在油料作物像油菜、向日葵、油棕等中，油(即三酰甘油)是种子 或果实中最有价值的产物，而其它化合物例如淀粉、蛋白质和纤维被 认为是低价值的副产物。在油料作物中通过消耗其它化合物来提高每 重量份油的数量会因此增加该作物的价值。如果调节还原碳分配到油 生产中的酶可以通过过量表达进行正调节，则细胞将通过消耗其它产 物来积蓄更多的油。这种方法可能不仅用来在已是高产油生物例如油 料作物中增加含油量，而且它们可能在中等或低含油量作物例如大 豆、燕麦、玉米、马铃薯、甜菜和芜菁以及在微生物中导致较高的油 产量。
结合更加了解三酰甘油生物合成的遗传工程技术的开发，现在使 得有可能将编码参与三酰甘油生物合成的关键酶的基因从野生植物种 或其它界的生物转移到驯化油料种子作物中。这样，可以以中等成本、 高纯度和数量来生产三酰甘油。
已知三酰甘油(TAG)在动物(Bell和Coleman，1983)和植物(Cao和 Huang，1986，Martin和Wilson 1983)的脂肪积蓄组织中的生物合成以及 油在微生物例如细菌(Ekundayo和Packter，1994)、酵母和其它真菌 (Ratledge 1989)的积蓄可以通过酰基辅酶A：二酰甘油酰基转移酶 (DAGAT)来催化，所述酶使酰基从酰基辅酶A转移到二酰甘油，从而 生成TAG。
近几年，已经在以下生物中鉴定了编码DAGAT的基因：动物 (Cases等，1998)、植物(Hobbs等，1999；Lardizabal等，2000)和微生物 (Lardizabal等，1999)。这些DAGAT属于两个不相关的蛋白质家族。
已经鉴定的DAGAT的第一种类型-DAGAT A迄今仅在动物 (Cases等，1998)和植物(Hobbs等，1999)中发现。这些基因与编码酰基 辅酶A：胆固醇酰基转移酶(ACAT)的基因显示有序列相似性。小鼠 DAGAT A与小鼠ACAT具有20％氨基酸序列同一性(Cases等， 1998)。然而，来自植物和动物的DAGAT A相互之间比与ACAT更为 相似。因此，小鼠DAGAT A与拟南芥(Arabidopsis thaliana)DAGAT A 具有38％氨基酸序列同一性(Hobbs等，1999)。它也与据认为参与TAG 合成的人ACAT样蛋白ARGP1(Oelkers等，1998)有大约80％相同，， 表明ARGP1是一种DAGAT A。
酿酒酵母(S.cerevisiae)含有两个与ACAT具有序列相似性的基 因，ARE1和ARE2(Yang等，1996)。所编码的蛋白与小鼠ACAT具有 大约24％总体氨基酸序列同一性，并且与来自小鼠的DAGAT A具有 15％同一性。应该注意到，它们两者之间(45％氨基酸序列同一性)比与 来自高等真核生物的或者ACAT或者DAGAT更为相似。因为它们与 两组高等真核生物的酶的进化距离是相似的，所以不可能仅根据序列 相似性将它们分为推定的ACAT或DAGAT。然而，实验已经表明， Arel和Are2均为ACAT，它们一起负责存在于酵母中的所有甾醇酯的 合成(Yang等，1996；Yu等，1996)。对Are1和Are2可能参与TAG的合 成也进行了研究(Yang等，1996；Yu等，1996)。根据这些研究，可以断 定Are1和Are2不参与TAG的合成。因此，现有技术没有说明Are1 是一种TAG合成酶，也不可能根据已经公布的与ACAT样序列的同 源性，断定Are1是DAGAT(Lassner和Ruezinsky，1999)。
DAGAT酶的第二个家族-DAGAT B家族与任何其它已知的蛋白 质不相关。这些酶显示与小鼠和植物ACAT样DAGAT A蛋白 (Lardizabal等，2000)或与任何其它已知的蛋白质都没有序列同源性。
DAGAT A和DAGAT B不是对TAG的生物合成产生影响的仅有 的酶。TAG也可以通过酰基辅酶A独立反应来合成。因此，新发现的 酶磷脂：二酰甘油酰基转移酶(PDAT)通过使酰基从磷脂的sn-2位置转 移到DAG来催化TAG的生成(Dahlqvist等，1999；Sthl，1999)。
发明概述
本发明描述了酵母中部分负责TAG积蓄的酶的编码基因的鉴 定。
在第一个实施方案中，本发明涉及包含SEQ ID NO 2中所示的氨 基酸序列的TAG合成酶或其功能片段、衍生物、变异体、直向同源物 或同工酶。
本发明还包括SEQ ID NO 1中所示的核苷酸序列以及所述基因组 序列的部分、其cDNA序列、等位基因变异体、合成变异体和突变体。 这包括编码序列表中所示多肽的变异体(包括生物活性三酰甘油合成 酶)的序列以及用作探针、转化用载体或克隆中间体的序列。
本发明的另一方面涉及与SEQ ID NO 2具有至少60％同一性的那 些多肽。优选的实施方案是编码具有二酰甘油酰基转移酶活性的多肽 的多核苷酸。
在一个不同的方面，本发明涉及将这些核苷酸序列应用于重组 DNA构建体中，以指导本发明的二酰甘油酰基转移酶序列在宿主生物 或其后代(包括油料种子、酵母和其它真菌)以及其它油积蓄性生物中 的转录和翻译。由于产生酰基转移酶编码序列而含有二酰甘油酰基转 移酶的细胞和生物也包括在本发明的范围内。
特别有价值的是用优先在植物种子组织中表达的转录起始区表达 本发明的核苷酸序列。设想了可以合成所述基因序列，尤其是当有意 提供植物优选密码子时合成所述基因序列。
在一个不同的实施方案中，本发明也涉及应用编码本发明的所述 蛋白质的DNA序列增加不同生物的细胞内的含油量的方法。
