[0001] 本发明属于农业生物育种领域，具体涉及一种郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点及其高效分子标记和应用。

[0002] 玉米(Zea mays L.)是世界第一大粮食作物,也是重要的饲料、经济兼用型作物。玉米籽粒的蛋白质含量一般在10％左右，从营养学观点看，普通玉米的蛋白品质比较差。普
通玉米中赖氨酸的含量只有0.23％左右，而畜禽通常需要的饲料赖氨酸含量在0.6％‑
0.8％，目前不足部分需要通过添加较多的合成赖氨酸、豆饼和鱼粉等给予补充，这样极大
地增加了饲料的成本。

[0003] 1964年，Mertz等首次发现玉米opaque2突变体胚乳赖氨酸含量比普通玉米高70％。Opaque2(O2)是一个能够特异调控22kDα‑醇溶蛋白表达的转录因子。Opaque2通过结
合到醇溶蛋白启动子顺式作用元件O2‑box(TCCACGTAGA)，调控22‑kDα‑醇溶蛋白和15kDβ‑
醇溶蛋白等的表达。O2是目前鉴定的最主要的醇溶蛋白基因调控转录因子，其它发现的玉
米转录因子PBF、OHP和ZmMADS47均与O2相互作用共同调控醇溶蛋白基因的表达。玉米成熟
籽粒中α‑醇溶蛋白超基因家族分为4个亚家族：Z1A、Z1B、Z1C、Z1D，其中三个基因家族Z1A、
Z1B、Z1D编码19kDα‑醇溶蛋白，其同源度在75％到95％之间。Z1C家族编码22kDα‑醇溶蛋白，
其成员基因之间的同源度大约有90％。

[0004] 利用分子标记进行优质蛋白玉米回交育种，o2供体以及分子标记的选择影响到选择的效率。Chen等(2014)研究发现CA339是一个启动子区域发生突变导致o2基因不表达的
突变体，以CA339为o2供体材料，辽2345为受体材料，利用CA339o2基因内分子标记phi057回
交转育过程中，发现辽2345/o2‑1籽粒表型和醇溶蛋白表达恢复正常表型，结果发现
CA339o2基因CDS导入，但是CA339突变启动子序列未导入辽2345，导致辽2345/o2‑1中的o2
基因在辽2345启动子驱动下正常表达并行使功能。o2基因突变位点的研究以及突变位点完
全连锁分子标记的开发将有助于提高优质蛋白育种选择效率。因此我们对本研究室获得的
郑58/o2近等基因系的籽粒表型、醇溶蛋白积累以及o2基因突变位点和蛋白质序列进行分
析，同时开发高效分子标记，为优质蛋白玉米分子标记辅助育种提供高效分子标记。

[0005] 本发明的目的在于提供一种郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因突变位点及其应用。

[0006] 本发明的另一目的在于提供一种郑58/opaque2近等基因系中opaque2突变基因及其应用。

[0007] 本发明的又一目的在于提供一种与上述opaque2基因突变位点完全连锁的分子标记及其应用。

[0008] 本发明的又一目的在于提供一种优质蛋白玉米分子标记辅助育种的方法。

[0009] 本发明的目的可以通过以下技术方案实现：

[0010] 一种opaque2基因突变位点，该基因突变位点位于郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因ATG后713bp处，并在opaque2基因ATG后713bp处缺失10个碱基。

[0011] 一种opaque2突变基因，该突变基因在郑58/opaque2近等基因系中opaque2基因ATG后713bp处缺失10个碱基。该突变基因的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。

