普通野生稻抗白叶枯病近等基因系的培育方法

普通野生稻抗白叶枯病近等基因系的培育方法

本发明涉及基因工程领域。具体涉及一个来自普通野生稻的携有高抗水稻白叶枯病新基因的近等基因系。

水稻白叶枯病是1个全球性的重要细菌性病害。80年代以来我国大面积种植的水稻品种携有单一的抗病基因Xa-4，致使对Xa-4有毒的5型菌上升为优势菌，潜在着品种丧失抗性的风险。国际水稻研究所(IRRI)60年代投放大量携有基因Xa-4的品种，在东南亚国家业已大面积感病化[1]。迄今，由日本与IRRI合作鉴定21个抗白叶枯病基因中，多数为抗谱较窄或为隐性基因，不便用于育种，只有近年由Khush等(1990)从长药野生稻(O.longislaminata)中鉴定到的新基因Xa-21[2]，其广谱抗性与本发明相似，即对当时包括对1个广致病力的专化菌系PXO99在内的6个国际白叶枯病生理小种均能抵御。但是Xa-21基因存在以下不足：即(1)构建携有该基因的近等基因系时，只进行4次回交和1次自交，世代较；用于育的导入效应较低。(2)携有Xa-21的基因系IRBB21在苗期是感病的，至分蘖期以后才抗病。(3)可能由于当时尚未明确生理小种6号的代表菌系PXO99为关键鉴别小种菌系，而采用小种2的代表菌系PXO86揭示Xa-21的抗性遗传基础是不够贴切的。

本发明的目的在于提供1个能鉴别特异性的白叶枯病广致病菌系PXO99，并用此菌系构建了一套携有来自普通野生稻特异基因Xa23的近等基因系的方法。

本发明的内容为：1、用以鉴定特异抗白叶枯病基因的1个水稻黄单胞致病变种(Xanthomonasoryzae pv.oryzae)菌系PXO99已于1999年7月14日由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏。在该中心登记入册的编号是CGMCCNO.0406.

2、培育方法成功培育携有特异抗性基因Xa23近等基因系的全部程序均必须采用能鉴别该基因的特异广致病菌系PXO99，方能检测该专化抗性基因是否存在：1)采用包括白叶枯病广致病菌系PXO99在内的9个国际的、3个日本的和7个中国的共19个菌系对普通野生稻抗源接种鉴定，获得1个全生育期抗全部菌系的广谱抗源RBB16。

2)采用花培单倍体育种技术加速纯合该普通野生稻抗源的抗性。通过野栽杂交，将该种质的抗病性导入1个株型良好的籼型栽培稻JG30，获F1植株，选择高抗菌系PXO99的单株进行花药培养获得H1，自交3次，逐代用PXO99菌系鉴定，获得全生育期稳定表达高度抗病的抗性纯合系H4。

3)采用PXO99揭示H4的抗性遗传基础及其抗性表达类型在迄今国际正式命名的栽培稻种的所有抗白叶枯病显性基因中都不能抵御PXO99的侵袭，仅有来自野生稻的Xa-21和该纯合系H4对PXO99是能抵御的，遂分析了H4对PXO99的抗性遗传模式，揭示了H4携有的抗性基因对PXO99的高度抗病性由一对完全显性抗病基因控制。该基因是自苗期至成株期均表达抗性的全生育期抗性。而Xa-21对PXO99的抗性至分蘖盛期才能表达。两者间等位性测定显示为非等位基因，表明H4携有一对新基因，暂命名为Xa23。

4)构建携有抗病基因Xa-23的近等基因系以感病籼稻品种JG30与花培抗病纯合系H4杂交，又以JG30为轮回亲本回交，每代分别用专化抗性菌系PXO99接种鉴定，选留14株在苗期具有显性抗性表达、显示轮回亲本的性状的单株，继续与轮回亲本回交至BC5F1，再自交至BC5F3，获得一对遗传背景与轮回亲本基本一致，目标抗性清晰而稳定的近等基因系，命名为WBB1。

5)SSR分子标记选择用携有Xa-23抗性基因的近等基因系WBB1与感病品种JG30杂交的F1和F2分离群体，选择与目标抗病基因连锁的SSR分子标记。先用菌系PXO99接种F1和F2，获得抗和感的反应参数资料，选择160株F2进行叶片基因组总DNA提取。按常规PCR反应选了160对SSR引物，获得2对能在亲本和抗感DNA池之间检测到多态性的引物，OSR6和RM224，用其分别对选出的160个F2单株进行共分离分析，并采用作图软件Mapmarker(3.0)分析遗传图距。发现OSRS与新基因Xa-23紧密连锁，图距为5.3cM，RM224与Xa-23的遗传图距为27.cM。

3、本发明的优点和积极效果(1)设计了新基因鉴定和构建近等基因的技术体系水稻与白叶枯病保存着典型的基因对基因互作关系的原理和普通野生稻抗病性通常处于杂合状态，本发明采用的核心技术是：①全程采用广致病茵系PXO99；②采用花培单倍体育种技术构建新基因抗病纯合系；③多代回交逐代同步进行专化菌系检测抗病性和农艺性状选择。构建携有新基因的Xa-23的抗病近等基因系。

(2)构建携有Xa-23基因的近等基因系中，充分考虑到将轮回亲本JG30的遗传成份恢复到携有目标抗性基因系中，因而回交和自交的总代数较多，从而建成了遗传背景与轮回亲本高度一致而专化抗性清晰、稳定的近等基因系，为基因克隆提高效率。

(3)育成的近等基因系WBB1携有的普通野生稻抗白叶枯病新基因Xa-23，是迄今国际已命名的抗病基因中抗谱最广、抗性导入效应极强、水稻全生育期都高度抗病的完全显性基因。它将在改变我国抗白叶枯病基因利用单一的严峻现状、改良我国水稻抗病性上发挥积极作用，并在开展我国水稻分子标记辅助选择育种中起促进作用。

图1建立普通野生稻抗白叶枯病纯合系及鉴定新基因图2培育携有Xa23新基因的抗病近等基因系WBB1技术程序图3新基因Xa23在水稻第11条染色体上等位置(其它抗白叶枯病基因及其DNA标记引自Causse等1994)材料         抗病                         对9个小种的抗性反应                          抗性表达生育期基因P1     P2     P3     P4     P5     P6     P7     P8     P9WBB1         Xa-？      R      R      R      R      R      R      R      R      R        全生育期IRBB21       Xa21       R      R      R      R      R      R      R      R      R        分蘖盛期IRBB3        Xa3        R      R      R      R      R      S      S      S      R        成株期IRBB4        Xa4        R      S      S      M      R      S      R      R      S        全生育期IRBB7        Xa7        MS     R      R      S      R      S      R      R      R(？)    成株期IRBB10       Xa10       S      R      S      S      R      S      R      S      S        全生育期IRBB14       Xa14       S      S      S      S      R      S      S      R      S        全生育期JG30(CK)                S      S      S      S      S      S      S      S      S        全生育期R＝抗，M＝中抗，S＝感表1参考文献(1)T.W.Mew 1987，Current status and Future Prospects of research onBacterial Blight of Rice，Ann.Rev.Phytopathology，1987，25：359~382(2)(2)G.S.Khush et al，A new gene for resistance to bacterial blightFrom O.longistamanata，RCX，1990，7：21~22