此外，本发明使得有可能提供一种生产三酰甘油的方法，所述方 法包括使转基因细胞或生物在以上所讨论的任何核苷酸序列被表达的 条件下生长，以便在这些细胞中产生一种具有使脂肪酸从酰基辅酶A 转移到二酰甘油能力的酶，从而生成三酰甘油。
此外，通过上述方法生产的三酰甘油包括在本发明的范围内。
对本发明的特征可以基本上表述为以下方面：
1.应用一种核酸序列生产三酰甘油(TAG)，所述核酸序列编码催 化脂肪酸从酰基辅酶A转移到二酰甘油的酶，即通过用所述序列遗传 转化产油生物，以便在该生物体内表达所述序列并且产生一种活性 酶，以便增加该生物的含油量。
所述核酸序列来源于SEQ ID NO.1中所示的序列、酿酒酵母ARE1 基因(基因组克隆或cDNA)，或者来源于所含有的核苷酸序列编码的蛋 白质的氨基酸序列与SEQ.ID.NO.2中所示的氨基酸序列有60％或更 多相同的核酸序列或cDNA。
2.转基因生物，所述转基因生物在其基因组内或质粒上包含通过 重组DNA技术转移的以上所述的核酸序列。所述转基因生物选自真 菌、植物和动物。最好是所述转基因生物为农作物，并且最好是所述 核苷酸序列在贮藏器官特异性启动子的控制下进行表达。或者，所述 核苷酸序列在种子特异性启动子的控制下进行表达。
3.得自按照方面2的生物的油。
4.一种蛋白质或其功能(酶活性)片段，所述蛋白质由按照SEQ ID NO.1的DNA分子编码。或者，在方面2中具体描述的生物中产生的 蛋白质，该蛋白质具有SEQ ID NO.2中所示的氨基酸序列或者具有与 所述氨基酸序列有至少60％同源性的氨基酸序列。所述蛋白质最好分 离自酿酒酵母。
5.应用方面4中具体描述的蛋白质生产三酰甘油。
6.按照方面5的三酰甘油。
发明详述
现在，参照以下附图和实施例将更加容易地理解已概述的本发 明，包括附图和实施例仅为了说明目的，而不用来限制本发明的范围。
附图的描述
图1.过量表达ARE1基因的酵母菌株(SCY62)中的体外DAGAT活 性。按照材料和方法中介绍的方法A，测定用对照菌株(泳道A)或ARE1 过量表达菌株(泳道B)制备的等份微粒体膜的DAGAT活性。在TLC 板上通过电子放射自显影术(Instant Imager，Packard，US)显现所合成的 放射性三酰甘油并且以cpm(括号中的数字)对其进行定量。用于附图 中的缩写：三酰甘油(TAG)和未酯化的脂肪酸(FA)。
图2.在PDAT DAGAT B双重突变体、PDAT DAGAT BARE1三重 突变体和含有过量表达ARE1基因的质粒的相同三重突变体中的体 外DAGAT活性。
在TLC板上通过电子放射自显影术(Instant Imager，Packard，US)显 现来自如下菌株的微粒体中所合成的放射性三酰甘油(TAG)：双重突 变体H1226(泳道A)、三重突变体H1236(泳道B)和含有过量表达ARE1 基因的质粒的相同三重突变体(泳道C)。
SEQ ID的简述
SEQ ID NO.1：酿酒酵母ARE1基因ORF YCR048W的基因组 DNA序列。
SEQ ID NO.2：酿酒酵母可读框YCR048W的氨基酸序列。
实施例
实施例1-在缺乏ARE1基因的酵母细胞中三酰甘油积蓄减少
材料和方法
酵母菌株。用于本研究的酵母菌株与W303-1A(Thomas和 Rothstein，1989)背景属同类系。通过使两个菌株SCY60(MATαare1- Δ::HIS3 ade2-1 can 1-100 leu2-3，112 trp1-1 ura3-1)和SCY61(MATa are2-Δ::LEU2 ADE2 can 1-100 his3-11，15 trp1-1 ura3-1)(Yang等，1996) 杂交，然后分开四联球菌，产生具有基因型MATαare1-Δ::HIS3 ADE2 can 1-100 leu2-3，112 trp1-1 ura3-1的are1突变株H1111。作为野生型 对照，我们使用SCY62(MATa ADE2 can 1-100 his3-11，15 leu2-3 trp1- 1 ura3-1)(Yang等，1996)。采用乙酸锂方法，通过一系列酵母转化，构 建分别在编码酵母DAGAT B和PDAT的YNR008w和YOR245c中和 ARE1基因被破坏的酵母突变株。如下产生用来破坏YOR245c和 YNR008w基因的线型DNA片段。构建对YOR245c特异性的引物(所 述基因上游300碱基，CAGCATTGACGTAATGGGAA，和下游， AAAGCCAAAAAGAGAAGGACA)，从SCY62基因组DNA，采用PCR 合成该基因。将PCR片段制成平端后连接到先前用限制性酶SmaI切 割的pUC119中。然后将所得的质粒YOR245c-pUC119用ClaI/StuI消 化后去磷酸化，以防止重新连接。通过SmaI/SacI消化质粒pFA6a获 得标记KanMX4。然后将平端的KanMX4片段连接到YOR245c- pUC119载体的YOR245c可读框内的ClaI和StuI位点之间。通过用 BamHI/NdeI切割最终获得含有所得的YOR245c::KanMX4破坏盒的线 型片段。以与YOR245c::KanMX4片段相似的方式，构建用来破坏 YNR008w基因的线型片段。用SCY62基因组DNA扩增YNR008w基 因，将其克隆到pBluescript载体(DahlqVist等，2000)中，用限制性酶 BbsI/MunI消化。然后将TRP1标记连接在YNR008w-pBluescript质粒 的BbsI和MunI位点之间，通过BamHI/PstI消化获得含有所述破坏盒 的线型片段。