[0012] 一种与上述opaque2基因突变位点完全连锁的分子标记，该分子标记为o2‑indel‑1，其引物序列为：

[0013] o2‑indel‑1F：5’‑TTTTAACTCCTGGGCTTATCG‑3’，

[0014] o2‑indel‑1R：5’‑AGGTGAGCGGCTTTCCTGTAT‑3’。

[0015] 上述分子标记的引物也是本发明保护的范围。

[0016] 上述的opaque2基因突变位点在优质蛋白玉米分子标记辅助育种中的应用。

[0017] 上述的分子标记及其引物在优质蛋白玉米分子标记辅助育种中的应用。

[0018] 一种优质蛋白玉米分子标记辅助育种的方法，利用上述的分子标记辅助选择转育opaque2突变基因。

[0019] 上述的优质蛋白玉米分子标记辅助育种的方法，其在于，利用上述分子标记的引物对郑58/o2供体和受体材料HA01构建的回交群体BC1F1进行分子标记选择，选择杂合基因
型植株进行下一次回交，每次回交群体均利用所述的分子标记引物进行分子标记选择最终
得到o2o2纯合基因型植株。

[0020] 本发明的有益效果：

[0021] 优质蛋白玉米分子标记辅助育种过程中，opaque2突变体材料是最常用的高赖氨酸玉米供体。opaque2基因突变位点的详细解析有助于完全连锁分子标记的开发，有效降低
错选率。因此本发明对已获得的郑58/o2近等基因系突变表型、突变位点以及连锁标记开发
进行了详细研究。结果表明郑58/o2表现出典型的o2突变体表型，其籽粒赖氨酸含量显著增
加，SDS‑PAGE显示胚乳发育不同时期22‑kDα‑醇溶蛋白的积累均明显低于郑58。荧光定量
PCR结果表明α‑醇溶蛋白家族基因Z1A、Z1B、Z1C和Z1D的表达均显著低于郑58，但是荧光定
量PCR实验发现郑58/o2胚乳发育不同时期O2基因均正常表达。测序分析发现郑58/o2中o2
基因ATG后713bp处缺失10个碱基，ORF预测O2蛋白翻译提前终止。针对突变缺失位点开发基
因内共显性分子标记o2‑indel‑1，利用该标记进行回交转育，结果表明o2‑indel‑1与o2突
变表型完全连锁，错选率为0。因此opaque2基因突变位点的解析有助于高效分子标记的开
发，提高优质蛋白玉米育种选择效率。

[0022] 图1为供试玉米材料不同基因型种子。

[0023] 其中，A,郑58；B,opaque2

[0024] 图2为籽粒发育不同时期醇溶蛋白SDS‑PAGE带谱检测。

[0025] 图3为Opaque2基因及醇溶蛋白基因发育不同时期表达分析。

[0026] 图4为郑58与郑58/o2CDS序列扩增。

[0027] 图5为郑58与郑58o2近等基因系DNA序列比对分析。

[0028] 图6为郑58与郑58/o2蛋白质序列比对分析。

[0029] 图7为opaque2基因分子标记辅助选择电泳检测结果。

[0030] 其中，1,6,29:maker；2,8,31:郑58；3,7,30:郑58/o2；4:昌7‑2；5:HA01；9‑28:BC1F1不同单株带型；32‑38:BC5F5不同单株带型。

[0031] 1材料与方法

[0032] 1.1试验材料

[0033] 供试的郑58/o2近等基因系以及对照材料郑58来自河南省农业科学院粮食作物研究所。郑58/o2近等基因系为掖478/o2与郑58回交六代自交转育而成的近等基因系自交后
代。

[0034] 1.2玉米籽粒氨基酸检测

[0035] 1、样品制备：每样品取3个果穗,取中部1/3籽粒,充分混合,磨碎过60目筛。取过筛后的样品2g‑10g，放入扁形称量瓶中(可用小培养皿)，瓶盖斜支于瓶边，置于101‑105℃的
烘箱中2‑4小时，取出盖好，置干燥器内冷却0.5小时，称量。称量后再重新加热1小时，冷却
0.5小时，称量。重复至前后称重不差2mg，并计算样品含水量。

