[0001] 本发明属于农业生物技术工程，涉及抗白粉病近等基因系配制，更具体的说是涉及小麦Brock抗白粉病近等基因系遗传背景的分子检测与应用。技术背景

[0002] 近等基因系(Near-isogenic Lines，NIL)是由Yong等提出的，指的是遗传背景相近，目标基因不同的一组品系(Young N D，Zamir D G，Tanksley S D.Use of isogenic lines andsimultaneoue probing to identify DNA markers tightly linked to the TM-Za gene in tomato.Genetics.1988，120：579-585)，它可以用于基因多效性分析、目标基因分离、基因精细定位和克隆等研究(田清震，周荣华，贾继增.小麦抗白粉病近等基因系遗传背景的分子检测.作物学报，2004，30(3)：205-209；张毅，李云峰，谢戎，杨正林，钟秉强，沈福成，谭自俊，何光华.水稻小穗簇生性近等基因系的构建及其近等性评价.作物学报，2006，32(3)：397-401)，因此，是遗传学及育种研究的珍贵材料。通过杂交和多代回交已培育了包括抗病性在内的许多目标性状的NIL，并应用于各自的相关领域研究中([BorbálaD，Harrach J F，Miklós P，et al.Antioxidant ethylene and membrane leakage responses topowdery mildew infection of near-isogenic barley lines with various types of resistance.European Journal of Plant Pathology.2008，121：21-33；Mumtaz S，Khan I A，Ali S，et al.Development of RAPD based markers for wheat rust resistance gene cluster(Lr37-Sr38-Yr17)derived from Triticum ventricosum L.African Journal of Biotechnology.2009，8(7)：1188-1192；Zhu S，Walker D R，Boerma H R，et al.Effects of defoliating insectresistance QTLs and a crylAc transgene in soybean near-isogenic lines.Theoretical andApplied Genetics.2008，116：455-463；Brevis J C，Chicaiza O，Khan I A，et al.Agronomicand quality evaluation of common wheat near-isogenic lines carrying the Leaf Rust ResistanceGene Lr47.Crop Science.2008，48，1411-1451.Zhou R H，Zhu Z D，Kong X Y，Huo N X，Tian Q Z，Li P，Jin C Y，Dong Y C，Jia J Z.Development of wheat near-isogenic lines forpowdery mildew resistance.Theoretical and Applied Genetics.2005，110：640-648)。但NIL的培育与选择需7-8年时间，周期长，而选择效率的评价指标是回交代数和外观形态，这种方法容易受发育和环境条件影响，选择效率低。
分子水平上跟踪和评价NIL遗传背景，可靠性高，不受发育和环境条件制约，因此，可以提高NIL的培育进程和选择效率。栽培小麦Brock中含有一个抗白粉病新基因(Wang Z Y，Zheng Q，Peng Y K，et al.Identification of random amplified polymorphic DNA and simple sequence repeat markerslinked to powdery mildew resistance in common wheat cultivar Brock.Plant ProductionScience，2004，7(3)：318-322；Wang Z Y，Zhao P，Chen H，et al.Identification of RAPDmarkers and development of SCAR markers linked to a powdery mildew resistance gene，andtheir location on chromosome in wheat cultivar Brock.Plant Production Science，2005，8(5)：578-585)。中国农业大学以Brock为供体，和农业性状优良的小麦品系015杂交后，后代与优良品种京411杂交，获得抗白粉病的F1，与京411为轮回亲本再次杂交，后代用京411回交，并在白粉菌胁迫下选
7
择，配制了近等基因系Brock/015//京411。

[0003] 本发明以Brock为抗白粉病基因供体亲本，直接和优良品种京411，通过杂交、回7
交和白粉菌胁迫下的个体选择，配制了抗白粉病近等基因系Brock/京411。并利用AFLP方
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法，对本发明配制的近等基因系Brock/京411 的遗传背景进行了检测，该检测在抗白粉病
7 7
基因供体亲本Brock、轮回亲本京411和近等基因系Brock/015/京411 和Brock/京411之间进行。结果发现有4种AFLP谱型：“亲二型”、“偏抗病供体Brock型”、“偏轮回亲本京
411型”和“交换型”被检测到，它们能反映出近等基因系中双亲遗传背景。同时，对2对近等基因系中与抗病基因相连锁分子标记进行了筛选，获得紧密连锁分子标记P15/M14-160。
上述对近等基因系遗传背景的检测，会使其能在抗病遗传机理研究和农业上应用发挥更好作用。

