[0001] 本发明属于分子育种技术领域，具体涉及一种棉花纤维长度单QTL近等基因系的创建方法。

[0002] 棉花是世界上重要的经济作物，也是最重要的天然纤维作物和纺织工业原料。随着纺织部门引入喷气纺、气流纺等高效快捷的纺纱技术，以及消费者对衣着要求的普遍提高，对我国棉花品种的纤维品质提出了更高的要求。纤维长度是评价纤维品质的重要指标之一，它最终影响着终端产品的质量，常规育种对纤维长度的改良进展较慢。

[0003] 更重要的是，纤维长度、纤维强度等重要品质指标与产量及产量构成因素存在显著的负相关，这些因素制约了棉纤维品质的遗传改良，致使棉花品质育种虽经过几十年的努力，产量与品质的负相关仍然存在。而随着人口的不断增加和耕地的日益减少，因此纤维品质和产量的同步改良是棉花育种的重要课题。

[0004] 分子标记技术的发展为研究纤维品质的遗传和改良提供了一条新的途径，迄今为止，国内外学者利用不同的优质纤维材料筛选并鉴定了100多个与纤维长度相关的数量性状位点（QTL）。然而目前这些研究所用的群体都为F2、BC1和重组自交系群体(RIL)，这些群体的遗传背景较复杂，存在如QTL间的互作与QTL与环境的互作，导致所估计的QTL的效应与位置的精确性有限。由这些群体获得的QTL的分辨率通常在10-30cM之间。而且在这样大的区间内，可能存在多个连锁的QTL，无法分解紧密连锁的负相关性状QTL。从而大大影响标记辅助选择的效率以及进一步的分子机理研究。

[0005] 近年来，近等基因系（near-isogenic lines，NILs)被广泛应用于植物数量性状QTL的精细定位研究中，因为近等基因系只含有供体的单个渐渗片段，性状的复杂性被降低到类似于由单基因控制的性状，可以更精确地估计QTL的效应、研究QTL之间的互作以及QTL与环境的互作，而且在目标QTL区域形成的重叠渐渗系可以促进数量性状基因的精细作图，降低连锁累赘程度，最终完成QTL的图位克隆。然而，除了目标染色体区域外，近等基因系通常含有一定数量的供体染色体片段，这些遗传背景将对目标QTL的效应产生影响，从而影响目标QTL的精细定位及遗传效应的估计。因而，在对目标QTL精细定位的基础上，利用分子标记进行前景与背景分子标记辅助选择，培育高遗传相似度的单QTL近等基因系，不但可以为标记辅助选择提供紧密连锁的标记，而且为数量性状位点图位克隆和基于单个数量性状位点下纤维发育的分子机制研究创造了重要的材料基础。

[0006] 培育高遗传相似度的纤维长度单QTL近等基因系，可以尽可能消除遗传背景及与目标QTL连锁的其他基因的影响，从而促进目标QTL的精细定位，为通过标记辅助选择改良棉纤维品质提供紧密连锁的标记，为数量性状位点图位克隆和基于单个数量性状位点下纤维发育的分子机制研究创造重要的材料。

[0007] 本发明的目的是提供一种棉花纤维长度单QTL近等基因系的创建方法。

[0008] 本发明所述棉花纤维长度单QTL近等基因系的创建方法，包括以下步骤:

[0009] a)利用含有海岛棉（G.barbadense）Pima S-61号染色体上纤维长度QTL的渐渗系与轮回亲本Tamcot2111构建F2群体，分离各个F2单株叶片的DNA，获得分子标记资料，构建目标QTL区间NAU3384-BNL3090标记区间的遗传连锁图谱。

[0010] b)根据上述a步骤中的分子标记资料，鉴定在NAU3384-BNL3090标记区间的重组个体。对重组个体进行多年、多重复的纤维长度测定。根据不同重组类型的纤维长度鉴定结果进行置换作图，将目标QTL定位于MUSS084-CIR018标记区间。

[0011] c)在F3群体中，选择在NAU3384-BNL3090标记区间含有较小渐渗片段且较长纤维长度的重组个体与轮回亲本回交，进行前景、背景分子标记辅助选择和纤维长度鉴定，获得了遗传背景与轮回亲本一致且纤维长度明显优于轮回亲本的单QTL近等基因系。

