，包括以下步骤： [0068] 1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其当年饱满果实。 [0069] 2、将步骤1的果实用自来水洗净表面后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理 30s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌30min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。 [0070] 3、无菌实生苗的获取：将经过步骤2消毒灭菌好的果实切开，取其内种子为材料，接入下列培养基A中： [0071] MS基本培养液： [0072] 蔗糖 30000mg/L [0073] 琼脂粉 4700mg/L [0074] pH 5.4 [0075] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行种子无菌萌发，60d后，根芽生长旺盛，真叶舒展，获得无菌实生苗；此时，随机取10个植株，每个植株2个根尖进行染色体压片，确定其染色体数为2n＝2x＝18。 [0076] 4、浸泡处理：取步骤3长约1.0cm、带2个幼叶的茎尖在经高温灭菌后的0.05％秋水仙素溶液(质量比)中浸泡84h。 [0077] 5、带叶茎尖培养：将步骤4中的带叶茎尖取出，无菌水冲洗3次，每次不低于3min，转入下列培养基B中： [0078] MS基本培养液： [0079] [0080] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下培养60h。 [0081] 6、取步骤5中带叶茎尖，不做任何修剪，接入下列培养基C中： [0082] MS基本培养液 [0083] [0084] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下培养40d苗壮根粗时，每一植株取5个根尖进行染色体压力，可获得25.07％的多倍体，且无嵌合体现象发生。 [0085] 7、将确定加倍的植株，按1.0cm长、带1‑2节剪切，转接到步骤5中的培养基C中，培养10d后，材料基部开始膨大并出现密集的不定根基点；20d后茎段开始迅速伸长，新叶出现，老叶充分伸展，叶脉明显，同时不定根开始出现；30d后，随着主茎的生长，每一叶腋处均有侧芽萌发，新叶也逐渐展开，呈深绿色，不定根亦迅速生长；40d后材料整体高大粗壮，有分枝出现，叶片宽大呈深绿色，与周围叶肉组织相比叶脉颜色较浅而明显，同时不定根多而壮，呈发达的簇状根系，此时生根率为100％，增殖系数为7.26；此后，每一代每一植株随机抽取3个根尖进行压片，明确所有植株均为2n＝4x＝36。 [0086] 8、炼苗和移栽：步骤7中生根苗高至5cm时，将培养瓶于自然光条件下放置3d后，再将培养瓶封口膜取下放置2d，取出生根苗，小心洗净残余培养基，用0.1％多菌灵(质量比) 泡洗5min，移栽至经高温灭菌后的腐殖质土中保温保湿培养60d(温度20～25℃湿度70％左右)后，即得移栽苗，成活率可达100％。 [0087] 实施例2 [0088] 一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，包括以下步骤： [0089] 1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其当年饱满果实。 [0090] 2、将步骤1的果实用自来水洗净表面后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理 30s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌30min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。 [0091] 3、无菌实生苗的获取：将经过步骤2消毒灭菌好的果实切开，取其内种子为材料，接入下列培养基A中： [0092] MS基本培养液： [0093] 蔗糖 30000mg/L [0094] 琼脂粉 4700mg/L [0095] pH 5.6 [0096] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行种子无菌萌发，60d后，根芽生长旺盛，真叶舒展，获得无菌实生苗；此时，随机取10个植株，每个植株3个根尖进行染色体压片，确定其染色体数为2n＝2x＝18。 [0097] 4、浸泡处理：取步骤3长约1.2cm、带3个幼叶的茎尖在经高温灭菌后的0.05％秋水仙素溶液(质量比)中浸泡90h。 [0098] 5、带叶茎尖培养：将步骤4中的带叶茎尖取出，无菌水冲洗3次，每次不低于3min，转入下列培养基B中： [0099] MS基本培养液： [0100] [0101] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下培养66h。 [0102] 6、取步骤5中带叶茎尖，不做任何修剪，接入下列培养基C中： [0103] MS基本培养液 [0104] [0105] [0106] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下培养40d苗壮根粗时，每一植株取6个根尖进行染色体压力，可获得24.80％的多倍体，且无嵌合体现象发生。 [0107] 7、将确定加倍的植株，按1.2cm长、带2‑3节剪切，转接到步骤5中的培养基C中，培养10d后，材料基部开始膨大并出现密集的不定根基点；20d后茎段开始迅速伸长，新叶出现，老叶充分伸展，叶脉明显，同时不定根开始出现；30d后，随着主茎的生长，每一叶腋处均有侧芽萌发，新叶也逐渐展开，呈深绿色，不定根亦迅速生长；40d后材料整体高大粗壮，有分枝出现，叶片宽大呈深绿色，与周围叶肉组织相比叶脉颜色较浅而明显，同时不定根多而壮，呈发达的簇状根系，此时生根率为100％，增殖系数为7.35此后，每一代每一植株随机抽取4个根尖进行压片，明确所有植株均为2n＝4x＝36。 [0108] 8、炼苗和移栽：步骤7中生根苗高至6cm时，将培养瓶于自然光条件下放置2d后，再将培养瓶封口膜取下放置3d，取出生根苗，小心洗净残余培养基，用0.3％多菌灵(质量比) 泡洗6min，移栽至经高温灭菌后的腐殖质土中保温保湿培养60d(温度20～25℃湿度70％左右)，后，即得移栽苗，成活率可达100％。 [0109] 实施例3 [0110] 一种红果参多倍体诱导及多倍体植株的高效人工育苗方法，包括以下步骤： [0111] 1、外植体的获取：选择生长势好、无病虫害的健壮植株，取其当年饱满果实。 [0112] 2、将步骤1的果实用自来水洗净表面后用质量百分比10％洗衣粉溶液浸泡10min并轻微震荡搅动后流水冲洗30min，置于超净工作台上用体积百分比75％乙醇溶液处理 30s，再用质量百分比0.1％升汞水溶液灭菌30min，最后无菌水冲洗3次，每次不低于3min，在整个消毒过程中充分摇动器皿。 [0113] 3、无菌实生苗的获取：将经过步骤2消毒灭菌好的果实切开，取其内种子为材料，接入下列培养基A中： [0114] MS基本培养液： [0115] 蔗糖 30000mg/L [0116] 琼脂粉 4700mg/L [0117] pH 5.8 [0118] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下进行种子无菌萌发，60d后，根芽生长旺盛，真叶舒展，获得无菌实生苗；此时，随机取10个植株，每个植株5个根尖进行染色体压片，确定其染色体数为2n＝2x＝18。 [0119] 4、浸泡处理：取步骤3长约1.5cm、带2个幼叶的茎尖在经高温灭菌后的0.05％秋水仙素溶液(质量比)中浸泡96h。 [0120] 5、带叶茎尖培养：将步骤4中的带叶茎尖取出，无菌水冲洗3次，每次不低于3min，转入下列培养基B中： [0121] MS基本培养液： [0122] [0123] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下培养72h。 [0124] 6、取步骤5中带叶茎尖，不做任何修剪，接入下列培养基C中： [0125] MS基本培养液 [0126] [0127] 培养条件：在光照度1500‑2000lx，光照时间10h/d，温度控制在23±2℃的条件下培养40d苗壮根粗时，每一植株取4个根尖进行染色体压力，可获得25.05％的多倍体，且无嵌合体现象发生。 [0128] 7、将确定加倍的植株，按1.5cm长、带2‑3节剪切，转接到步骤5中的培养基C中，培养10d后，材料基部开始膨大并出现密集的不定根基点；20d后茎段开始迅速伸长，新叶出现，老叶充分伸展，叶脉明显，同时不定根开始出现；30d后，随着主茎的生长，每一叶腋处均有侧芽萌发，新叶也逐渐展开，呈深绿色，不定根亦迅速生长；40d后材料整体高大粗壮，有分枝出现，叶片宽大呈深绿色，与周围叶肉组织相比叶脉颜色较浅而明显，同时不定根多而壮，呈发达的簇状根系，此时生根率为100％，增殖系数为7.15；此后，每一代每一植株随机抽取5个根尖进行压片，明确所有植株均为2n＝4x＝36。 [0129] 8、炼苗和移栽：步骤7中生根苗高至6.5cm时，将培养瓶于自然光条件下放置2d后，再将培养瓶封口膜取下放置3d，取出生根苗，小心洗净残余培养基，用0.5％多菌灵(质量比)泡洗4min，移栽至经高温灭菌后的腐殖质土中保温保湿培养60d(温度20～25℃湿度 70％左右)，后，即得移栽苗，成活率可达100％。 [0130] 本发明的技术原理： [0131] 1、秋水仙素诱导是人工诱导多倍体最常用的方法之一，其可阻碍细胞分裂中期纺锤丝的形成，使有丝分裂被迫中断，但细胞和细胞质并不分离，从而使染色体加倍。 [0132] 2、本发明采用先直接浸泡一定时间，转入含秋水仙素的培养基中培养60‑72h，再转入不含秋水仙素的培养基中培养，诱导成功率较高(最高达25.07％)，而未发现有嵌合体出现。在后续的扩繁中，每一代均随机抽取10个植株，30‑50个根尖进行压片镜检，均为四倍体而未发现嵌合体现象，表明此方法在红果参的多倍体诱导中效果最佳。 [0133] 3、本发明证实了离体诱导即组织培养诱变法容易控制实验条件，由此可以有效地减少加倍不完全的嵌合体产生，获得更多有丝分裂稳定的多倍体，证实了与活体诱导相比，离体诱导具有明显的优越性。 [0134] 4、本发明在多倍体诱导成功的基础上，针对多倍体生长延缓的状况，优化了培养配方，可与二倍体植株的转接周期相差不大，与二倍体植株相比增殖系数有所下降，但对多倍体而言已具很高的增殖系数。 [0135] 5、本发明在多倍体的快速繁殖过程中只需1种培养基就完成了增殖和生根的问题，二者合二为一，利于后期生产计划的安排；同时解决了多倍体繁殖困难的问题；通过本发明，可使所有种苗保持同一基因型背景，易于标准化、工厂化操作，有效地提高了种苗质量，可为大面积推广种植提供统一标准的多倍体优良种苗。 [0136] 最后应说明的是：以上实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的精神和范围。