用于构建孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的方法

IPRDB

API 数据接口

专利申请

使用指引 chat嘟嘟

会员体验

联系我们

交流群

现在联系顾问~

用于构建孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的方法
申请号	CN201610451511.4	申请日	2016-06-21	公开(公告)号	CN105994176A	公开(公告)日	2016-10-12
申请人	中国农业科学院蔬菜花卉研究所;			发明人	吴青君; 苑广迪; 万岩然; 何秉青; 李晓宇;
摘要	本发明提供一种用于构建孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的方法，属于昆虫遗传技术领域。所述方法包括：(1)选择所述逆境敏感品系雌性成虫与所述逆境抗性品系雄性成虫进行杂交获得杂交1代；(2)从所述杂交1代中选取雌性成虫，并使其孤雌繁殖得到单一雄性后代；(3)在所述逆境下处理培养所述单一雄性后代，筛选收集存活的雄性成虫，与敏感品系雌性成虫重复步骤(1)所述的杂交；以上述(1)‑(3)为一个循环，进行多轮杂交循环；将最后一次杂交得到的杂交后代雌性成虫与其父本回交，得到的子代在所述逆境下处理培养、筛选后，存活的子代即为孤雌生殖昆虫抗所述逆境的近等基因系。本发明的方法具有易于操作、步骤简单、便于实现、成本较低等优点。
权利要求	1.用于构建孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的方法，其特征在于，包括如下步骤：(1)选择所述逆境敏感品系雌性成虫与所述逆境抗性品系雄性成虫进行杂交获得杂交 1代； (2)从所述杂交1代中选取雌性成虫，并使其孤雌繁殖得到单一雄性后代； (3)用所述逆境筛选所述单一雄性后代，收集存活的雄性成虫，与敏感品系雌性成虫重复步骤(1)所述的杂交；以上述(1)-(3)为一个循环，进行多轮杂交循环；将最后一次杂交得到的杂交后代雌性成虫与其父本回交，得到的子代用所述逆境筛选后，存活的子代即为孤雌生殖昆虫抗所述逆境的近等基因系。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述逆境指杀虫剂。 3.根据权利要求1或2所述的方法，其特征在于，所述孤雌生殖昆虫为西花蓟马。 4.根据权利要求1-3任一所述的方法，其特征在于，用所述逆境筛选指，用100ppm的多杀菌素浸泡后的豆角饲喂西花蓟马。 5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多轮杂交循环5-7轮。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述成虫指，于蛹期挑取单头蛹培养至羽化后获得的虫子活体。 7.采用权利要求1-6任一所述的方法获得的孤雌生殖昆虫近等基因系。 8.权利要求1-6任一所述的方法在昆虫生理及抗逆性研究方面的应用。
说明书全文	用于构建孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的方法技术领域 [0001] 本发明属于昆虫遗传学技术领域，具体涉及一种为用于构建孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的方法。背景技术 [0002] 在昆虫抗药性研究中，通常以敏感品系和抗性品系昆虫为试虫材料，研究比较两种群昆虫在生理、生物化学和生物学方面的差异，用以明确昆虫产生抗药性之后，在生物学特性和杀虫剂靶标方面发生的变化，为抗性治理提供依据。 [0003] 现有技术中，抗性品系昆虫和敏感品系昆虫隔离饲养，抗性品系昆虫多是通过对敏感品系用杀虫剂进行汰选，连续多世代之后获得，敏感品系昆虫不接触任何杀虫剂，这个方法获得的两个种群存在较大的缺陷。因为昆虫抗性品系和敏感品系往往来源不同，除在抗药性方面存在差异外，在种群生态、生理生化或其它形态特征上也存在多种多样的变化，即使是从同一个种群昆中筛选的抗性、敏感品系，由于长期处在缺乏基因交流的条件下，也会导致遗传背景也发生一些变化。因此，直接对敏感和抗性种群进行比较，产生的差异有可能是由于抗性和其它因素导致，特别是进行生物学特性比较时，干扰的因素更多。并且昆虫种类繁多，变化复杂以及遗传基础的不明确性，给昆虫特别是农业害虫的抗性遗传机理和分子机理的研究造成极大的困难，从而阻碍了害虫的有效控制与治理。 [0004] 昆虫抗性近等基因系是通过与敏感品系杂交和多代回交之后，并用杀虫剂筛选，其与敏感品系仅存在目标基因(主要是抗性基因)上存在差异，排除了遗传背景差异的影响，还使得相关基因的效应充分显露出来，是抗性相关生理生化研究、抗性适合度研究、以及抗性基因或抗性基因位点定位及功能研究的理想遗传学材料，因此在昆虫对杀虫剂的抗性研究中具有非常重要的作用。但该方法主要适用于建立两性生殖昆虫的抗药性近等基因系。如何建立孤雌生殖昆虫的抗药性近等基因系，在本领域尚属空白。发明内容 [0005] 本发明根据本领域的上述空白，提供了一种用于构建孤雌生殖昆虫近等基因系的方法，具体为，西花蓟马抗药性的近等基因系建立方法。现有的昆虫近等基因系建立方法只能用于行两性生殖的昆虫，本发明首次提出了西花蓟马这类行孤雌生殖昆虫的近等基因系建立方法，使孤雌生殖昆虫近等基因系的建立成为可能，为昆虫抗性及生理研究提供了良好的研究材料，具有重要的科研价值。 [0006] 本发明解决上述技术问题所采用的技术方案是： [0007] 用于构建孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的方法，其特征在于，包括如下步骤： [0008] (1)选择所述逆境敏感品系雌性成虫与所述逆境抗性品系雄性成虫进行杂交获得杂交1代； [0009] (2)从所述杂交1代中选取雌性成虫，并使其孤雌繁殖得到单一雄性后代； [0010] (3)在所述逆境下处理培养所述单一雄性后代，筛选收集存活的雄性成虫，与敏感品系雌性成虫重复步骤(1)所述的杂交； [0011] 以上述(1)-(3)为一个循环，进行多轮杂交循环； [0012] 将最后一次杂交得到的杂交后代雌性成虫与其父本回交，得到的子代在所述逆境下处理培养、筛选后，存活的子代即为孤雌生殖昆虫抗所述逆境的近等基因系。 [0013] 所述逆境指杀虫剂。 [0014] 所述孤雌生殖昆虫为西花蓟马。 [0015] 在所述逆境下处理培养指，用100ppm的多杀菌素浸泡后的豆角饲喂西花蓟马。 [0016] 所述多轮杂交循环5-7轮。 [0017] 所述成虫指，于蛹期挑取单头蛹培养至羽化后获得的虫子活体。 [0018] 所述的方法获得的孤雌生殖昆虫近等基因系。 [0019] 所述的方法在昆虫生理及抗逆性研究方面的应用。 [0020] 本发明参照两性生殖昆虫近等基因系建立思路，结合孤雌繁殖昆虫的特点，为孤雌生殖昆虫的近等基因系建立提供了一种可行方法；该方法建立的抗性近等基因系种群的建立有助于消除遗传背景差异，为后续的昆虫生理及抗性机制研究提供重要材料。 [0021] 西花蓟马Frankliniella occidentalis(Pergande)属缨翅目蓟马科，典型孤雌生殖昆虫，食性杂且具锉吸式口器，可取食植物汁液和花粉，危害多种植物。除直接危害外，西花蓟马还是多种植物病毒的传播媒介。西花蓟马为单、双倍体繁殖系统，进行两性生殖的后代为雌虫，是二倍体，进行孤雌生殖的后代为雄虫，是单倍体。