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生物防治
申请号 CN201710958978.2 申请日 2013-03-05 公开(公告)号 CN108018309A 公开(公告)日 2018-05-11
申请人 奥西泰克有限公司; 发明人 L·阿尔菲;
摘要 提供的是一种适于在节肢动物雄性生殖系中条件表达效应物基因的节肢动物雄性生殖系基因表达系统。所述系统包括第一表达单元，所述第一表达单元包含效应物基因和与其可操作连接的用于其的启动子；和第二表达单元。所述第二单元包含转录因子的编码序列和可操作连接于其的上游调控元件，所述转录因子能够作用于第一表达单元中的启动子上以驱动所述效应物基因的表达。所述上游调控元件包括转录因子的启动子；和临近转录因子编码序列起始位点的5’UTR。上游调控元件驱动转录因子足量表达，从而转录因子蛋白转而在减数分裂前驱动效应物基因的转录。还提供的是所述系统例如在生物防治和质量控制方法中的用途。
权利要求

1.一种适于在节肢动物雄性生殖系中条件表达效应物基因的节肢动物雄性生殖系基因表达系统，所述系统包括：-第一表达单元，所述第一表达单元包含效应物基因和与其可操作连接的用于其的启动子；

-第二表达单元，所述第二表达单元包含转录因子的编码序列和可操作连接于其的上游调控元件，所述转录因子能够作用于第一表达单元的启动子上以驱动效应物基因的表达，所述上游调控元件包括：-转录因子的启动子；和

-临近转录因子编码序列起始位点的5’UTR；

所述上游调控元件驱动转录因子的足量表达，从而转录因子蛋白转而在减数分裂前驱动效应物基因的转录。

2.根据权利要求1所述的基因表达系统，其中所述转录因子是转录激活剂，如tTA，GAL4或它们的变体。

3.根据任一项在前权利要求所述的基因表达系统，其中所述效应物是核酸内切酶，最优选为3-锌指核酸酶。

4.根据任一项在前权利要求所述的基因表达系统，其中第一表达单元的启动子是最小启动子。

5.根据任一项在前权利要求所述的基因表达系统，其中第二表达单元中上游调控元件的启动子大多来自topi，aly或β-2微管蛋白(B2T)或其同源物。

6.根据任一项在前权利要求所述的基因表达系统，其中第二表达单元的上游调控元件中的5’UTR是来自hsp83，优选来自地中海果蝇或hsp83的同源物，特别是在目标节肢动物中发现的hsp83同源物的5’UTR。

7.根据任一项在前权利要求所述的基因表达系统，其中使用Ga14-UAS系统，从而转录因子是GAL4。

8.根据权利要求1-6任一项所述的基因表达系统，其中所述系统是诱导型系统，其中诱导通过提供化学实体发生，如通过提供四环素发生，或通过提供四环素的类似物之一发生，所述四环素的类似物包括多西环素。

9.根据权利要求8所述的基因表达系统，其中第二表达单元中的转录因子是tTA或其变体(tTAV，tTAV2，tTAV3)。

10.根据任一项在前权利要求所述的基因表达系统，其中第二表达单元的转录因子是tTA或变体并且所述第一表达单元包括tet操纵子(tetO)。

11.根据任一项在前权利要求所述的基因表达系统，其中所述节肢动物是昆虫，优选双翅目(Dipteran)，包括实蝇科(Tephritid)，如地中海果蝇或橄榄果蝇。

12.根据任一项在前权利要求所述的基因表达系统，其中所述效应物是核酸酶并赋予或给予父本效应致死性。

13.一种在性腺或精子中表达效应物蛋白的方法，所述方法包括用根据任一项在前权利要求的表达系统转化所述性腺。

14.一种群体控制的方法，所述方法包括在雄性节肢动物的性腺中表达根据权利要求

1-12任一项所述的表达系统的效应物蛋白。

15.一种抗性管理方法，所述方法包括使用根据权利要求1-12任一项所述的表达系统。

16.一种质量控制方法，所述方法包括：包括报道分子如荧光蛋白作为根据权利要求1-

12任一项所述的表达系统中的效应物蛋白，或在根据权利要求1-12中任一项的表达系统中的效应物蛋白之外包括报道分子如荧光蛋白，从而来自所述系统的表达被诱导或去抑制的个体在合适波长的光下变得可见。

17.一种确定雌性节肢动物的交配状况的方法，所述方法包括在转基因雄性群体中使用根据权利要求1-12任一项所述的表达系统，其中所述系统包含标记如荧光报道蛋白；并且精子存在时，测定雌性中所述标记的存在；标记的存在表示雌性已经与携带所述系统的转基因雄性交配。
说明书全文