[0012] 本发明中所述的含有海岛棉（G.barbadense）Pima S-61号染色体上纤维长度QTL的渐渗系是在回交高代QTL作图群体中通过分子标记辅助选择获得(Shen et al.,2011)。

[0013] 本发明的积极效果：本发明建立了一种棉花纤维长度单QTL近等基因系的创建方法，并获得了棉花1号染色体上纤维长度单QTL近等基因系，为促进目标QTL的精细定位及其以后的图位克隆创造了重要材料。

[0014] 图1目标QTL附近的局部遗传连锁图谱。

[0015] 图2目标区间重组个体的置换作图。

[0016] 图3棉花纤维长度单QTL近等基因系的创建流程图。

[0017] 本发明中所涉及的供体亲本Pima S-6和轮回亲本Tamcot2111均为常规的棉花品种，渐渗系R01-40-08是在高世代回交群体获得，已有文章报道（Shen et al.,2011）发明人实验室有保存。

[0018] 实施例1：渐渗系R01-40-08的近等性分析

[0019] 具体方法如下：为了分析渐渗系R01-40-08的近等性。我们根据已发表的两个棉花遗传连锁图谱（Guo et al.,2007;Xiao et al.,2009），选择534个分布于棉花整个基因组的SSR引物分析渐渗系R01-40-08与供体亲本Pima S-6和轮回亲本Tamcot2111之间的多态性。结果显示，供体亲本Pima S-6和轮回亲本Tamcot2111呈现多态性的引物有413个，其中，R01-40-08和轮回亲本Tamcot2111之间呈现多态性的引物23个。其中1号染色体有11个（BNL2921、JESPR240、NAU422、MUSS84、MUSS422、CIR018、JESPR56、NAU2182、TMD03以及BNL3090和1对STS引物（STS38）、2号染色体1个（NAU2858）、3号染色体1个（NAU1167）、
14号染色体3个（NAU2190、NAU3820、AU5465）、15号染色体1个（NAU2573）、19号染色体3个（NAU3110、NAU1221、NAU1042）、20号染色体1个（NAU3407）、23号染色体1个（NAU3732）。
遗传背景相似性估计根据公式GBS（genetic background similarity）=N/S×100%（N表示R01-40-08和轮回亲本Tamcot2111之间为单态的标记数，S表示供体亲本Pima S-6和轮回亲本Tamcot2111之间呈现多态性的引物总数）=390/413=94.43%，因此渐渗系含有轮回亲本Tamcot211194.43%的基因组。

[0020] 实施例2：qFL-chr1附近区域高密度遗传连锁图谱构建

[0021] 具体方法如下：最初的渐渗系R01-40-081号染色体上携带的Pima S-6片段位于引物

[0022] NAU3384-BNL3090之间。为了丰富目标片段区间，我们从1号染色体上选择了88个SSR引物来分析渐渗系R01-40-08和轮回亲本Tamcott2111。结果得到多态性引物12对（NAU3384、MGHES10、NAU3533、CGR5144、CIR049、NAU5085、DPL0887、NAU4891、BNL2827、DPL094、CGR5914以及TMB0062）。加上前期研究(Chee et al.,2005)得到的10对SSR引物（BNL2921、JESPR240、NAU422、MUSS84、MUSS422、CIR018、JESPR56、NAU2182、TMD03以及BNL3090）和1对STS引物（STS38），一共23对引物位于R01-40-08目标区段内。利用含有纤维长度QTL（qFL-chr1）的渐渗系R01-40-08与轮回亲本Tamcot2111构建一个含有1672个单株F2群体。用以上23对多态性引物对1672个F2单株进行基因型鉴定，共鉴定出在目标区间NAU3384-BNL3090标记区间重组的个体432株。用MAPMAKER/EXP3.0b软件对该F2群体分离数据进行连锁分析，获得了目标QTL区域高密度遗传连锁图谱，位于标记区间NAU3384-BNL3090，该图谱共13.1cM，标记间平均距离为0.6cM（图1）。

[0023] 实施例3：目标区间重组个体的置换作图

[0024] 具体方法如下：用实施例2中获得的23个多态性引物分析F2群体，共鉴定了目标区间

[0025] NAU3384-BNL3090标记区间重组的个体432个。在这432个重组个体中，其中143个在纯合的Tamcot2111遗传背景下含有不同的Pima S-6杂合片段；289个在纯合的Pima S-6遗传背景下含有不同的杂合片段。鉴于Pima S-6遗传背景可能对表型产生影响，因此在精细作图时我们没有考虑Pima S-6遗传背景下的重组个体，对143个来自Tamcot2111遗传背景下的重组个体进行多年、多重复的纤维长度测定。