由于其发育周期短、繁殖力高、适应性强等特点，西花蓟马易对杀虫剂产生抗药性。目前国内外均有报道西花蓟马对多种药剂产生了抗性，包括活性最高的多杀菌素类杀虫剂。急需对其抗药性品系的遗传信息进行研究。 [0022] 因此，在本发明的实施例中，以西花蓟马抗多杀菌素为例，构建了抗多杀菌素近等基因系。具有如下特征：首先于蛹期挑取单头敏感种群西花蓟马置于2mL离心管中，待羽化后，选择其中的雌虫与抗性种群的雄虫进行交配，得到后代F1。待F1代发育至蛹期时，再单头挑取蛹置于2mL离心管中，羽化后收集雌虫，使其孤雌繁殖以得到单一的雄性后代，再用诊断剂量的多杀菌素药剂筛选，收集存活的雄虫再度与敏感种群雌虫交配，进入第二轮杂交循环。如此循环5-7次后，将最后一次得到的杂交后代雌虫与其父本回交一次，得到的子代用诊断剂量的多杀菌素药剂筛选，存活子代即为西花蓟马抗多杀菌素的近等基因系种群。用ISSR分子标记对亲本种群和近等基因系种群的遗传相似度进行评估。实验结果表明，经此方法获得的近等基因系种群，与其循环亲本的遗传背景相近，且仍维持了原有的抗性水平。本例所用试虫为西花蓟马室内敏感品系Ivf03和筛选自该敏感品系的多杀菌素抗性品系Spin-R，且抗性品系的抗性倍数已稳定在10,000倍以上。由于多杀菌素抗性为单基因控制的常染色体隐性遗传，因此敏感种群西花蓟马的基因型为SS♀和S♂，多杀进行抗性种群的基因型为rr♀和r♂，杂合体Sr♀表现为敏感型。 [0023] 本发明所提供的孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的构建方法，不仅限于实施例中提供的具体的抗杀虫剂近等基因系的构建，也不仅限于实施例中提供的西花蓟马近等基因系的构建。基于本发明所公开的内容，本领域技术人员采用本发明所述方法中的步骤构建其它抗逆境近等基因系，和/或构建除西花蓟马以外的其它孤雌生殖昆虫的近等基因系，均落入本发明请求保护的范围。所述其它抗逆境近等基因系包括，抗寒、抗热、抗旱、抗化学物质等，在构建这些抗逆境近等基因系的过程中，只需将上述步骤中的筛选条件更换成相应的寒、热、旱、化学物质等逆境条件，亦能构建出孤雌生殖昆虫的除抗杀虫剂近等基因系以外的其它抗逆境近等基因系。 [0024] 采用本发明所述的方法对孤雌生殖昆虫的抗逆性近等基因系进行构建，不仅为孤雌生殖昆虫的近等基因系建立提供了一种可行方法，而且有助于消除抗性近等基因系种群建立过程中遗传背景的差异，为昆虫生理及抗逆性研究提供与亲本材料遗传背景相近的供试材料，使其维持原有的抗性水平。对于构建孤雌生殖昆虫的抗逆境近等基因系，本发明的方法具有易于操作、步骤简单、便于实现、成本较低等优点。附图说明 [0025] 图1是本发明方法流程示意图。 [0026] 图2是Ivf-3,Spin-R和NIL-R三种群间ISSR-PCR电泳图，其中1-3：敏感种群Ivf03 ISSR-PCR结果；4-6：抗性种群Spin-R ISSR-PCR结果；7-9：近等基因系抗性种群NIL-R ISSR-PCR结果。具体实施方式 [0027] 下面结合附图和实施例对本发明进一步说明，但并不以此限制本发明的范围。所用试剂与耗材，如无特殊说明，均可商购获得。 [0028] 实施例1、本发明所述的孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系构建方法及构建的近等基因系 [0029] 本实施例提供一种用于构建孤雌生殖昆虫抗逆境近等基因系的方法，包括如下步骤： [0030] (1)选择所述逆境敏感品系雌性成虫与所述逆境抗性品系雄性成虫进行杂交获得杂交1代； [0031] (2)从所述杂交1代中选取雌性成虫，并使其孤雌繁殖得到单一雄性后代； [0032] (3)用所述逆境筛选所述单一雄性后代，收集存活的雄性成虫，与敏感品系雌性成虫重复步骤(1)所述的杂交； [0033] 以上述(1)-(3)为一个循环，进行多轮杂交循环； [0034] 将最后一次杂交得到的杂交后代雌性成虫与其父本回交，得到的子代用所述逆境筛选后，存活的子代即为孤雌生殖昆虫抗所述逆境的近等基因系。 [0035] 所述逆境选自下述几种环境之一：寒、热、旱、化学物质(包括杀虫剂等)等。 [0036] 所述“用所述逆境筛选”指，分别在上述几种环境下培养或用化学物质进行处理。 [0037] 实施例2、采用本发明的方法构建西花蓟马孤雌生殖昆虫抗杀虫剂近等基因系[0038] (1)采用实施例1所述的方法，以室内饲养多年的西花蓟马敏感品系(Ivf03)和源自Ivf03用多杀菌素进行汰选而获得的抗性品系(Spin_R)为试虫材料，进行西花蓟马抗多杀菌素近等基因系的构建。 [0039] (2)亲本材料的准备：于蛹期从敏感品系中挑取单头蛹置于2mL离心管中，待羽化后，收集其中的雌虫(基因型为SS♀，此后每一步的敏感雌虫皆如此获得)与抗性品系的雄虫(基因型为r♂)杂交，得到后代F1(含有杂合敏感雌虫Sr♀和敏感雄虫r♂)。 [0040] (3)待F1代发育至蛹期时，再挑取单头蛹分别置于2mL离心管中，羽化后收集其中的雌虫(Sr♀)，令其孤雌繁殖以得到全雄性的后代(含有敏感雄虫S♂和抗性雄虫r♂)。 [0041] (4)用诊断剂量(100ppm)的多杀菌素药剂浸泡过的豆角饲喂后，收集存活的的雄虫(r♂)与敏感种群雌虫(SS♀)杂交，其后代即为BC1代(含有杂合敏感雌虫Sr♀和敏感雄虫S♂)。 [0042] (5)再次于BC1代蛹期挑取单头蛹分别置于2mL离心管中，重复孤雌产雄、药剂筛选和与敏感雌虫杂交的步骤，即获得BC2代。 [0043] 如此重复进行(2)-(6)，直到获得BC6代。 [0044] (6)于BC6代蛹期时挑取单头蛹，羽化后收集其中的雌虫(基因型Sr♀)，与其父本一代(即BC5代孤雌繁殖获得的雄虫，基因型r♂)杂交，收集其后代(含有杂合敏感雌虫Sr♀，抗性雌虫rr♀和抗性雄虫r♂)，并用药剂筛选，最终获得抗多杀菌素的西花蓟马近等基因系种群NIL-R(基因型rr♀和r♂)。 [0045] 用ISSR分子标记对亲本种群和近等基因系种群的遗传相似度进行评估，从University of British Columbia提供的ISSR标准引物序列中筛选出适合西花蓟马的引物序列，选择的ISSR引物序列及最适退火温度如表1所示。分别收集3个种群的成虫，提取单头西花蓟马的DNA，用以进行ISSR-PCR扩增。ISSR-PCR反应体系如表2所示，反应条件为94℃预变性4min，94℃变性40s，X℃退火40s(不同引物退火温度不同)，72℃延伸1min20s，72℃延伸10min，4℃终止反应，35个循环。 [0046] 表1 ISSR引物序列及最适退火温度 [0047] [0048] 表2 ISSR-PCR反应体系 [0049] [0050] [0051] 经过ISSR-PCR得到的产物用2％琼脂糖电泳检测，得到DNA指纹图谱如图2所示，利用Quantity One凝胶分析软件分析胶图，统计每个样品各个迁移位置条带的有无情况，在相同位置如果有条带就记录为“1”，相应位置没有条带则记录为“0”，建立二元数据矩阵。将建立的二元数据矩阵输入分析软件POPGEN32中，及获得3个西花蓟马种群(Ivf03、Spin-R和NIL-R)的遗传相似度矩阵，结果如表3所示。其中Spin-R抗性种群和Ivf03敏感种群间的遗传相似度为0.6476，而近等基因系种群NIL-R和敏感种群Ivf03间的遗传相似度高达0.9832。 [0052] 表3 Ivf03,Spin-R和NIL-R三种群间遗传相似度结果 [0053]