生物防治

[0001] 本申请是国际申请号PCT/EP2013/054417，国际申请日2013年03月05日，中国申请号201380023783.9，发明名称为“生物防治”的专利申请的分案申请。发明领域
[0002] 本发明涉及一种能够在节肢动物，特别是昆虫中提供不育的，但竞争性的精子的表达系统，以及其在所述节肢动物的生物防治(群体控制)，质量控制和性选择的方法中的用途。
[0003] 引言
[0004] 经济重要的，对于世界的某些部分起初是本地的虫害，现在通过国际贸易和人的活动广泛分布。此种害虫发展为巨大的群体并且在世界范围内对水果和蔬菜产生破坏性侵染。可能的控制方法是广泛的，包括诱饵喷洒，直接喷洒杀虫剂，生物防治，病虫害综合治理(IPM)方法和不育昆虫技术(sterile insect technique，SIT)(Malacrida等人，2007)。然而，目前的防治方法，绝大多数依赖于化学杀虫剂的使用。直接或诱饵喷洒二者都具有由于蜜蜂的减少导致授粉减少的能力，和使动物或人中毒的能力。另一方面，SIT是环境友好，物种特异的害虫防治方法。其依赖于大量不育雄性的大量饲养、绝育和释放，所述不育雄性与野生的雌性交配，引起后代中野生群体的减少(Dyck等人，2005；Knipling，1955)。如果将足够的不育雄性释放足量时间，目标群体将瓦解。
[0005] SIT依赖于辐射以绝育目标害虫物种，但这对释放的昆虫具有负面影响(Alphey，2002；Alphey，2007；Alphey等人，2007)。辐射影响昆虫的所有细胞，不仅是配子，并且因此对释放的昆虫一定程度的损害不可避免，可能对其性能具有负面影响(例如寿命或交配竞争性)。辐射-绝育需要在发育晚期进行，限制了对释放的选择。而且，辐射仪器相对大和昂贵(获得或运行)，并趋向于产生对于一些方案可能不利的集中程度。最后，由于有关这些仪器中放射性同位素的大量存在的安全性考虑，已经是SIT计划至今的主要支柱的基于同位素的辐射器变得越发不受欢迎。
[0006] 特别是对于蚊子，过去已经尝试了辐射的备选方案。这些包括化学绝育和通过使用细胞质不相容性(cytoplasmic incompatibility(CI，由沃尔巴克体(Wolbachia)诱导))绝育，但这些各个具有其自身的缺点。化学不育剂倾向于为毒性或诱变化合物，导致对工人和环境安全的问题。基于沃尔巴克体(Wolbachia)的系统依赖于自然环境中缺乏任何相当的沃尔巴克体(Wolbachia)感染的雌性(其可能不是这样的)，并且还需要不释放此种雌性；此种严格的雌雄分离可能难以实现。可以通过使用重组DNA方法克服这和其它与目前的SIT相关的其它问题(Morrison等人，2010；Franz & Robinson，2011)。
[0007] 已经建议了辐射-绝育的转基因备选方案，称为携带显性致死因子昆虫的释放(RIDL：(Alphey，2002；Alphey，2007；Alphey和Andeasen，2002；Alphey等人，2010；Alphey等人，2007；Alphey和Thomas，1999；Thomas等人，2000)。在该系统中，改造昆虫以携带显性可抑制致死基因或遗传系统。将这些释放到野外；野生昆虫和经遗传获得RIDL基因或构建体拷贝的RIDL昆虫之间交配的后代将倾向于死亡。可以设计RIDL系统以杀灭经遗传获得它的所有后代或仅一个性别。还可以设计以杀灭发育的特定阶段的受影响的昆虫；在一些物种，例如一些蚊子(Phuc等人，2007)中，这可以具有显著的优势。已经在很多害虫物种中构建了RIDL系统(例如Fu等人，2007；Gong等人，2005；Phuc等人，2007)。可以在WO 01/39599中找到RIDL系统方面的进一步信息。
[0008] 我们的雌性致死RIDL技术(雌性-特异RIDL，fsRIDL)在分离性别方面高度有效，甚至有时差不多100％有效，并且成功地在实验室、温室和半现场(semi-field)实验中测试。RIDL可由在有或无辐射的情况下使用以产生有效产物。
[0009] 尽管事实上该技术对于许多害虫上的SIT实施提供相当大的优势，比如果蝇；地中海果蝇(Ceratitis  capitata)，橄榄果蝇(Bactrocera oleae)和墨西哥按实蝇(Anastrepha ludens)，鳞翅目(Lepidoptera)；红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella)和菜蛾(Plutella xylostella)和蚊子；埃及伊蚊(Aedes aegypti)和白纹伊蚊(Aedes albopictus)，并且可以各自被使用，在某些市场中，辐射仍然可以是绝育方法。这是因为，在至今描述的雌性-特异的RIDL株中，F1雄性是完全可存活的并且雌性在幼虫期(即卵孵化后)被消除。此外，通过提供遗传绝育(或赋予遗传绝育的特性)将显著缓解常规途径和公众接受度。雄性中的遗传绝育会有利地增强我们目前的“雌性致死”(fs-RIDL)株。
[0010] 因此，在本领域中存在在雄性中提供类似于SIT方法中的辐射效果的遗传绝育手段，而无放射的个体中相关的健康降低的表达系统的需求。
[0011] Crisanti等人，(Catteruccia等人，2009；Windbichler等人，2007；Windbichler等人，2008)已开发出核酸内切酶(IppO-1，也称为I-PpoI)连接于组成型结构基因，β-2微管蛋白的启动子的表达系统。本文中描述的其中该系统的许多问题，尤其是在达到其目的方面，实验总体上不成功。然而，对遗传绝育效果的时机能够发挥一定程度的控制也将是特别有用的。该控制在Crisanti系统中不存在。
[0012] 例如，人们可能想要允许在实验室中饲养携带表达系统的个体，但还想要系统在需要时，比如在释放时或释放前/后立即，激活或引发。换句话说，人们可能想要在特定点抑制系统的效果和/或诱导它。
[0013] 简言之，希望这种表达系统包括对表达系统的效果发挥控制的手段。此种控制常被称为“条件性，”从而包括该控制的系统为条件系统。条件表达系统例如在昆虫中(但不是在目前的遗传绝育情况下)已知。在任何情况下，这些条件系统不适于雄性生殖系表达。事实上，为了利用存在的条件系统，比如双重tet系统，人们不能简单地将它们包括在更大的雄性生殖系表达系统中。在雄性生殖系如此操作，对效应物(设计在所述生殖系实现遗传绝育)的控制表达无用。其原因复杂，但集中于由减数分裂引起的独特条件。
[0014] 尽管这样，我们意外地开发了用于在雄性生殖系中表达的合适系统。该系统能够提供就所述系统在生殖系中的表达产生不能形成可成活受精卵的精子这方面而言的遗传绝育。我们已经发现，可以利用条件系统比如tet的使用，但需要整个表达系统的显著全面检查。我们发现的系统巧妙地重复了SIT方法中的辐射效果，这是极为有利的。实质上，其允许产生雄性不育昆虫，而不采取使动物虚弱的辐射的使用。
[0015] 因此，我们展示了一种节肢动物表达系统，其包含通过可以使能够诱导条件遗传绝育，本文有时称为“精子致死性”的其它调节区域用于条件系统的合适效应物。然而，将理解优选的目的不是杀死精子本身或甚至阻止其生产，反而是产生不能传递其遗传信息的精子。然而，相反地，所述精子能够与野生型精子竞争或使受精卵不可成活(即阻止可成活受精卵的形成)。
[0016] 这通过提供条件的，和优选可抑制的，雄性不育解决上述问题，其通过允许产生从不能使卵受精以产生可成活受精卵或胚胎(其能够发展为不育成体)的意义上是缺陷的，但仍然能够进入或与卵接触以这种方式来排斥其它精子的精子起作用。
[0017] 可以在GB2404382A，GB2355459A，JP2008067678A，WO2009/016627A，WO2008/134068A，WC Black等人(Trends in Parasitology，362-370，第27卷，2011)，C Barreau等人(Development，1897-1902，第135卷，2008)，G Fu等人(Proc Natl Acad Sci USA，4550-
4554，第107卷，2010)和T Ant等人(BMC Biology，51，第10卷，2012)中找到进一步技术背景信息。
[0018] 发明概述
[0019] 因此，在第一个方面，本发明提供一种适于在节肢动物雄性生殖系中条件表达效应物基因的节肢动物雄性生殖系基因表达系统，所述系统包含：
[0020] -第一表达单元，所述第一表达单元包含效应物基因和可操作连接于其的用于其的启动子；
[0021] -第二表达单元，所述第二表达单元包含转录因子的编码序列和可操作连接于其的上游调控元件，所述转录因子能够作用于第一表达单元中的启动子以驱动效应物基因的表达，所述上游调控元件包括：
[0022] -转录因子的启动子；和
[0023] -临近转录因子编码序列翻译起始位点的5’UTR；
[0024] 所述上游调控元件驱动转录因子的足量表达，从而所述转录因子蛋白转而在减数分裂前驱动效应物基因的转录。
[0025] 所述转录因子优选为转录激活剂，比如tTA，GAL4或其变体。所述效应物优选为核酸内切酶，最优选为3-锌指核酸酶。第一表达单元的启动子优选为最小启动子。第二表达单元中上游调控元件的启动子最优选自topi，aly或β-2微管蛋白(B2T)或其同源物。所述同源物优选为在所述系统要表达于其中在目标节肢动物中发现的同源物。该启动子是雄性生殖系启动子，即其在雄性生殖系中作用于或激活转录。第二表达单元的上游调控元件中的5’UTR优选为来自hsp83，优选来自地中海果蝇(Medfly)或hsp83的同源物的5’UTR，特别是来自在目标节肢动物中发现的hsp83同源物(即所述系统要表达于其中的同源物)的5’UTR。备选地，所述5’UTR可以是来自B2T或其同源物的5’UTR，条件是所述5’UTR被修改以去除或改善野生型中包含的转录延迟信号的效果，特别是如果与B2T启动子组合使用时。
[0026] 所述第一或第二表达单元还可以包含增强子。第一和第二表达单元启动子之一或二者，尤其是最小启动子，可以考虑进一步包括增强子。
[0027] 可以在相同构建体内分开或一起提供所述表达单元。如果分开，那么所述表达系统可以包含分开的多个构建体。所述一个构建体或多个构建体优选为质粒。所述质粒可以包含转座子。所述转座子可以转而包含转座元件。转座子的实例可以包括piggyBac转座子。
[0028] 表达效应物基因的条件性质是其可以由使用者控制或否则受外界因素影响。此种因素可以是环境因素比如温度(例如在使用Gal4-UAS系统的情况中)，但最优选为化学实体，比如四环素或其类似物。可以在实验室控制温度，并且可以设想可以利用日或季节进程中的温度改变。然而，在一些实施方案中，这不是优选的，因为人们可能希望获得更精细程度的控制。在此种情况下，特别优选所述系统从为诱导型的和最优选为可抑制的意义上是条件性的。
[0029] 诱导型系统是已知的，例如可以使用GAL4-UAS设置，其中转录因子是GAL4并且第一表达包含(效应物基因编码序列外)GAL4结合的UAS区域(CGG-N11-CCG，其中N可以是任何碱基)，或优选为其寡聚物。如果第二表达单元中的上游调控元件包含合适启动子和5’UTR，那么Gal4转录因子的转录可以通过提供例如作用于Gal4转录因子的启动子(直接或间接，即引起转录被诱导)的肽或激素被诱导。
[0030] 在另一个优选的实例中，所述系统可以是诱导型系统，其中诱导通过提供化学实体，如四环素或包括多西环素的其类似物中一种发生。在此种情况下，可以使用rtTA(“反向tTA”)作为转录因子，例如，从而rtTA仅在四环素类似物比如多西环素的存在下结合DNA。rtTA描述于WO 2001/059088等中。在此情况下，提供四环素(即在饮食中)或类似物比如多西环素将允许rtTA转录因子在本系统中作用于第一表达单元并以此诱导本效应物基因的表达。
[0031] 然而，优选所述系统是可抑制的。一个优选的实例是第二表达单元中的转录因子是tTA或其变体(tTAV，tTAV2，tTAV3等)。这些结合DNA除非四环素(Tc)，或适当类似物存在。四环素将阻断tTA的DNA-结合，从而在tTA和第一表达单元的增强子之间不存在相互作用，因此，效应物基因不转录。因此，如公知的(参见例如本文提及的我们的RIDL发表)，可以将四环素提供在饮食中直到需要去抑制(即去除或缓解抑制)表达效应物基因的时候。在缺失四环素(或类似物比如多西环素)的情况下，比如野外释放后或在切换实验室中饮食时，效应物基因表达。
[0032] 因此，在一些实施方案中，优选所述系统为诱导型，但在其它特别优选的实施方案中，所述系统是可抑制的。
[0033] 两个表达单元优选为双重(条件的)表达系统的两个部分中的一个。优选的实例包括GAL4：UAS和各种tet系统。在第一种情况中，第二表达单元的转录因子优选为Gal4，同时所述第一表达单元优选包含用于GAL-4结合的UAS序列。还预想GAL4的合适变体，比如GAL4-VP16。
[0034] 一般而言，表达单元之一或二者可以包含增强子。然而，特别优选所述第一表达单元包含增强子。优选第二表达单元的转录因子是tTA或变体(即当本表达系统使用tet系统提供条件性)。当是这种情况时，那么第一表达单元优选包括tet操纵子(tetO)。tetO-微型启动子(tRE)元件是特别优选的。其一起提供第二表达单元上游调控元件的启动子和增强子元件。426-bp TRE启动子含有七个融合于微型巨细胞病毒(mini-CMV)启动子tetO 18聚体(参见例如M.Ghosh等人，Mol.Cell Biol.2004，24(23)10193)。
[0035] 尽管双重系统是优选的，其中以分开的构建体提供第一和第二表达单元，所述第一表达单元和第二表达单元也可以提供在相同构建体或质粒上。从而，本系统优选为一个质粒或由两个质粒组成。最优选所述两个表达单元作为单个质粒或载体转化，从而它们插入在基因组的相同位点。
[0036] 所述节肢动物优选为如下文进一步描述的昆虫。雄性生殖系将被理解为包括精子，从而所述系统能够在精子中表达所述效应物基因。
[0037] 在至少一些情况下，所述效应物赋予或给予父本效应致死性，即是“父本效应致死”遗传系统，或是“父本效应致死”遗传系统的部分。在此种系统中，后代(这里采用从精子进入卵的阶段，其在昆虫中可以不与膜融合同时)的死亡依赖于父本的基因型而不是受精卵(或可能的受精卵)的基因型。因此，例如，在显性父本效应致死系统中，来自杂合雄性与(纯合)野生型雌性交配的野生型后代中的至少一些将受影响。另外的合子效果当然是可能，并且预期在本发明内。对于此效应物，一些可能的作用模式是可能的和设想到的。例如，在一些实施方案中，所述效应物是或包含核酸酶。从而，通过我们称为“父本效应致死”实现不育。这里，将效应物表达(以提供功能核酸酶蛋白)于精子中。这可以导致精子中DNA受影响，从而受精的胚胎具有降低的存活几率；实质上，这是父本效应致死性可以实现所通过的机制的优选实例。还可能所述效应物蛋白进入卵，其中DNA切割也可以发生。然而，还预想到至少一些效应物转录本也可以从精子进入卵并且在卵中翻译。在这两种情况中，核酸酶效应物可以从而在卵以及精子中发挥其作用
[0038] 所述系统适于表达效应物，但将理解这还可以优选被称为‘能够如此表达’或‘适应于在雄性生殖系中表达效应物’。
[0039] 所述效应物基因将在下文进一步描述，但其优选为报道分子，比如标记，例如荧光蛋白比如GFP，YFP等等。然而，所述效应物基因更优选为核酸酶，其合适实例在下文提供。其最优选为既是核酸酶又是报道分子，例如核酸酶-荧光蛋白融合(其优选的实例包括公知的绿色荧光蛋白或黄色荧光蛋白)。
[0040] 本文中述及‘是’报道分子或核酸酶的基因，例如，将理解所述基因包括编码具有那种陈述的功能的蛋白的DNA或RNA。
[0041] 所述第一表达单元包含效应物基因。它还包含用于其的启动子并且所述启动子可操作连接于其。所述启动子因此适于驱动效应物基因的转录。如上文提到的，所述第一表达单元还可以包含增强子，或至少第二表达单元的转录因子的结合区域或序列(即由所述转录因子识别)。
[0042] 所述第二表达单元包含转录因子的编码序列。其还包含上游调控元件。这转而可操作连接于转录因子的编码序列，以致它可以驱动转录因子的转录。
[0043] 所述转录因子能够作用于第一表达单元中的启动子以驱动效应物基因的表达，尽管这当然可以通过增强子，即所述转录因子可以不直接作用在启动子上，而取而代之的是通过增强子。当然预想到其它调控元件比如对于5’帽，5’UTR，3’UTR和多聚腺苷酸尾的那些。
[0044] 为了驱动转录因子的转录，第二表达单元的上游调控元件包含启动子和5’UTR。这两种都需要仔细选择以提供效应物的足量表达。从而，第二表达单元(即在上游调控元件中)的启动子优选为来自β-2微管蛋白(B2T)的启动子。备选地，并且所述启动子更优选来自topi或aly。第二表达单元(即上游调控元件中)中的5’UTR优选为来自hsp83，例如来自地中海果蝇(Medfly)的5’UTR，但其也可以来自B2T。如果5’UTR和启动子二者都来自B2T，则一个或另一个必需被修改为翻译延迟信号被去除或改善。当然述及这些基因时包括其同源物。
[0045] 本文将5’UTR定义为与翻译起始位点(即最低限度地，翻译的ATG起始位点)5’相邻(即上游)的序列。其在真核生物中具有约150个碱基的中值长度并且优选延伸直到启动子，例如在ATG起始位点上游约50-500个碱基处。
[0046] 尽管第二表达单元中框架的主体可以来自B2T，即使B2T ORF以转录因子ORF替代，将理解第二表达单元的启动子和其5’UTR二者不能都是来自B2T的那些：至少需要将它们之一改变以在减数分裂发生前提供效应物转录本的足够积累。如果要使用B2T启动子，那么B2T 5’UTR必需是上文描述的修改/改善的形式，或其可以是来自hsp83的5’UTR。
[0047] 备选地，如果使用B2T 5’UTR，那么所述启动子必需是其它早期作用启动子。所需要的是对于第二表达元件的5’UTR和启动子的选择必须一起作用以在减数分裂发生前允许效应物转录本的足量积累。
[0048] 备选启动子的优选实例是topi和aly启动子。可以与一些5’UTR使用这些启动子。其序列的实例在下文提供。
[0049] 当对特定遗传元件比如启动子，增强子，5’UTR或甚至‘来自’某命名的基因的ORF进行引用时，将理解它实际上不意为将所述元件从引用的基因去除，其仅意为这是元件的来源。描述它的其它方式会是‘源自’。优选基因的物种来源与目标物种的来源相同。换句话说，在想要在地中海果蝇(Medfly)中表达本效应物的情况下，优选所述元件源自提到的基因的地中海果蝇(Medfly)同源物。然而，如果不这样，则果蝇(Drosophila)版本是优选的。
[0050] 事实上，优选偏好的递降次序是：
[0051] -(最优选)来自目标物种(其中效应物的表达是预想到的)；
[0052] -来自目标属(即来自相同属内的其它物种)；和最后
[0053] -(最不优选)来自目标科。
[0054] 原因是，优选的启动子的作用至少可以是跨物种非常良好保守的。例如，果蝇(Drosophila)启动子可以在地中海果蝇(Medfly)中不工作，因此来自相同基因的地中海果蝇(Medfly)同源物的启动子是优选的。然而，因为编码序列是良好保守的，(例如)在给定节肢动物中鉴定β-2-微管蛋白基因和因此通过常规方法鉴定地中海果蝇(Medfly)版本的合适启动子片段相对简单。
[0055] 通常在mRNA的转录起始上游1至2kb内鉴定合适启动子。尽管在本发明中该范围是优选的，一些雄性生殖系启动子可以短并且100-200bp的一段序列也是优选的，或者在mRNA的转录上游1-2kb窗内，或甚至mRNA的转录起始上游的100-200bp的一段序列。
[0056] 就序列保守性而言，关于5’UTR，应用类似的考虑，其中最初序列保守性低。因此，优选5’UTR来自与目标节肢动物相同的物种(例如按照上文实例)，如果目标是地中海果蝇(Medfly)，那么5’UTR优选为来自相同基因的地中海果蝇(Medfly)同源物的5’UTR(可如上文讨论的通过参考更高度保守的ORF鉴定)。鉴定和限定5’UTR的一种方式是其(作为RNA)与编码相应ORF，例如β-2微管蛋白的序列的5’端连接。
[0057] 在5’UTR和启动子二者的情况下，将很容易被鉴定用于本表达的序列是否不足量，因为将无转录因子表达，其可以通过通常方式测定，或通过提供将转录因子ORF连接于荧光蛋白来测试。
[0058] 优选地，第二表达单元的上游调控元件中的启动子是β-2-微管蛋白启动子。与本文描述的hsp835’UTR组合使用(第二表达单元的上游调控元件中)是最优选的。
[0059] 还优选上游调控元件中的启动子是topi启动子。为了帮助鉴定topi的同源物，我们在此提供topi ORF(参见下文)。进一步指导在Perzgasga等人(2004)中提供，例如，其通过引用并入本文并且描述了来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)，Drosophila pseudoobscura和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)的topi同源物，后者是特别优选的。
[0060] 备选地，优选上游调控元件中的启动子是aly启动子。Aly比topi表示更近的基因复制，因此不以如topi一样宽范围的物种中的雄性生殖系特异基因存在。尽管如此，在它存在的情况下，可以通过参考保守的ORF以与对于topi相同的方式容易地鉴定。aly ORF在下文提供。
[0061] 第二表达单元的转录因子优选为tTA或其变体并且第一表达单元包含tet操纵子(tetO)。tTA，tTAV，tTAV2和tTAV3的氨基酸序列在下文给出。
[0062] 因此优选第二表达单元的转录因子包含编码tTA或其变体，例如上文给出的那些的氨基酸序列中任一个的多核苷酸。如上文描述的，还优选所述转录因子是GAL4或其变体并且所述第一表达单元包含GAL4的UAS位点。
[0063] 对于tTA和Gal4二者，这优选包括与所述SEQ ID NOS(包括所述变体)中的一个在至少50个残基上具有(或编码)至少70％，至少90％或至少95％氨基酸序列‘同一性’或甚至更不严格的‘相似性’的任何序列。
[0064] 将理解转录因子识别序列(DNA，例如，转录因子结合的序列)的放置，不许在第一表达单元内并且不在ORF内。例如，以tetO和UAS二者，插入在例如ATG起始位点上游几千碱基内。它们通常置于启动子的几百个碱基内，但可以作用在几kb外。
[0065] 在任何情况中，优选所述启动子是最小启动子。为简单起见，与增强子一起，可以将{增强子+最小启动子}仅称为启动子。然后，增强子(转录激活剂结合位点，例如tetO或UAS)是定义的启动子的一部分。
[0066] 附图简述
[0067] 现在将参考以下附图描述本发明的某些实施方案，其中：
[0068] 图1是表示卵孵化率测定的设计的示意图；