[0036] 2、样品盐酸水解：制备好的样品，称取0.2g，加入5mL(6mol/L)HCl，充入氮气，封管，放入110℃的烘箱中过夜水解。取出冷却后，在100mL容量瓶中加入6mol/L NaOH至中性，
将水解液过滤到此容量瓶中，用PH2.2的缓冲液(0.02mol/L的稀盐酸)洗涤水解管，过滤，最
后定容至100mL。样品上机前需用0.45μm滤膜过滤[1]。

[0037] 3、玉米籽粒氨基酸含量测定：利用日立L‑8900型全自动氨基酸分析仪对待测样品进行氨基酸测定，17种氨基酸标准液(日本味之素公司)作为蛋白质水解分析标准样品。分
离柱：4.6mm×60mm填料为3μm磺酸型阳离子树脂分离柱，交换树脂为日立专用离子交换树
脂。柱温：50℃；进样体积：20μL。反应柱：4.6mmID×40mm，填充材料：金刚砂惰性材料。EZ 
Chrom软件操作仪器，并分析处理数据[1]。

[0038] 表1 供试玉米材料籽粒氨基酸组分检测分析

[0039] Table1 The amino acid composition of maize kernel

[0040]

[0041] 表中数值为每种氨基酸检测值与氨基酸总和的百分比(w/w×100)

[0042] 1.3玉米籽粒发育不同时期取样

[0043] 郑58和郑58/o2近等基因系套袋自交授粉，授粉后10、13、16、19、22、26、30、34、38、42天取样，选取果穗中部三分之一处籽粒，每次取样时间为上午11点左右。取下的样品立即
放入液氮，然后置于‑80℃冰箱保存用于RNA提取。

[0044] 1.4玉米籽粒醇溶蛋白SDS‑PAGE检测

[0045] 1、醇溶蛋白提取：醇溶蛋白的提取参考Wu等的方法[2]。发育不同时期玉米籽粒于液氮中磨成粉状，称取100mg，加400μL醇溶蛋白提取液(70％乙醇(v/v)，2％β‑巯基乙醇(v/
v))，震荡提取6h，13000rpm离心15min，吸取100μL上清，加10μL10％SDS溶液，真空干燥后加
100μL双蒸水溶解。

[0046] 2、SDS‑PAGE电泳分析：取8μL用于SDS‑PAGE电泳分析检测，使用15％的分离胶和4％的浓缩胶进行SDS‑PAGE电泳，恒定电压120V进行电泳。电泳后用考马斯亮蓝R‑250染色
液(0.1％考马斯亮蓝，25％(v/v)异丙醇，10％(v/v)乙酸)染色，染色时间视胶的厚度以及
胶的数量而定，大概时间在30min到4h之间。之后用10％的乙酸脱色过夜。

[0047] 1.5 RNA提取与cDNA制备

[0048] RNA提取参照天根公司的RNAprep Pure Plant Kit说明书对胚乳样品材料进行总RNA的提取。详细步骤见说明书。采用PrimeScript RT reagent Kit(Takara)合成单链
cDNA。根据RNA浓度测定结果进行精确计算，每20uL体系中加入1ug的RNA，反应条件为37℃
15min，85℃5sec。

[0049] 1.6 PCR引物设计

[0050] 从NCBI数据库中检索O2基因cDNA，以此序列为模板，应用Primer Premier 5.0软件设计引物O2‑CDS‑1F：5’‑GAGCATCCAAGCCTACTCCTG‑3’，O2‑CDS‑1R：5’‑
GAGACAACCAGCCTTATTCAGC‑3’。郑58/o2基因连锁分子标记开发以本研究测序的郑58/o2中
o2基因序列为模板，设计引物o2‑indel‑1F：5’‑TTTTAACTCCTGGGCTTATCG‑3’，o2‑indel‑1R：
5’‑AGGTGAGCGGCTTTCCTGTAT‑3’。醇溶蛋白Z1A、Z1B、Z1C和Z1D基因荧光定量引物参照Feng
等[3]发表的文章，O2基因荧光定量引物参照Zhang等[4]发表的文章。所有引物由上海生工
公司合成。

