[0001] 本发明属于农业生物技术工程，涉及抗白粉病近等基因系配制，更具体的说是涉 及小麦Brock抗白粉病近等基因系遗传背景的分子检测与应用。技术背景

[0002] 近等基因系（Near-isogenic Lines, NIL)是由Yong等提出的，指的是遗传背景 相近，目标基因不同的一组品系（Young N D, Zamir D G, Tanksley S D. Use of isogenic lines andsimultaneoue probing to identify DNA markers tightly linked to the TM-Za gene in tomato. Genetics. 1988，120 :579_585)，它可以用于基因多效性分析、目 标基因分离、基因精细定位和克隆等研究（田清震，周荣华，贾继增.小麦抗白粉病近等 基因系遗传背景的分子检测.作物学报，2004，30 (3) :205-209;张毅，李云峰，谢戎，杨正 林，钟秉强，沈福成，谭自俊，何光华.水稻小穗簇生性近等基因系的构建及其近等性评 价.作物学报，2006，32 (3) :397-401)，因此，是遗传学及育种研究的珍贵材料。通过杂交 和多代回交已培育了包括抗病性在内的许多目标性状的NIL，并应用于各自的相关领域研 究中([BorbalaD, Harrach J F，Miklos P，et al. Antioxidant ethylene and membrane leakage responses topowdery mildew infection of near-isogenic barley lines with various types of resistance. European Journal of Plant Pathology.2008， 121 :21_33 ；Mumtaz S，Khan I A，Ali S，et al. Development of RAPD based markers for wheat rust resistance gene cluster(Lr37_Sr38_Yrl7)derived from Triticum ventricosum L.African Journal of Biotechnology. 2009，8(7) : 1188-1192 ；Zhu S， Walker D R，Boerma H R，et al. Effects of defoliating insectresistance QTLs and a crylAc transgene in soybean near-isogenic lines. Theoretical andApplied Genetics. 2008，116 :455_463 ；Brevis J C，Chicaiza 0，Khan I A，et al. Agronomicand quality evaluation of common wheat near-isogenic lines carrying the Leaf Rust ResistanceGene Lr47. Crop Science.2008,48,1411-1451. Zhou R H, Zhu Z D， Kong X Y，Huo N X，Tian Q Z，Li P，Jin C Y，Dong Y C，Jia J Z. Development of wheat near-isogenic lines forpowdery mildew resistance.Theoretical and Applied Genetics. 2005，110 :640_648)。但NIL的培育与选择需7_8年时间，周期长，而选择效率 的评价指标是回交代数和外观形态，这种方法容易受发育和环境条件影响，选择效率低。 分子水平上跟踪和评价NIL遗传背景，可靠性高，不受发育和环境条件制约，因此，可以提 高NIL的培育进程和选择效率。栽培小麦Brock中含有一个抗白粉病新基因（Wang Z Y， Zheng Q，Peng Y K，et al.Identification of random amplified polymorphic DNA and simple sequence repeat markerslinked to powdery mildew resistance in common wheat cultivar Brock. Plant ProductionScience，2004，7(3) ：318-322 ；Wang Z Y，Zhao P，Chen H，et al. Identification of RAPDmarkers and development of SCAR markers linked to a powdery mildew resistance gene， andtheir location on chromosome inwheat cultivar Brock. Plant Production Science, 2005,8 (5) :578_585)。中国农业大学 以Brock为供体，和农业性状优良的小麦品系015杂交后，后代与优良品 种京411杂交，获 得抗白粉病的F1，与京411为轮回亲本再次杂交，后代用京411回交，并在白粉菌胁迫下选 择，配制了近等基因系Brock/015//京4117。

[0003] 本发明以Brock为抗白粉病基因供体亲本，直接和优良品种京411，通过杂交、回 交和白粉菌胁迫下的个体选择，配制了抗白粉病近等基因系Brock/京4117。并利用AFLP方 法，对本发明配制的近等基因系Brock/京4117的遗传背景进行了检测，该检测在抗白粉病 基因供体亲本Brock、轮回亲本京411和近等基因系Brock/015/京4117和Brock/京4117 之间进行。结果发现有4种AFLP谱型：“亲二型”、“偏抗病供体Brock型”、“偏轮回亲本京 411型”和“交换型”被检测到，它们能反映出近等基因系中双亲遗传背景。同时，对2对近 等基因系中与抗病基因相连锁分子标记进行了筛选，获得紧密连锁分子标记P15/M14-160。 上述对近等基因系遗传背景的检测，会使其能在抗病遗传机理研究和农业上应用发挥更好 作用。