通过用线型YNR008w::TRP1片段转化野生型菌株 SCY62，产生具有基因型MATa pdat-Δ::TRP1 ADE2 leu2-3，112 ura3-1 his3-11，15 trp1-1的单PDAT突变体H1079。以相同的方式，通过用线 型YOR245c::KanMX4片段转化H1079，构建具有基因型MATa pdat- Δ::TRP1 dagat B-Δ::KanMX4 ADE2 leu2-3，112 ura3-1 his3-11，15 trp1-1 的PDAT DAGAT B双重突变体H1226。通过用线型YNR008w::TRP1 片段转化H1111，产生具有基因型MATαare1-Δ::HIS3 pdat-Δ::TRP1 ADE2 can 1-100 leu2-3，112 ura3-1 trp1-1的ARE1 PDAT双重突变体 H1224。通过用线型YOR245c::KanMX4片段转化H1224，构建具有基 因型MATαare1-Δ::HIS3 pdat-Δ::TRP1 dagat B-Δ::KanMX4 ADE2 leu2-3，112 ura3-1 trp1-1的三重突变体H1236。
酵母培养。在液体YPD培养基(1％酵母提取物、2％蛋白胨、2％ 葡萄糖)中在旋转振荡器上于28℃或30℃培养酵母细胞。让转化细胞 在缺乏尿嘧啶而补充2％(体积/体积)甘油和2％(体积/体积)乙醇的合 成培养基(Sherman等，1986)中生长。
脂质分析。根据Dahlqvist等(2000)介绍的方法，测定酵母细胞的 脂质含量，并以nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵母表示。
结果
在不同的生长期对其中ARE1基因被破坏的酵母突变株(SCY60) 的脂质含量进行分析，并将其与野生型酵母细胞(SCY62)进行比较。在 培养10小时后在指数期收获的are1突变细胞中，以nmol FA/干重酵 母测定的脂质总量与野生型酵母没有显著差异(表1)，积蓄到TAG中 的脂肪酸量在野生型和are1突变体之间也没有明显的不同。在一个实 验中，酵母细胞在液体YPD培养基中预培养24小时后，分析are1破 坏对稳定期细胞中油积蓄的影响。然后收获细胞，将其重悬于补充16 g/l甘油的基本培养基(Meesters等，1996)中，至生长培养物的原始体 积。在这种补充甘油的基本培养基中，酵母细胞在适合于TAG积蓄的 条件下将进入稳定期。再培24小时后，收获细胞，测定其脂质组成。 are1突变体中的总脂质含量比野生型低15％。are1突变体中的TAG 量几乎比野生型低40％，而极性脂质含量在are1突变体和野生型酵母 之间没有显著不同(表1)。
最近已经表明，两种其它基因YNR008w和YOR254c(Sthl，1999； Dahlqvist等，2000；Lardizabal等，2000)参与酵母中的TAG合成。这些 基因分别编码PDAT蛋白和DAGAT B蛋白。构建所有三个基因 (ARE1、YNR008w和YOR254c)均被破坏的酵母菌株以及仅PDAT基 因和DAGAT B基因被破坏的酵母菌株，在此将它们分别称为三重突 变体和双重突变体。双重突变体的TAG含量为野生型的48％(表2)， 而在三重突变体中积蓄的TAG量仅为野生型酵母水平的4％。通过比 较双重突变体和三重突变体中积蓄的TAG量，显然Are1蛋白有助于 酵母的TAG合成。
总之，这些实验清楚地表明，ARE1基因产物有助于酵母中TAG 的积蓄。
表1.ARE1突变型酵母细胞(SCY60)和野生型酵母细胞(SCY62)中的 脂质含量。在不同的生长期分析ARE1基因被破坏的酵母(are1突变体) 中的脂质积蓄，并将其与对照野生型酵母进行比较。在YPD培养基中 于28℃培养10小时后，分析指数生长中细胞的脂质组成。通过将细 胞在液体YPD培养基中于28℃预培养24小时，制备稳定期的酵母细 胞，然后收获细胞，重悬于补充16g/l甘油的基本培养基(Meesters等， 1996)中，再于28℃培养24小时。测定甾醇酯、TAG、其它中性脂质 和极性脂质的含量，表示为nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵母。
          SCY62        (nmol FA/mg)          SCY60       (nmol FA/mg)   10小时   48小时   10小时   48小时   甾醇酯   三酰甘油   其它中性脂质   极性脂质   15   6   4   65   24   44   6   74   12   8   4   63   19   28   5   74   总脂质   90   148   87   126
表2.PDAT DAGATB双重突变株(H1226)、PDAT DAGATB ARE1 三重突变株(H1236)和野生型酵母细胞(SCY62)中的脂质含量。在YNB 培养基中培养不同的酵母菌株(全部菌株都含有空表达质粒pJN92 (Ronne等，1991))，至A600为4时加入2％(体积/体积)半乳糖。再生长 22小时后收获细胞，测定甾醇酯、TAG、其它中性脂质和极性脂质的 含量，表示为nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵母。   SCY62   (nmol FA/mg)   H1226   (nmol FA/mg)   H1236   (nmol FA/mg)   甾醇酯   三酰甘油   其它中性脂质   极性脂质   13   163   17   58   10   78   16   66   1   7   41   44   总脂质   251   170   87