[0069] 图2显示开和关四环素时OX4282-OX4104雄性不育的百分数；
[0070] 图3显示开和关四环素时OX4282-OX4458雄性不育的百分数；
[0071] 图4显示开和关四环素时OX4353雄性不育的百分数；
[0072] 图5显示开和关四环素时OX4353雌性不育的百分数；
[0073] 图6显示在OX4718-σ1系中可抑制的雄性特异不育；
[0074] 图7显示开和关四环素时OX4705橄榄果蝇(Olive fly)雄性不育的百分数；
[0075] 图8显示开和关四环素时OX4705雌性不育的百分数；
[0076] 图9显示OX4466株孵化率测定；
[0077] 图10显示OX4467-E1株孵化率测定；
[0078] 图11显示既携带topi-tTAV也携带tetO-Dm-鱼精蛋白-FokI等位基因的埃及伊蚊(Aedes aegypti)系的孵化率测定；
[0079] 图12显示既携带β2-微管蛋白-tTAV也携带tetO-Ae-鱼精蛋白-FokI等位基因的埃及伊蚊(Aedes aegypti)系的孵化率测定；
[0080] 图13显示与两株主要RIDL雌性致死系(OX3864A和OX3647Q)杂交的OX4353株；
[0081] 图14是OX3866的质粒图；
[0082] 图15是OX3867的质粒图；
[0083] 图16是OX3671的质粒图；
[0084] 图17是OX4112的质粒图；
[0085] 图18是OX4103的质粒图；
[0086] 图19是OX4104的质粒图；
[0087] 图20是OX3831的质粒图；
[0088] 图21是OX4458的质粒图；
[0089] 图22是OX4391的质粒图；
[0090] 图23是OX4286的质粒图；
[0091] 图24是OX3978的质粒图；
[0092] 图25是OX4275的质粒图；
[0093] 图26是OX4254的质粒图；
[0094] 图27是OX4371的质粒图。
[0095] 发明详述
[0096] 术语‘编码序列’和ORF可以在本文中相互替换使用。
[0097] 如上文解释的，在一个优选的实施方案中，精子不死亡(如术语‘精子致死性’可能意味着一些)。作为替代，精子中的某物杀死受精卵。当我们使用核酸酶时，这可能对精子DNA遗传损害，但也可能由精子携带的RNA或蛋白在受精后具有其效果(实质上，Burt/Crisanti已经提示这点以解释冈比亚按蚊(An.gambiae)中来自其X-shredder的雌性以及雄性胚胎的死亡，参见Windbichler等人2008，在前)。
[0098] 现有技术教导应该使用B2T基因(启动子和ORF)并用目的基因代替ORF。然而，我们发现这并不导致本文描述类型的条件系统。如果将系统做成条件的，我们发现必须对该设置进行显著改变。一个问题是一旦细胞进入减数分裂，转录关闭。尽管翻译仍然能够在减数分裂后的细胞中发生，进一步的转录不能发生(近期由Barreau等人(2008)描述了一些例外基因的减数分裂后的转录，但一般意义上是对的)。因此，如果想要表达目的蛋白(从所述目的基因)，比如效应物蛋白，那么必须在减数分裂前有效应物基因的足量表达(以提供相应的效应物RNA)。由“效应物RNA”，其意为RNA，例如mRNA，编码(其当翻译和任选地翻译后修饰时，(如果是融合蛋白)切割，和/或折叠)以提供作为效应物蛋白行使功能的氨基酸序列。
[0099] 在本发明的范围内，“足够”提供转录本或蛋白涉及与所述转录本或蛋白的数量和时机二者。因此，当应用于效应物基因时，其意为本系统确保至少效应物蛋白的转录本在减数分裂(时机)前产生和由此提供足量的所述转录本以实现所需蛋白功能。将理解这包括蛋白表达中的所有临时事件，比如转录本的任选加工，翻译转录本为具有初级结构和其任选修饰的氨基酸序列，和提供二级、三级和甚至四级结构(例如在二聚体的情况中)。
[0100] 然而，当使用条件系统时，现有技术系统不能提供要有效的足够功能效应物蛋白。这主要被认为是由于此种条件系统不仅需要转录和翻译效应物蛋白，而且还需要转录和翻译用作对效应物蛋白的转录因子(调控单元)的控制因子蛋白。在减数分裂前，完全没有进行转录、翻译和蛋白功能，然后进一步转录的完整周期的所有步骤另外需要的时间。换句话说，如果，如这里的情况，所述条件系统使用转录因子，那么该转录因子自身需要被转录和翻译以提供功能转录因子蛋白。该转录因子蛋白必须随后转而作用于效应物基因(编码效应物蛋白)的调控元件，从而在减数分裂之前在各细胞中存在效应物转录本的足够积累，以在减数分裂之后在各细胞中及时允许效应物转录本翻译。
[0101] 我们发现的是仅以编码转录因子的ORF代替现有技术系统中的ORF是全然不够的。作为替代，本领域中的B2T启动子区域也必须被修改或完全替代，从而所述系统可以在减数分裂前产生足够的效应物转录本以在减数分裂后具有功能(翻译的)蛋白。因此，在我们的新条件系统中，需要新上游调控元件(比如启动子和/或5’UTR)以驱动转录因子ORF的表达。
所述新上游调控元件必须在精子自然发生中足够早地作用以产生足够的转录因子功能蛋白，以转而作用于调控元件，控制效应物的表达并从而在减数分裂发生和转录关闭前产生足够的效应物转录本。在条件系统的情况下能够实现它是本发明的特定优势。
[0102] 效应物蛋白(即由效应物基因编码的功能蛋白)最优选在减数分裂后对精子使卵受精以产生可成活受精卵的能力具有有害效果。
[0103] 所述系统优选从其在精子中引起的不育是显性的意义上为显性的。这是父本效应致死性的概念的引入点，进一步参见下文。由优选的效应物比如核酸酶引起的遗传不育优选为在雄性中显性，从而所有来自杂合雄性的精子都受影响。将理解这不是关键的，因为我们预期释放纯合雄性，但是是优选的。这与如常规RIDL的情况中的受精卵中显性是相反的。在这些现有技术系统中，一个拷贝(与精子一起继承)足以杀死受精卵，当然，由携带野生型等位基因的精子(来自杂合雄性)受精的卵不受影响。
[0104] 节肢动物优选为昆虫并且在本文对昆虫和非昆虫节肢动物二者都提供合适实例。然而，节肢动物特别优选为蚊子，特别是能够传染疟疾或登革热的物种的，或农业害虫，比如果蝇。
[0105] 本系统表达于其中的节肢动物是雄性节肢动物并且表达发生在其雄性生殖系细胞，特别是性腺，即精巢，精子在那里自然发生。此外，或备选地，表达可以在精子自身中发生。优选，所述表达发生在大多数所述细胞(即至少50％的所述细胞)中，但它可以更高，例如至少80％，至少90％，至少95％或最优选99-100％的所述细胞。
[0106] 因此，所述表达系统能够适应于或适于在节肢动物的雄性生殖系中表达基因。这里由“基因”，主要意为蛋白。换句话说，该表达系统的功能是在节肢动物雄性生殖系(生殖系细胞)中表达蛋白。该表达的时机是关键的并且在别处进一步讨论，但它必须足以使精子不能让卵受精以产生可成活受精卵。理想地，所述表达系统自身是，或包含在，即通过转化，能够在节肢动物雄性生殖系中表达的质粒，转座子或其它转座遗传元件。因此，所述表达系统优选为多核苷酸表达系统，优选DNA，RNA或二者的混合物。
[0107] 从所述系统表达优选为有条件的。尽管它可以是诱导型的，特别优选所述条件性是可抑制的，从而表达仅在缺少抑制物的情况下发生。在诱导型系统中，表达将仅在诱导物的存在下发生。包括在本表达系统中的特别优选的可抑制系统是tet(四环素)系统或GAL4/UAS系统，二者都在本文进一步描述。
[0108] 将理解所述启动子能够节肢动物的雄性生殖系细胞中表达，即能够在其中起始转录。还将理解，所述启动子可操作连接于本系统的调控元件和编码序列。
[0109] 其可以是，所述系统包含单条编码序列或多于一条编码序列。所述一条或更多条编码序列可以以融合连接或分开提供。进一步编码序列的合适实例为标记或报道分子比如荧光蛋白(例如GFP，EFP，YFP，等)，但进一步效应物也是优选的，以提供更好特异性。
[0110] 除具体描述的第二表达单元的上游调控元件之外，本系统还可以适当包括进一步调控元件。这些促进，即使能够，在节肢动物的雄性生殖系细胞中表达。此外，如下文描述的，所述进一步调控元件促进RNA的有丝分裂前加工和翻译。因此，所述进一步调控元件不是启动子的部分，但优选包括第一表达单元中的5’UTR和/或第一和第二表达单元二者中的3’UTR。因此，这些进一步调控元件可以被认为是非翻译序列，如以第二表达单元的指定5’UTR的情况。它们都优选包括至少5’UTR或3’UTR的实质部分，但是最优选完全5’UTR或完全
3’UTR。最优选，提供5’UTR和3’UTR的至少实质部分(并且优选二者都是完全的)。所述调控元件因此可以包括5’UTR的全部或部分，包括各种调控序列，其与使RNA序列(例如最近从DNA转录的RNA)能够翻译的5’UTR内关联或在其中发现。
[0111] 所有本文描述的启动子应该优选包括特征比如转录因子和RNA聚合酶结合位点。这些是启动子元件(典型地)，不是UTR元件(尽管可以存在重叠)。5’UTR一般具有一些翻译起始信号，可能还有RNA稳定性，定位，翻译控制和内含子序列(尽管不是必要的)。
[0112] 对于可以包括5’帽和/或多聚腺苷酸尾的其它进一步调控元件同样适用。换句话说，理想地，所有这些元件存在于至少实质部分，即足以提供其必要的调控功能的那个。技术人员将能够评估这些调控元件的全部或部分存在或缺失的情况下是否提供编码序列的足量表达，因为基本要求是精子的下游功能性。技术人员能够评估精子是否能够竞争，这是有利的。他也能够容易地鉴定精子是否产生可成活受精卵，这是不利的。如果精子不竞争，和/或如果它们确实产生可成活受精卵，那么效应物的表达水平将需要修正。在本发明中，精子(其意为转化的或GM(遗传修饰的，即携带转基因/本表达系统))优选能够与野生型精子竞争但是不产生可成活受精卵。因此，如果这些中的一个未实现，尤其是如果产生可成活受精卵，那么所述系统需要修正。
[0113] 然而，必须铭记在心的是将效应物ORF/编码序列的RNA加工为所述效应物转录本在减数分裂前发生并且以足够水平积累，从而之后翻译的和功能性蛋白对精子使卵受精产生可成活受精卵的能力具有所需效果。这点另外进一步详细讨论。
[0114] 效应物编码优选的核酸酶的情况下，例如，这是有害效果。这在任何点发生(尽管明显在效应物转录本被加工和翻译等等为功能蛋白之后)。基本需求是在减数分裂前必须存在足够的效应物转录本，因为转录在那一点关闭。然而，可以设想所述效应物蛋白可以是有丝分裂后(但是当然是减数分裂后的)功能性的。
[0115] 优选地，所有调控元件是彼此同源的，即源自相同基因。特别优选，为了精细调节表达水平，所述调控元件彼此异源，从而例如，3’UTR可以源自相对选择的5’UTR的不同基因。优选所述5’帽和多聚腺苷酸尾与启动子同源，即来自与启动子相同的基因。
[0116] 因为效应物基因是通常不表达于雄性节肢动物的生殖系细胞中的基因，还将理解调控元件与所述基因异源(即与编码序列异源)。在所有这些中，将理解异源指遗传元件比如启动子，5’UTR(或其它调控元件)或编码序列的来源，从而它们可以来自相同生物的不同基因；来自不同生物的保守基因；或甚至来自不同生物的不同(不相关)基因。换句话说，所述元件可以来自(从源自的意义上，尽管修饰是可预想的)单个生物内的一系列不同基因或不同生物的一系列不同基因，具有限制条件是，它们足以在节肢动物雄性生殖系，即在其性腺或精子中提供必要的表达水平。尤其，所述编码序列可以根本不必须来自节肢动物，而如果有助于从编码序列的蛋白表达的适当程度和时机，特别是有关减数分裂前翻译，例如所述调控元件还可以优选源自细菌或病毒。
[0117] 所述编码序列编码效应物蛋白。如上文提到的，所述编码序列优选为与表达系统中的其它元件比如启动子和/或调控元件异源。同时，表达系统中的编码序列将是多核苷酸，其能够被转录为合适的信使RNA(mRNA)，其足以随后被翻译为功能蛋白。设想了RNA的可变剪接，其由内含子(剪接控制)序列与剪接体合作调节。提供或控制可变剪接的优势是其添加调节蛋白表达的另外水平。对此的进一步指导提供在我们之前的公开WO 2007/091099中。
[0118] 效应物蛋白表达的时机和定位对于本发明是关键的并在下文进一步讨论。然而，将理解效应物的功能优选对精子使卵受精以产生可成活受精卵的能力具有有害效果。
[0119] 如本文描述的，雌性感觉好像她已经恰当地受精，否则她将寻找进一步交配或，实质上，已经可以存在本精子需要竞争的其它野生型精子是重要的。然而，如果其一般功能被显著损害，比如其“游泳”的能力，精子将不能竞争。
[0120] 优选的效应物对精子使卵受精以产生可成活受精卵的能力具有有害效果。优选，其诱导或直接引起DNA损害。这个的特定优选实例为核酸酶，特别是核酸内切酶。这些的进一步实例在下文提供。
[0121] 启动子驱动，即能够或适应于起始，效应物编码序列以及其周围的调控元件转录为RNA。这个时机是关键的并且另外强调。效应物的翻译可以在减数分裂之前或之后发生。
[0122] 效应物蛋白具有有害效果，尤其是在减数分裂后(减数分裂后)。精子通过精子自然发生从携带本表达系统的雄性生殖系细胞产生。所述精子因此优选携带或包含至少一个拷贝的效应物蛋白，但是优选显著多于一个拷贝。该有害效果降低精子使卵受精的能力。因此，本系统在如Horn和Schetelig(Horn，C.，Wimmer，A.E.2003，Schetelig，M.F.，Handler，M.A.2012)中公开的胚胎特异系统中诱导致死性之前作用良好。强烈优选效应物使精子具有足够的运动性，从而它们能够在急于到达卵的过程中与普通(即野生型或未转化的)精子竞争。同样，值得注意的是，精子携带一个拷贝的DNA(编码效应物的基因)不是关键的。实质上，这是优选的并且是与合子活化的RIDL系统的关键差异，因为本系统可以：
[0123] -保证不存在卵孵化；
[0124] -与遗传性别鉴定组合使用；
[0125] -提供条件性；和
[0126] -纯种，合子致死性和抗性。
[0127] 一般而言，受精在雌性生殖道中。在交配过程中雄性将精子转移，雌性保存它。从雌性生殖道传下的成熟卵暴露于该精子并受精。对于一些物种(地中海果蝇(Medfly)，埃及伊蚊(Aedes aegypti))，雌性典型地仅交配一次并使用储存的精子用于其所有卵。一些其它昆虫，例如一些蛾，交配更频繁。
[0128] 然而，特别优选效应物引起足够的DNA损害，可成活受精卵不可能形成，例如因为由精子提供的单倍体遗传信息被损害。例如，优选精子的DNA在其中具有双链损伤。由使用核酸内切酶导致的该优选的实施方案，其实例在本文提供。因此，本发明已开始就阻止可成活受精卵的形成，而不是在一旦形成的受精卵中进一步表达蛋白。这是超过现有技术，比如RIDL技术(其中功能受精卵形成并且随后表达效应物以杀死受精卵)的重要区别。在本发明中，无可成活受精卵曾经形成。
[0129] 因此，优选所述受精卵可以从不超过单细胞阶段。早期昆虫胚胎，例如，在无细胞分裂的情况下分开其核，随后细胞化，因此一步从1细胞到＞1000。然而，还优选的胚胎仅未能孵化为幼虫(其是野外所需的特征)。因此，最小需求是，优选个体未能发展为可成活成体。
[0130] 因此，可以看出，作为现有技术的问题的解决方案，本发明提供精子自然发生过程中减数分裂之前，异源效应物蛋白(优选核酸内切酶)的转录本的减数分裂前积累的微妙平衡作用，从而，减数分裂后，产生的精子携带翻译的效应物序列拷贝，其可以随后在精子中产生效果。该效果在受精前发生，因此有效使精子不育，从而精子是不育的活性精子。这是本文描述的“精子致死”效果。
[0131] 在减数分裂时，似乎不存在对于DNA完整性的强烈检验点。因此减数分裂前对DNA的损害通常是耐受的。实质上，这可能是辐射所做的：辐射导致各种精子头部尺寸，同时头部尺寸与DNA含量成比例。该不同DNA含量可以因此源自由于由在减数分裂前细胞中辐射引起的DNA损害导致的减数分裂时DNA的不均匀分离。然而，在有丝分裂(通常)中存在强烈的检验点，因此生殖系干细胞(GSCs)或精子发生细胞中的DNA损害可能阻止功能性(从使卵受精能力的意义上)精子的发育。
[0132] 根据本发明的一个进一步方面，提供在性腺或精子中表达效应物蛋白的方法。优选地，所述方法包含用本表达系统转化性腺。这方面还涉及转化方法。
[0133] 还提供的是群体控制方法，包括在雄性节肢动物的性腺中通过本表达系统表达所述蛋白。本文描述优选的节肢动物。
[0134] 本发明还提供抗性管理的方法。基本上对于任何合子活性RIDL系统，包括胚胎活性的合子活性RIDL系统，存在受精卵的基因组中的某物(例如从其母本遗传获得的遗传物质)可以阻止或降低想要的致死效果的可能性。关于RIDL，这将是遗传的抗性因子。为了说明，抗性因子可以是降低致死效应物表达水平，或降低致死效应物的目标对那个效应物的敏感度的某物。然而，对于本发明，当使用核酸内切酶时，难以预想那可能怎样发生。损害已经完成-使用核酸酶作为实例，精子DNA受损害并且难以预见在卵中这可能怎样纠正，因此使损害成为永久性的。
[0135] 关于抗性管理，可以预见如果我们使用雌性特异的RIDL并且在野外看到抗性产生的情形。我们可以加入根据本发明的系统，保持fsRIDL雌雄分离并保持本发明不育。备选地，我们可以仅切换本系统，然而雌雄分离在一些物种中对SIT有明显益处。
[0136] 该抗性管理不是完全全面的-行为抗性仍然可能(如果雌性可以区别可育和不育雄性，对于优先交配可育雄性的那些，将存在强烈的选择，从而避免暴露于受本发明影响的精子。已经在基于辐射的SIT计划中观察到此种行为抗性，但是仅非常少(我们相信仅知道存在一个好的实例)。该争论与辐射-绝育的支持者使用的那个非常类似，为了上文概述的原因争论精子中的辐射损害对合子(RIDL)致死的优越性。
[0137] 在本方法中，优选所述条件系统，优选本文描述的tet系统，用以提供进一步程度的控制。这允许，例如，在实验室条件下，即在抑制物，比如四环素的存在下饲养。当释放，或去除四环素时，系统的抑制被去除并且效应物蛋白从而被表达。
[0138] 在目前的情况下，雄性不育既用于农业，以例如阻止卵孵化，以及也用于疾病控制，例如控制疾病载体比如蚊子(例如造成疟疾和登革热传播的那些)。因此，本发明还提供生物节制(biocontainment)的方法，所述方法包括在群体中表达所述系统或向野外释放雄性(携带所述系统)。优选的，以可抑制系统，所述株变得依赖于抑制物且不能在野外建立。
[0139] 本发明还提供质量控制方法，例如，通过包括报道分子比如荧光蛋白，优选绿色荧光蛋白(GFP)或本领域已知的任何其它颜色荧光蛋白。这可以是效应物蛋白本身，其以转化标记起作用。用作转化标记的荧光蛋白的其它实例包括DsRed，DsRed2和AmCyan。
[0140] 还可以使用分开的转化标记，包括使用这里描述的那些。这些转化标记的转录可以在对于第一或第二表达单元的那个的分开的启动子的控制下。此种启动子的实例包括肌肉肌动蛋白启动子，3xP3，hrIE和hr5IE1。
[0141] 然而，更优选地，所述荧光蛋白可以连接于本系统的效应物蛋白，从而该报道蛋白和其表达将允许评估将转基因或其它效应物包括在群体中的程度。这具有以下优点中的至少一些：
[0142] (1)如任何此种标记，其鉴定转基因的存在，从而可以按照遗传。标记与研究的特征(例如致死系统)连接越紧密，失活一个但不失活另一个的突变发生的可能性越低。尽管在实践中，如果它们(标记和转基因)在同样的DNA片段上，这在任何情况下都极不可能；
[0143] (2)如果从融合的意义上连接，标记显示效应物蛋白的表达。这将允许人审视实际表达。例如，在核酸酶的tet-可抑制表达的优选的例子中，核酸酶融合于荧光报道分子会允许人核实要释放的昆虫表达所述核酸酶。荧光标记的存在将告诉你(i)雄性具有至少一个拷贝的转基因；(ii)所述表达系统从在抑制物缺失的情况下产生效应物的表达的意义上正确行使功能；(iii)昆虫表达核酸酶-FP融合(并且因此例如，不是在存在抑制物的情况下无意饲养)；[(iv)假定雄性特异的表达，是雄性]；(v)通过推理它们实质上不育。在质量控制(QC)条款中，这使你比仅知道雄性具有一个拷贝的转基因更确定′他们′不育′，其是你从使用连接的(遗传连锁的，例如相邻基因)荧光标记所获得的；
[0144] (3)用高功率的显微镜，你可以看到表达何时开始和蛋白定位在细胞内的哪里。这是有用的研发工具并且也用于例如在进行的QC中，而且在精子精子间表达的一致性的情况下，监控一致性，以建立系统今天是否进行，它昨天/去年做了什么；和
[0145] (4)就荧光精子而言的进一步优势，在下文讨论。
[0146] 对于核酸酶，存在对切割DNA的明确的功能关联，因此如果其不是在核中，就不可能具有想要的DNA-切割效果。从而，因此还优选提供核定位信号以保证核酸酶定位于核。
[0147] 在进一步的方面，在此提供质量控制的方法，所述方法包括在目标组个体中诱导或去抑制本表达系统的表达并确定这些个体是否满足预期的标准比如尺寸、数量、发育阶段或定位。例如，如果所述系统包括表达报道分子比如荧光蛋白为效应物或为例如融合蛋白的部分之一的工具，那么其中从所述系统表达被诱导或去抑制的个体将变得在合适波长的光下可见。
[0148] 优选本系统包括至少一个间隔区。此间隔区可以有利地位于所述系统的任何本元件之间。例如，可以在启动子和调控元件之间和/或调控元件和编码序列之间提供间隔区，从而在这些元件之间提供“缓冲”以保证其正确功能性。因此，所述间隔区除了分开这些元件之外，不具有基因表达的功能，尽管它可以任选地包括许多限制性位点，如果这被认为是有用的。理想地，它应该不包括任何转录结合因子位点等，因为这些可能干扰效应物的表达。
[0149] 还优选所述效应物可以是融合序列或蛋白的形式，从而，例如，核酸酶融合于标记以致效应物的转录和翻译也导致标记的转录和翻译。这具有显示将精子暴露于核酸酶的优点，荧光蛋白的存在表示核酸酶被表达。可以在荧光显微镜下使用适于特定荧光蛋白的激发滤光片观察荧光蛋白。这些的实例是我们的株LA4466或LA4467(LA4466＝PB-hr5IEl-DsRed-Aeprot-tGFP-EcoRI和LA4467＝PB-hr5IE1-DsRed-Aeprot-tGFP-FokICD)。应该注意，更早期的株随发明人Luke Alphey标记“LA”，但是从那以后，我们随申请人Oxitec采用了前缀“OX”。因此，对于个体株，前缀LA和OX可以相互替换使用。LA4466/OX4466和LA4467/OX4467二者都是成功融合于荧光表达的核酸酶功能的实例。
[0150] 还可预见，本系统和方法可以用于产生荧光精子。例如，可以将报道分子比如上文提到的那些连接于启动子或，实际上，在分开的启动子下，比如tetO启动子增强子系统，如果效应物是tTA或其变体的任一种。荧光精子对于精子或性腺的可视分离，特别是在解剖或性选择方法中会是有优势的。尤其，它推断出确定雌性与哪个雄性个体交配，在野外释放程序的情况下哪个有用的能力。此方法可能包括，提供(例如诱捕)野生雌性；解剖它们；寻找储存的精子并看此精子是否携带本系统，即是荧光的。这将非常快速地告诉你雌性是否：
[0151] (i)是未交配的(尚未交配)；
[0152] (ii)与野生型雄性交配(因为它显示非荧光精子)；