[0051] 1.7实时荧光定量RT‑PCR

[0052] 实时荧光定量PCR反应体系20μL包括：10μl 2×qPCR master mix(Promega)，1.0μl cDNA模板，0.8μl 10μM引物，8.2μl dd H2O。

[0053] PCR扩增程序：95℃预变性2min；95℃变性15s，60℃退火15s，72℃延伸20s，共进行40次循环；95℃变性15s、60℃退火1min，95℃变性15s。荧光定量PCR反应在Bio‑Rad CFX 
Manager仪器中进行。

[0054] 2结果与分析

[0055] 2.1籽粒表型及醇溶蛋白SDS‑PAGE检测

[0056] 郑58/o2与郑58相比较，籽粒表现为粉质不透明(图1)。为了观察籽粒发育不同时期醇溶蛋白积累情况，我们利用SDS‑PAGE对郑58/o2和郑58籽粒醇溶蛋白的积累进行实时
监控。观察从授粉后10天开始到42天结束。结果发现郑58在授粉后10天到42天这段时间内，
醇溶蛋白得到快速积累。而郑58/o2中，22kDα‑醇溶蛋白和15kDβ‑醇溶蛋白的积累明显受到
抑制。郑58是在授粉后13天开始积累醇溶蛋白，而郑58/o2在授粉后10天和13天均未检测到
蛋白条带，直到16天才开始出现27kDγ‑醇溶蛋白的积累，而且整个观察时期醇溶蛋白积累
速率缓慢。郑58/o2中16kDγ‑醇溶蛋白的积累与郑58相比较未发生明显变化(图2)。

[0057] 2.2 opaque2基因及醇溶蛋白基因表达分析

[0058] 我们利用荧光定量RT‑PCR检测了籽粒发育不同时期opaque2基因及醇溶蛋白基因的表达情况。结果发现郑58在授粉后10天到26天这段时间内，Opaque2基因的表达在10天到
16天之间缓慢增加，19天达到最高值。而郑58/o2中opaque2基因的表达量并未下降，与郑58
表达相似。醇溶蛋白基因表达结果显示，与郑58相比较，郑58/o2中Z1A、Z1B、Z1C和Z1D基因
的表达均显著下降(图3)。

[0059] 2.3 opaque2基因突变位点分析

[0060] 由于郑58/o2近等基因系中o2基因表达正常，因此我们设计引物对郑58和郑58/o2近等基因系中Opaque2基因的全长CDS进行扩增，结果郑58和郑58/o2均扩增出预期的
1621bp片段(图4)，将扩增产物送至生工公司进行测序。测序结果利用EBI数据库clustal 
omega在线软件对O2基因DNA和蛋白序列进行比对分析(http://www.ebi.ac.uk/Tools/
msa/clustalo/)。结果发现郑58和郑58/o2的O2基因DNA序列之间有21个位点存在差异，序
列一致性96.15％(图5)。利用序列处理在线工具包对CDS测序结果进行ORF预测(http://
www.bio‑soft.net/sms/)，预测结果显示郑58中O2蛋白序列全长436个氨基酸，而郑58/o2
近等基因系O2蛋白序列只翻译了253个氨基酸(图6)。我们推测郑58/o2近等基因系o2基因
ATG后713bp处缺失的10个碱基导致O2蛋白从711bp以后阅读框发生改变，导致在760bp处出
现TGA，使蛋白翻译提前终止。利用NCBI蛋白数据库对郑58O2蛋白序列保守结构域进行预测
(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)，结果显示bZIP型DNA结合
结构域位于第230到第280个氨基酸的位置，而郑58/o2近等基因系只翻译了237个正确的氨
基酸，该区域并未有完整的bZIP保守结构域。