实施例2-在过量表达ARE1基因的酵母细胞中三酰甘油积蓄增加
材料和方法
为了诱导ARE1基因的过量表达，将来自质粒YEP 3-16(Yang等， 1996)的2001bp EheI/Ecl136II片段克隆到GAL1表达载体pJN92 (Ronne等，1991)的BamHI位点，由此产生pUS5。用pUS5转化野生型 酵母菌株SCY62(MATa ADE2 can 1-100 his3-11，15 leu2-3 trp1-1 ura3- 1)(Yang等，1996)，将其在缺乏尿嘧啶而补充2％(体积/体积)甘油和2％ (体积/体积)乙醇的合成培养基(Sherman等，1986)中在旋转振荡器上于 28℃进行培养。生长43小时后，通过添加2％(重量/体积)终浓度的半 乳糖来诱导GAL1启动子。再生长24小时后收获细胞。用空载体pJN92 转化并在相同条件下培养的野生型(SCY62)细胞用作对照。根据 Dahlqvist等(2000)介绍的方法，测定酵母细胞的脂质含量，并以nmol 脂肪酸(FA)/mg干重酵母表示。
结果
通过用含有在半乳糖诱导型GAL1启动子控制下的ARE1基因的 质粒转化野生型酵母(菌株SCY62)，来研究ARE1基因的过量表达对脂 质积蓄的影响(表3)。通过光密度测定法进行测定，用该启动子过量表 达ARE1基因对生长率没有强作用。然而，过量表达ARE1的酵母细胞 中的总脂质含量增加到用空表达载体转化的对照酵母的1.4倍(表3)。 与对照相比，过量表达ARE1的酵母细胞中脂质含量的升高几乎都是 由于TAG含量增加50％所致，而在这些细胞中甾醇酯的量也显著增 加。这些结果清楚地证实，ARE1的基因产物，除其较早报道的参与甾 醇酯的合成(Yang等，1996)外，也参与TAG的合成。在ARE1过量表 达细胞中达到的升高的TAG水平也清楚地证实，ARE1基因在增加转 基因生物含油量方面的潜在用途。
表3.过量表达ARE1基因的酵母细胞中的脂质含量。按照材料和方 法一节中所述的方法，培养用pJN92载体中在GAL1启动子控制下的 ARE1基因转化的酵母细胞(SCY 62)。用空载体转化并在相同条件下培 养的酵母细胞(SCY62)用作对照。收获细胞，测定甾醇酯、三酰甘油、 其它中性脂质和极性脂质的含量，表示为nmol脂肪酸(FA)/mg干重酵 母。   SCY62   (nmol FA/mg)   过量表达ARE1的SCY62   (nmol FA/mg)   甾醇酯   三酰甘油   其它中性脂质   极性脂质   19   160   30   48   27   239   32   56   总脂质   257   354
实施例3-ARE1基因产物具有二酰甘油酰基转移酶活性
材料和方法
通过运用以下方法之一，分析用酵母细胞制备的微粒体部分中的 体外二酰甘油酰基转移酶(DAGAT)活性。
方法A：用含有在GAL1启动子控制下的ARE1基因的质粒(pUS5) 转化野生型酵母(菌株SCY62)(实施例2的材料和方法中介绍的)。该 转化酵母在缺乏尿密啶的已知成分的YNB培养基中于28℃进行培 养。生长8小时后通过添加2％(体积/体积)半乳糖诱导ARE1基因的表 达，再生长17小时后收获细胞。在加有4ml玻璃珠(直径0.45-0.5mm) 的12ml玻璃试管中，通过将1g酵母(鲜重)重悬于8ml冰冷缓冲液(20 mM Tris-Cl，pH 7.9，10mM MgCl2、1mM EDTA、5％(v/v)甘油、1mM DTT、0.3M硫酸铵)中，由该转化酵母制备微粒体膜。用MSK细胞匀 浆器(B.Braun Melsungen AG，德国)剧烈振摇(3×60s)该玻璃试管。悬 液以20 000g于6℃离心15分钟，所得上清液以100 000g于6℃离心 2小时。将含有微粒体膜的所得沉淀重悬于0.1M磷酸钾(pH 7.2)缓冲 液中，贮藏于-80℃。其中加有在含有190mM HEPES-NaOH，pH 7.5、 125mM MgCl2、30mM CHAPS、2.5mg/ml BSA和2nmol[14C]-棕榈酰 辅酶A(2775dpm/nmol)的50μl缓冲液中乳化的1μmol二油酰-PG和 0.25μmol二油酰-DAG、相当于10nmol磷脂酰胆碱的等份微粒体膜(50 μl)中，分析DAGAT活性。反应混合物于30℃孵育30分钟。然后在 氯仿中抽提脂质，采用薄层层析在硅胶60板上在己烷/二乙醚/乙酸 (80∶20∶1)中进行分离。在所述板上通过电子放射自显影术(Instant Imager，Packard，US)显现放射性脂质并对其进行定量。