[0153] (iii)与携带本系统的转基因雄性交配(其会显示荧光精子；或
[0154] (iv)与两种类型的雄性都交配(通过荧光和非荧光精子的存在显示)。
[0155] 因为‘雌性与谁交配？’是评估和控制SIT-类型计划的关键问题，这是有用的优点。存在一些提议这点的文章，例如Malacrida等人2007文章已经被引用，但是不在我们这里提供的上下文中。
[0156] 本理念的实例是构建体(OX3878)，设计其以荧光标记精子头，尤其在埃及伊蚊(Aedes aegypti)中。该构建体使用埃及伊蚊(Aedes aegypti)tGFP-标签标记的鱼精蛋白和其调控序列，以精子-特异的方式表达荧光融合蛋白。在完整的解剖的精巢和在从OX3878雄性蚊子分离的精子中都检测到强烈的绿色荧光。这显示，荧光蛋白的表达可以由本系统驱动以产生荧光精子并且，此外所述荧光可以有用地被检测到。
[0157] 因此，在进一步的方面，本发明提供确定雌性节肢动物的交配状况的方法，所述方法包括在转基因雄性(即释放的)群体中使用根据本发明系统，其中所述系统包含标记比如荧光报道蛋白；并且在存在精子时，测定雌性中所述标记的存在；标记的存在表示雌性已与携带所述系统的转基因雄性交配。不携带标记的精子的存在表示雌性与野生型(不是转基因)个体交配。精子不存在的情况，其表示雌性尚未，或刚交配。在一些实施方案中，所述方法包括释放携带本系统的转基因的雄性并且允许它们与雌性(即野生型雌性)交配。
[0158] 将理解，在本发明中，所述系统的表达必须被引发或被允许发生。换句话说，遵循诱导效应物表达(和如果分开，任选标记的比如报道分子)所需的条件。在可抑制tet系统的情况下，例如，这意为从转基因雄性的饮食中去除四环素。
[0159] 本发明的首要目的是提供雄性不育。然而，我们还显示的是可能提供不育精子，其仍然能够与野生型精子竞争。这是有优越性的，因为其导致更高程度的群体控制，因为如果野生型精子轻易能够竞争掉转化的精子，并且雌性可能与两种类型的雄性都交配，那么将在下一代中仅存在群体的少量减少。即使雌性典型地仅交配一次，在此种情况下，对于增加的再交配可以存在强烈的选择性。
[0160] 泛素融合蛋白还可以有利地包括在本系统中。这具有以融合产生两种蛋白的表达，即单个多肽，但是(共翻译)切割为两个分开的蛋白的优点。如果所述蛋白之一不容许融合(例如，tTA，趋于以N-末端融合不行使功能)，这是有用的。你仍然具有紧密结合形式的共表达，然而你失去了使用标签(例如荧光蛋白，FP)以确定融合蛋白的亚细胞定位的能力，因为其不保持与它融合。
[0161] 值得重申，本启动子是“早期作用”生殖系启动子，因此在减数分裂前提供必要水平的转录。所述启动子在下文进一步定义，但是同样值得铭记于心的是，启动子应该优选在有丝分裂之后不在早于topi启动子作用，尤其是，不在干细胞中作用(至少其中效应物不损害此种细胞类型，即其中效应物不是核酸酶)。
[0162] 所述启动子应该具有生殖系效果，并且优选所述系统的表达是有条件的。理想地，在看到效应物表达的任何负效应之前，精子自然发生应该基本上完成。优选不存在对精子功能的可辨效果，直到卵进入后。同时可能看到DNA损害为‘负效应，’人们可以仅将精子中的DNA视为“货物”，因为在精子中无转录。由效应物引起的任何DNA损害必须足以阻止可成活子代的产生。
[0163] 因此，本发明优选提供条件生殖系特异性(就表达而言)。
[0164] 在一个优选的实例中，第二表达单元的‘框架’尤其基于来自Dm或目标节肢动物的B2T野生型基因。将编码序列用转录因子的编码序列替代，并且也将启动子和/或5’UTR序列改变。实质上，甚至可以插入异源增强子或使用异源3’UTR。显然，如果进行所有这些改变，将存在很少残留的原序列，因此将理解这是建立第二表达单元的一种方式。
[0165] 关于调控元件，特别是第二表达单元中的上游调控元件启动子和/或5’UTR，对于本转录因子不存在延迟的翻译效果是重要的。实现这点的一种途径是使用来自已知在减数分裂前以足够，优选强烈水平转录和翻译的基因的调控元件。合适的实例会包括分子伴侣基因，优选HSP家族的基因，尤其是hsp83。在一个其它的优选实施方案中，3’UTR可以源自病毒，比如SV40。
[0166] 在一个特别优选的实施方案中，本系统的第二表达单元包含来自β2微管蛋白(B2T)的启动子，连同修改的B2T 5’UTR或来自hsp83的5’UTR。任选地，可以使用来自SV40的3’UTR。启动子和5’UTR之一或二者可以来自topi。topi指果蝇(Drosophila)基因matotopetli。然而，本发明包括功能同源物和来自其它物种的旁系同源物。这些可以通过参考如上文描述的保守ORF鉴定。在5’UTR来自topi的情况下，所述启动子也可以来自topi，尽管可预见其可以来自本文公开的任何其它启动子，例如B2T。同样，当使用来自topi的启动子和/或使用来自的topi 5’UTR时，3’UTR优选为也来自topi，剩余的调控元件比如5’帽和多聚腺苷酸尾也是一样。这一点的原因是topi在精子自然发生中具有“早期”表达形式，从而其能够在有丝分裂后但在减数分裂前驱动合适的转录和翻译。
[0167] 在B2T，同时启动子有用的情况下，我们发现的确似乎存在与来自B2T的5’UTR密切相关的延迟信号，阻碍早期翻译。由于该原因：B2T的5’UTR可以由来自例如，分子伴侣比如hsp83的5’UTR替代。因此，将看出，在一些情况下启动子和调控元件彼此同源，或至少优选来自不同物种的保守同源物的同时，在一些情况下，使用彼此异源的启动子和调控元件以精细调控本发明所需的表达模式可以是必要的。如在实施例中看到的，我们提供每个方案的实施例。
[0168] 在其它方面，本发明还提供用本系统或通过本方法转化的节肢动物(在本文提供其优选实例)。换句话说，本发明还提供转化子或遗传改进的节肢动物，优选如本文进一步限定的。将理解所述节肢动物是雄性，优选其性腺携带本系统，从而在精子自然发生过程中效应物的表达发生。
[0169] 启动子和调控元件以协同方式一起作用以提供所需表达模式是本发明的优点。
[0170] 如上文提到的，所述启动子优选来自精巢-特异的基因或至少足以在精子自然发生过程中提供“早期”表达的基因。备选方案包括更为组成型的启动子，比如结构启动子，例如，微管蛋白家族，特别是β微管蛋白和最优选β2微管蛋白启动子，和其同源物。当使用它时，有必要使用不具有至少在β2微管蛋白的上游调控元件的一些情况下看到的翻译延迟信号的上游调控元件。使用B2T启动子的优点是B2T基因编码序列高度保守并且它和合适的启动子片段可以由技术人员从给定节肢动物物种中容易地鉴定和分离。
[0171] B2T启动子序列的实例在下文给出。
[0172] 改善的B2T启动子序列的实例在下文给出。
[0173] 来自B2T的5’UTR的实例在下文给出。如果来自其它物种的B2T启动子用于本发明，那么技术人员将能够基于其来自上述SEQ ID NO的保守性质容易鉴定5’UTR。他们将随后能够用其它5’UTR替代它。制备的实例包括来自分子伴侣，特别是hsp家族，特别是hsp83的5’UTR。来自hsp83的5’UTR的合适实例在下文给出。
[0174] 已经成功用于本发明实施方案的3’UTR的合适实例是来自SV40的3’UTR。该3’UTR在下文给出。
[0175] topi编码序列在蚊子比如埃及伊蚊(Aedes aegypti)和地中海果蝇(Medfly)(C.capitata)间大部分保守。如对于B2T，人们可以通过序列相似性(很多方法，包括分子和基于序列的方法)克隆topi(或其部分)编码区域，然后转向转录起始的5’并获取其5’DNA的大部分作为你的启动子。有多少不总是立即清楚；保守地转向5’，直到你到达下一个转录的区域并获取其全部，但是实践中雄性生殖系启动子趋向于非常短(几百个碱基)，因此转录起始5’1kb应该足够，如果你感觉谨慎，获取2-5。这里的试验和错误测试也显而易见：将启动子连接至FP，制备转基因，观察表达模式。
[0176] topi是有用的，因为它具有早期表达并且与精子自然发生相关。其也是有利的，因为它是相对“紧凑的”系统，即由相对少的多核苷酸组成。同样，它是精巢特异的并且，实质上，它早于B2T表达。与B2T启动子相比，表达可能弱点，但是如果表达水平需要被改善，这在某些方面可以是有利的。Topi是转录因子的实例并且因此来自在精巢表达并且优选精巢-特异的(即仅在精巢表达)的其它转录因子的启动子和/或调控元件在此是优选的。
[0177] 我们发现，在杂交中更强的完全绝育效果，其中与特别是埃及伊蚊(Aedes aegypti)中的B2-微管蛋白相比，核酸酶表达由Topi启动子驱动。尽管如此，在两种情况下都观察到显著的雄性不育，在蚊子，尤其是埃及伊蚊(Aedes aegypti)中“父性致死性效应”既赋予topi也赋予B2-微管蛋白合适启动子的改变形式。
[0178] 其产物(例如编码的蛋白)仅在减数分裂时或减数分裂后需要的基因可能仅在减数分裂前或后被短暂翻译，即使更早被转录。相反，需要驱动此基因表达的转录因子必须足够早被表达(转录和翻译)，使得其蛋白产物足够积累以驱动在减数分裂前的转录停止之前目标基因的足够表达。因此，在需要在雄性生殖系中表达转录激活剂比如tTA的情况下，雄性生殖系转录因子的调控元件可以以最小改进相适合。
[0179] 下文更详细描述合适的核酸内切酶。然而，优选的实施方案包括例如在LA4104看到的锌指核酸内切酶。其它备选方案包括IppO1，也称为I-PpoI，如由Crisanti等人使用的(Catteruccia等人，2009；Windbichler等人，2011；Windbichler等人，2007；Windbichler等人，2008)。这具有某些优点，比如它具有非常长的识别序列，相应地，其在随机序列中罕见。然而，其相对于一些限制性内切酶不具有高特异性，例如，因为它将容许(即仍然切割)具有与典型识别序列一定程度差异的序列。Windbichler等人2007展示冈比亚按蚊
(An.gambiae)组织培养细胞中的生长抑制，其是合理的证据(如他们也推断的)，表达会是有毒的，但是他们不直接显示它。
[0180] 不同结果来自Windbichler等人2008，其中I-PpoI的表达-他们认为其应该只切割冈比亚按蚊(An.gambiae)中的X染色体，因为在此物种中，其在rDNA中目标位点似乎仅在X染色体上-给出完全不育的雄性，而不是其预期(由于对源自父系的X染色体的损害而无可成活雌性后代，但有可成活雄性后代)。他们提议的解释(对其他们提供了一些支持数据)为精子中I-PpoI自身被转移至受精卵中，在那里它也切割源自母系的X染色体(他们似乎假定为蛋白，但是可能与为mRNA相当)。这是持久的问题，其与蛋白(或mRNA)稳定性相关.[0181] 替代的优选核酸内切酶是Fok-1鱼精蛋白融合核酸内切酶。进一步优选的备选方案包括EcoRI鱼精蛋白融合核酸内切酶。鱼精蛋白是DNA结合蛋白并起具有一般非常低的序列特异性。这与Fok-1，类型IIS切割结构域联合。该切割结构域必须二聚化以切割其靶。这是有用的，因为所述位点需要一起足够近，从而产生非线性浓度效应。以单体作用的效应物被预期具有与其浓度成比例的其效果(这里，DNA切割)。对于很多应用，人们将偏好非线性剂量反应曲线，以致效果接近零直到某点，但是随后相对快速超过那个点增加至完全有效，这点的限制是双重′阈值′效果。核酸酶比如鱼精蛋白-FokI被预期具有一定程度的此种非线性。但是鱼精蛋白结合DNA具有很少或不具有序列特异性。因此，在低浓度(例如每个核中的分子)鱼精蛋白-FokI蛋白将趋向于在染色质周围随机分散，很少以足够紧密的接近度/定位二聚化并切割染色体。
[0182] 然而，随浓度增加，此接近度的几率大大增加，导致浓度和切割之间的非线性关系。这促进启动子的选择(和特异转基因插入)，因为所述系统相对惰性，甚至具有低-但是非零水平的脱靶(基底)表达，同时在更高表达时仍然具有所要的效果(在预期的表达结构域，在可抑制表达系统的情况下去抑制)。在结合于DNA之前效应物必须二聚化(或形成更大复合体，例如四聚体)的情况下，可以获得类似的效果。在想要更线性的效果的情况下，这可以通过使用不需要二聚化的核酸酶结构域，或其中以单个多肽(例如FokI结构域的两个拷贝而不是一个)提供必要的亚单位，容易地在本发明的方法内完成。可以使用更好或更差的序列特异性的核酸酶实现所述系统另外的操作，因为可获得得蛋白分子将通过DNA结合结构域对更大量或更少量位点的特异性和亲和力′集中′，导致在那些位点更大或更小程度的浓度。
[0183] 优选所述鱼精蛋白基因(或蛋白编码序列)获自与目标物种的那个相同的物种。优选所述鱼精蛋白基因源自黑腹果蝇(D.melanogaster)。还优选所述鱼精蛋白基因源自埃及伊蚊(Aedes aegypti)。
[0184] 设计与组成型表达的构建体OX4466和OX4467相关的实例以分别研究效应物蛋白Aeprotamin-EcoR1和Aeprotamin-Fok1的功能性。这些实例显示，这两种效应物蛋白当用于精子致死系统，即在早期作用启动子(第二表达单元)的控制下时都应该确定工作。事实上，我们还继续对Aeprotamin-Fok1二元构建体继续显示这点。证明了两种效应物蛋白的功能性之后，我们开发和注射Aeprotamin-Fok1二元构建体(参见实施例“OX4282-OX4627Topi-tTAV-驱动表达tetO-Ae-鱼精蛋白-FokI-CD”)，其证实了之前的(组成型表达的)系统的阳性结果。因此，完全有理由预期EcoR1系统在精子致死环境中也将产生效果。因此，效应物基因优选为Aeprotamin-EcoR1或Aeprotamin-Fok1。这些对于在蚊子和尤其伊蚊(Aedes)，尤其是埃及伊蚊(Aedes aegypti)中使用是最优选的。
[0185] 其它类型II核酸内切酶包括例如Eco32I，BfiI，和MboII。这些核酸内切酶是同源二聚的。一般而言，二聚核酸内切酶是有利的。他们是二聚的，因为他们仅当二聚化时才切割DNA。当它们适当地二聚化时，它们导致双链DNA破坏。
[0186] 其它核酸内切酶可以包括HEG’s(归巢核酸内切酶(Homing Endonucleases)。这些HEG’s可以是单体或二聚体，但是一般具有低特异性(从它们不需要与其(非常长)识别序列完全匹配，但是它们确定不仅切割随机序列的意义上)。其它备选方案包括来自细菌的限制型核酸内切酶。这些也具有低特异性。
[0187] 因此，技术人员可以选择所需特异性的水平。将理解对于给定的识别序列，低特异性核酸内切酶将比高特异性核酸内切酶以更大量的机会破坏或损害DNA。HEGs具有非常长的识别序列，其将以常小于一次/基因组的频率偶然发生。因此尽管对于该序列有其不完美的特异性，它们可以根本不切割(例如Windbichler等人，2011中的I-SceI仅切割设计的位点，不切割基因组的剩余部分-至少不以足够高以引起他们的实验中的明显问题的频率)。
[0188] 因此，通过适当选择核酸内切酶为效应物的进一步精细调节水平是可能的。已经发现所述核酸酶效应物融合蛋白在至今测试的三种不同双翅目物种，即地中海果蝇(C.capita)，橄榄果蝇(B.oleae)和埃及伊蚊(Aedes aegypti)中是完全形式功能的。这些物种是特别优选的，如相同属中其它物种一样。
[0189] 特别优选所述节肢动物(本系统表达所在的宿主生物)是昆虫，优选实蝇(Tephritid)。尤其，优选所述昆虫来自双翅目(Order Diptera)，尤其是高级双翅目并且特别它是实蝇，优选地中海果蝇(Medfly)(地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis 
capitata)))，优选墨西哥果蝇(Mexfly)(墨西哥按实蝇(Anastrepha ludens))，优选东方果蝇(Oriental fruit fly)(Bactrocera dorsalis)，橄榄果蝇(Bactrocera oleae)，瓜实蝇(Melon fly)(瓜实蝇(Bactrocera cucurbitae))，纳塔尔果蝇(Natal fruit fly)(纳塔耳小条实蝇(Ceratitis rosa))，樱桃果蝇(樱桃绕实蝇(Rhagoletis cerasi))，昆士兰果蝇(Bactrocera tyroni)，桃果蝇(Bactrocera zonata)加勒比果蝇(加勒比按实蝇(Anastrepha suspensa))或西印度群岛果蝇(Anastrepha obliqua)。还特别优选的所述宿主生物是蚊子，优选来自覆蚊亚属(Stegomyia)，伊蚊属(Aedes)，按蚊属(Anopheles)或库蚊属(Culex)。特别优选是Stegomyia aegyptae，也称为埃及伊蚊(Aedes aegypti)，Stegomyia albopicta(也称为白纹伊蚊(Aedes albopictus))，史氏按蚊(Anopheles stephensi)，白魔按蚊(Anopheles albimanus)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)。
[0190] 在双翅目内，其它优选的群是丽蝇科(Calliphoridae)，特别是新世界旋蝇(New World screwworm)(嗜人锥蝇(Cochliomyia hominivorax))，旧世界旋蝇(Old World screwworm)(蛆症金蝇(Chrysomya bezziana))和澳大利亚羊丽蝇(Australian sheep blowfly)(铜绿蝇(Lucilia cuprina))。鳞翅目(Lepidoptera)和鞘翅目(Coleoptera)也是优选的，尤其是蛾，包括苹果蠹蛾(codling moth)(Cydia pomonella)，和蚕(家蚕(Bombyx mori))，棉红铃虫(the pink bollworm)(红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella))，小菜蛾(the diamondback moth)(菜蛾(Plutella xylostella))，舞毒蛾(Gypsy moth)(Lymantria dispar)，脐橙蠕虫(the Navel Orange Worm)(脐橙螟(Amyelois 
transitella))，桃芽蛾(Peach Twig Borer，桃条麦蛾(Anarsia lineatella))和水稻螟虫(rice stem borer)(三化螟(Tryporyza incertulas))，还有夜蛾，尤其是实夜蛾亚科(Heliothinae)。鞘翅目(Coleoptera)中，日本甲虫(日本金龟子((Popilla japonica))，白流苏甲虫(White-fringed beetle)(白缘象(Graphognatus spp.))，棉籽象鼻虫(Boll weevil)(墨西哥棉铃象(Anthonomous grandis))，玉米根虫(叶甲属(Diabroticaspp))和Colorado马铃薯甲虫(马铃薯甲虫(Leptinotarsa decemlineata))是特别优选的。
[0191] 然而，如我们在实施例中显示的，本系统和方法可以跨双翅目实施，包括高级和低级双翅目。高级双翅目因此是优选的。低级双翅目也是优选的。
[0192] 在一些实施方案中，优选所述昆虫不是果蝇(Drosphilid)。因此，在一些实施方案中，在果蝇(Drosophilid)，尤其是黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)中的表达是被排除的。
[0193] 优选效应物蛋白的表达导致生物中表型的后果，即不育。特别优选地，功能蛋白可以与可视标记(包括荧光)关联。
[0194] 在对特定核苷酸或蛋白序列进行参考的情况下，将理解这包括对与其具有基本上相当得生物学活性的其任何突变体或变体的参考。优选地，所述突变体或变体与参考序列具有至少85％，优选至少90％，优选至少95％，优选至少99％，优选至少99.9％，和最优选至少99.99％的序列同一性。
[0195] 我们预期：
[0196] a)本不育是显性的，从而杂合雄性的所有精子将受影响(不必要都是缺陷的，因为所述系统可能对于一些类型的精子有选择性，或对应该受影响的那些精子有少于100％的有效性)；并且
[0197] b)所述机制不依赖于由通过这些精子的显性致死基因的受精卵导致的遗传[0198] 因此，本系统不是RIDL系统，因为a)和b)都区别于RIDL。
[0199] 辐射的一个可能优点是，难以看到野生目标群体中可遗传的或遗传改变能够克服辐射的绝育效果。因此难以想象在野生群体中对于基于辐射的SIT的这方面产生的抗性(然而其它类型的抗性，比如行为抗性例如选型交配(Dhillon等人，2005)，可能产生)。相反，可以想象，赋予对RIDL基因的杀灭或失能作用的抗性的基因或等位基因可能产生。类似地，尽管CI的精确生物化学基础未知，以沃尔巴克氏体(Wolbachia)的合适株感染的胚胎能够反转CI诱导的雄性不育，因此对CI诱导的不育的生物化学/遗传抗性似乎是可以想象的。
[0200] 本发明克服这些困难。设计绝育机制以在合子基因表达前作用，从而可遗传抗性的可能性严格受限。例如，考虑使用在精子自然发生中表达的核酸酶。在限制性条件(对于繁殖力，容许表达核酸酶)下，这将倾向于与辐射几乎相同的方式损害DNA，例如诱导双链破坏。因此同样难以想象野生目标群体如何能够发展出对此种不育或父本效应致死性的抗性。其可以是，人工大量饲养的群体可能发展出抗性，然而使用合适的条件表达系统，从而在容许的(对于繁殖力)条件下几乎对精子(或其它细胞或组织)不进行损害，将最小化对于此种等位基因的选择压力。尽管从这方面与辐射类似，但本发明的方法具有一些优点。绝育效果限制于性腺或配子，并且这样较小可能降低昆虫的性能。通过选择合适的可抑制表达系统，可以仅通过去除抑制物就实现不育。从这方面，所述系统还提供生物节制，因为释放到野外的昆虫(故意或无意)为不育的，或它们的后代中的部分或全部是不育的。
[0201] 我们打算将雌性致死(或不能飞)RIDL技术与本“精子致死”发明组合以开发适于在SIT计划中实施的昆虫产品。我们在实施例中显示本“精子致死”系统与RIDL技术的联合是可行的。当然，还将存在不需要雌雄分离的物种，和需要雌雄分离但可以通过其他手段实现的物种(例如基于物理尺寸的雌雄分离，如适于埃及伊蚊(Aedes aegypti)的)。因此，优选地，本表达系统还可以与存在的雌性致死(或不能飞)技术联合以进一步开发适于在SIT-类型计划中实施的节肢动物，并特别是昆虫产品。对于SIT，对于很多物种，仅释放雄性被认为是所需的，例如成体雌性即使不育实质上或可能是有害的(例如蚊子，通过叮咬，或地中海果蝇(Medfly)，通过产卵于未成熟水果)，同样对于地中海果蝇(Medfly)，共释放不育雌性似乎‘干扰’不育雄性找到野生雌性(Rend6n等人，2004)。