[0004] 本发明的目的在于用对白粉菌免疫的小麦品种Brock为抗白粉病基因供体亲本， 以农艺性状优良的品种京411为轮回亲本，配制抗白粉病近等基因系，通过AFLP检测技术， 检测近等基因系与双亲间的遗传背景，从而获得可靠的抗白粉病近等基因系，用于小麦的 抗白粉病育种、抗病基因因克隆及抗病分子机理研究。为实现上述目的，本发明提供如下的 技术方案：

[0005] 一种抗白粉病近等基因系Brock/京4117遗传检测方法，其特征在于包括如下步 骤：

[0006] DAFLP分析参照所用接头和引物见表1 ；

[0007] 表1 AFLP分析所用接头和引物

[0008]接头与引物 序列
Pst I 接头 5’ CTCGTAGACTGCGTACATGCA3’
3' CATCTGACGCATGT 5' Mse I 接头 5' GACGATGAGTCCTGAG3' 3' TACTCAGGACTCAT5' 5， GACTGCGTACATGCAG3， 预扩增引物 5’ GATGAGTCCTGAGTAA3，

[0009]5’ -GACTGCGTACATGCAG ANN 或 GNN_3;~ 5’ -GATGAGTCCTGAGTAACNN-3’
选择性扩增引物

[0010] 注：下画线部分为选择碱基，N为任意碱基A、G、T、C[0011] 2)基因组 DNA 双酶切及接头连接：100XBSA 0. 2μ 1, NEB buffer 4. 0μ 1, Pst I(20U/y 1)0. 25 μ 1, Mse I(10U/μ 1)0. 5 μ 1, Pst I 接头（5ρΜ) 1· 0 μ 1，Mse I 接头 (50ρΜ) 1· 0μ 1，Τ4 DNAligase 0. 4μ 1,10ΧΤ4 buffer 2· O μ 1，DNA(100ng/μ 1) 5· O μ 1， ddH20补齐40 μ 1。37 °C条件下保温8个小时；

[0012] 3)预扩增：反应体系为25 μ L，内含IyL连接产物，0.6pmol/L引物，IOXPCR缓冲 液 2. 5μ L，0. 2mmol/L 的 dNTPs，IU Taq 聚合酶。PCR 扩增程序为 94°C 2min ；94°C 35S,56°C 35S，72°C 60S, 30个循环；72°C 5min。预扩增产物用琼脂糖电泳检测，稀释20倍保存备用； [0013] 4)选择性扩增：选择性扩增体积为20 μ L，AFLP选扩体系：Pst I接头引物（50ng/ μ L) 0· 8 μ L，Mse I 接头引物(50ng/μ L) 0. 8 μ L, IOXBuffer 2. 0 μ LjMgCl2 (25mM) L 2 μ L， dNTP (IOmM) 0. 45 μ L, TaqE (5U/ μ L) 0· 2 μ L，模板 DNA 2. 0 μ L, ddH20 补齐 20 μ L ；PCR 扩增采 用递降式方法，其程序为94°C 2min -MV 35S，65°C 35S，72°C 30S,以后每个循环退火温度 降低 0. 7°C，共 12 个循环；然后 94°C 35S，56°C 35S, 72°C, 60S, 30 个循环；最后 72°C 5min。 扩增在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行。

[0014] 5)扩增产物的检测：扩增产物加等量loading Buffer (98 %甲酰胺；IOmM EDTA(pH8. 0) ；0.25%溴酚兰；0. 25%二甲苯青），95°C变性5min，立即于冰浴待用；用6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶（含6mol/L尿素）电泳分离，银染法显示电泳图谱。

[0015] 6)遗传背景分析：以两个近等基因系（Brock/015//京4117 ；Brock/京4117)和供 体亲本Brock及轮回亲本京411为材料，用表2中随机选取225对AFLP引物组合，用上述 酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子检测，结果有4种亲二型、 偏抗病供体Brock型、偏轮回亲本京411型和交换型被检测到。