方法B：用空表达质粒(pJN92)转化实施例1的材料和方法中介 绍的PDAT DAGAT B双重突变体(H1226)和PDAT DAGAT BARE1三 重突变体(H1236)。通过用质粒pUS5转化三重突变体H1236(实施例2 的材料和方法中介绍的)，产生在GAL1启动子的控制下表达ARE1基 因的转化子。将所有酵母转化子在YNB培养基中培养，至A600为4 时加入2％(体积/体积)半乳糖。再生长6小时后收获细胞，运用 Dahlqvist等(2000)方法的改进方法制备微粒体。在含有0.2ml玻璃珠 (直径0.45-0.5mm)的2ml Eppendorf管中，将酵母细胞(0.2g)重悬于1.5 ml冰冷缓冲液(20mM Tris·Cl，pH 7.9、10mM MgCl2、1mM EDTA、 5％(vol/vol)甘油、1mM DTT、0.3M硫酸铵)中。在细胞匀浆器(Mini Bead Beater)中剧烈振摇(3×60s)该管。匀浆酵母以1350xg于4℃离 心20分钟，随后将所得上清液以150 000xg于4℃离心1小时。将沉 淀重悬于0.1M磷酸钾(pH 7.2)中，贮藏于-80℃。将溶于氯仿的二己 酰-DAG(5nmol)加到微量管中，在氮气流下蒸发氯仿。将相当于150μg 蛋白质的微粒体部分在由50mM HEPES(pH 7.2)、5mM MgCl2和1 mg/ml BSA组成的缓冲液中的等份样品(90μl)加到该管中，将悬浮液 充分混匀。最后，加入10μl[14C]-棕榈酰辅酶A(20nmol、5000 dpm/nmol)，混合物于30℃孵育15分钟。将反应混合物中的脂质萃取 到氯仿中(Bligh和Dyer，1959)，然后在硅胶60板(Merck)上通过TLC 进行分离。TLC板首先在氯仿/甲醇/乙酸/水(85∶15∶10∶3.5)中展开80 mm。然后将经干燥的板在己烷/二乙醚/乙酸(80∶20∶1.5)中展开180 mm。在所述板上通过电子放射自显影术(Instant Imager，Packard)显现放 射性脂质并对其进行定量。
结果
按照材料和方法中的方法A，测定用过量表达ARE1基因的转化 酵母和用空质粒(pJN92)转化的对照酵母制备的微粒体膜的DAGAT活 性。与对照酵母相比，用ARE1过量表达子制备的微粒体膜中从[14C]- 棕榈酰辅酶A合成的放射性标记TAG的量增加66％(图1)。也测定了 用PDAT DAGAT B双重突变株(H1226)细胞和PDAT DAGAT B ARE1 三重突变株(H1236)细胞(方法B)制备的微粒体膜的DAGAT活性。在 具有功能性ARE1基因的双重突变体中，从加入的二己酰-DAG和[14C]- 棕榈酰辅酶A合成具有两条己酰链和一条[14C]棕榈酰链的TAG。在其 中ARE1基因被破坏的三重突变体(图2)中几乎检测不到这种合成。然 而，在用表达ARE1基因的质粒转化的三重突变细胞中TAG的体外合 成得到恢复。这清楚地表明，TAG在这些酵母突变体中的体外合成与 功能性ARE1基因的存在相关，并且由ARE1基因编码的蛋白质具有 DAGAT活性。
实施例4-在表达ARE1基因的拟南芥种子中三酰甘油积蓄增加
材料和方法
采用校读酶聚合酶pfu(Promega)，从酵母基因组扩增ARE1基因。 将EcoR1和Xba1限制性酶位点分别导入该片段的5’端和3’端中，使 得可以定向克隆该片段。将PCR片段克隆到载体pBluescript(Stratagene) 中。然后将得自该质粒的插入片段克隆到载体pPGTV-KAN(Becker 等，1993)中的napin启动子片段(Stlberg等，1993)的下游。将该质粒转 化到农杆菌属(Agrobacterium)菌株GV3301中。然后用转化农杆菌属 细胞，转化来自拟南芥的根外植体(Valvekens等，1992)。通过脂肪酸的 甲基化测定拟南芥种子中的脂质含量。将约2-3mg种子的油中的脂肪 酸在2ml 2％(vol/vol)H2SO4的干燥甲醇溶液中于90℃甲基化90分 钟。用己烷萃取脂肪酸甲酯，并经GLC通过50m×0.32mm CP- Wax58-CB熔融石英柱(chrompack)对其进行分析，十七酸甲酯用作内 标准品。
结果
用napin启动子控制下的ARE1基因转化拟南芥，该启动子是种子 特异性的并且在油积蓄的主要阶段有活性。分析得自4个独立转化事 件的单个T2植株种子中的含油量(表4)。结果表明，与对照植株种子 中的含油量相比，在3个品系中，50％-100％T2植株产生的种子中的 含油量的上升具有统计学显著性。在表达ARE1的种子中，含油量升 高达18％。1个系(28-1)与对照植株种子的含油量相同。
表4.用ARE1基因转化的拟南芥种子中的油积蓄
在可控条件下在生长室中培育用napin启动子控制下的ARE1基因 转化的T2植株和用空载体转化的对照植株。通过GLC分析测定这些 植株成熟种子中的含油量，并以nmol脂肪酸(FA)/mg种子表示。                                                     转化子                          对照   28-1   28-2   28-3   28-4   所分析的T2植株数  4   6   2   6   11   种子含油量显著增加的   T2植株数*  -   0   2   3   9   具有最高含油量的T2植   株中的nmol FA/mg种子  1535±114   1562±28   1753±53   1641±82   1818±18
*在α＝5时，根据4株对照植株的平均含油量，用平均差双侧检验进行计算。
参考文献
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                             说明书序列表
1一般资料
i)申请人：斯堪的纳维亚生物技术研究公司(Scandinavian Biotechnology
          Research AB)
ii)发明名称：应用一类酶及其编码基因增加转基因生物的含油量
iii)序列数：2