[0202] 合适雌雄分离系统包括基于两性异形的分离(例如埃及伊蚊(Aedes aegypti)的尺寸，舌蝇(tsetse fly)的蛹化时间)；诱导的两性异形(例如Catteruccia等人，2005)。备选地，可以通过使用致死遗传雌雄鉴别系统排除一个性别；此种系统已经通过经典遗传学(例如Franz，2005；Klassen和Curtis，2005)和还通过包括RIDL的实施方案的重组DNA方法((Fu等人，2007；Thomas等人，2000)构建。两种条件表达系统都可以使用相同条件，从而协调控制两种表型中每个的控制。因此，例如，如果各个系统被四环素(或其合适的类似物，比如氯四环素)抑制，在合适浓度的四环素的存在下饲养会让所述株生长到足够数量。在释放前的最后一代中，在无四环素的条件下饲养会导致雌性-特异的致死系统和建议的精子致死系统二者去抑制。因此，雌性将死亡并且剩余的雄性将是不育的。
[0203] 两个tet-可抑制系统之间一定程度的对话(cross-talk)是可以预期的，从而两种效应物将由两个系统都表达。雌性中精子致死效应物的表达不可能具有任何不想要的后果，因为意图是这些雌性死亡。以其它方式对话，即在精子自然发生中表达雌性-致死效应物可能有困难，其依赖于雌性-致死效应物的性质和其对精子自然发生的影响。如果认为不需要，此种对话可以容易被避免，以对雌性限制雌性-致死效应物的表达，例如通过使用型别特异的可变剪接调节功能效应物的产生(Fu等人，2007)。
[0204] 可以以两种方式实现所述组合技术：
[0205] -可以将提议的发明通过转座子介导的转化分开插入昆虫的基因组。仔细分析产生的株将引起具有所需特征的候选株。可以将这些回交以导致雌性致死(优选fs-RIDL)株产生双纯合子用于两次插入。
[0206] 在一个特别优选的实施方案中，可以将两个系统与条件雌性-特异的致死构建体组合在单个DNA构建体上。该构建体将因此既提供遗传雌雄鉴别也提供雄性不育。
[0207] 精子自然发生是细胞分化的高度专化的过程，其导致用于成功繁殖的功能精子的形成。理论上，精子自然发生的过程在所有有性繁殖的生物中是良好保守的，尽管成熟精子的大小和形状在不同物种间十分不同。很多细节在哺乳动物和果蝇(Drosophila)之间是类似的，使得果蝇成为研究生育缺陷的非常好的模型系统。像哺乳动物的生殖细胞，果蝇(Drosophila)生殖细胞，在胚胎发育的早期被预留出来并通过后肠原基迁移入胚胎内部，在那里，它们加入胚胎性腺的体部(Zhao和Garbers，2002)。在第三幼虫龄的最后和蛹化的开始，第一生殖细胞进入减数分裂。精子自然发生是成熟阶段过程中的连续过程并且，因此，成体精巢含有从干细胞到成熟精子的所有阶段。
[0208] 一般而言，对于精子自然发生中的雄性(昆虫)生殖系细胞，转录在减数分裂前短暂关闭(Fuller，1993)。可以有一些之后转录的基因(Barreau等人，2008)，但是这些是例外的。一般而言，但在减数分裂时或减数分裂后需要其产品的基因在减数分裂前转录；之后储存和翻译mRNA，即当需要时，例如转录后。之后在翻译后典型地mRNA降解。很多基因遵循此模式；实例包括β2-微管蛋白和鱼精蛋白，还有减数分裂调节剂twine。这些当中，twine蛋白是进入减数分裂所需的，β2-微管蛋白是减数分裂纺锤体和减数分裂后鞭毛所需的；鱼精蛋白严格是减数分裂后所需的。因此，可以提供时机的适当控制。
[0209] 理论上通过影响(例如杀死)精子自然发生所需的精巢中的体细胞(例如包囊细胞)，或通过在雄性中影响激素产生等或(稍微更有希望)表达或消除精液中的因子破坏精子产生应该是可能的。然而，此种方法将至多确定产生至多无精子雄性，或明显异常的精子。为了此原因，我们试图集中于雄性生殖系表达。
[0210] 生殖系启动子序列
[0211] 因此，可以容易制备单基因表达构建体，其将在雄性生殖系中表达研究的基因(“效应物”)。已经在果蝇(Drosophila)中鉴定了很多基因，其在精子自然发生过程中表达并且这些中的很多是生殖系，或雄性生殖系特异的。此种表达数据可容易直接从文献获得；还有大规模的项目(Chintapalli等人，2007)和http://www.flyatlas.org/)对果蝇(Drosophila)基因组中的很多基因进行表达分析(例如FlyAtlas(Chintapalli等人，2007)和http：//www.flyatlas.org/，果蝇(Drosophila)精巢表达数据库(www.fly-ted.org)和在FlyBase上整理的数据，例如http：//flybase.bio.indiana.edu/)。因此可以如下制备表达构建体：
[0212] (1)鉴定合适的精巢-表达的基因，例如β2-微管蛋白，其编码β-微管蛋白的雄性-生殖系-特异的同种型(Nielsen等人，2001)(近期的报道(Jattani等人，2009)，表明β2-微管蛋白的表达和功能可以不严格限制于果蝇(Drosophila)中的雄性生殖系，然而来自冈比亚按蚊(An.gambiae)β2-微管蛋白的启动子片段用于表达有效的核酸酶，已知其切割冈比亚按蚊(An.gambiae)基因组中的序列，除了在雄性生殖系和在由来自此种雄性的精子受精的胚胎中之外无明显影响)；
[0213] (2)分离基因的野生型拷贝；
[0214] (3)用效应物基因替代基因的编码区域；和
[0215] 4)使转基因昆虫携带该基因。
[0216] 通过该方法在果蝇(Drosophila)中使用一系列参与精子自然发生的基因比如鱼精蛋白，例如don juan和Sneaky，实现荧光蛋白报道分子的雄性-生殖系-特异表达(Raja和Renkawitz-Pohl，2005；Santel等人，1997；Wilson等人，2006)。β2-微管蛋白是良好的保守基因，因此对此方法的延伸，在步骤2中从研究的物种(或相关物种，比如冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)分离适当基因用于在史氏按蚊(Anopheles stephensi)中使用(Catteruccia等人，2005))，将允许在任意选择的节肢动物物种中使用。该方法已经实质上成功用于在包括地中海果蝇(Malacrida等人，2007)，埃及伊蚊(Aedes aegypti)(Maynard-Smith等人，2007)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)(Catteruccia等人，2005)的一些物种中雄性-生殖系-特异表达荧光蛋白报道分子，它们所有都使用来自目标物种的β2-微管蛋白的启动子片段，除了Catteruccia等人使用来自冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)β2-微管蛋白的启动子片段在史氏按蚊(Anopheles stephensi)中驱动精子自然发生-特异表达荧光蛋白。
[0217] 将“精子致死性”与条件表达系统联合使用以通过在容许的条件下生殖保证转换。该条件可以是温度，例如通过温度-敏感蛋白效应物产生效果。然而，基于温度的条件系统倾向于例如“有渗漏”。TSL雌雄鉴别地中海果蝇(Medfly)株(Casares，2002)，基于外部施加分子(例如RU486/米非司酮(mifepristone)(Osterwalder等人，2001))的存在/缺失的系统可以使备选的。然而，其不适于二元表达系统(Brand等人，1994；Brand和Perrimon，1993；
Fussenegger，2001；Fussenegger等人，2000；Gossen和Bujard，1992；Gossen和Bujard，
2002；Victorinová和Wimmer，2007)。
[0218] 另一方面，Tet-关或Tet-开系统是选择的方案(Gossen和Bujard，1992；Gossen和Bujard，2002)。该系统依赖于条件地驱动合适基因(效应物)的表达的转录因子的表达。在tet系统中，合成的转录因子tTA(或其变体，包括rtTA)的结合受四环素和/或相关化合物比如氯四环素或多西环素浓度影响。在tet-关表达系统中，tTA对tetO的结合被四环素抑制，因此效应物的表达被四环素抑制，从而“Tet-关”。由链阳菌素调控的类似的表达系统也是已知的(Fussenegger等人，2000)。然而，在β2-微管蛋白的控制下的tTA的表达，例如，将不导致效应物的显著表达，甚至在缺少四环素的情况下。这是因为tTA的表达将基本上在减数分裂后(更确切地，基本上在减数分裂前的转录关闭之后)，并且因此太迟以不能驱动效应物的表达，甚至在缺少四环素的情况下。
[0219] 关键是理解在节肢动物并且尤其是在昆虫精子自然发生种基因表达的时机。在减数分裂起始后基本上无基因表达。因此，为了使用二元表达系统比如tet-关(或tet-开)，序列-特异转录因子(tTA)的转录必须在减数分裂之前足够远以允许在减数分裂之前积累tTA mRNA，翻译tTA蛋白和tTA-依赖地转录效应物。在精子自然发生过程中表达的大多数基因在精母细胞中(即在减数分裂前)转录，但然后当实际需要蛋白产物时翻译。对于参与精子分化或功能的多数蛋白(和因此多数精子蛋白)，这意为在减数分裂后翻译。因此，为了我们的目的的合适的表达意为tTA的早期转录和早期翻译。这不是被广泛认可的，并且也不易实现。因此，我们第一个发现这里存在问题。
[0220] 可以使用异源序列，而不是源自精巢-表达的基因的序列构建合适3’UTR，例如也可以保留精巢-表达的基因的编码区域的全部或部分。雄性-生殖系-特异地表达荧光蛋白报道分子已经通过该方法在果蝇(Drosophila)中使用一系列参与精子自然发生的基因比如鱼精蛋白，例如don juan和sneaky实现(Raja和Renkawitz-Pohl，2005；Santel等人，1997；Wilson等人，2006)。类似地，5′UTR可以用异源序列替代以避免在减数分裂后翻译。五个主要的非翻译区(5′UTR)，可以包含用于通过例如调控元件的方式控制基因表达的序列。
已经将启动或抑制翻译起始或5′UTRs内的内含子的序列基因表达和mRNA输出的调控相关联(Cenic等人，2011)。其在转录起始位点开始并且在编码区域的起始密码子(通常AUG)之前一个核苷酸(nt)终止。
[0221] 为了获得tTAV和效应物基因各自的足够表达，换句话说，为了获得“精子致死性，”我们用来自hsp83(Theodoraki&Mintzas，2006)和SV40(猴空泡形成病毒(Simian vacuolating virus)40或猴病毒(Simian virus)40)(Cheng等人，2009)的相应序列分别替代(在第二表达单元的上游调控元件中)β2-微管蛋白基因的5’UTR，和在一些情况下3’UTR，参见本文的讨论和本实例。
[0222] 换句话说，优选的5’UTR来自hsp83。这优选来自地中海果蝇(Medfly)，因为它是我们在具体实例中使用的，但是来自其它物种的同源物也是优选的。优选的3’UTR来自SV40，但是也可以来自hsp83(如上文对于5’UTR的物种)。然而，我们发现5’UTR的选择比3’UTR的选择更重要。
[0223] 反式激活子(这里以tTA为例)的更早表达，也可以通过以下方法中的任一个实现。一个实例是通过鉴定在精子自然发生中更早作用的启动子。这意为启动子作用从而在该启动子控制下表达的转录因子，例如tTA将能够驱动tTA-响应性效应物构建体的表达。我们偏爱这不是在生殖系干细胞中基本上活化的启动子，因为此种基因(例如vasa)在未成熟阶段表达；这将倾向于导致效应物的表达(在诱导的或去抑制的条件下)在发育的很早期表达，可能导致对生殖系的损害或生殖系的丧失并且因此不产生或产生更少的配子。如果所述表达系统在发育中晚些诱导(或去抑制)，精子自然发生的时间过程，即干细胞分裂和成熟精子的产生之间(在果蝇(Drosophila)中为几天)，会导致对诱导(或去抑制)的缓慢反应(例如不育)；该效果由雄性储存精子的能力复合。
[0224] 我们因此偏爱使用来自在精原细胞或初级精母细胞中表达的基因的启动子元件。如上文讨论的，很多在初级精母细胞中表达的基因参与之后的功能并且在减数分裂后翻译，因此我们偏爱具有减数分裂前功能的基因(和来自基因的启动子)。特别优选的基因类型是编码转录因子，或转录复合体的组分的那些，其参与精子自然发生基因(例如之后作用的基因)的表达。偏爱此种基因的关键原因是，几乎通过限定，在精子自然发生中足够早表达(以蛋白水平)，从而能够驱动其它基因的减数分裂前表达(当然此种复合体的负调控元件也是优选的，重要的是表达的时机，而不是翻译的蛋白的特异功能)。
[0225] 已知此种基因的一些类型。然而，如下文讨论的，不是所有都是合适的并且一些相对其它的是优选的。类型包括can-类型的减数分裂停止基因。该类型包括can，mia，sa，nht和rye；这些编码广泛表达的TATA-结合蛋白相关因子(TAFs)精巢特异的旁系同源物(Hiller等人，2004)。其它类型是减数分裂停止基因的aly-类型。这些包括aly，comr，achi/vis，topi和tomb，其编码序列特异的DNA结合蛋白和与称为dREAM或Myb-MuvB的广泛表达的转录调控复合体旁系同源的相关因子的复合体的组分(Beall等人，2007；Jiang等人，2007；Jiang和White-Cooper，2003；White-Cooper等人，2000)。这些基因中的大多数似乎通过保守的‘体’基因(例如在体系或生殖系中都行使功能的祖先TAFs或Myb-MuvB组分)的复制而呈现，然后专化这些版本为生殖系-或雄性生殖系特异的表达和作用。这些复制中的一些似乎在进化中相对近期发生，意味着生殖系-特异的种内同源基因以可变的，并且在一些情况下非常有限，种系发生的/分类学范围存在。我们偏爱使用从果蝇(Drosophila)到研究的物种都保守的基因的启动子，并且特别偏爱横跨宽种系发生/分类学范围保守的基因的启动子；该保守使鉴定同源物更容易，并且使特异基因更普遍有用。
[0226] 可以以以下两种方式中的一种鉴定此种(保守早期作用)基因：
[0227] 1.通过与例如来自果蝇(Drosophila)的已知基因同源，以具有合适表达模式和水平。
[0228] 这通过在序列数据库中同源性检索获得。然而，一些精子自然发生基因正在快速进化，并且特异同源物不能容易地横跨宽的种系发生范围而被鉴定。例如，bag-of-marbles(bam)满足上文的早期表达的标准-bam在精原细胞中表达(并且也在卵子发生中表达)并且早期行使功能-其参与调节精原细胞的有丝分裂数量(Gonczy等人，1997；Kawase等人，2004)。此外，bam启动子的片段已经成功用于果蝇(Drosophila)的精子自然发生(并且也在卵子发生)的二元表达系统(GAL4/UAS)(Jiang等人，2007)。然而，bam仅在果蝇
(Drosophilid)中可被识别。具有类似表达模式的其它基因(其基因产物被认为与bam的产物相互作用)是良性性母细胞肿瘤(benign gonial cell neoplasm，bgcn)。不幸的是，该基因也不是跨昆虫良好保守的；两种基因都显示正选择和快速进化的信号(Bauer DuMont等人，2007)。
[0229] 对于can-类型和aly-类型减数分裂停止基因的一些成员也产生困难。他们中的很多似乎源自据推测既用于体细胞也用于生殖系细胞的祖先基因的复本。所述生殖系版本倾向于快速进化，从而体旁系同源物比生殖系旁系同源物更容易被鉴定。此外，导致果蝇(Drosophila)中这些体/生殖系基因对的复本系列似乎发生在双翅目从其它目昆虫的趋异之后，因此大多数这些基因的生殖系-特异的种内同源基因不存在于双翅目之外，并且它们中的一些仅存在于高等双翅目中。
[0230] 然而，例外的确存在；这些容易通过与来自其它目的昆虫(例如意蜂(Apis mellifera)，赤拟谷盗(Tribolium castaneum)，家蚕(Bombyx mori)-基因组的大部分已经被测序的昆虫的列表快速增加并且容易由本领域技术人员评估)序列比较而鉴定。此种基因的一个实例是matotopetli(topi)(aly-类型基因)，其编码在双杂筛选中鉴定为结合其它aly-类型蛋白(Comr)的，推定的序列-特异DNA结合蛋白并且因此据推测是精巢-特异的Myb-MuvB复合体的组分。在果蝇(Drosophila)和冈比亚按蚊(Anopheles gambiae)中鉴定了Topi同源物(Perezgasga等人，2004)；通过公共序列数据库的序列相似性检索，我们也在一些其它目的昆虫，包括鞘翅目(Coleoptera)(赤拟谷盗(Tribolium castaneum)，NW_001092862.1)，膜翅目(Hymenoptera)(意蜂(Apis mellifera)，NW_001253507.1)中鉴定了同源物。因此Topi是具有合适表达模式的良好保守基因的实例(基于(i)FlyAtlas上和别处的定量rtPCR数据；(ii)在初级精母细胞中，尤其是早期初级精母细胞中由RNA原位杂交显示的发育表达模式(Perezgasga等人，2004)；(iii)预测的作为雄性生殖系-特异转录复合体的部分的功能(Beall等人，2007；Perezgasga等人，2004)；(iv)通过突变体表型分析的实际功能影响许多其它精子自然发生基因的表达(Perezgasga等人，2004))。
[0231] 也可以通过以下方法鉴定具有早期作用启动子的基因：
[0232] 2.从目标物种选择的基因的同源物鉴定
[0233] 来自与研究的物种具有更大或更小种系发生距离的物种的相关序列的比对将鉴定可能在目标物种的研究的基因中保守的区域。优选，为了富集研究的基因并避免内含子的问题，将使用来自提取自雄性的RNA的cDNA，最优选来自解剖的精巢。合适的启动子片段可以从所研究基因的转录区域的克隆片段获得。
[0234] 合适启动子片段的候选物在转录起始的5’包含至少50个核苷酸碱基的基因组DNA，并且优选，转录由自身起始并且转录区域的至少1个核苷酸。这将包含启动子片段和报道分子的开放阅读框。其还可以包含5’和3’UTR序列，或者来自与启动子片段相同的基因，或者来自其它区域。如果基因被正确地鉴定为在精子自然发生中是活化的，来自相同基因的那些可能在精子自然发生中行使功能，然而他们也可以包含信号，例如用于延迟的翻译，这对于必须在减数分裂前行使功能的蛋白(比如tTA)的表达将是不希望的。来自与启动子片段相同的基因的调控序列因此对于功能已知或被认为是(例如通过同源性)减数分裂前的(例如topi)的基因是优选的，但是异源调控序列对于功能已知或被认为减数分裂的或减数分裂后的基因是优选的。
[0235] 为了我们工作的目的，本实施例中，我们分离并测试了具有不同效应物蛋白的，来自地中海果蝇(C.capitata)和埃及伊蚊(A.aegypti)的topi启动子序列。
[0236] 产生后期精子表型的蛋白效应物
[0237] ‘后期’这里意为在需要精子功能的点(例如转移至雌性或进入卵)之后。目的是产生转移至雌性的精子并且将诱导雌性中对再交配的不应态，并且如果雌性的确再交配将在精子竞争方面做好。当雌性与多于一个雄性交配时，精子竞争发生，或能够发生；在此情况下，哪个雄性生育，雌性胚胎的比率是什么的问题产生。可能不转移精子的雄性在此种情况下将做得不好。由于对于使用无精子，或具有不能转移至雌性的精子，或具有转移至雌性后不能与其它精子竞争的精子的雄性的进化反应的可能(likelihood)或概率(possibility)，为了生物控制的目的，需要设计的确产生精子，这些精子能够转移至雌性并在转移至雌性后能够与其它精子竞争的不育雄性。
[0238] 父本效应致死
[0239] 我们的途径，我们青睐的实现“不育”的方法是构建父本效应致死，其中精子进入卵，但是无可成活受精卵(能够发育为可育成体)形成。优选地，该效果由具有单拷贝的父本效应致死的雄性产生，尽管使用多拷贝也是可预见的。将雄性纯合释放到环境中用于条件父本效应致死是特别是优选的，这样在饲养过程中株基本上稳定。本发明的父本效应致死(Pals)典型地影响由携带至少一个拷贝Pal的雄性产生的精子中的全部或大多数。尤其，所述受精卵可以受不利影响，例如基于亲本的基因型被杀死，被绝育或其发育(例如性别表型被改变。这与RIDL相反，其中对受精卵的影响基于胚胎基因型。因此，对于在单个位置的RIDL构建体，野生型雌性和雄性杂合之间交配的后代将典型地产生～50％正常后代和经遗传获得RIDL构建体并可以受其影响的～50％。相反，对于Pal，雄性杂合的所有后代都可以受影响。
[0240] 一些类型的基于蛋白的效应物是可预见的。蛋白或RNA效应物可以随精子被传输以影响卵或发育的受精卵。这些可以在精子表面(例如如果蝇(Drosophila)性肽，SP)，或在其内部产生和储存。精子自然发生的其它阶段的精子和细胞，对一些类型的蛋白，例如促凋亡蛋白有显著抗性，据推测因为凋亡途径被指定于精子自然发生中的其它目的(Arama等人，2003；Cagan，2003)。
[0241] 优选所述效应物对精子具有直接的生物化学效果，而不是仅使用精子作为通过其进入卵的载体(并随后在那里具有效果)。这是由于考虑到可能的抗性。在SIT-类型计划中，在人工饲养设施中产生释放的雄性，从而它们和它们的基因型在一定程度上在控制下，或与可能从相同物种的野生群体被鉴定或排除相比，至少变异可以可能更容易被鉴定或排除。作用于卵(或发育中的受精卵)的生物化学效果可以可能通过那个卵中的改变被改变或缓和；如果这些可遗传，那么至少存在可能的对产生该生物化学效果的毒素的可遗传抗性的基础。相反，在其进入卵之前(或在其进入雌性之前)，难以看到母系或合子基因型怎样能够补偿已经对精子进行的至少一些类型的损害。此种损害的一个实例是对精子包含的遗传信息的损害，其它实例(尽管可能关于母系/合子基因组补偿能力具有较弱的确定性)，包括早期过程的关键组分的丧失或损害比如例如精子膜破裂或精子核去凝缩，或中心体功能。
[0242] 父本效应致死的一种优选类型是核酸酶。尽管精子对受精卵贡献很多东西，一个关键的东西是遗传信息。如果该遗传信息被损害到部分或(优选)基本上所有受精卵不可成活的程度，那么这形成通过父本效应致死性的不育的合适形式的基础。如例如在常规不育昆虫技术中使用的辐射-绝育是条件(在通过辐射可诱导的情况下)父本效应致死性的实例；用化学不育剂，例如噻替派(thiotepa)的绝育是另一个。这些方法中的每个通过损坏精子中DNA，从而降解携带至很多受精卵死亡的点的遗传信息，而产生效果(Robinson，2005)。化学不育剂比如噻替派(thiotepa)和bisazir，例如，可以留下毒性残留并且通常认为对于广泛使用是不可接受的。
[0243] 在精子中，或在精子自然发生过程中合适核酸酶的合适表达，将具有破坏配子的遗传信息，或产生配子而不类似地破坏雄性体细胞的遗传信息的效果。这将降低与绝育过程相关联的使雄性失能的程度。相反，使用辐射或化学不育剂典型地大致相等地将所有细胞暴露于绝育剂。