[0004] 本发明的目的在于用对白粉菌免疫的小麦品种Brock为抗白粉病基因供体亲本，以农艺性状优良的品种京411为轮回亲本，配制抗白粉病近等基因系，通过AFLP检测技术，检测近等基因系与双亲间的遗传背景，从而获得可靠的抗白粉病近等基因系，用于小麦的抗白粉病育种、抗病基因因克隆及抗病分子机理研究。为实现上述目的，本发明提供如下的技术方案：

[0005] 一种抗白粉病近等基因系Brock/京4117遗传检测方法，其特征在于包括如下步骤：

[0006] 1)AFLP分析参照所用接头和引物见表1；

[0007] 表1 AFLP分析所用接头和引物

[0008]接头与引物 序列
Pst I 接头 5’CTCGTAGACTGCGTACATGCA3’
3’CATCTGACGCATGT 5’
Mse I接头 5’GACGATGAGTCCTGAG3’
3’TACTCAGGACTCAT5’
5’GACTGCGTACATGCAG3’
预扩增引物 5’GATGAGTCCTGAGTAA3’
选择性扩增引物 5’-GACTGCGTACATGCAG ANN或GNN-3’
5’-GATGAGTCCTGAGTAACNN-3’

[0009] 注：下画线部分为选择碱基，N为任意碱基A、G、T、C

[0010] 2)基因组DNA双酶切及接头连接：100×BSA 0.2μl，NEB buffer 4.0μl，Pst I(20U/μl)0.25μl，Mse I(10U/μl)0.5μl，Pst I接头(5pM)1.0μl，Mse I接头(50pM)1.0μl，T4 DNAligase 0.4μl，10×T4 buffer 2.0μl，DNA(100ng/μl)5.0μl，ddH2O补齐40μl。37℃条件下保温8个小时；

[0011] 3)预扩增：反应体系为25μL，内含1μL连接产物，0.6pmol/L引物，10×PCR缓冲液2.5μL，0.2mmol/L的dNTPs，1U Taq聚合酶。PCR扩增程序为94℃ 2min；94℃35S，56℃35S，72℃ 60S，30个循环；72℃5min。预扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，稀释20倍保存备用；

[0012] 4)选择性扩增：选择性扩增体积为20μL，AFLP选扩体系：Pst I接头引物(50ng/μL)0.8μL，Mse I接头引物(50ng/μL)0.8μL，10×Buffer 2.0μL，MgCl2(25mM)1.2μL，dNTP(10mM)0.45μL，TaqE(5U/μL)0.2μL，模板DNA 2.0μL，ddH2O补齐20μL；PCR扩增采用递降式方法，其程序为94℃2min：94℃35S，65℃35S，72℃30S，以后每个循环退火温度降低0.7℃，共12个循环；然后94℃35S，56℃35S，72℃，60S，30个循环；最后72℃5min。扩增在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行。

[0013] 5)扩增产物的检测：扩增产物加等量loading Buffer(98％甲酰胺；10mM EDTA(pH8.0)；0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青)，95℃变性5min，立即于冰浴待用；用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(含6mol/L尿素)电泳分离，银染法显示电泳图谱。

[0014] 6)遗传背景分析：以两个近等基因系(Brock/015//京4117；Brock/京4117)和供体亲本Brock及轮回亲本京411为材料，用表2中随机选取225对AFLP引物组合，用上述酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子检测，结果有4种亲二型、偏抗病供体Brock型、偏轮回亲本京411型和交换型被检测到。