2)SEQ ID NO：1的信息：
i)序列特征：
A)长度：1833个碱基
B)类型：核酸
C)链型：单链
D)拓扑结构：线性
ii)分子类型：DNA
iii)序列描述：：SEQ ID NO：1：
ATGACGGAGA CTAAGGATTT GTTGCAAGAC GAAGAGTTTC TTAAGATCCG    50
CAGACTCAAT TCCGCAGAAG CCAACAAACG GCATTCGGTC ACGTACGATA    100
ACGTGATCCT GCCACAGGAG TCCATGGAGG TTTCGCCACG GTCGTCTACC    150
ACGTCGCTGG TGGAGCCAGT GGAGTCGACT GAAGGAGTGG AGTCGACTGA    200
GGCGGAACGT GTGGCAGGGA AGCAGGAGCA GGAGGAGGAG TACCCTGTGG    250
ACGCCCACAT GCAAAAGTAC CTTTCACACC TGAAGAGCAA GTCTCGGTCG    300
AGGTTCCACC GAAAGGATGC TAGCAAGTAT GTGTCGTTTT TTGGGGACGT    350
GAGTTTTGAT CCTCGCCCCA CGCTCCTGGA CAGCGCCATC AACGTGCCCT    400
TCCAGACGAC TTTCAAAGGT CCGGTGCTGG AGAAACAGCT CAAAAATTTA    450
CAGTTGACAA AGACCAAGAC CAAGGCCACG GTGAAGACTA CGGTGAAGAC    500
TACGGAGAAA ACGGACAAGG CAGATGCCCC CCCAGGAGAA AAACTGGAGT    550
CGAACTTTTC AGGGATCTAC GTGTTCGCAT GGATGTTCTT GGGCTGGATA    600
GCCATCAGGT GCTGCACAGA TTACTATGCG TCGTACGGCA GTGCATGGAA    650
TAAGCTGGAA ATCGTGCAGT ACATGACAAC GGACTTGTTC ACGATCGCAA    700
TGTTGGACTT GGCAATGTTC CTGTGCACTT TCTTCGTGGT TTTCGTGCAC    750
TGGCTGGTGA AAAAGCGGAT CATCAACTGG AAGTGGACTG GGTTCGTTGC    800
AGTGAGCATC TTCGAGTTGG CTTTCATCCC CGTGACGTTC CCCATTTACG    850
TCTACTACTT TGATTTCAAC TGGGTCACGA GAATCTTCCT GTTCCTGCAC    900
TCCGTGGTGT TTGTTATGAA GAGCCACTCG TTTGCCTTTT ACAACGGGTA    950
TCTTTGGGAC ATAAAGCAGG AACTCGAGTA CTCTTCCAAA CAGTTGCAAA    1000
AATACAAGGA ATCTTTGTCC CCAGAGACCC GCGAGATTCT GCAAAAAAGT    1050
TGCGACTTTT GCCTTTTCGA ATTGAACTAC CAGACCAAGG ATAACGACTT    1100
CCCCAACAAC ATCAGTTGCA GCAATTTCTT CATGTTCTGT TTGTTCCCCG    1150
TCCTCGTGTA CCAGATCAAC TACCCAAGAA CGTCGCGCAT CAGATGGAGG    1200
TATGTGTTGG AGAAGGTGTG CGCCATCATT GGCACCATCT TCCTCATGAT    1250
GGTCACGGCA CAGTTCTTCA TGCACCCGGT GGCCATGCGC TGTATCCAGT    1300
TCCACAACAC GCCCACCTTC GGCGGCTGGA TCCCCGCCAC GCAAGAGTGG    1350
TTCCACCTGC TCTTCGACAT GATTCCGGGC TTCACTGTTC TGTACATGCT    1400
CACGTTTTAC ATGATATGGG ACGCTTTATT GAATTGCGTG GCGGAGTTGA    1450
CCAGGTTTGC GGACAGATAT TTCTACGGCG ACTGGTGGAA TTGCGTTTCG    1500
TTTGAAGAGT TTAGCAGAAT CTGGAACGTC CCCGTTCACA AATTTTTACT    1550
AAGACACGTG TACCACAGCT CCATGGGCGC ATTGCATTTG AGCAAGAGCC    1600
AAGCTACATT ATTTACTTTT TTCTTGAGTG CCGTGTTCCA CGAAATGGCC    1650
ATGTTCGCCA TTTTCAGAAG GGTTAGAGGA TATCTGTTCA TGTTCCAACT    1700
GTCGCAGTTT GTGTGGACTG CTTTGAGCAA CACCAAGTTT CTACGGGCAA    1750
GACCGCAGTT GTCCAACGTT GTCTTTTCGT TTGGTGTCTG TTCAGGGCCC    1800