[0244] 合适的核酸酶是切割DNA，优选产生双链损伤的那个。影响遗传信息的储存或解释，或例如通过细胞DNA修复机制导致直接切割或修饰DNA的DNA-修饰酶，在此也归类为核酸酶；将理解对‘切割’DNA的引用，例如，因此适当包括‘修饰’DNA。
[0245] 合适的表达是条件表达，从而在限制性条件(对于可育性，显然这些是表达核酸酶的容许条件)下，来自携带至少一个拷贝的包含核酸酶父本效应致死系统的雄性(‘PAL雄性’)的至少30％，优选多于50％和最优选＞90％的精子不能使卵受精以形成能够存活以在典型地饲养条件，例如如在野外建立的条件，或近似于野外建立的条件的实验室条件下产生可育成体的可成活受精卵。相反，在容许条件下(对于可育性)，相当的PAL雄性应该比限制性条件显著产生更多的可成活受精卵；优选至少50％的受精卵应该存活。
[0246] 优选地，在雄性表达中核酸酶基本上受限于生殖系。在这可以意为表达基本上限制于雄性生殖系的同时，这不是关键的。对于一些应用，排除雌性是所需的(例如SIT中的遗传雌雄鉴别(Alphey，2007；Franz，2005))。在雌性被排除掉的情况下，在雌性中表达核酸酶可以不是不可取的。实质上，如果用于排除，或帮助排除雌性，其可以是所需的。这会是可能的‘双重用途’的实例-使用核酸酶既作为PAL也作为(合子)显性致死以杀死一些或全部雌性。已知很多核酸酶。相关类型包括限制性核酸内切酶和锌指核酸酶和转录激活剂样效应物(TALE)核酸酶(Hockemeyer等人，2011；Mahfouz等人，2011；Miller等人，2011)和归巢核酸内切酶。不同类型和一类中的不同成员在或接近它们切割的位点处显示不同水平的序列特异性。理论上，具有很高程度序列特异性的酶将在每个基因组的相对小量的位点切割，可能仅有一个。这不是优选的，因为其允许通过目标位点的突变或改变导致的抗性的可能性。在特异序列重复很多次的情况下，从而尽管对于相对长的识别序列有相对高程度的特异性，在基因组中存在多个位点，这是更可接受的。然而，我们偏爱核酸酶在每个基因组具有多个目标位点。这意为识别对于名义上的目标序列不完全特异性的，然而以多个拷贝存在于基因组中的相对长的序列或相对短的识别序列或目标序列内显著程度的冗余，或实质上具有很小或根本无序列特异性的核酸酶。I-PpoI是这种类型，具有长的识别序列，但是其在rDNA的高度保守区域内，其存在于每个基因组的多个拷贝中。I-PpoI另外进一步讨论。
[0247] 已经描述了锌指核酸酶(ZFNs)，其中各个锌指提供对短核苷酸序列，例如3核苷酸的序列-特异性结合。因此通过将多个此种锌指组合在单个蛋白中可以提供更高的亲和力和更大的序列特异性。如果将这与核酸酶，例如限制性核酸内切酶FokI的核酸酶结构域组合，人工的序列-特异性核酸酶可以被构建，其具有任意的序列特异性(Kim等人，1996)。此种合成的锌指核酸酶已经被开发用于基因治疗的目的，例如(Urnov等人，2005)。相当大的尝试已经转向例如改善其特异性，以减少对基因组中单个位点的切割，(Miller等人，2007)。在果蝇(Drosophila)的实例中，锌指核酸酶当在转基因果蝇中表达时产生，特异损害目标位点，例如yellow和之后还有rosy和bw位点(Beumer等人，2006；Bibikova等人，
2002)。观察到不想要的副作用，其是使用的一些ZFN的高水平表达有毒性。进一步显示该毒性依赖于核酸酶，而不是毒性ZFN的DNA结合活性(Beumer等人，2006)。尽管不是基因靶向所需，该更广泛的特异性对于我们在一些或很多位点产生损害的目的是有吸引力的。
[0248] 使用归巢核酸内切酶(HEGs)通常不是优选的，因为它们倾向于识别相对长的(15-40bp，尽管常接受对普通目标序列的一些错配)核苷酸序列，其因此在很多昆虫基因组中即使真的有也很少发生。可接受识别/切割位点的最小数量是每个二倍体基因组一个；每个单倍体基因组一个是优选的并且每个单倍体基因组识别/切割多个位点是特别优选的。可能不适当的HEG的实例是I-SceI。最初分离自酵母(酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae))线粒体的I-SceI已经作为允许或促进靶向的同源重组的系统的部分用于果蝇
(Drosophila)(Gong和Golic，2003；Rong和Golic，2000；2001；Rong等人，2002)。对于那个同源重组系统的I-SceI的一个有吸引力的特征恰恰是I-SceI不容易切割黑腹果蝇
(Drosophila melanogaster)基因组中的任何内源序列，并且将因此倾向于在转基因上插入物的设计的位点处特异切割。尽管一些其它昆虫基因组可以偶然具有一个以上被I-SceI识别的位点，该酶对于本发明中的使用通常不是优选的。每个基因组切割多个位点的归巢核酸内切酶的一个实例是PpoI。尽管它具有相当特异的，长识别位点，其对应于rDNA基因中高度保守的序列。因为在所有真核基因组中存在该rDNA基因的多个拷贝，多个目标位点可用。存在可能的借以‘有抗性’，即对PpoI-介导的切割有抗性的机制，比如基因转变，此种基因的突变可以通过rDNA序列散布，然而存在足够拷贝的此种抗性基因组的风险(其中这些位点全部或几乎全部变得有抗性)似乎相当低的的序列。已经显示I-SceI和PpoI在蚊子(冈比亚按蚊(Anopheles gambiae))组织培养细胞中都行使功能(Windbichler等人，2007)；因为研究者可以预期PpoI的表达对细胞有害，导致细胞增殖停止，然而I-SceI是相对无害的。
归巢核酸内切酶一种类型的自私DNA元件，其可以通过真菌群体(它们从中被鉴定)扩散。在动物中无已知的归巢核酸内切酶，但是有人建议它们的异常性质(切割同源的不携带HEG的染色体并且通过细胞的DNA修复机制复制于其中(Burt和Trivers，2006))可以用于构建‘基因驱动’系统(Burt，2003)；已经使用I-SceI和人工目标位点完成了原理验证(Windbichler等人，2011)。基因驱动系统是通过其中要扩散的基因不赋予简单的选择优势的目标群体例如野生群体扩散基因的系统(例如Alphey等人，2002)。
[0249] 除了‘常规’使用HEG作为基因驱动系统(其类似它们的天然扩散系统并包括将HEG复制入切割的DNA)外，有人还建议特异切割X染色体的位于Y染色体上的HEG可能产生雄性，其中仅可成活配子是携带Y的(Deredec等人，2008)。
[0250] HEGs典型地识别15-40bp的目标位点。ZFNs每个锌指识别大致3bp。在典型的情况中，ZFNs需要二聚化以切割DNA；这意为18bp的有效识别序列。特异的18nt序列将典型地在418核苷酸(其是约7x1010核苷酸或7000Mb)中出现一次。为了比较，昆虫基因组典型地是数百Mbp，并且人基因组为约3000Mbp，因此此种序列将典型地出现0-1次/基因组。当然这是简化的计算，并且忽略了GC含量，重复DNA等的影响，但是基本点仍然保持，即此种长识别序列的特异性对于需要特异性的目的，比如基因治疗和基因靶向是所需的，但是具有更短识别序列的分子对于两次以上切割基因组的目的通常是优选的。
[0251] 一个此种类型的酶是限制性核酸内切酶。这些典型地具有4-10bp的识别位点，其10 6
将典型地切割真核基因组很多次(4 为大致1x10)。一些限制性核酸内切酶对底物DNA的甲基化状态敏感；对甲基化不敏感或切割以目标基因组的原因特征修饰的DNA酶是优选的。例如，黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)基因组DNA基本上是非甲基化的，因此酶比如DpnI(其仅切割腺甲基化的DNA)不是优选的。相反，为了切割相同的序列(GATC)，备选酶比如DpnII，MboI或Sau3AI将是优选的。对甲基化不敏感的和已知核酸酶结构域在一系列细胞类型以及体外行使功能的FokI，是特别优选的。
[0252] 核酸酶需要部具有任何实质的序列特异性。核酸酶的其它优选类型是其中例如来自FokI的核酸酶结构域，与DNA结合结构域(所述DNA结合结构域具有很少或不具有序列特异性)组合的类型(尽管对于一些类型DNA相对于其它的一般偏好，例如对于富GC或富AT区域或序列，是可接受的)。此种类型效应物的特别优选的实例是鱼精蛋白-核酸酶和组蛋白-核酸酶融合。鱼精蛋白-核酸酶融合的一些优点在上文描述。两种类型的核酸酶结构域是可预见的。第一，需要结合至少一个其它蛋白(与其自身(同源二聚体)或与至少一个不同蛋白(异源二聚体))(‘二聚化’；将理解对于形成更大复合体，例如三聚体，四聚体等的需要包括在本项中)以切割DNA的类型；第二，不需要这样二聚化的类型。
[0253] 这些两种类型之间的关键差异是它们的浓度/功能关系。不需要二聚化的酶将与其浓度成比例而广泛地行使功能。因此很低浓度将产生一些DNA损害或修饰；更高浓度将产生更多。当条件表达系统产生相对少量的效应物时，这是有利的。精子自然发生的时间过程可能产生效应物至少一些小时以作用，并可能更长。相反，的确需要二聚化的酶将典型地具有非线性剂量反应的功能。特别是对于可以在基因组中很多位点结合的酶，在低浓度不可能两个酶分子将以如此种能够切割的方式接触。在更高浓度，可能远超成比例的(典型地对于同源二聚体以浓度的平方增加，对于同源三聚体以浓度的立方增加，等)。在例如，所述条件表达系统有点渗漏，在除了在预期细胞中(例如除了在雄性生殖系，或作为其它实例在其中预期的表达仅在精原细胞中或在精子自然发生的后期阶段的雄性生殖系细胞中之外)之外的至少一些细胞中产生低、非零水平的效应物的情况下，这可以是有利的。然后该低‘基本’表达应该相对无害，或至少在非目标细胞中在其活性方面相对其在目标中的活性显示超过线性的不同。
[0254] 其它相关类型的渗漏活性涉及条件表达系统的条件性-不可能应该是‘关’的条件将事实上产生零表达，因此扩大‘开’和‘关’状态的表型差异的另外的系统，比如该系统是所需的。注意，这些放大和可能的好处应用于其它类型的效应物。在核酸酶效应物内，它们应用于锌指核酸酶以及应用于鱼精蛋白-核酸酶等。尤其，FokI核酸酶结构域需要二聚化以切割DNA。通常这通过同源二聚化。然而，已知改变这点的变体。所述两种核酸酶结构域可以包括在相同蛋白中，通过合适接头连接，从而不需要二聚化(即分子内，而不是分子间的二聚化足以)。同样，已知FokI的突变体，其中需要异源二聚化(Miller等人，2007)。注意，不需要两个二聚化结构域中的每个都具有核酸酶活性。这允许获得更好特异性的其它方法。需要异源二聚化的两个(或更多)蛋白可以在分开的控制(例如转录控制，而且还有例如翻译或降解控制)下表达。仅两种结构域都表达的细胞将具有显著活性。因此，也不容许其它蛋白的渗漏表达的细胞中一个蛋白的渗漏表达将具有很少的或不具有负作用。实施例
[0255] 实施例1：生殖系特异的启动子
[0256] 为了测试分离的启动子区域的适用性，荧光蛋白可以用作报道分子，并且特别是四环素响应性转录激活剂(tTA)和荧光蛋白间的融合。这允许既允许蛋白表达的直接可视化，而且还允许进一步测试由为了以在精子自然发生中行使功能的条件二元表达系统的部分使用的特定目的的候选的合适启动子片段引导的表达的时机和水平的适用性。来自此插入物的报道分子的表达说明候选的合适启动子片段的活性。评估一些此种插入品系允许确定启动子片段可能的适用性。由于‘位置效应’，一些插入品系应该被检测；插入基因表达凭借的公知的现象是受其插入的染色质环境影响(Wilson等人，1990)。
[0257] 如上测试所述候选的合适启动子片段在雄性生殖系作为可以条件表达系统的部分行使功能的实际能力，但是包括例如编码tTA或相关序列合适的表达系统，或其相关组分。在上文的报道分子测试中使用tTA-荧光蛋白(tTA-FP)融合允许使用用于两种测试的相同的插入品系，或插入品系组。容许从所述表达系统表达的条件下横跨合适的品系，例如tRE-X(其中X可以是效应物或报道分子)，将允许确定所述表达系统(启动子-tTA，tRE-X)在精子自然发生中是否行使功能和，例如通过对解剖的精巢的荧光显微，确定X和/或tTA-FP在哪表达、何时表达和表达多少。抑制表达条件下的类似实验将允许确定表达系统是否是条件的。
[0258] 如果表达研究表明，候选的合适启动子片段事实上不合适，研究者可以采用来自相同基因的不同启动子片段。此种改变的片段典型更长，因为原片段可以被删除一些重要的调控元件，然而在表达是特异的但在发育中太晚(例如减数分裂后)的情况下，即使启动子片段源自的基因被认为(例如基于RNA原位数据)足够早期被转录，删除一些元件，尤其是UTR元件，以去除翻译延迟信号可以是所需的。测试更长或更短的片段以鉴定对基因表达水平和暂时的和组织特异性是必要的或影响基因表达水平和暂时的和组织特异性的启动子区域也可以是所需的；该方法已经被广泛用于分析启动子并且可以简单地用原候选启动子片段的变体通过重复上述过程实现。
[0259] RNA原位杂交实验表明地中海果蝇(Medfly)β2-微管蛋白转录在地中海果蝇(Medfly)精子自然发生的早期至晚期阶段。假设地中海果蝇(Medfly)β2-微管蛋白转录本与Dmβ2-微管蛋白类似的阶段起始，其在减数分裂前并且从晚第三龄幼虫期合成，之前在发育的精巢中存在显著减数分裂。已经开发使用该基因启动子的精子标记系统用于蚊子史氏按蚊(Anopheles stephensi)(Catteruccia，Benton等人2005)和埃及伊蚊(Ae.Aegypti)(Smith，Walter等人2007)，在我们针对精子致死性的研究时期过程中用于地中海果蝇(Medfly)(Scolari，Schetelig等人2008)和之后用于加勒比果蝇，加勒比按实蝇(Anastrepha suspensa)(Zimowska，Nirmala等人，2009)。据此，我们使用以下引物从地中海果蝇(Medfly)基因组扩增了β2-微管蛋白启动子：
[0260] 正向：CTCCCGTGCGATATCCTAGGCCCCATGTTACAAGGCTG(SEQ ID NO：53)
[0261] 反向：
[0262] AGCCATTTTGGTTAATTGAAATCCCTAAAA下AAATGTAATTCATTTTTCG(SEQ ID NO：54)[0263] 构建体OX3671(图16)含有融合于DsRed2序列的地中海果蝇(Medfly)β2-微管蛋白启动子(1556bp启动子片段扩增自地中海果蝇(Medfly)基因组DNA)。大多数Ccβ2-微管蛋白3’-UTR序列被删除或由通常使用的3′-UTR-SV40(已知在多个物种中表达)替代。表达转基因应该导致在适当激发滤光片下精子发红色荧光。DsRed2表达在获得的所有三个品系中的转基因雄性腹部是明显可见的，其中两个区域具有更强的荧光，看似精巢(数据未显示)。
[0264] 为了进一步评估DsRed2标记在精子中是否表达，解剖性成熟转化的雄性的精巢。结果表明，与来自野生型雄性的精子相比，成熟精子呈现强烈的DsRed2表达。在与B2-微管蛋白表达模式的比对中，早期精母细胞不呈现荧光，其在精子自然发生的精细胞阶段开始明显可见。
[0265] 为了测试使用二元“tet-关系统”我们是否会获得类似的荧光表达模式，建立两个荧光报道分子构建体；OX3866(图14)(tetO-微型启动子-DsRed2-mls)和OX3867(图15)(与DsRed2融合的tetO-微型启动子-鱼精蛋白)。tetO-微型启动子元件公认为tRE并且是优选的。在OX3866(图14)中，DsRed2报道分子融合于膜定位信号(mls)，预测其导致表达后任何表达的荧光蛋白为膜结合或相关的，然而在OX3867(图15)中，DsRed2融合于果蝇(Drosophila)鱼精蛋白。以驱动体细胞中tTAV表达的启动子测试两种报道分子基因并且发现是有功能的。
[0266] 按照β2-微管蛋白启动子驱动精子中DsRed2表达的研究结果，尽管对于我们的目的来说太晚，以驱动tTAV-荧光融合基因的地中海果蝇(Medfly)β2-微管蛋白启动子设计构建体OX3831(图20)并从OX3671(图16)修饰。在该构建体中，在tTAV蛋白将随后在精子自然发生过程中更早期表达的推测下，果蝇(Drosophila)aly5’UTR区域替代了β2-微管蛋白启动子的5’UTR区域。因为TurboGFP序列与tTAV融合，OX3831(图20)转基因雄性的精子应该在适当的激发滤光片下呈现绿色荧光。为了测试这点，解剖来自七个转基因品系的成体雄性并在荧光显微镜下观察。尽管荧光表达在未解剖的雄性的精巢中不容易看到，但在解剖的OX3831(图20)成体雄性的精巢中，荧光表达在精细胞束中可见。一些品系比其它品系表达更强荧光，但是OX3831(图20)株中的所有精细胞呈现荧光精巢-特异的精子标记表达。
[0267] OX3831-杂合蝇与OX3866-和OX3867-杂合蝇(分别为图14和15)(tetO-DsRed2株)杂交。将多于20只以无四环素食物饲养的(即tetO-DsRed2表达的容许条件)，以不同杂交和在不同时间的成体雄性后代解剖并在高倍荧光显微镜下观察。仅一个雄性显示强烈的DsRed2表达，其在一些精细胞束中可见。在其它雄性中，在任何精细胞束中都未检测到DsRed2表达。仅一个雄性呈现强烈的DsRed2表达的可能原因是由Ccβ2-微管蛋白启动子驱动的tTAV-荧光的后期转录和翻译。该后期表达可以意为对于tTAV有足够的时间以结合tetO序列和在减数分裂前进一步诱导足够的DsRed2转录本。根据我们的结果，仅是偶然，一些雄性中的精母细胞中的一些具有足够的在减数分裂前积累的DsRed2转录本并且DsRed2荧光可以在精细胞束中被检测。使用tTAV特异引物对OX3831(图20)雄性的分离的精巢和尸体的反转录酶PCR分析，表明5’UTR-aly Ccβ2-微管蛋白启动子的精巢-特异性。
[0268] 在这个阶段，显然tTAV的甚至更早表达是必要的以允许在雄性生殖系中足够表达报道分子基因。为此，我们开发和测试了构建体OX4282，其含有Hsp83基因的5’UTR。Hsp83在地中海果蝇地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))的生殖系和体细胞中都强烈表达并且不认为包含任何延迟翻译信号。在构建体OX4282中，报道分子基因；TurboGFP，不融合于tTAV序列，但是与tetO序列相邻设置。此外，在尝试中将tetO-报道分子和启动子-tTAV组分组合于单个质粒中从而以更直接的方式评估Hsp835’UTR。tTAV应该被表达在转化个体的雄性生殖系中并且，在缺失四环素的情况下，通过结合tetO应该诱导相邻TurboGFP标记基因的表达。换句话说，当关四环素饲养时，携带该构建体的那些株的雄性精巢应该显示TurboGFP表达，并且表达应该被四环素抑制。精巢解剖在缺少四环素的情况下饲养的成体雄性，揭示6个测试的品系的三个中存在强烈的绿色(turboGFP)荧光。
[0269] 在其它品系中未观察到TurboGFP表达的事实可能由于转基因插入物的位置效应。在呈现TurboGFP荧光关四环素的品系中，表达由四环素完全抑制(数据未显示)。
[0270] 将OX4282雄性与OX3867(tetO-鱼精蛋白-DsRed2)(图15)雌性在各笼中杂交以进一步检测启动子驱动报道分子基因足够表达的能力；在此种情况下DsRed2使用“tet-关”二元条件系统。
[0271] 可以在精子自然发生的不同阶段(在延长的精细胞和精母细胞二者中)检测TurboGFP表达，尽管红色荧光仅在延长的精细胞但是未在早期精母细胞中检测到(图3)。在精细胞的精子头(核定位处)和尾都检测TurboGFP表达。
[0272] 上述结果表明，与tTAV表达相比，存在报道分子基因(本实验中为DsRed2)表达的稍微延迟；因为这由观察到的绿色荧光的量估计。考虑到红色荧光在精子自然发生的后期(延长的精细胞)明显，可能报道分子在减数分裂前转录但是在减数分裂后翻译。
[0273] Dmtopi是精巢-特异的基因，其编码生理上与Comr相互作用的精巢-特异的锌指蛋白(Perezgasga，Jiang等人2004)。Dmtopi对于Aly或Comr的核定位不是所需的，但对于其在染色质上的积累是所需的。在果蝇(Drosophila)中，尽管对于表达依赖于aly或comr的所有基因也依赖于achi/vis和/或topi，但存在一些基因，其转录依赖于achi/vis和topi，但是不依赖于aly或comr(Perezgasga，Jiang等人2004)。可能更显著的是，很多aly-类型基因似乎产生自基因复制。复制之后，一对中的一个承担体作用并且另一个承担生殖系作用。就使用这些基因作为宽范围的昆虫中雄性生殖系启动子的来源而言，这具有两个限制。
[0274] 第一，所述两个基因可以非常类似，使得相对难以鉴定生殖系-特异的版本。第二，和更加显著的是，很多这些复制似乎都非常近期。多数昆虫可以因此具有祖先版本(其是既执行生殖系功能也执行体功能的单个基因)，并且因此无分开的生殖系基因和启动子。topi在这方面是不寻常的，因为它不具有明显的体替代物，并且它还似乎比aly-类型复制中的大多数更古老。因此可能比其它aly-类型基因在更宽范围的昆虫中提供可能的生殖系-特异的启动子。对这点的一个注意事项是，topi序列保守性是明确的，但是功能保守型，和尤其是topi在其它昆虫中的表达模式，通常未知。然而，该保留意见也适用于其它雄性-生殖系基因。由于这些不同原因，选择topi用于雄性-生殖系启动子来源的进一步研究。
[0275] 在地中海果蝇(Medfly)中开发基于topi的构建体之前，首先在蚊子埃及伊蚊(Ae.Aegypti)中测试topi的表达模式的保守性；基因组序列的可用性意为topi同源物和推定的启动子片段可以快速被分离。RISH(RNA原位杂交)结果显示埃及伊蚊(Ae.Aegypti)topi(Aetopi)基因转录从初级精母细胞阶段开始；表达谱类似果蝇(Drosophila)精巢中Dmtopi的表达谱(Perezgasga，Jiang等人2004)。开发了埃及伊蚊(Ae.Aegypti)转基因株(OX4286，图23)，具有由1233-bp序列(包括1168bp的Aetopi启动子和65bp Aetopi 5’-UTR)驱动的tTA表达。将3个独立的OX4286(图23)系与tetO-报道分子株(OX3978，tetOAehsp70微型启动子-Amcyan，图24)杂交后，在以无TET饮食饲养的全部三个杂交中的精巢和精子自然发生细胞中都看到明显的Amcyan表达(数据未显示)。表达是四环素-可抑制的。
[0276] 在显示埃及伊蚊(Ae.Aegypti)topi启动子诱导tTAV的精巢-特异表达和后续的报道分子基因的表达之后，分析地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))topi的表达模式。在地中海果蝇(Medfly)中使用该基因核苷酸序列，设计因无以验证Cctopi在地中海果蝇(Medfly)中是精巢-特异的基因。将解剖自十只野生型雄性的十对精巢用于提取RNA(解剖详情见2.6.4.3部分)。从生育的尸体提取RNA以提供非精巢对照。使用引物TopitestF1’：和‘TopitestR’的反转录酶分析用于这些PCR。结果确认Cctopi表达是精巢-特异的。RISH也证明Cctopi在地中海果蝇(Medfly)精巢中转录(数据未显示)。因此选择此基因启动子在用于开发转基因株中精巢-特异表达的新构建体中使用。