[0026] 根据重组位置的不同，我们将这些重组个体分成29种类型（图2）。类型1含有3个重组个体，在标记区间NAU3384-BNL2921之间重组；类型2含有2个重组个体，在标记区间BNL2921-JESPR240之间重组；类型3含有3个重组个体，在标记区间NAU422-MUSS84之间重组；类型4含有1个重组个体，在标记区间MUSS84-MUSS422之间重组；类型5含有6个重组个体，在标记区间MUSS422-CIR018之间重组；类型6含有6个重组个体，在标记区间CIR018-CGR5144之间重组；类型7含有7个重组个体，在标记区间CGR5144-JESPR56之间重组；类型8含有1个重组个体，在标记区间JESPR56-CGR5914之间重组；类型9含有8个重组个体，在标记区间CGR5914-NAU2182之间重组；类型10含有19个重组个体，在标记区间NAU2182-STS38之间重组；类型11含有2个重组个体，在标记区间STS38-TMB0062之间重组；类型12含有1个重组个体，在标记区间TMB0062-TMD03之间重组；类型13含有7个重组个体，在标记区间BNL2827-DPL094之间重组；类型14含有3个重组个体，在标记区间DPL094-BNL3090之间重组。

[0027] 类型15含有6个重组个体，在标记区间NAU3384-BNL2921之间重组；类型16含有2个重组个体，在标记区间BNL2921-JESPR240之间重组；类型17含有2个重组个体，在标记区间JESPR240-NAU422之间重组；类型18含有6个重组个体，在标记区间MUSS422-CIR018之间重组；类型19含有9个重组个体，在标记区间CIR018-CGR5144之间重组；类型20含有
3个重组个体，在标记区间CGR5144-JESPR56之间重组；类型21含有3个重组个体，在标记区间JESPR56-CGR5914之间重组；类型22含有5个重组个体，在标记区间CGR5914-NAU2182之间重组；类型23含有18个重组个体，在标记区间NAU2182-STS38之间重组；类型24含有
8个重组个体，在标记区间STS38-TMB0062之间重组；类型25含有5个重组个体，在标记区间TMB0062-TMD03之间重组；类型26含有1个重组个体，在标记区间TMD03-CIR049之间重组；类型27含有1个重组个体，在标记区间CIR049-NAU5085之间重组；类型28含有1个重组个体，在标记区间DPL0887-NAU4891之间重组；类型29含有4个重组个体，在标记区间BNL2827-DPL094之间重组。

[0028] 根据不同重组类型的纤维长度鉴定结果，将目标QTL定位于1.0cM的标记区间[0029] MUSS084-CIR018。

[0030] 实施例4：单QTL近等基因系的创建

[0031] 具体方法如下：根据置换作图，我们从F3群体中，选择在目标QTL区间含有较小渐渗片段且较长纤维长度的重组个体5680-4，其重组区间为NAU3384-CGR5144。将这个重组个体种植在海南棉花基地，继续与轮回亲本Tamcot2111进行回交。第二年夏季将回交所获得的种子种植在江苏省农科院溧水试验基地。苗期对这个回交群体进行单株取样，提DNA，进行基因型鉴定。前景用引物NAU3384、BNL2921、MGHES10、NAU3533、JESPR240、NAU422、MUSS84、MUSS422、CIR018以及CGR5144来分析；背景用引物NAU2858、NAU1167、NAU2190、NAU3820、NAU5465、NAU2573、NAU3110、NAU1221、NAU1042、NAU3407以及NAU3732来分析。秋季对它们进行单株收花，送中棉所进行纤维长度鉴定。根据基因型和纤维长度鉴定结果获得了遗传背景与轮回亲本一致且纤维长度明显优于轮回亲本Tamcot2111的单QTL近等基因系E9、E232（表1、2）（图3）。

[0032] 表1、单QTL近等基因系的前景分子标记辅助选择和纤维长度鉴定结果[0033]

[0034] 表2、单QTL近等基因系的背景分子标记辅助选择及纤维长度鉴定结果[0035]

[0036] 1代表Pima 2代表Tamcot2111 3代表杂合。