AGTATCATTA TGACGTTGTA CCTGACCTTA TGA                      1833
2)SEQ ID NO：2的信息：
i)序列特征：
A)长度：610个氨基酸
B)类型：氨基酸
D)拓扑结构：线性
ii)分子类型：蛋白质
iii)序列描述：SEQ ID NO：2
Met Thr Glu Thr Lys Asp Leu Leu Gln Asp Glu Glu Phe Leu Lys Ile
  1               5                  10                  15
Arg Arg Leu Asn Ser Ala Glu Ala Asn Lys Arg His Ser Val Thr Tyr
             20                  25                  30
Asp Asn Val Ile Leu Pro Gln Glu Ser Met Glu Val Ser Pro Arg Ser
         35                  40                  45
Ser Thr Thr Ser Leu Val Glu Pro Val Glu Ser Thr Glu Gly Val Glu
     50                  55                  60
Ser Thr Glu Ala Glu Arg Val Ala Gly Lys Gln Glu Gln Glu Glu Glu
 65                  70                  75                  80
Tyr Pro Val Asp Ala His Met Gln Lys Tyr Leu Ser His Leu Lys Ser
                 85                  90                  95
Lys Ser Arg Ser Arg Phe His Arg Lys Asp Ala Ser Lys Tyr Val Ser
            100                 105                 110
Phe Phe Gly Asp Val Ser Phe Asp Pro Arg Pro Thr Leu Leu Asp Ser
        115                 120                 125
Ala Ile Asn Val Pro Phe Gln Thr Thr Phe Lys Gly Pro Val Leu Glu
    130                 135                 140
Lys Gln Leu Lys Asn Leu Gln Leu Thr Lys Thr Lys Thr Lys Ala Thr
145                 150                 155                 160
Val Lys Thr Thr Val Lys Thr Thr Glu Lys Thr Asp Lys Ala Asp Ala
                165                 170                 175
Pro Pro Gly Glu Lys Leu Glu Ser Asn Phe Ser Gly Ile Tyr Val Phe
            180                 185                 190
Ala Trp Met Phe Leu Gly Trp Ile Ala Ile Arg Cys Cys Thr Asp Tyr
        195                 200                 205
Tyr Ala Ser Tyr Gly Ser Ala Trp Asn Lys Leu Glu Ile Val Gln Tyr
    210                 215                 220
Met Thr Thr Asp Leu Phe Thr Ile Ala Met Leu Asp Leu Ala Met Phe
225                 230                 235                 240
Leu Cys Thr Phe Phe Val Val Phe Val His Trp Leu Val Lys Lys Arg
                245                 250                 255
Ile Ile Asn Trp Lys Trp Thr Gly Phe Val Ala Val Ser Ile Phe Glu
            260                 265                 270
Leu Ala Phe Ile Pro Val Thr Phe Pro Ile Tyr Val Tyr Tyr Phe Asp
        275                 280                 285
Phe Asn Trp Val Thr Arg Ile Phe Leu Phe Leu His Ser Val Val Phe