[0016] 表2 AFLP标记的弓丨物组合

[0017]

[0019] 本发明所述的遗传检测方法，其中抗白粉病近等基因系Brock/京4117的配制在 于：以抗白粉病普通小麦Brock为抗病基因供体亲本，以农艺性状优良但不抗白粉病的栽 培小麦京411为轮回亲本，BrockX京411杂交，杂交组合为Brock/京411”，所得F1均抗 白粉病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系Brock/京4117 ；每一次的杂 交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株。

[0020] 本发明采用AFLP方法与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记P15/M14-160，其碱基 序列为：

[0021] GCAGAAGTCGTTTACAATCAGGTCATAGTAGAAACTGTTGAAATCAAAAGGAAATGGGTGCGTGTTTT GAATTGAGACGTGTTAGTCGCTAAATCGAGGTGTCAAAGCGTCGTTCTGTTCTTATGATCGCTCGTTATGTGTTGC TGAAGAAAATGTGGTC。

[0022] 本发明与已有标记相比的优点和有益效果在于：

[0023] 白粉病是影响小麦生产的一种严重病害。本发明是利用对白粉菌免疫的栽培小麦 Brock为抗白粉病基因供体亲本，用农艺性状优良但对白粉菌敏感的京411为轮回亲本配 制近等基因系，并利用AFLP方法对该近等基因系的遗传背景进行了分子检测，建立安全有 效的检测方法；同时筛选到与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记。本发明对抗白粉病栽培 小麦优良品种的选育、进一步了解小麦抗白粉病的分子遗传学机理有积极意义。因此，本发 明的研究结果在小麦育种实践及抗病理论研究上都很有价值。其优点具体归纳如下：

[0024] (1)本发明配制的小麦抗白粉病近等基因系，可以用于小麦抗白粉病新品种选育， 小麦抗白粉病分子机理研究。

[0025] (2)本研究所用材料为对15号生理小种（为混合型生理小种，为华北地区流行的 多种白粉病病菌）免疫的小麦品种，对华北地区白粉病菌具有比较广普的抗性。因此，根据 所得近等基因系有望克隆到新的白粉病抗性基因。[0026] (3)本发明用AFLP分子标记技术，对近等基因系和双亲的遗传背景进行分子检 测，得到肯定的实验结果，得到的分子标记P15/M14-160与抗白粉病新基因紧密连锁，有可 能用于生产实践。

[0027] 图1 ：近等基因系、Brock和京411对白粉病的抗性反应。其中a.京411 ；b.近等 ；基因系 Brock/015// 京 4117 ；c.近等基因系 Brock/ 京 4117 ；d. Brock。

[0028] 图2 ：近等基因系及供体亲本Brock、京411的AFLP指纹。其中1.京411 2.近等基因系 Brock/015// 京 4117 ；3.近等基因系 Brock/ 京 4117 ；4. Brock

[0029] I代表“亲二型，，

[0030] II代表“偏抗病供体Brock型”

[0031] III代表“偏轮回亲本京411型”

[0032] IV代表“交换型”

[0033] 图3 =AFLPs核酸序列，其中（1)为P6/M3-166的测序结果（2)P6/M3_163的测序结 果（3)P3/M6-395的测序结果（4) P15/M14-206的测序结果（5) P13/M13-245的测序结果（6) P11/M14-206的测序结果。

[0034] 图4 :P15/M14在Brock、京411和抗、感单株中的PCR扩增结果。其中M， DL2000Marker ； 1-3 感病单株；4，Jing 411 ；5, Brock ；6-18 抗病单株。

[0035] 以下结合实施例（附图、表具体说明）用来帮助理解本发明，并且不用于也不应被 解释为以任何方式对所列出的权利要求中发明的限制。特别加以说明的是，本发明所用到 的各种试剂均有市售。

[0036] 实施例1、近等基因系的配制：

[0037] 本发明近等基因系的配制：抗病基因供体亲本来自英国普通小麦品种Brock，其 与农艺性状优良但感病亲本京411进行杂交，杂交组合为“Brock/京411”，所得F1均抗 白粉病，用京411回交，在华北地区流行的白粉菌15号生理小种胁迫下，选择抗病单株，7 代后，再自交一次，获得抗白粉病近等基因系Brock/京4117。图1为京411、近等基因系 Brock/015//京4117、近等基因系Brock/京4117和Brock叶片染菌2周时比较，发现竟411 严重染菌，菌丝几乎铺满叶片，而两个近等基因系（图lb，c)和Brock叶片上未见菌斑。