[0015] 表2 AFLP标记的引物组合

[0016]Primer PstI selective primers Primer MseI selective primers
Designation Designation
P1 gACTgCgTACATgCAgAAC M1 gATgAgTCCTgAgTAACAA
P2 gACTgCgTACATgCAgAAg M2 gATgAgTCCTgAgTAACAg
P3 gACTgCgTACATgCAgACA M3 gATgAgTCCTgAgTAACAT
P4 gACTgCgTACATgCAgACC M4 gATgAgTCCTgAgTAACTg
P5 gACTgCgTACATgCAggTA M5 gATgAgTCCTgAgTAACCT
P6 gACTgCgTACATgCAgACT M6 gATgAgTCCTgAgTAACTA
P7 gACTgCgTACATgCAgAgC M7 gATgAgTCCTgAgTAACgA
P8 gACTgCgTACATgCAgAgg M8 gATgAgTCCTgAgTAACAC
P9 gACTgCgTACATgCAgAAT M9 gATgAgTCCTgAgTAACgC
P10 gACTgCgTACATgCAgACg M10 gATgAgTCCTgAgTAACCA
P11 gACTgCgTACATgCAgAgA M11 gATgAgTCCTgAgTAACAC
P12 gACTgCgTACATgCAgAgT M12 gATgAgTCCTgAgTAACgT
P13 gACTgCgTACATgCAggAC M13 gATgAgTCCTgAgTAATCT
P14 gACTgCgTACATgCAggAT M14 gATgAgTCCTgAgTAAACC
P15 gACTgCgTACATgCAgggT M15 gATgAgTCCTgAgTAAgCA

[0017] 本发明所述的遗传检测方法，其中抗白粉病近等基因系Brock/京4117的配制在于：以抗白粉病普通小麦Brock为抗病基因供体亲本，以农艺性状优良但不抗白粉病的栽培小麦京411为轮回亲本，Brock×京411杂交，杂交组合为Brock/京411”，所得F1均抗白粉病，用京411回交7代，自交1代育成抗白粉病近等基因系Brock/京4117；每一次的杂交和回交，均在白粉菌胁迫下选择抗病单株。

[0018] 本发明采用AFLP方法与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记P15/M14-160，其碱基序列为：

[0019] GCAGAAGTCGTTTACAATCAGGTCATAGTAGAAACTGTTGAAATCAAAAGGAAATGGGTGCGTGTTTTGAATTGAGACGTGTTAGTCGCTAAATCGAGGTGTCAAAGCGTCGTTCTGTTCTTATGATCGCTCGTTATGTGTTGCTGAAGAAAATGTGGTC。

[0020] 本发明与已有标记相比的优点和有益效果在于：

[0021] 白粉病是影响小麦生产的一种严重病害。本发明是利用对白粉菌免疫的栽培小麦Brock为抗白粉病基因供体亲本，用农艺性状优良但对白粉菌敏感的京411为轮回亲本配制近等基因系，并利用AFLP方法对该近等基因系的遗传背景进行了分子检测，建立安全有效的检测方法；同时筛选到与抗白粉病基因紧密连锁的分子标记。本发明对抗白粉病栽培小麦优良品种的选育、进一步了解小麦抗白粉病的分子遗传学机理有积极意义。因此，本发明的研究结果在小麦育种实践及抗病理论研究上都很有价值。其优点具体归纳如下：

[0022] (1)本发明配制的小麦抗白粉病近等基因系，可以用于小麦抗白粉病新品种选育，小麦抗白粉病分子机理研究。

[0023] (2)本研究所用材料为对15号生理小种(为混合型生理小种，为华北地区流行的多种白粉病病菌)免疫的小麦品种，对华北地区白粉病菌具有比较广普的抗性。因此，根据所得近等基因系有望克隆到新的白粉病抗性基因。

[0024] (3)本发明用AFLP分子标记技术，对近等基因系和双亲的遗传背景进行分子检测，得到肯定的实验结果，得到的分子标记P15/M14-160与抗白粉病新基因紧密连锁，有可能用于生产实践。

[0025] 图1：近等基因系、Brock和京411对白粉病的抗性反应。其中a.京411；b.近等基因系Brock/015//京4117；c.近等基因系Brock/京4117；d.Brock。

[0026] 图2：近等基因系及供体亲本Brock、京411的AFLP指纹。其中1.京411；2.近等基因系Brock/015//京4117；3.近等基因系Brock/京4117；4.Brock

[0027] I代表“亲二型”

[0028] II代表“偏抗病供体Brock型”

[0029] III代表“偏轮回亲本京411型”

[0030] IV代表“交换型”

[0031] 图3：AFLPs核酸序列，其中(1)为P6/M3-166的测序结果(2)P6/M3-163的测序结果(3)P3/M6-395的测序结果(4)P15/M14-206的测序结果(5)P13/M13-245的测序结果(6)P11/M14-206的测序结果。

[0032] 图4：P15/M14在Brock、京411和抗、感单株中的PCR扩增结果。其中M，DL2000Marker；1-3感病单株；4，Jing 411；5，Brock；6-18抗病单株。

[0033] 以下结合实施例(附图、表具体说明)用来帮助理解本发明，并且不用于也不应被解释为以任何方式对所列出的权利要求中发明的限制。特别加以说明的是，本发明所用到的各种试剂均有市售。