[0277] TopitestF1引物：GTAACTCCCGTTCCTGAGACAACA(SEQ ID NO：55)
[0278] TopitestR引物：CGATATGGAGTGGGTGAAACCTCA(SEQ ID NO：56)
[0279] 构建体OX4275(图25)包含来自Cctopi的驱动DsRed2的推定启动子片段(1178bp)(SV403’UTR)。来自以该构建体获得的所有株的成体雄性的解剖的精巢不显露DsRed2表达的任何信号(数据未显示)。为了进一步测试Cctopi启动子，开发了具有相同启动子序列的驱动tTAV表达的构建体(OX4254，图26)。将OX4254-杂合蝇与异性的OX3867(tetO-DsRed2)(图15)杂合蝇(tetO-DsRed2株)杂交并且将这些杂交的成体雄性后代解剖并评估红色荧光。在那些雄性精巢的任何精细胞束中都未检测到DsRed2表达。
[0280] 因为OX4275(图25)和OX4254(图26)中推定的Cctopi启动子的长度短可以导致显见功能的缺失，基于以下改进制备了新构建体-OX4371(图27)。该构建体含有来自推定的Cctopi编码区域的1708-bp序列，比之前的包括484bp可能的编码序列和编码区域的保留的部分的55bp内含子的构建体多出超过530bp。因为在其N末端与其它蛋白融合后tTAV通常不行使功能，在Cctopi编码区域和tTAV之间使用228bp泛素基因序列(基于果蝇(Drosophila)泛素的但是优化用于在一系列昆虫表达的序列，由Geneart Ltd合成)以在翻译后通过泛素蛋白酶的切割分开两个基因产物(Varshavsky 2005)。该构建体既含有新设计的驱动tTAV的Cctopi启动子也还有tetO-Dmhsp70微型启动子-TurboGFP报道分子。因此，应该通过在其幼虫饮食中无四环素的情况下饲养的雄性的精巢中的荧光检测tTAV的表达。在来自两个测试的品系中的一个中关四环素饲养的OX4371(图27)雄性成体的解剖的精巢中检测到精子自然发生细胞中的弱TurboGFP表达。在开四环素条件下饲养的任何雄性的解剖的精巢中未检测到TurboGFP表达，表明可抑制的表达。
[0281] 产生和分析以OX4371(图27)，OX4391(图22)株操作的并发事件。
[0282] OX4391(图22)在一个方面不同于OX4371(图27)：OX4371(图27)中的tTAV的SV403’UTR由OX4391中的Cctopi内源3’UTR替代(图22)。如之前提到的，3’-UTR可以影响特定mRNA的命运，例如转录本稳定性或翻译水平(Mazumder，Seshadri等人2003)。考虑到已经显示3’UTR在mRNA加工中发挥重要作用，我们假想来自Cctopi的内源3’UTR可以将基因的所需的表达模式赋予我们的tTAV转基因。使用反转录PCR扩增Cctopi 3’-UTR。将来自6个OX4391(图22)株的在关四环素下饲养的2-3日龄的雄性成体的精巢解剖。3株显示在雄性生殖系细胞中强烈的TurboGFP表达。在其它三株中检测到弱荧光。
[0283] 为了进一步测试新设计的topi启动子序列，我们将OX4391(图22)雄性(以无四环素饮食饲养)与野生型雌性杂交并且评估解剖的纳精囊中荧光的存在。在荧光显微镜下检查储存在纳精囊中的精子证明TurboGFP实际上是可检测的。
[0284] 上述结果表明我们的分离的topi启动子序列(如上文描述的)在雄性生殖系中表达并且足够驱动精巢中tetO报道分子基因的表达。与包含tetO-核酸酶转基因的蝇的杂交在之后讨论。
[0285] 实施例2效应物蛋白
[0286] 本工作的目的是产生转移至雌性的精子并且将导致低的或实质上无胚胎(否则雌性会产生的)存活。相同的精子应该诱导足够的对雌性中再交配的不应态，同时如果雌性的确再交配将在精子竞争方面表现良好。对此，我们的方法是构建父本效应致死，借此，精子可以进入卵，但是无可成活受精卵(能够发育为可育成体)形成。理想地，该效果由具有单拷贝父本效应致死的雄性产生，尽管多拷贝的使用也是可预见的。还优选效应物对精子具有直接的生物化学效果，而不是仅使用精子作为进入卵(并随后在那里具有效果)所通过的载体。这是由于对可能的抗性的考虑。核酸酶是对于本发明的目的的优选的选择。理论上，如果由精子携带的遗传信息被损害至一些或(优选)基本上全部受精卵不可成活的程度，那么这形成形成通过父本效应致死性的不育的合适形式的基础。在尝试中已经探索不同类型的核酸酶诱导精子特异的损害。作为“tet-关”二元条件系统的部分测试所有核酸酶；其连接于tetO序列。该方式允许与不同生殖系特异的启动子序列组合评估各种效应物蛋白，而无产生新转化子株的负担。此外，其就未来应用而言提供更现实的状况。
[0287] 已经描述了锌指核酸酶(ZFNs)，其中各个锌指提供对短核苷酸序列，例如3个核苷酸的序列-特异的结合。可以通过将多个此种锌指组合于单个蛋白提供更高的亲和力和更好的序列特异性。如果将这与核酸酶，例如限制性核酸内切酶FokI的核酸酶结构域组合，可以以任意的序列特异性构建人工序列-特异的核酸酶。我们已经通过将这些品系与不同雄性生殖系特异的启动子杂交测试ZFNs可以在延长的精细胞中产生DNA破坏的假想。设计和测试了两个(OX4103)(图18)和三个(OX4104，图19)锌指核酸酶构建体。之前的通过与在体组织中表达的启动子-tTAV品系杂交的评估，表明3-锌指核酸酶呈现更好的“致死”效果并且因此将这些品系中最强的用于本工作的目的。该核酸酶因此是优选的。
[0288] 归巢核酸内切酶是典型地由内含子编码的一种类型的限制性内切酶的。它们作用于合成它们的细胞的细胞DNA并且它们倾向于识别相对长的(15-40bp，尽管经常接受对正常目标序列的一些错配)核苷酸序列，其因此在任何给定昆虫基因组中就算真的有也很少发生。可接受识别/切割位点的最小数量是每二倍体基因组一个；每单倍体基因组一个是优选的并且每个单倍体基因组识别/切割多个位点是特别优选的。每基因组切割多个位点的归巢核酸内切酶的一个实例是IppoI。尽管这具有相当特异的，长识别位点，其对应于rDNA基因中的高度保守序列。因为该rDNA基因的多个拷贝存在于所有真核基因组中，多个目标位点是可用的。设计和测试了tetO-IPPO1(OX4112，图17)构建体。
[0289] 限制性核酸内切酶具有4-10bp的识别位点，其将典型地切割真核基因组很多次。此种核酸酶不具有实质的序列特异性。FokI(其对甲基化不敏感并且对于其，已知核酸酶结构域在在一系列细胞类型中以及体外行使功能)对于我们的目的是特别优选的。与具有很少或无序列特异性的DNA结合结构域组合的FokI核酸酶结构域是特别感兴趣的。类型效应物的优选的实例是鱼精蛋白-核酸酶融合。鱼精蛋白-核酸酶融合的优点是需要与其自身(同源二聚体)或与至少一种不同蛋白(异源二聚体)二聚化(或多聚化)以切割DNA。的确需要二聚化的酶将典型地具有非线性剂量响应的功能。特别是对于可以结合在基因组中很多位点的酶，在低浓度可能两个酶分子将以此种能够被切割的方式相遇。条件表达系统渗漏-通过启动子或通过条件系统自身之一，除了在预期的细胞(例如除了在雄性生殖系中之外)之外在至少一些细胞产生低的，非零水平的效应物，可以是有利的。已经设计和测试了tetO-鱼精蛋白-Fok1构建体(OX4458，图21)。
[0290] 在之前提到的二元系统中评估雄性不育被称为“卵孵化率测定或实验”。设计的图示在图1中说明。启动子品系驱动雄性生殖系中tTAV的表达，优选在别处具有很少或无表达，同时效应物品系连结于tetO序列，其表达与tTAV相关，二者是时间和空间上的。启动子和效应物品系中的转化标记使用不同荧光基因用于精确评估结果，即在适当激发滤光片下启动子品系发绿色荧光，同时效应物系发红色荧光。效应物(E)和启动子(P)品系在无四环素，即容许(表达)条件下杂交。收集来自这些杂交的卵并分为容许条件(无四环素)或抑制条件(有四环素)并从而饲养。对于品系特异的荧光标记的表达筛选蛹并且收集双杂合子-两种标记都具有。Ecclosion之后将这些对核实相等的雄雌比和雄性与野生型雌性杂交-同样开或关tet。双杂合子雌性与野生型雄性杂交用于测试任何观察到的效果是否是性别特异的。野生型控制被包括为卵孵化率的参考点。收集和计数来自杂交的卵。三天后重复计数并且评估未孵化卵的数量。
[0291] 图1.：卵孵化率测定的设计。
[0292] 许多这些杂交的结果在下文显示。这里提供的所有杂交遵循上文描述的基本设计。
[0293] OX4282(PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-tetol4-cc微管蛋白-hsp83-tTAV-SV40)x OX4104(PB-YAFN-hsp83-tetO21-Hr5-IE1-Red)(图19)
[0294] 图2.开和关四环素下OX4282-OX4104雄性不育。将三个独立的，携带由来自地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))基因(I，L，G)的β2-微管蛋白启动子的四环素可抑制反式激活子(tTAV)的OX4282转座子的常染色体插入品系与携带tetO-3锌指效应物的品系OX4014。以有(100μg/ml；tet+)或无四环素(tet-)的饮食饲养和繁殖这些杂交的后代。将携带驱动物和效应物等位基因二者的雄性与野生型雌性杂交并且计算获自这些杂交的卵的孵化率(孵化的产的卵的百分数)。对于每个杂交使用每组100-150个卵的两组不同的卵收集物。使用在存在或缺少四环素的情况下与野生型雌性杂交的野生型雄性作为对照。
观察到高度显著雄性不育的杂交(卡方检验，*表示P＜0.01，**表示P＜0.001)用星号标记。
[0295] 将三株OX4282品系与之前当与两个遗传启动子(Hsp83和OP)杂交时显示有希望的结果的3个锌指品系(OX4104，图19)。对于含有两种质粒的蝇未记录到负效应，表明效应物在体组织中的基础表达不足够高以显示负效应。从品系L和从品系I仅观察到14％和27％卵孵化。从品系G在卵孵化方面也无显著降低。品系L和I包含单拷贝的转基因，与含有两个(或更多个)拷贝的品系G相反。结果明确表明5’Hsp83UTR-Cc微管蛋白-SV403’UTR启动子驱动雄性生殖系中tTAV的足够表达以诱导精子不育，如由从这些雄性产生的后代孵化的幼虫的减少表明的。另外，未观察到雌性可育性的降低，表明启动子以雄性-生殖系特异的方式作用(数据未显示)。然而，一个OX4282品系的后代无显著减少的事实指向影响表型的位置效应。
[0296] OX4282(PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-teto14-cc微管蛋白-hsp83-tTAV-SV40)x OX4112(PB-IPPO-1-hsp83-tetO21-Hr5-IE1-Red)
[0297] 将相同的OX4282品系与I-Ppo1品系杂交，其证明在体细胞中活化的两个启动子(Hsp83和Opie2)杂交时的致死性。与野生型和四环素对照相比，使用该效应物，观察到高达50％不育(数据未显示)。结果表明在此测定中看到的不育是通过tTAV激活核酸酶表达和之后的精子DNA切割的结果。不育水平表明不足够的外显率。当其与遗传启动子品系杂交时，相同品系呈现强烈的致死效果的事实可以提示，在雄性生殖系中产生不足够的此种蛋白分子以引起想要的效果。对于强烈效果发生，可能蛋白需要超过某阈值，其也增加影响性能的转基因的位置效应的可能性。这与含有在该测定过程中观察的两种转基因的蛹的降低的数量一起，使I-Ppo1成为对于开发精子致死性不适当的，并且因此不优选的候选物。
[0298] OX4282(PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-teto14-cc微管蛋白-hsp83-tTAV-SV40)x
[0299] OX4458(PB-AttP-Hr5-IE1-DsRed2-SV40-teto21-Dm鱼精蛋白-核酸酶)
[0300] 图3.开和关四环素下的OX4282-OX4458雄性不育-转基因地中海果蝇中可抑制的雄性特异的不育。
[0301] 将四个独立的，携带tetO-鱼精蛋白-FokI效应物(B1，D1，D2，F2)的OX4458(图21)转座子的常染色体插入品系与携带来自地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))β2-微管蛋白基因的启动子驱动的四环素可抑制反式激活子(tTAV)的OX4282L驱动物品系杂交。将这些杂交的后代以有(100μg/ml；tet+)或无四环素(tet-)的饮食之一饲养和繁殖。既携带驱动物等位基因也携带效应物等位基因的雄性与野生型雌性杂交并且计算获自这些杂交的卵孵化率(孵化的所产卵的百分数)。200-500个卵每组的四组不同卵收集物用于各个杂交。野生型和OX4282L雄性与野生型雌性在存在或缺少四环素的情况下的杂交用作对照。将观察到的高度显著雄性不育的杂交(卡方检验，P＜0.0001)用星号标记。
[0302] OX4458(图21)构建体含有在单端的源自piggyBac的载体中的tetO操纵子的转录控制下的融合于果蝇(Drosophila)鱼精蛋白的单个FokI切割结构域，以hr5-IEl-DsRed2作为转化标记。OX4458(图21)构建体应该自身不发挥任何效果。当OX4458(图21)品系与合适的表达tTAV的品系杂交时，在具有两个等位基因的双杂合子后代中，并且在容许条件(无tTAV抑制物-四环素)下，效应物融合蛋白的表达发生。
[0303] 将具有单个，常染色体转基因插入的四个品系与表达tTAV的品系-OX4282L(其在之前的实验中呈现更高的启动子活性(参见上文))杂交。在所有的四个双杂合子组合中，观察到来自与转基因雄性交配的雌性的卵的孵化率的剧烈降低。使用与野生型雄性杂交的携带两种转基因的转基因雌性验证观察到的效果的性别特异性(数据未显示)。
[0304] 根据上文显示的结果，“改变的”微管蛋白启动子和果蝇(Drosophila)鱼精蛋白-Fok1效应物的组合，似乎产生以任何其它方式比测试的方式对雄性的一般健康具有最小(或缺少)负效应的雄性生殖系特异的致死效果。另外，雌性似乎不显著受转基因表达的影响，支撑使用的序列的雄性生殖系特异性。下一步将是设计将在单个质粒(OX4353)中既含有启动子也含有效应物序列的构建体。此种构建体将提供要用于开发父本效应致死系统的转座子的更现实的状况。
[0305] OX4353(PB-HrIE-AmCyan-SV40-teto14-Dm鱼精蛋白-核酸酶-cc微管蛋白-hsp83-tTAVnew-SV40)
[0306] 4个品系被认为是除品系F(其被认为具有两个插入)的，基于转化标记的遗传模式单插入事件。如之前描述的在四环素存在和缺少的情况下，通过与野生型杂交测试所有品系。将来自相同品系的雌性也与野生型雄性杂交并且以类似的方式评估其可育性。
[0307] 图4.开和关四环素下OX4353雄性不育的百分数。
[0308] 在地中海果蝇中产生五株独立的，携带tetO-鱼精蛋白-FokI效应物和由来自地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))的β2-微管蛋白启动子驱动的四环素可抑制反式激活子(tTAV)的OX4353转座子的常染色体插入品系(A，B，C，D，F)。将这些品系的后代以有(100μg/ml；tet+)或无四环素(tet-)的饮食饲养和繁殖。将雄性与野生型雌性杂交并且计算获自这些杂交的卵孵化率(孵化的所产卵的百分数)。100-150个卵的两组卵用于每个杂交。在四环素存在或缺少的情况下与野生型雌性杂交的野生型雄性用作对照。观察到高度显著雄性不育的杂交(卡方检验，**表示P＜0.001，***表示P＜0.0001)用星号标记。
[0309] 图5.开和关四环素下OX4353雌性不育的百分数。在地中海果蝇中产生五个独立的，携带tetO-鱼精蛋白-FokI效应物和由来自地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))的β2-微管蛋白启动子驱动的四环素可抑制反式激活子(tTAV)的OX4353转座子的常染色体插入品系(A，B，C，D，F)。将这些品系的后代以有(100μg/ml；tet+)或无四环素(tet-)的饮食饲养和繁殖。将雌性与野生型雄性杂交并且计算获自这些杂交的卵孵化率(孵化的所产卵的百分数)。使用来自各个杂交的100-150卵的两组卵收集物。在存在或缺少四环素的情况下与野生型雌性杂交的野生型雄性用作对照。未观察到显著的雌性不育(卡方检验，P＞0.05)。
[0310] 结果表明在饮食中缺少四环素(容许条件)的情况下，杂合OX4353雄性多达100％不育。然而一些品系的雄性甚至在四环素存在的情况下是近乎可育的(sub-fertile)并且来自多数品系的雌性在四环素缺少的情况下显示可育性的稍微降低。从上述结果，我们可以得出结论：转基因的表达在所有5个测试的品系中就诱导精子致死性而言是起作用的，然而实现对含有该转基因的昆虫的一般健康具有最小影响的完全(或非常接近)精子致死性的精细调节，似乎极大地受位置效应(即插入的序列在昆虫基因组合接近的调控元件中的位置)影响。
[0311] 这里描述的工作显示1030bp地中海果蝇(Medfly)β2-微管蛋白启动子片段在四环素的控制下足以驱动tTAV表达并进一步驱动精子自然发生中效应物基因表达。OX4353株证明是功能的，四环素-可抑制的精子-致死株。另外，研究者可以得出结论：当在地中海果蝇(Medfly)中表达时，Dm鱼精蛋白保留其关键性质中的至少一种；即结合精子DNA。鱼精蛋白序列不是良好保守的，因此在这些实验之前阳性结果是不确定的。这些结果表明进一步使用与二元“tet-关”系统有关的启动子/效应物组合的对于地中海果蝇(Medfly)群体控制的看法的希望。
[0312] OX4718 (PB4Hrie1-AmC-MexMActPro-DsR-tetO21-Prota-mCh-FokI-CcBTubPro-tTAV2-Hrie1-ZsG)
[0313] OX4718是地中海果蝇(Medfly)上的既携带启动子组分又携带效应物组分的单个构建体的实例。将该质粒注射入前胚盘地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))胚胎中。既表达红也表达绿色荧光蛋白的蛹(含有不同颜色的pb端的4-端pb构建体(Dafaala等人，2006)-意味着完全转座子的插入-在两组Go杂交V(1个蛹)和σ(47个蛹)中的G1后代之间发现。来自OX4718-V品系的单个蛹未存活至成年。来自OX4718-σ品系的蛹展现两个明显不同的表型：更强(30个蛹)和更弱(17个蛹)并且分别命名为σ1和σ2。这些大多数增殖为与野生型的单个雄性或雌性杂交并且在此阶段被认为是两个独立的插入事件。OX4718-σ1(b)和OX4718-σ2(b)品系在G2阶段终止。G2蛹的表型分析表明每个这些品系中的多个插入。G3阶段的品系的进一步分析证实σ1(a)和σ1(c)品系二者都是单个，常染色体插入。OX4718-σ2(a)在X染色体上携带单个插入-如通过改变不同代雄性中转基因的缺少或存在所提示的并且尚未为了本研究的目的进一步分析。
[0314] 以有(100μg/ml；tet+)或无四环素(tet-)的饮食饲养和繁殖OX4718-σ1(a)和OX4718-σ1(c)品系并与野生型杂交。在存在或缺少四环素的情况下，野生型与野生型之间和OX4718雌性与野生型雄性的杂交用作对照。在建立笼后第4天收集来自这些杂交的新鲜-不老于24小时-卵。进行每个杂交/笼三次收集。将卵的总数量与四天后未能孵化的卵数量进行比较。计算孵化率为平均孵化的所产卵的百分数；这些数据显示在四环素缺失情况下OX4718-σ1雄性的显著不育。结果显示于图6。将在存在或缺少的四环素情况下饲养的OX4718-σ1(a)和X4718-σ1(c)品系与野生型雌性杂交并且计算获自这些杂交的卵孵化率(孵化的所产卵的百分数)。野生型与野生型之间和OX4718雌性与野生型雄性的杂交用作对照。观察到高度显著雄性不育的杂交(卡方检验，P＜0.0001)用星号标记。
[0315] 上述结果证明成功以适于野外使用的方式在地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))开发条件雄性特异的不育；即个体启动子和效应物分子组装于单个构建体。
[0316] 图7和8开和关四环素下橄榄果蝇中OX4705雄性和雌性不育的百分数。
[0317] OX4705
[0318] (PBMexMActPro-DsR-tetO21-Prota-mCh-FokI-CcBTubPro-tTAV2)
[0319] 这提供既含有启动子组分又含有效应物组分的单个构建体的其它实例，在这一情况中是在橄榄果蝇中。
[0320] 基于在地中海果蝇(Medfly)(地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata)))中获得的另人鼓舞的结果，对于相关的实蝇(Tephritid)，橄榄果蝇(Bactrocera oleae)(通常称为橄榄果蝇)开发类似的质粒。质粒OX4705整合了驱动雄性生殖系中tTAV表达和接着驱动tetO和Dro鱼精蛋白-FokI融合效应物的表达的B2微管蛋白的改变的形式。所述质粒还整合了新的墨西哥果蝇(Mexfly)(墨西哥按实蝇(Anastrepha ludens))肌肉肌动蛋白启动子，其驱动作为转化标记的DsRed2荧光蛋白的表达。
[0321] 在橄榄果蝇前胚盘胚胎上显微注射质粒OX4705s产生10个独立的插入事件。所有株在显微镜下以适当的激发滤光片呈现强烈的荧光表型(荧光标记表达)并且根据孟德尔遗传法则是单个插入。9个插入是常染色体的，同时一个在X染色体上。在存在和缺少四环素的情况下从幼虫中期测试所有株的雄性和雌性不育。野生型杂交提供另外的对照。结果显示于图7和8。
[0322] 图7显示开和关四环素下OX4705橄榄果蝇雄性不育的百分数。在橄榄果蝇中产生9个独立的，携带tetO-鱼精蛋白-FokI效应物和由来自地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capttata))的β2-微管蛋白启动子的改变形式驱动的四环素可抑制反式激活子(tTAV)的OX4605转座子的常染色体插入品系(A，A1，A2，A3，B，B1，F，F1，P)。将这些品系的后代以有(100μg/ml；tet+)或无四环素(tet-)的饮食饲养和繁殖。将雄性与野生型雌性杂交并且计算获自这些杂交的卵孵化率(孵化的所产卵的百分数)。100-150卵的三组卵收集物用于各个杂交以提供统计显著性。在存在或缺少四环素的情况下与野生型雌性杂交的野生型雄性用作对照。
