植物种子和幼苗在萌发早期容易受到不同土壤植物病原性真菌的 感染，特别是土壤中含有一组真菌的腐霉(Pythium)复合体，它们会 导致严重的作物减产和经济损失。在园艺和农业土壤中腐霉是最占优 势的微生物集落。几乎世界上所有开垦的土地都可能含有至少一种腐 霉的孢子。真菌中的腐霉常常是作物根部的坏死营养型寄生物，也能 腐生生长。
目前，市场上有一些杀真菌剂。化学杀真菌剂尽管十分有效，但 可能会对环境造成不应有的污染，由于大多数种类对人类健康有害， 操作时需十分小心，并且这类药剂对于产生抗性的病原菌株也无效。
与其它防治方法相比，使用生物防治剂或生物杀虫剂可能更加有 效或有益，所以此类制剂已被广泛试用。已知有些细菌和真菌菌株对 各种微生物致病剂的生长有抑制作用。为了达到在田间有效使用的要 求，药剂必须稳定，在田间的使用效果有重复性，并且能够在田间条 件下应用。到目前为止，只有极少数药剂能达到这些要求而被用作商 品。
其中一种产品就是用绿针假单胞菌(Pseudomonas chlororaphis) 菌株MA342(NCIMB40616)防治种子植物的真菌疾病(PCT申请 WO95/28085，公开于1995年10月26日)。
发明概述
本项发明提供了一种新型有用的生物防治剂，可有效用于防治经 济作物受病原攻击，其特征在于是属于包括假单胞菌属之种的菌株 Ki72、Ab131、Ki353、MF416和Ma358(它们保藏于Aberdeen，Scotland 的国立工业及海洋细菌保藏有限公司(NCIMB)，保藏号分别为40936， 40940，40941，40942和41010)的组中的一种或多种菌株的分离物。 这些分离物按照布达佩斯公约的规则保藏。
本项发明还提供了植物疾病防治组合物，其中包含一种生物防治 剂作为活性成分，该生物防治剂是上述一种或多种菌株的分离物或其 生物纯培养物；或者是包括一种或多种上述分离物或其抗病原性活性 代谢物的培养液。而且，本项发明还提供了用发明的一种或多种菌株， 防治由病原性真菌引起的植物疾病的方法。此外提供了用本发明的生 物防治剂，防治由病原性真菌引起的植物疾病的应用。
附图简述
图1表明细菌菌株Ab131，MF416和Ki72对终极腐霉(Pythium ultimum)所致种子和幼苗疾病的作用。
DI＝患病指数(0＝健康，4＝100％感染的根部)
图2表明细菌菌株Ab131，Ki72及杀真菌剂1996年在田间条件 下对糖相对产量的影响。 杀真菌剂：Eup＝抑菌灵(Euparen)(对甲抑菌灵)
      Tach＝土菌消(Tachigaren，Hymexazol) 杀虫剂：Montur＝吡虫啉+七氟菊酯
图3表明细菌菌株Ki72、Ki353及杀真菌剂1997年在田间条件 下对糖相对产量的影响。 杀真菌剂：Tach.＝土菌消    Eup.＝对甲抑菌灵 杀虫剂：Montur＝吡虫啉+七氟菊酯
图4表明菌株Ki353和MF416及杀真菌剂1998年在田间条件下 对植物数目的影响。 杀真菌剂：土菌消     TMTD＝Tiram 杀虫剂：Montur＝吡虫啉+七氟菊酯
                      发明详述
一方面，本项发明涉及一种用于防治由病原性真菌引起的植物疾 病的新型生物防治剂，其特征在于是属于包括假单胞菌属之种的菌株 Ki72、Ab131、Ki353、MF416和Ma358(它们保藏于Aberdeen，Scotland 的国立工业及海洋细菌保藏有限公司(NCIMB)，保藏号分别为40936， 40940，40941，40942和41010)的组中的一种或多种菌株的分离物； 或者是其生物学纯培养物或其与亲本菌株具有基本相同特征的突变 体。
另一方面，本发明涉及防治由病原性真菌引起的植物疾病的组合 物，其特征是含有如上定义的生物防治剂，或含有其抗病原活性代谢 物的培养液，或含有这样的抗病原活性代谢物作为活性成分。
在本发明的一个优选实施方案中，待被保护以免受病原侵袭的植 物是甜菜。
病原性真菌优选属于腐霉属之种(Pythium sp.)或丝囊霉属之种 (Aphanomyces sp.)的真菌，尤其是终极腐霉。
而且，本发明所涉及的生物防治剂及组合物预计可用于其它象蔬 菜等经济作物(如番茄)，特别是受腐霉属之种真菌攻击的作物。
另外，本发明涉及一种防治由病原性真菌引起的植物疾病的方法， 包括将有效剂量的抗病原活性生物防治剂导入待抑制疾病的环境中， 本方法的特征在于应用上述的生物防治剂或组合物。
本发明的生物防治剂可用于种子、幼苗、植物营养繁殖单位、植 株或植株部分或者土壤。
根据本发明又一方面，提供了上述生物防治药剂或组合物用于防 治病原性真菌，特别是腐霉属之种类真菌引起的植物疾病的用途。
以下是本发明中新细菌菌株的特征，并描述了菌株增殖以及在田 间或温室制剂制备和应用的优选方法。提供一些实例进一步阐明本发 明的方法和组合物，但范围不限于此。
