滇龙胆多倍体培育方法

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滇龙胆多倍体培育方法
申请号	CN202211631233.2	申请日	2022-12-19	公开(公告)号	CN115606504A	公开(公告)日	2023-01-17
申请人	云南省农业科学院药用植物研究所; 云县信合农业发展有限公司;			发明人	左应梅; 张金渝; 张霁; 杨维泽; 朱新焰; 杨美权; 何凤春;
摘要	滇龙胆多倍体培育方法，涉及滇龙胆多倍体的培育技术。本发明的方法包括外植体的选择与清洁、外植体的消毒、接种、染色体加倍诱导、生根培养、形态鉴定筛选、染色体鉴定步骤；其中，诱导液为不添加琼脂的MS+0.04‑0.08%安磺灵+0.02‑0.05%二甲戊灵+0.5%DMSO。本发明染色体加倍诱导剂采用二甲戊灵和安磺灵进行复配使用，丛生芽死亡率低于8%，多倍体诱导率高达65%以上，较单一使用秋水仙素的丛生芽死亡率低，多倍体诱导率高。
权利要求	1.滇龙胆多倍体培育方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1，选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体，并进行清洁和消毒；步骤2，将消毒好的外植体接种于丛生芽诱导培养基中进行诱导；步骤3，将诱导出的丛生芽，置于诱导液中进行染色体加倍诱导；步骤4，将经染色体加倍诱导的芽，接种于生根培养基中生根培养；步骤5，生根培养后进行形态鉴定筛选，筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的生根苗；步骤6，染色体鉴定，取经筛选的苗的根尖，用染色体染色计数法镜检，筛选出染色体数至少等于4n的生根苗为滇龙胆多倍体；步骤3所述的诱导液为不添加琼脂的MS+0.04‑0.08%安磺灵+0.02‑0.05%二甲戊灵+ 0.5%DMSO。 2.如权利要求1所述的滇龙胆多倍体培育方法，其特征在于步骤2所述的丛生芽诱导培养基为MS+NAA0.01‑0.05mg/L+KT 5.0‑10.0mg/L+TDZ 0.05‑0.15mg/L。 3.如权利要求1所述的滇龙胆多倍体培育方法，其特征在于步骤4所述的生根培养基为 1/2MS+NAA0.5‑1mg/L+IAA0.5‑1.0mg/L。
说明书全文	滇龙胆多倍体培育方法技术领域 [0001] 本发明涉及中药材的育种方法，属于中药材及生物技术领域，特别涉及滇龙胆多倍体的培育方法。背景技术 [0002] 滇龙胆（Gentiana rigescens Franch.）为龙胆科龙胆属多年生草本植物，以根和根茎，是我国常用大宗药材之一,具有清热燥湿、泻肝胆火的功效。滇龙胆主产于云南。 [0003] 多倍体普遍存在于自然界中，常见于高等植物中，据资料统计，种子植物中的528属1171种中约有38.71%是多倍体，其中被子植物约50%为多倍体。 [0004] 多倍体由于具有抗逆性增强、茎叶增粗增厚、可使单株生物量增加或次生代谢产物增加等特性，使得多倍体育种逐渐成为植物育种的重要方向。对于观赏性植物来说，多倍体可能使其更具观赏性，而对于药用植物来说，多倍体可能使其产量增加，亦有可能使其有效成分含量提高。 [0005] 目前，仅有孙天国等发表的（《东北龙胆多倍体诱导的研究》[J]，高师理科学刊，2010，30（2）：69‑71）以及梁伟发表的（大叶秦艽的组织培养及离体诱导多倍体的研究[D]，西安：西北大学，2007。）对龙胆多倍体诱导进行了研究，但还未有滇龙胆多倍体育种的相关报道。发明内容 [0006] 本发明的目的是提出一种滇龙胆多倍体培育方法，使得培育出的滇龙胆更具观赏性，有效成分含量提高，亩产提高。 [0007] 滇龙胆多倍体培育方法，其特征在于该方法包括以下步骤：步骤1，选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体，并进行清洁和消毒；步骤2，将消毒好的外植体接种于丛生芽诱导培养基中进行诱导；步骤3，将诱导出的丛生芽，置于诱导液中进行染色体加倍诱导；步骤4，将经染色体加倍诱导的芽，接种于生根培养基中生根培养；步骤5，生根培养后进行形态鉴定筛选，筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的生根苗；步骤6，染色体鉴定，取经筛选的苗的根尖，用染色体染色计数法镜检，筛选出染色体数至少等于4n的生根苗为滇龙胆多倍体；步骤3所述的诱导液为不添加琼脂的MS+0.04‑0.08%安磺灵+0.02‑0.05%二甲戊灵+0.5%DMSO。 [0008] 步骤2所述的丛生芽诱导培养基为MS+NAA0.01‑0.05mg/L+KT 5.0‑10.0mg/L+TDZ 0.05‑0.15mg/L。 [0009] 步骤4所述的生根培养基为1/2MS+NAA0.5‑1mg/L+IAA0.5‑1.0mg/L。 [0010] 植物多倍体育种中常用的化学诱导剂为秋水仙素，但其为剧毒化学品，购买及使用都极其严格，其药品的管理及使用有一定的安全风险，而本发明的化学诱导剂为二甲戊灵和安磺灵，均为低毒试剂，使用时相对秋水仙素安全，同时由于其主要用途为除草剂，更加容易采购，使用成本较低。 [0011] 本发明染色体加倍诱导剂采用二甲戊灵和安磺灵进行复配使用，丛生芽死亡率低于8%，多倍体诱导率高达65%以上，较单一使用秋水仙素的丛生芽死亡率低，多倍体诱导率高。 [0012] 本发明能使滇龙胆药材中核心质量标准的龙胆苦苷含量增加1.2倍左右。使滇龙胆茎明显增粗，叶明显增宽，可使得种植亩产提高约1.4倍以上。可使滇龙胆花色更具观赏价值，同时花期亦可延长15‑40天。附图说明 [0013] 图1为染色体加倍前后比较图，其中，图1a为染色体加倍后的形态学叶片增肥变宽，图1b为未进行染色体加倍的叶片形态，相对较薄及小。 [0014] 图2为染色体加倍前后比较图，其中，图2a为染色体加倍后形态学明显增粗，图2b为为未进行染色体加倍的茎形态，相对较细。 [0015] 图3为多倍体滇龙胆表现出的不同花色及花型。具体实施方式 [0016] 实施例1：滇龙胆多倍体培育方法，包括以下步骤：1、外植体的选择与清洁：选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体，用肥皂水涮洗至表面无明显尘土，自来水冲淋40min。 [0017] 2、外植体的消毒：将清洁完成的外植体，转移至超净工作台内，用75%酒精消毒20s，无菌水冲洗2次，饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水冲洗3次，0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗6次，消毒污染率为17.4%，消毒死亡率为3.6%。 [0018] 3、接种：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于MS+ NAA0.01mg/L+KT 5.0mg/L+TDZ 0.05mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度为25±2℃，单日照强度为2000‑3000lx的白光12h进行光暗交替培养30天，丛生芽诱导率为65.9%。 [0019] 4、染色体加倍诱导：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，置于MS（不添加琼脂）+0.04%安磺灵+0.02%二甲戊灵+0.5%DMSO（二甲基亚砜）的诱导液中，置于温度为25±2℃，单日照强度为2000‑3000lx的白光12h进行光暗交替下静置培养6天，多倍体诱导率为69.3%，诱导后芽死亡率为4.9%。 [0020] 5、生根培养：将经染色体加倍诱导的芽，接种于1/2MS+NAA0.5mg/L+IAA0.5mg/L的生根培养基中，置于温度为25±2℃，单日照强度为2000‑3000lx的白光12h进行光暗交替下培养30天，生根率为100%。 [0021] 6、形态鉴定筛选：筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的生根苗，变异率为86.3%。 [0022] 7、染色体鉴定：取经筛选的苗的根尖，用染色体染色计数法镜检，筛选出染色体数至少为4n的生根苗为滇龙胆多倍体，形态变异植株中多倍体率为80.3%。 [0023] 实施例2：滇龙胆多倍体培育方法，包括以下步骤：1、外植体的选择与清洁：选用滇龙胆腋芽或顶芽作为外植体，用肥皂水涮洗至表面无明显尘土，自来水冲淋50min。 [0024] 2、外植体的消毒：将清洁完成的外植体，转移至超净工作台内，用75%酒精消毒20s，无菌水冲洗2次，饱和漂白粉溶液消毒30min，无菌水冲洗3次，0.05%升汞溶液消毒10min，无菌水冲洗6次，消毒污染率为15.9%，消毒死亡率为3.8%。 [0025] 3、接种：将消毒好的外植体，用无菌纸吸去表面水分，并剪去两端伤口，接种于MS+NAA 0.05mg/L+KT 10.0mg/L+TDZ 0.15mg/L的丛生芽诱导培养基中，置于温度为25±2℃，单日照强度为2000‑3000lx的白光12h进行光暗交替培养30天，丛生芽诱导率为69.1%。 [0026] 4、染色体加倍诱导：将诱导出的丛生芽，剪成单芽，置于MS（不添加琼脂）+0.08%安磺灵+0.05%二甲戊灵+0.5%DMSO（二甲基亚砜）的诱导液中，置于温度为25±2℃，单日照强度为2000‑3000lx的白光12h进行光暗交替下静置培养5天，多倍体诱导率为74.9%，诱导后芽死亡率为7.4%。 [0027] 5、生根培养：将经染色体加倍诱导的芽，接种于1/2MS+NAA 1mg/L+IAA 1.0mg/L的生根培养基中，置于温度为25±2℃，单日照强度为2000‑3000lx的白光12h进行光暗交替下培养20‑30天，生根率为100%。 [0028] 6、形态鉴定筛选：筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的生根苗，变异率为77.5%。 [0029] 7、染色体鉴定：取经筛选的苗的根尖，用染色体染色计数法镜检，筛选出染色体数大于或等于4n的生根苗为滇龙胆多倍体，形态变异植株中多倍体率为96.6%。 [0030] 本发明染色体加倍过程中，经诱导出的丛生芽，剪成单芽，以DMSO为辅助剂，采用不同浓度、不同浸泡时间的秋水仙素、安磺灵、二甲戊灵、氟乐灵、甲基胺草磷进行二因素三水平对比试验，具体试验设计如表1。 [0031]经上述诱导剂诱导后，将染色体加倍诱导的芽接种于实施例1的生根培养基中，待生根后筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的植株，取根尖进行染色体染色镜检，其结果如下表2。 [0032] 从表1和表2可以看出，以0.1%的秋水仙素浸泡24、48以及72小时的多倍体诱导率为最高，但其丛生芽的死亡率亦较高，最高可达41.3%，而其他类除草剂，除采用0.1%浓度的氟乐灵浸泡24、48以及72小时的丛生芽死亡率较高外，其余均较低，但单一诱导剂因素使用下来，仍以秋水仙素为最佳，然而采用复配诱导剂后取得了较为显著的效果，具体体现如下。 [0033] 经诱导出的丛生芽，剪成单芽，以DMSO为辅助剂，采用除秋水仙素外不同种类的诱导剂进行不同浓度的复配试验，浸泡时间为72小时，具体试验设计如下表3。 [0034] 经上述诱导剂复配诱导后，将染色体加倍诱导的芽接种于实施例1的生根培养基中，待生根后筛选出叶片明显增肥变宽，茎明显增粗的植株，取根尖进行染色体染色镜检，其结果如下表4。 [0035] 由表3和表4可以看出，甲基草铵膦与其他诱导剂进行复配时，对丛生芽死亡率和多倍体诱导率并没有特别大的影响，而氟乐灵不论多大浓度，与安磺灵或二甲戊灵组合时，虽然多倍体诱导率得到极大的提升，但丛生芽死亡率也随之大幅增加，而仅安磺灵和二甲戊灵进行组合时，能极大幅度的提高多倍体诱导率，同时还能将丛生芽死亡率控制到理想范围内，如FP6及FP8。 [0036] 在表3中的FP6的基础上，去掉甲基胺草磷，用0.05%安磺灵与0.05%二甲戊灵进行组合，对丛生芽进行浸泡2d、3d、4d、5d、6d、7d试验，结果发现，在5d内，浸泡时间愈长，其多倍体诱导率愈高，5d后，多倍体诱导率不再明显升高，而在7d范围内，浸泡时间对丛生芽死亡率影响不大。 [0037] 但是，在研究过程中发现，随着浸泡时间的延长，诱导后的丛生芽接种在生根培养基中时，苗开始表现为叶肉黄绿、苗纤弱等缺营养症状，后在染色体加倍诱导时加入添加琼脂的MS时，可完全规避缺素现象的发生。 [0038] 将实施例1和实施例2的原母本种子育苗后进行栽植，同时将实施例1和实施例2中获得的多倍体苗进行栽植，分别检测龙胆苦苷含量以及测定其亩产量，同时进行观赏性状比较，其结果如下表5。