[0034] 实施例1、近等基因系的配制：

[0035] 本发明近等基因系的配制：抗病基因供体亲本来自英国普通小麦品种Brock，其与农艺性状优良但感病亲本京411进行杂交，杂交组合为“Brock/京411”，所得F1均抗白粉病，用京411回交，在华北地区流行的白粉菌15号生理小种胁迫下，选择抗病单株，77
代后，再自交一次，获得抗白粉病近等基因系Brock/京411。图1为京411、近等基因系
7 7
Brock/015//京411、近等基因系Brock/京411 和Brock叶片染菌2周时比较，发现竟411严重染菌，菌丝几乎铺满叶片，而两个近等基因系(图1b，c)和Brock叶片上未见菌斑。

[0036] 实施例2、基因组DNA的分离：

[0037] 取0.2g黄化幼苗叶片，于液氮中研磨，尽量呈粉末，迅速加入2毫升提取Buffer(50mM Tris-HCl，pH 8.0；20mM EDTA；50mM NaCl)，轻轻混合，65℃温浴15min，其间颠倒混匀2-3次。0℃冰浴10分钟，0-4℃，3000转/分离心15分钟，轻取上清，加入到一新管中，加等体积Tris-HCl(pH 8.0)饱和酚，轻轻混合。0-4℃，3000转/分离心10分钟，取上清，加入等体积酚、氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提，轻轻混匀。0-4℃，3000转/分离心10分钟，取上清，加入等体积氯仿-异戊醇(25∶24∶1)抽提，轻轻混匀。0-4℃，3000转/分，离心10分钟，取上清，加2倍体积冷乙醇，-20℃沉淀1小时以上。0-4℃，12000转/分，离心20分钟，弃上清，75％乙醇0-4℃短暂离心，洗沉淀2次，晾干，溶于100μl TE(pH8.0)。
加1μl RNase(10mg/ml)，37℃保温1小时，以除去样品中的RNA。加等体积酚、氯仿，抽提一次，0-4℃，3000转/分离心10分钟。取上清，加等体积仿，抽提一次，0-4℃，3000转/分离心10分钟。取上清，加两倍体积冷乙醇，-20℃沉淀2小时以上。0-4℃，12000转/分，离心20分钟。弃上清，75％乙醇0-4℃短暂离心，洗沉淀2次，晾干，溶于50μl TE(pH8.0)中。分别用紫外分光光度法检测DNA样品的浓度，0.7％的琼脂糖凝胶电泳检测DNA的完整性。

[0038] 实施例3、遗传背景检测：

[0039] AFLP分析参照Vos(Vos，P.，R.Hogers，M.Bleeker，M.Reijans，T.van de Lee，M.Hornes，A.Frijters，J.Pot，J.Peleman，M.Kuiper，M.Zabeau.AFLP：A new technique forDNA fingerprinting.Nucleic Acids Res，1995，21：4407-4414)等的方法进行。所用接头和引物见表1。

[0040] 1)基因组DNA双酶切及接头连接：100×BSA 0.2μl，NEB buffer 4.0μl，Pst I(20U/μl)0.25μl，Mse I(10U/μl)0.5μl，Pst I接头(5pM)1.0μl，Mse I接头(50pM)1.0μl，T4 DNAligase 0.4μl，10×T4buffer 2.0μl，DNA(100ng/μl)5.0μl，ddH2O补齐40μl。37℃条件下保温8个小时。

[0041] 2)预扩增：反应体系为25μL，内含1μL连接产物，0.6pmol/L引物，10×PCR缓冲液2.5μL，0.2mmol/L的dNTPs，1U Taq聚合酶。PCR扩增程序为94℃ 2min；94℃35S，56℃35S，72℃60S，30个循环；72℃5min。预扩增产物用1％琼脂糖电泳检测，稀释20倍保存备用。

[0042] 3)选择性扩增：稀释的预扩增产物为选择性扩增模板进行AFLP分析。选择性扩增体积为20μL，AFLP选扩体系：Pst I接头引物(50ng/μL)0.8μL，Mse I接头引物(50ng/μL)0.8μL，10×Buffer 2.0μL，MgCl2(25mM)1.2μL，dNTP(10mM)0.45μL，TaqE(5U/μL)0.2μL，模板DNA 2.0μL，ddH2O补齐20μL。