新细菌菌株的特征
菌株可以用表1所示生化测试鉴定。
分离物 NO3 ：  TR P GL AD H UR E ESC GEL PN GL U A R M MAN NA G MA L GNT CAP AD I ML T CIT PAC OX Ab 131 - - - + - - + - + + + + + - + + - + + - + Ki72 - - - + - - + - + + + + + - + + - + + - - MF 416 - - - + - - + + + + + + + + + + - + + - + Ki 353- -    +       +   - -      + - +    + + +      + -      +    +      +    +    + -    + 分离物 NO3 - TR P GL ADH UR E ESC GEL PN GL U AR M MAN NAG MA L GNT CAP AD I ML T CIT PAC OX Ma 358   - - -   +  - -   + -   +   + +     +     + -     +     + -     +     +  -   +
表1各菌株进行API20NE快速测定结果，以下为注释 NO3＝硝酸盐还原作用     TRP＝吲哚产生        GL＝葡萄糖产酸 ADH＝精氨酸双水解酶     URE＝脲酶            ESC＝七叶苷水解 GEL＝明胶水解           PN＝B-半乳糖苷酶     GLU＝葡萄糖同化 ARA＝阿拉伯糖同化       M＝甘露糖同化        MAN＝甘露醇同化 NAG＝N-乙酰葡糖胺同化   MAL＝麦芽糖同化      GNT＝葡糖酸同化 CAP＝癸酸盐同化         ADI＝己二酸盐同化    MLT＝苹果酸盐同化 CIT＝柠檬酸盐同化       PAC＝苯基乙酸盐同化  OX＝细胞色素氧化酶 菌株增殖及制剂制备和在田间或温室应用的优选方法
获得大量抗病原活性菌株最好通过培养方法进行，该方法包括在 包含合适的液体培养基的摇瓶或发酵罐中接种所述菌株的纯培养物样 品。菌株也可在无菌表面如琼脂表面上生长，当菌落长出时，可将细 胞重悬于水或本领域公知的其它液体培养基中。培养基在原则上可以 是本领域公知的任何细菌生长培养基。发酵培养至足够的菌体浓度， 如达到5-109cfu(菌落形成单位)/ml液体培养基。如此获得的发酵液 或菌悬液即可在植物保护中应用，或者先经过处理或制剂再进行使用。
一种类型的处理中，可以通过例如加热灭活或者离心处理发酵培 养液中的菌体细胞，含有细菌代谢物的培养液或上清，经或不经过预 先的纯化和/或浓缩，均可用于保护植物。菌体悬液或发酵培养液还可 以与本领域公知的一种或几种化合物或化合物组均匀混合，前提条件 是这些化合物与这些细菌菌株、其抗病原活性代谢物或它们的衍生物 相容。适合的化合物可以为粉状添加剂或固体载体，例如滑石、高岭 土、膨润土、蒙脱石，本领域公知的可湿粉末、碳源营养物质(如葡 萄糖、蔗糖和果糖)或者细菌混合营养物(如酵母提取物、细菌蛋白 胨和胰蛋白胨)、金属盐类、脂肪酸盐、脂肪酸酯、离子或非离子表面 活性剂、植物营养成分、植物生长调节剂、杀真菌剂、杀虫剂、杀菌 剂等等。在与合适的化合物混合之前或之后，细菌悬浮物和发酵肉汤 也可经过干燥或冷冻干燥，获得的产品可用于植物保护。一种合适的 干燥方法是例如将蛭石与细菌发酵液混合，经过空气干燥。
可以采用已知用细菌菌株处理种子、植物营养繁殖单位、植株和 土壤与菌株的任何方法应用菌体和代谢产物制剂。根据预定的目标和 主要的环境状况可选择使用喷洒、喷雾、撒粉、播散、造粒、浸渍或 倾倒。应用的有利比率，对于种子处理一般为1011-1012cfu/ha，喷洒 为1012-1014cfu/ha，或相应的细菌代谢物量。
实施例1
本发明细菌菌株的分离
所挖不同植物物种的根用无菌自来水清洗去除附着的泥土。在无 菌条件下，从幼根剪断下2-3厘米的小段并进行处理。选取的是根尖 上方区的一部分。用烧过的解剖刀在根段上切几个小切口，然后将根 段置于TSA10琼脂(Tryptic Soy Agar Oxoid Ltd.，10g/litre) 平板上摩擦。平皿在0℃放置9天，菌落长出后，挑取菌落，在TSA10 培养基中5℃培养5天。
实施例2
菌株的保藏
纯培养物用小安瓿管冻存于-70℃，冻存液为经高压灭菌的10 ％甘油(用自来水配制，调pH至7.15)。安瓿管在-70℃冻凝后， 转至-20℃。