[0038] 实施例2、基因组DNA的分离：

[0039] 取0.2g黄化幼苗叶片，于液氮中研磨，尽量呈粉末，迅速加入2毫升提取 Buffer (50mM Tris-HCl, ρΗ 8. O ；20mM EDTA ；50mM NaCl)，轻轻混合，65°C温浴 15min，其间 颠倒混勻2-3次。0°C冰浴10分钟，0-4°C，3000转/分离心15分钟，轻取上清，加入到一新 管中，加等体积Tris-HCl (ρΗ 8. 0)饱和酚，轻轻混合。0-4°C，3000转/分离心10分钟，取上 清，加入等体积酚、氯仿-异戊醇（25 ： 24 ： 1)抽提，轻轻混勻。0-4°C，3000转/分离心 10分钟，取上清，加入等体积氯仿-异戊醇（25 ： 24 ： 1)抽提，轻轻混勻。0-4°C，3000转/ 分，离心10分钟，取上清，加2倍体积冷乙醇，_20°C沉淀1小时以上。0-4°C，12000转/分， 离心20分钟，弃上清，75 %乙醇0-4°C短暂离心，洗沉淀2次，晾干，溶于100 μ 1 TE (ρΗ8· 0)。加1 μ 1 RNase(10mg/ml)，37°C保温1小时，以除去样品中的RNA0加等体积酚、氯仿，抽提 一次，0-40C，3000转/分离心10分钟。取上清，加等体积仿，抽提一次，0-40C，3000转/分 离心10分钟。取上清，加两倍体积冷乙醇，-20°C沉淀2小时以上。0-4°C，12000转/分， 离心20分钟。弃上清，75%乙醇0-4°C短暂离心，洗沉淀2次，晾干，溶于50 μ 1 TE (ρΗ8. 0) 中。分别用紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0. 7%的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整 性。

[0040] 实施例3、遗传背景检测：

[0041] AFLP 分析参照 Vos (Vos, P.，R. Hogers, M. Bleeker, M. Reijans, T. van de Lee, Μ. Homes, A. Fri jters, J. Pot, J. Peleman, M. Kuiper, M. Zabeau. AFLP :A new technique forDNA fingerprinting. Nucleic Acids Res，1995，21 :4407_4414)等的方法进行。所用 接头和引物见表1。

[0042] 1)基因组 DNA 双酶切及接头连接：100XBSA 0. 2μ 1, NEB buffer 4. 0μ 1, Pst I(20U/y 1)0. 25 μ 1, Mse I(10U/μ 1)0. 5 μ 1, Pst I 接头（5ρΜ) 1· 0 μ 1，Mse I 接头 (50ρΜ) 1· 0μ 1，Τ4 DNAligase 0. 4μ 1,10XT4buffer 2· 0 μ 1，DNA(100ng/μ 1) 5· 0 μ 1， ddH20补齐40 μ 1。37 °C条件下保温8个小时。

[0043] 2)预扩增：反应体系为25 μ L，内含IyL连接产物，0.6pmol/L引物，10XPCR缓 冲液 2. 5 μ L，0. 2mmol/L 的 dNTPs, IU Taq 聚合酶。PCR 扩增程序为 94°C 2min ；94°C 35S, 56 0C 35S，72°C 60S, 30个循环；72°C 5min。预扩增产物用琼脂糖电泳检测，稀释20倍保存备用。

[0044] 3)选择性扩增：稀释的预扩增产物为选择性扩增模板进行AFLP分析。选择性扩增 体积为20 μ L，AFLP选扩体系：Pst I接头引物(50ng/μ L) 0. 8 μ L, Mse I接头引物(50ng/ μ L) 0· 8 μ L，10 X Buffer 2. 0 μ L, MgCl2 (25mM) 1· 2 μ L，dNTP (IOmM) 0. 45 μ L, TaqE (5U/ μ L) 0· 2 μ L，模板 DNA 2. 0 μ L，ddH20 补齐 20 μ L。