[0043] PCR扩增采用递降式方法，其程序为94℃2min：94℃35S，65℃35S，72℃30S，以后每个循环退火温度降低0.7℃，共12个循环；然后94℃35S，56℃35S，72℃，60S，30个循环；最后72℃5min。扩增在MJ Research PTC-200型PCR仪上进行。

[0044] 4)扩增产物的检测：扩增产物加等量loading Buffer(98％甲酰胺；10mM EDTA(pH8.0)；0.25％溴酚兰；0.25％二甲苯青)，95℃变性5min，立即于冰浴待用。用6％的变性聚丙烯酰胺凝胶(含6mol/L尿素)电泳分离，银染法显示电泳图谱。

[0045] 5)遗传背景分析：以两个近等基因系(Brock/015//京4117；Brock/京4117)和供体亲本Brock及轮回亲本京411为材料，用表2中随机选取225对AFLP引物组合，用上述酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子检测，扩增谱型的统计按照下列方法：由引物组合P6/M3扩增出的谱带(图2I)，明显可以看出2对NIL中，有两条AFLP谱带分别来自于供体亲本Brock和轮回亲本京411，这种AFLP谱型我们称其为“亲二型”，图中箭头所指，用I表示。由引物组合P3/M6、P6/M3、P6/M6、P6/M7、P11/M14、P13/M13、P15/M11、P15/M14、P15/M15扩增出来的AFLP谱型，表现为供体亲本Brock中存在的谱带，在2对NIL中也均存在，在京411中均缺失，这种谱型我们称之为“偏抗病亲本Brock型”，图中箭头所指，用II表示(图2II)。而由P6/M3、P3/M6、P6/M6、P13/M13引物组合扩增到的，特异地存在于京411和2对NIL中，在抗病亲本Brock中不存在，这类AFLP谱带我们称之为“偏轮回亲本京411型”，图中箭头所指，用III表示(图2III)。除了上述三种谱型外，我们还看到了在亲本Brock和京411中均不存在，但在2对NIL中存在的谱带，如由引物组合P6/M3、P6/M6、P6/M7、P13/M13扩增出来的AFLP谱带，这种谱型我们称之为“交换型”，图中箭头所指，用IV表示(图2IV)。

[0046] 实施例4、P15/M14-160标记的获得：

[0047] 以Brock、京411及近等基因系为材料，在表2中随机选取225对AFLP引物组合，用上述酶切连接、预扩增、选择扩增及扩增产物检测体系进行AFLP分子筛选，结果发现有28个引物组合出现扩增产物多态性，从聚丙烯酰胺凝胶中回收上述特异片段，分别用原来的引物对进行二次扩增，其中8个片段获得有效扩增，将扩增产物经纯化、克隆、鉴定后送上海生工测序。

[0048] 实施例5、P15/M14-160分子标记与抗自粉病基因的连锁性鉴定：

[0049] 根据实施例4测序结果设计特异引物，以Brock×京411 F2代183单株和两个亲本小麦总体DNA为模板进行PCR扩增，仅引物组合P15/M14扩增的谱带与抗性基因相连锁(图4)，扩增引物序列为F：GCAGAAGTCGTTTACAATCAG，R：GACCACATTTTCTTCAGCAAC，产物分子量为160bp，定名为P15/M14-160。表现为在抗病亲本Brock和Brock×京411 F2分离所得136单株中均检测到这条谱带，而在感病的京411和47感病单株中均未出现这条谱带，没有交换产生，说明可能这个AFLP分子标记与Brock中的抗病基因距离很近，甚至于可能是该抗病基因中的一个片段。该分子标记在小麦抗白粉病辅助选择育种有重要价值。

[0050] 序列表

[0051] <110>天津师范大学

[0052] <120>小麦Brock抗白粉病近等基因系的分子检测与应用

[0053] <160>2

[0054] <210>1

[0055] <211>160bp

[0056] <212>DNA

[0057] <213>基因序列

[0058] <220>

[0059] <221>gene

[0060] <222>(1)..(160)

[0061] <400>1

[0062] gcagaagtcg tttacaatca ggtcatagta gaaactgttg aaatcaaaag gaaatgggtg 60[0063] cgtgttttga attgagacgt gttagtcgct aaatcgaggt gtcaaagcgt cgttctgttc 120[0064] ttatgatcgc tcgttatgtg ttgctgaaga aaatgtggtc 160