为了长期保藏，将分离物冻干。在TSA10琼脂(Tryptic Soy Agar Oxoid Ltd.，10g/litre)上生长48小时后，将菌苔从琼脂表面上 刮下，与冻干剂(Dextran T70，Pharmacia Fine Chemicals Ltd.， 50g；Na-L-glutamate，Kebo AB，50g；1000ml蒸馏水)混合，注入 小安瓿管(20ml)中，在Hetoscicc冻干机(Heto Ltd.，Denmark) 中放置24小时，冻干后用橡胶塞密封住安培管口，4℃保藏。
实施例3
抗腐霉活性成分的初筛
接种物制备
从感染的甜菜根部分离终极腐霉，在PDA(Potato Dextrose Agar)中培养生长。待琼脂板中长出真菌后，将其浸解入花盆内 (13×12×7cm)，其中盛有2/3体积的混有20％(v/v)沙的市售 泥炭混合物(Enhetsjord K Normal)(未经灭菌)。在花盆1cm深 的位置种上50粒甜菜种子，花盆置于空调室中，培养条件如下： 每天17℃光照16小时，14℃黑暗培养8小时。4周后，花盆中的 土壤可作为接种物(0.2％w/w)感染土壤，进行初步筛选实验。
细菌的生产
用于甜菜种子的细菌处理如下：将在TSA10琼脂中15℃培养 24小时的培养物从直径9cm的Petri平皿中刮取，与15ml自来水 混合，用此混合物喷洒种子。30分钟后，倒掉多余的混合物，种子 过夜干燥。
在初筛中，在置于上述相同条件下的花盆中种植了16粒种子。 4周后，对植物计数，并评价根部是否受腐霉的感染。
细菌菌株对腐霉作用的温室实验
用上述相同条件在空调室进行生物测定。图1显示了对照(种 在终极腐霉感染土壤的未经处理的种子)、健康土壤(种在健康土 壤中的未处理种子)及用细菌菌株处理的种子三种情况下细菌菌株 对病症的防治作用。
细菌菌株对腐霉作用的田间实验
实例
在1996和1997年，细菌菌株Ki72，Ab131用于田间实验；1998 年细菌菌株MF416和Ki353用于田间实验。通过土壤实验确定真菌 病原体的高负载量。田间实验是在6个不同区域进行的，在每个区 域随机区组划分设4个平行组。所有实验的样地面积为6行×12 米。图2显示了对照、细菌菌株+杀虫剂两个处理组和两种不同杀 真菌剂+杀虫剂一个处理组的糖相对产量。
图3所示为1997年田间实验中，菌株Ki72和Ki353与杀真菌 剂对糖相对产量的影响。
图4所示为对照、两种杀真菌剂+杀虫剂、Ki353、Ki353+杀虫 剂、MF416和MF416+杀虫剂几种情况下，菌株Ki353和MF416与杀 真菌剂对糖相对产量的影响。
1996、1997、1998年细菌菌株和杀真菌剂田间实验中对糖相对 产量的影响。
1996、1997、1998年细菌菌株和杀真菌剂田间实验中对糖相对 产量的影响如表2所示： 处理 1996年        1997年         1998年 糖相对产量    糖相对产量    糖相对产量 未处理对照 Eup.+Tach.+ Montur Ab131+Montur L18 L18+Montur Ki72+Montur MF416 MF416+Montur Ki353 Ki353+Montur Ma358 Ma358+Montur 100           100           100 106           111           119*   103            -            - -              -            107 -              -            109 105            106           - -              -            114 -              -            114 -              -            112 107            111          121 -               -           120 -              109          115 *TMTD代替Eup 杀真菌剂：Eup＝抑菌灵(对甲抑菌灵)，Tach＝土菌消
      TMTD＝Tiram 杀虫剂：Montur＝吡虫啉+七氟菊酯 -＝未测试
微生物保藏 已根据布达佩斯条约做了如下保藏： 微生物  保藏机构    保藏日    保藏号 Ki72     NCIMB     30March1998   40936 Ab131    NCIMB     30March1998   40940 Ki353    NCIMB     30March1998   40941 MF416    NCIMB     30March1998   40942 Ma358    NCIMB     10March1999   41010