[0045] PCR扩增采用递降式方法，其程序为94°C 2min :94°C 35S，65°C 35S，72°C 30S,以后 每个循环退火温度降低0. 7°C，共12个循环；然后94°C 35S，56°C 35S，72°C，60S, 30个循环； 最后72°C5min。扩增在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行。

[0046] 4)扩增产物的检测：扩增产物加等量loading Buffer (98 %甲酰胺；IOmM EDTA(pH8. 0) ；0.25%溴酚兰；0. 25%二甲苯青），95°C变性5min，立即于冰浴待用。用6% 的变性聚丙烯酰胺凝胶（含6mol/L尿素）电泳分离，银染法显示电泳图谱。

[0047] 5)遗传背景分析：以两个近等基因系（Brock/015//京4117 ；Brock/京4117)和供 体亲本Brock及轮回亲本京411为材料，用表2中随机选取225对AFLP引物组合，用上述 酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子检测，扩增谱型的统计按 照下列方法：由引物组合P6/M3扩增出的谱带（图21)，明显可以看出2对NIL中，有两条 AFLP谱带分别来自于供体亲本Brock和轮回亲本京411，这种AFLP谱型我们称其为“亲二 型”，图中箭头所指，用I表示。由引物组合P3/M6、P6/M3、P6/M6、P6/M7、P11/M14、P13/M13、 P15/M11、P15/M14、P15/M15扩增出来的AFLP谱型，表现为供体亲本Brock中存在的谱带， 在2对OTL中也均存在，在京411中均缺失，这种谱型我们称之为“偏抗病亲本Brock型”， 图中箭头所指，用II表示（图211)。而由P6/M3、P3/M6、P6/M6、P13/M13引物组合扩增到 的，特异地存在于京411和2对NIL中，在抗病亲本Brock中不存在，这类AFLP谱带我们称之为“偏轮回亲本京411型”，图中箭头所指，用III表示（图2111)。除了上述三种谱型外， 我们还看到了在亲本Brock和京411中均不存在，但在2对NIL中存在的谱带，如由 引物组 合P6/M3、P6/M6、P6/M7、P13/M13扩增出来的AFLP谱带，这种谱型我们称之为“交换型”，图 中箭头所指，用IV表示（图2IV)。

[0048] 实施例4、P15/M14-160标记的获得：

[0049] 以Brock、京411及近等基因系为材料，在表2中随机选取225对AFLP引物组合， 用上述酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子筛选，结果发现有 28个引物组合出现扩增产物多态性，从聚丙烯酰胺凝胶中回收上述特异片段，分别用原来 的引物对进行二次扩增，其中8个片段获得有效扩增，将扩增产物经纯化、克隆、鉴定后送 上海生工测序。

[0050] 实施例5、P15/M14-160分子标记与抗自粉病基因的连锁性鉴定：

[0051] 根据实施例4测序结果设计特异引物，以BrockX京411 F2代183单株和两个亲 本小麦总体DNA为模板进行PCR扩增，仅引物组合P15/M14扩增的谱带与抗性基因相连锁 (图 4)，扩增引物序列为 F ：GCAGAAGTCGTTTACAATCAG, R :GACCACATTTTCTTCAGCAAC，产物分子 量为160bp，定名为P15/M14-160。表现为在抗病亲本Brock和BrockX京411 F2分离所 得136单株中均检测到这条谱带，而在感病的京411和47感病单株中均未出现这条谱带， 没有交换产生，说明可能这个AFLP分子标记与Brock中的抗病基因距离很近，甚至于可能 是该抗病基因中的一个片段。该分子标记在小麦抗白粉病辅助选择育种有重要价值。

[0052] 序列表

[0053] <110>天津师范大学

[0054] <120>小麦Brock抗白粉病近等基因系的分子检测与应用

[0055] <160>2

[0056] <210>1

[0057] <211>160bp

[0058] <212>DNA

[0059] <213>基因序列

[0060] <220>

[0061] <221>gene

[0062] <222>(1). . (160)

[0063] <400>1

[0064] gcagaagtcg tttacaatca ggtcatagta gaaactgttg aaatcaaaag gaaatgggtg 60

[0065] cgtgttttga attgagacgt gttagtcgct aaatcgaggt gtcaaagcgt cgttctgttc 120

[0066] ttatgatcgc tcgttatgtg ttgctgaaga aaatgtggtc 160