    290                 295                 300
Val Met Lys Ser His Ser Phe Ala Phe Tyr Asn Gly Tyr Leu Trp Asp
305                 310                 315                 320
Ile Lys Gln Glu Leu Glu Tyr Ser Ser Lys Gln Leu Gln Lys Tyr Lys
                325                 330                 335
Glu Ser Leu Ser Pro Glu Thr Arg Glu Ile Leu Gln Lys Ser Cys Asp
            340                 345                 350
Phe Cys Leu Phe Glu Leu Asn Tyr Gln Thr Lys Asp Asn Asp Phe Pro
        355                 360                 365
Asn Asn Ile Ser Cys Ser Asn Phe Phe Met Phe Cys Leu Phe Pro Val
    370                 375                 380
Leu Val Tyr Gln Ile Asn Tyr Pro Arg Thr Ser Arg Ile Arg Trp Arg
385                 390                 395                 400
Tyr Val Leu Glu Lys Val Cys Ala Ile Ile Gly Thr Ile Phe Leu Met
                405                 410                 415
Met Val Thr Ala Gln Phe Phe Met His Pro Val Ala Met Arg Cys Ile
            420                 425                 430
Gln Phe His Asn Thr Pro Thr Phe Gly Gly Trp Ile Pro Ala Thr Gln
        435                 440                 445
Glu Trp Phe His Leu Leu Phe Asp Met Ile Pro Gly Phe Thr Val Leu
    450                 455                 460
Tyr Met Leu Thr Phe Tyr Met Ile Trp Asp Ala Leu Leu Asn Cys Val
465                 470                 475                 480
Ala Glu Leu Thr Arg Phe Ala Asp Arg Tyr Phe Tyr Gly Asp Trp Trp
                485                 490                 495
Asn Cys Val Ser Phe Glu Glu Phe Ser Arg Ile Trp Asn Val Pro Val
            500                 505                 510
His Lys Phe Leu Leu Arg His Val Tyr His Ser Ser Met Gly Ala Leu
        515                 520                 525
His Leu Ser Lys Ser Gln Ala Thr Leu Phe Thr Phe Phe Leu Ser Ala
    530                 535                 540
Val Phe His Glu Met Ala Met Phe Ala Ile Phe Arg Arg Val Arg Gly
545                 550                 555                 560
Tyr Leu Phe Met Phe Gln Leu Ser Gln Phe Val Trp Thr Ala Leu Ser
                565                 570                 575
Asn Thr Lys Phe Leu Arg Ala Arg Pro Gln Leu Ser Asn Val Val Phe
            580                 585                 590
Ser Phe Gly Val Cys Ser Gly Pro Ser Ile Ile Met Thr Leu Tyr Leu
        595                 600                 605
Thr Leu
    610