[0061] 2.4 opaque2基因完全连锁分子标记开发与利用

[0062] 以o2缺失位点作为扩增区域，O2基因序列为模板，设计分子标记o2‑indel‑1的引物o2‑indel‑1F和o2‑indel‑1R，检测郑58/o2、郑58、昌7‑2以及本研究团队优良自交系HA01
之间的多态性，结果显示分子标记o2‑indel‑1的引物扩增片段在郑58/o2与其它自交系之
间呈多态性，郑58/o2由于缺失10bp扩增片段较小，郑58、昌7‑2和HA01扩增片段较大，且大
小一致(图7)。利用引物o2‑indel‑1F和o2‑indel‑1R对郑58/o2供体和受体材料HA01构建回
交群体BC1F1，苗期取样进行分子标记选择，共检测100株。部分单株检测结果如图7所示。选
择杂合基因型植株进行下一次回交，每次回交群体均利用引物o2‑indel‑1F和o2‑indel‑1R
进行分子标记选择。利用分子标记o2‑indel‑1在BC5F2群体中选择o2o2纯合基因型植株，并
自交5代。HA01构建的BC5F5群体，PCR检测结果显示所有植株均为o2o2纯合基因型，部分结果
如图7，说明已经转育成o2o2纯合基因型近等基因系。HA01/o2近等基因系籽粒赖氨酸含量
为0.39‑0.46％，籽粒醇溶蛋白检测结果显示22kD醇溶蛋白条带表达量下降。由于引物扩增
区域包含o2基因突变位点，标记与突变表型完全连锁。

[0063] 3讨论与结论

[0064] 郑58/o2近等基因系表现出典型的opaque2突变表型，籽粒呈现粉质不透明，赖氨酸含量增加，胚乳发育不同时期22kDα‑醇溶蛋白的积累均受到显著抑制。但是荧光定量PCR
实验结果发现郑58/o2中o2基因的表达与郑58中O2基因的表达无显著差异。CDS测序结果显
示郑58/o2以及郑58的序列有21个位点存在差异，ORF预测发现其中位于第4外显子的第14
个差异位点郑58/o2缺失10个碱基导致郑58/o2中的O2蛋白翻译提前终止，其突变表型是由
于仅翻译出的前半段蛋白无保守功能结构域导致蛋白不具有转录因子功能所致。o2基因突
变位点的解析有助于优质蛋白玉米育种过程中高效分子标记的开发同时提高o2基因的选
择效率。

[0065] 使用分子标记辅助选择转育o2突变基因是一个快速、有效的改良玉米品质的方法。利用o2基因突变位点设计引物，可以使突变表型与分子标记完全连锁。利用o2基因突变
位点设计分子标记可以避免o2供体材料与受体材料出现无多态性的情况。

[0066] [1]Han X‑H(韩小花),Tie S‑G(铁双贵),Lu C‑X(卢彩霞),Yue R‑Q(岳润清),Qi J‑S(齐建双),Yan S‑F(燕树锋),Guo S‑L(郭书磊),Chi H‑F(池海锋),Fu X‑L(付晓雷),
Chen N‑N(陈娜娜),Liu L(刘璐).Interaction of the o2 Gene with Starch‑Forming 
Mutant Genes on the Lysine Content in Maize Kernel.Journal of Maize Sciences
(玉米科学),2016,24:14‑18

[0067] [2]Wu Y R,Wang W Q,Messing J.Balancing of sulfur storage in maize seed.BMC Plant Biol,2012,12:1471‑1480

[0068] [3]Feng,L.H.,Zhu,J.,Wang,G.,Tang,Y.P.,Chen,H.J.,Jin,W.B.,Wang,F.,Mei,B.,Xu,Z.K.,and Song,R.T.Expressional profiling study revealed unique 
expressional patterns and dramatic expressional divergence of maizeα‑zein 
super gene family.Plant Mol Biol.2009,69:649‑659.

[0069] [4]Zhang,Z.Y.,Yang.J.,Wu,Y.R.Transcriptional Regulation of Zein Gene Expression inMaize through the Additive and Synergistic Action of opaque2,
Prolamine‑Box Binding Factor,and O2Heterodimerizing Proteins.The Plant 
Cell.2015,27:1162‑1172.