[0323] 图8显示开和关四环素下OX4705橄榄果蝇雌性不育的百分数。在橄榄果蝇中产生9个独立的，携带tetO-鱼精蛋白-FokI效应物和来自地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))的β2-微管蛋白启动子驱动的四环素可抑制反式激活子(tTAV)的OX4705转座子的常染色体插入(A，A1，A2，A3，B，B1，F，F1，P)。将这些品系的后代以有(100μg/ml；tet+)或无四环素(tet-)的饮食饲养和繁殖。将雌性与野生型雄性杂交并且计算获自这些杂交的卵孵化率(孵化的所产卵的百分数)。使用来自每个杂交的100-150卵的两组卵收集物。在存在或缺少四环素的情况下与野生型雌性杂交的野生型雄性用作对照。未观察到显著的雌性不育。
[0324] 与野生型对照相比，当雄性在幼虫饮食中存在四环素的情况下饲养时，数据强烈地表明另人惊叹的OX4705橄榄果蝇雄性不育，而在幼虫饮食缺少四环素的情况下，雄性可育性不降低(图7)。雌性可育性(图8)和雄性的一般健康未受影响，提示“父性致死盒”的雄性生殖系特异表达。
[0325] 图9开和关四环素下OX4466雄性和雌性不育的百分数
[0326] 接着地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))，和橄榄果蝇(Bactrocera oleae)中父系转移的致死效果的成功，焦点转移至具有经济上重要性的其它双翅目；埃及伊蚊(Aedes aegypti)。以下实例使用与在地中海果蝇(C.capitata)中类似的启动子和效应物序列提供在此物种上的显著雄性不育的证据。在一些使用该生物的基因组序列的构建体中发生稍微的改变以获得最大化结果。
[0327] OX4466(PB-hr5IE1-DsRed-Aeprot-tGFP-EcoRI)
[0328] 这也提供其它效应物的实例；将Aepro-EcoRI.OX4466注射入前胚盘埃及伊蚊(Aedes aegypti)胚胎中。该构建体的组分组成型表达而不是通过tet-关系统诱导。产生4个独立的插入事件。来自各个株的雄性和雌性与野生型异性蚊子回交。野生型昆虫用作对照。让雌性在滤纸上产卵24小时。评估后代的存活。结果显示于图9。图标显示收集的从各个测试杂交孵化的胚胎的百分数。内部表格提供实际记录的数量。该实验证明当这些以OX4466雄性为父本时，孵化的卵数量显著减少；在品系D中，胚胎存活力的降低不明显，可能由于位置效应。结果证实胚胎致死性的性别特异性；来自转基因雌性的胚胎野生型对照杂交的这些同等地可成活。
[0329] 将构建体OX4466的伊蚊(Aedes)-鱼精蛋白-核酸酶效应物DNA序列(EcoRI)融合于荧光基因(turboGFP)，以致在精子中核酸酶的表达应该与荧光蛋白的表达共存。分离自许多OX4466雄性中解剖的精巢的精子的荧光显微，显示与核/精子头的强烈的GFP共定为。这是融合于荧光表达的核酸酶功能的实例。
[0330] 图10开和关四环素下OX4467雄性和雌性不育的百分数
[0331] OX4467(PB-hr5IE1-DsRed-Aeprot-tGFP-FokICD)
[0332] OX4467与质粒OX4466相同，仅有的区别是核酸酶效应物是Fok1而不是EcoRI。
[0333] 将该质粒注射入前胚盘埃及伊蚊(Aedes aegypti)胚胎产生3个独立的插入事件。这些事件中的两个在通过转基因G0雄性的代G1中丧失；表明父性致死效应的非常强烈的表达。如之前的分析剩余株。结果显示于图10中。表格显示收集的从各个测试杂交中孵化的胚胎的百分数。内部表格提供实际记录的数量。该实验表明当这些以OX4467雄性为父本时孵化的卵的数量的显著减少。结果证实预期的胚胎致死性的性别特异性；来自转基因雌性的胚胎与野生型对照杂交中的这些等同地可成活。
[0334] 如在OX4466质粒中，将伊蚊-鱼精蛋白-核酸酶效应物DNA序列(Fokl)融合于荧光基因(turboGFP)，从而在精子中核酸酶的表达应该与荧光蛋白的表达共存。分离自许多OX4467-E1雄性中解剖的精巢的精子的荧光显微，显示与核/精子头强烈的GFP共定位。这是融合于荧光表达的核酸酶功能的其它实例。
[0335] OX4286(PB-AeTopi-tTAV-K10-3xP3-DsR)
[0336] OX4286(图23)是基于piggyBac转座子的构建体，其含有由埃及伊蚊(Aedes aegypti)驱动的topi启动子驱动的tTAV和topi 5’UTR。OX4286(图23)使用3xP3驱动的DsRed作为转化标记。3xP3是人工的，眼特异的启动子，负责进化保守的Pax-6转录因子并且在胚胎，幼虫和蛹阶段过程中活化。为了测试Topi启动子的活性，使用报道分子品系，OX3979-Ae。OX3979-Ae含有在tetO操纵子控制下的AmCyan编码序列，使用噬菌体C31系统整合于基因组停泊位点(docking site)。其表达hr5IE1驱动的DsRed作为转化标记。由与OX4628B和OX3979品系杂交产生的既携带Topi-tTAV也携带tetO-AmCyan的双杂合子，显示来自后幼虫期的埃及伊蚊(Aedes aegypti)精巢中明确地AmCyan表达。
[0337] OX4635(PB-HrIE-AmCyan-SV40-Aeβ2微管蛋白-hsp83-tTAV-SV40)
[0338] 为了测试B2微管蛋白启动子用于埃及伊蚊(Aedes aegypti)蚊子的条件雄性不育系统中的适用性，构建基于piggyBac的构建体OX4635。Smith等人，在他们的2007年文章中描述了埃及伊蚊(Aedes aegypti)B2-微管蛋白启动子的克隆和表征并限定其959bp片段足以以类似于内源启动子的阶段和组织-特异的方式驱动蚊子精巢中的DsRed表达。这表明报道分子基因的成功直接表达并且就设计而言与我们之前测试的组成型雄性不育系统类似。为了将启动子适于用于我们的条件表达系统，我们决定尽可能去除B2-微管蛋白的转录的序列，理由是这些可能介导典型的B2-微管蛋白的翻译延迟，其对于建议的二元表达系统将是极不想要的。将与ORF的前36bp一起存在于由Smith等人(2007)使用的序列中的5’UTR去除并以来自地中海果蝇的hsp83最小启动子替代。该改变的启动子用于驱动构建体OX4635中tTAV表达。OX4635含有hr5IE1驱动的AmCyan作为转化标记。
[0339] 埃及伊蚊(Aedes aegytpi)中的条件雄性不育
[0340] 图11OX4282-OX4627Topi-tTAV-驱动的tetO-Ae-鱼精蛋白-FokI-CD(OX4286-B x OX4458)的表达
[0341] OX4627fPB-AeProt-FokI-sv40-多聚腺苷酸-hrIE1-DsRed)
[0342] 对于条件不育系统的第二部分；核酸酶效应物蛋白，以与OX4458(图21)(在地中海果蝇(C.capita)中成功使用)类似的方式建立构建体OX4627；主要区别是使用的鱼精蛋白序列源自埃及伊蚊(Aedes  aegypti)并且为了优化的结果，不源自黑腹果蝇(D.melanogaster)。
[0343] 株OX4282B与四个不同OX4627株杂交。将双杂合雄性与野生型雌性杂交并且将产生的胚胎对孵化率评分。包括野生型，OX4627自身，和雌性对照。在以无四环素的饮食饲养的携带两种等位基因的雄性的所有4个样品中都观察到胚胎孵化率的显著(高达100％)降低。结果显示于图11。将OX4286B和OX4627品系之间的杂交的后代以有(tet+)或无四环素(tet-)的饮食饲养。将既携带驱动物等位基因又携带效应物等位基因的雄性与野生型雌性杂交并且计算获自这些杂交的卵孵化率(孵化的所产卵的百分数)。野生型雄性与野生型雌性的杂交用作对照。观察到高度显著雄性不育的杂交(卡方检验)用星号标记。
[0344] 图12OX4635-OX4627β2-tub-tTAV-驱动的tetO-Ae-鱼精蛋白-FokI-CD(OX4635xOX4627)的表达
[0345] 将两个OX4635株与四个不同OX4627株杂交。将双杂合雄性与野生型雌性杂交并且将产生胚胎对孵化率评分。野生型杂交用作对照。在一些以四环素饮食饲养的携带两种等位基因的杂合雄性(对于各个等位基因)中观察到胚胎孵化率的显著降低。相信不是所有样品都表现出相同比例的精子不育的事实是由于不同转基因插入的位置效应。结果显示于图12中。将OX4635和OX4627品系之间杂交的后代以有(tet+)或无四环素(tet-)的饮食饲养。
将既携带驱动物等位基因又携带效应物等位基因的雄性与野生型雌性杂交并且计算获自这些杂交的卵孵化率(孵化的所产卵的百分数)。野生型雄性与野生型雌性的杂交用作对照。观察到高度显著雄性不育的杂交(卡方检验)用星号标记。
[0346] 在埃及伊蚊(Aedes aegypti)中，与B2-微管蛋白相比，在核酸酶表达由Topi启动子驱动的杂交中，看到更强的完全绝育效果。尽管如此，在两种情况下均观察到显著雄性不育，使topi和B2-微管蛋白合适启动子的改变形式二者都成为蚊子物种埃及伊蚊(Aedes aegypti)中的“父本致死效应”。然而由Topi启动子发挥的更强效应可能与多于一个Topi-tTAV等位基因插入相关。根据表型分离数据，在OX4286B品系中存在一些Topi-tTAV插入-它们中的一些与雄性性别确定位点连接。埃及伊蚊(Aedes aegypti)缺少性别二态性染色体，作为替代，性别由雄性性别确定位点(M)的存在或缺少确定。
[0347] 核酸酶效应物融合蛋白；鱼精蛋白-Fokl，在至今测试的三种不同双翅目物种，即地中海果蝇(C.capita)，橄榄果蝇(B.oleae)和埃及伊蚊(Aedes aegypti)中完全行使功能。
[0348] 雄性不育和雌性致死株一起杂交
[0349] 为了检测精子致死技术可以怎样与雌性致死RIDL技术相互作用和对包含着两种转基因的终产物的一般性能的可能的影响，建立了将OX4353的地中海果蝇(Medfly)雌性(选择两个品系B和F)与地中海果蝇(Medfly)雌性致死品系(OX3864A和OX3647Q)的雄性杂交的实验。RIDL技术的使用第一次在WO 01/39599中描述。根据其荧光表型选择包含这两种插入的个体并且不育和雌性致死性测定就位。在缺少四环素的情况下，这些杂交的后代应该仅是雄性并且是不育的。在存在和缺少四环素(100ng/μl)的情况下评估雄性可育性和雌性致死性。结果证实在缺少四环素的情况下在任何杂交中都无雌性后代产生，然而，当幼虫在含有四环素的食物上生长时，获得正常的50∶50雄性对雌性比例。将含有两种插入无的雄性与野生型雌性回交并且如在之前的杂交评估雄性不育。结果显示于图13。数据表明测试的OX4353株的雄性不育仍然不受雌性致死正反馈存在影响或实质上其被进一步稍微降低，尽管这可以归因于随机变异。因此重要的是，这些杂交强烈提示雌性和精子致死质粒的存在可以共存于单个生物中，而没有对二者中任一个的任何负效应。
[0350] 精子-致死株中Ccβ2-微管蛋白启动子的5’和3’UTR的作用
[0351] 如在文献(Catteruccia等人，2005；Smith等人，2007；Scolari等人，2008；Nirmala等人，2009)中另外描述的Ccβ2-微管蛋白启动子不驱动OX3671(图16)株所有精子中DsRed2表达，可能与Ccβ2-微管蛋白基因的后期转录或翻译相关。后期表达可以导致对tetO重复的足够tTAV蛋白结合，以激活转基因株中报道分子基因或致死基因之一的功能。具有修饰的5’UTR-OX3831，OX4282和OX4353的构建体-在精子中显示更高水平的荧光或致死性，其说明精子自然发生中基因表达中5’UTR的重要性。
[0352] 在黑腹果蝇(D.melanogaster)中，多数基因在减数分裂前表达并且产物储存在发育的生殖系细胞中，仅一些基因在减数分裂后转录(White-Cooper 2009)。转录和翻译的时机，和RNA和蛋白产物的稳定性，对于开发精子-致死转基因地中海果蝇(Medfly)株是关键的。这点的重要性可以从一种类型的效应物到另一种而不同。实质上Windbichler等人推测部分他们的问题是核酸酶太稳定，并且在胚胎中持续存在(Windbichler等人2008)。另一方面，对于用荧光蛋白标记的精子，荧光蛋白存活于成熟精子显然是关键的。未修饰的Ccβ2-微管蛋白表达在雄性生殖系中，如通过使用来自该基因启动子驱动精母细胞中报道分子基因表达证实的。然而，以其正常构造即与源自相同基因的5’UTR序列组合的该Ccβ2-微管蛋白启动子，可以在很后期并且刚好在减数分裂之前驱动tTAV的翻译。在该情况下，当与tetO-报道分子株杂交时，对于tTAV蛋白结合tetO序列并进一步诱导相邻报道分子基因的足量表达无充足时间。以未修饰的Ccβ2-微管蛋白启动子，20个精巢中仅一个在一些精细胞束中显示报道分子(DsRed2)表达。另一方面，5’UTR替代导致株OX3831(图20)和OX4282雄性精巢中的早期精母细胞和解剖精细胞中更强的荧光表达。3’UTR含有调节翻译效率和mRNA稳定性的序列，因此以已知在宽范围的物种中行使功能的序列替代微管蛋白基因的3’UTR；研究者可能排除负责微管蛋白基因的后期翻译的调控元件。
[0353] OX4371
[0354] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-teto14-Topi-ubi-tTAV2-SV40)
[0355] OX4112(PB-IPPO-1-hsp83-tetO21-Hr5-IE1-Red)
[0356] 通过遗传的方式，OX4371(图27)品系似乎具有单拷贝的转基因。当与品系OX4112(图17)(其含有效应物IPpo1)杂交时，含有两种质粒的个体的数量稍微减少(与相同杂交的野生型蛹相比)。然而，大多数品系中孵化的卵的数量无显著降低，除了品系E呈现雄性可育性的40％的降低。
[0357] OX4371
[0358] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-teto14-Topi-ubi-tTAV2-SV40)
[0359] OX4104(PB-YAFN-hsp83-tetO21-Hr5-IE1-Red)(图19).
[0360] 当将OX4371(图27)品系与3-锌指品系杂交时，含有两种质粒的蝇完全可成活和健康。品系F的雄性可育性无降低；然而品系B和E中分别存在45％和40％的降低。
[0361] OX4391
[0362] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-teto14-Topi-ubi-tTAV2-Topi3′UTR)
[0363] OX4104(PB-YAFN-hsp83-tetO21-Hr5-IE1-Red)(图19)
[0364] 评估品系OX4391G，C和D具有单个插入，同时品系B和H似乎各具有两个拷贝的转基因。当将OX4391(图22)品系与tetO-3锌指品系(OX4104，图19)杂交时，似乎对含有两种质粒的个体的生存力无任何负效应。这表明在体组织中存在非常低(如果有)的转基因的基础表达。所有5个分析的品系中，B具有精子产生可成活后代能力的70％降低，同时品系H为仅40％可育。在剩余的品系中，在开和关T下，卵生存力无显著差异。结果强烈表明该特定组合中存在两个拷贝显著减少测试的雄性的可育性。
[0365] OX4391
[0366] (PB-HrIE-AmCyan-SV40-TurboGFP-teto14-Topi-ubi-tTAV2-Topi3′UTR)
[0367] OX4112(PB-IPPO-1-hsp83-tetO21-Hr5-IE1-Red)
[0368] 当将相同的OX4391(图22)品系与IPPO1品系杂交时，与含有两种质粒之一或都不含的后代相比，在存在T的情况下含有两种质粒的后代的数量降低。如在类似的实验中描述的评估卵生存力。当与品系B，C，F和G中的野生型对照相比时，孵化的幼虫的数量无显著降低。在品系H中存在50％的胚胎生存力降低。
[0369] Aetopi和Cctopi启动子二者都显示报道分子基因和tTAV的直接精巢-特异的表达的能力，其随后诱导报道分子基因或致死基因的精巢-特异表达。具体地，显示1233-bp序列(包括1168bp的Aetopi启动子和65bp Aetopi 5’-UTR)驱动在埃及伊蚊(Ae.Aegypti)中tTAV-DsRed融合蛋白的精巢-特异表达(数据未显示)，并且tTAV表达可以进一步诱导精巢-特异的AmCyan报道分子基因表达。1178bp推定的Cctopi启动子不显示地中海果蝇(Medfly)中精巢-特异活性的证据。发现更大的(1708bp)Cctopi片段序列足以驱动精巢-特异的tTAV表达。
[0370] 从应用遗传工程的角度，证实使用的Cctopi推定的启动子片段为地中海果蝇(Medfly)中新的雄性生殖系-特异的启动子，其比之前表征的β-2-微管蛋白启动子更早表达。
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[0437] 序列
[0438] 以下涉及此后提供的SEQ ID NOs：1-56。
[0439] SEQ ID NOS：1-5完全β-2微管蛋白序列-不同昆虫
[0440] SEQ ID NO：1
[0441] ＞gi|167822003|gb|EU386342.1|地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))β-2微管蛋白mRNA，完全cds
[0442] SEQ ID NO：2
[0443] ＞gi|158742|gb|M20420.1|DROTUBB2A黑腹果蝇(D.melanogaster)β-2微管蛋白mRNA，完全cds
[0444] SEQ ID NO：3
[0445] ＞gi|111035017|gb|DQ833526.1|埃及伊蚊(Aedes aegypti)β-2微管蛋白(B2t)基因，完全cds
[0446] SEQ ID NO：4
[0447] ＞gi|219815271|gb|EU938673.1|东方果蝇(Bactrocera dorsalis)β-2微管蛋白基因，完全cds
[0448] SEQ ID NO：5
[0449] ＞gi|219815267|gb|EU938671.1|加勒比按实蝇(Anastrepha suspensa)β-2微管蛋白基因，完全cds
[0450] SEQ ID NOS：6-10：β-2微管蛋白5’UTR序列-不同昆虫
[0451] SEQ ID NO：6
[0452] ＞gi|167822003|gb|EU386342.1|地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))β-2微管蛋白5’UTR
[0453] SEQ ID NO：7
[0454] ＞gi|158742|gb|M20420.1|DROTUBB2A黑腹果蝇(D.melanogaster)β-2微管蛋白5’UTR
[0455] SEQ ID NO：8
[0456] ＞gi|219815271|gb|EU938673.1|东方果蝇(Bactrocera dorsalis)β-2微管蛋白5’UTR
[0457] SEQ ID NO：9
[0458] ＞gi|111035017|gb|DQ833526.1|埃及伊蚊(Aedes aegypti)β-2微管蛋白(B2t)5’UTR
[0459] SEQ ID NO：10
[0460] ＞gi|219815267|gb|EU938671.1|加勒比按实蝇(Anastrepha suspensa)β-2微管蛋白5’UTR
[0461] SEQ ID NOS：11-15：β-2微管蛋白3’UTR序列-不同昆虫
[0462] SEQ ID NO：11
[0463] ＞gi|167822003|gb|EU386342.1|地中海实蝇(地中海果蝇(Ceratitis capitata))β-2微管蛋白3’UTR
[0464] SEQ ID NO：12
[0465] ＞gi|158742|gb|M20420.1|DROTUBB2A黑腹果蝇(D.melanogaster)β-2微管蛋白mRNA3’UTR
[0466] SEQ ID NO：13
[0467] ＞gi|111035017|gb|DQ833526.1|埃及伊蚊(Aedes aegypti)β-2微管蛋白(B2t)基因3’UTR
[0468] SEQ ID NO：14
[0469] ＞gi|219815271|gb|EU938673.1|东方果蝇(Bactrocera dorsalis)β-2微管蛋白基因3’UTR
[0470] SEQ ID NO：15
[0471] ＞gi|219815267|gb|EU938671.1|加勒比按实蝇(Anastrepha suspensa)β-2微管蛋白基因3’UTR
[0472] tTAV和变体
[0473] SEQ ID NO.16：tTAV的开放阅读框
[0474] SEQ ID NO.17：tTAV的蛋白序列
[0475] SEQ ID NO.18：tTAV2的开放阅读框
[0476] SEQ ID NO.19：tTAV2的蛋白序列
[0477] SEQ ID NO.20：tTAV3的开放阅读框
[0478] SEQ ID NO.21：tTAV3的蛋白序列
[0479] SEQ ID NO：22-来自黑腹果蝇(D.melanogaster)的5’UTR β-2微管蛋白
[0480] SEQ ID NO：23-24-黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的b2微管蛋白启动子序列(SEQ ID NO 24)与Dm b2-微管蛋白的mRNA序列(SEQ ID NO 23)比对(5’UTR包括在比对中)
[0481] SEQ ID NO：25-Hsp83的ORF地中海果蝇(Medfly)
[0482] SEQ ID NO：26-如由Genebank给出的5’UTR
[0483] SEQ ID NO：27-来自4353的Hsp835’UTR
[0484] SEQ ID NO：28-Hsp83的氨基酸序列，地中海果蝇(Medfly)
[0485] SEQ ID NO：29-来自OX3831的Dm Aly 5’UTR
[0486] SEQ ID NO：30-Dm Aly启动子
[0487] SEQ ID NO：31-tetR
[0488] SEQ ID NO：32-Vp16
[0489] 组合TETR和VP16序列产生tTAV序列。
[0490] SEQ ID NO：33-DmTopi cDNA
[0491] SEQ ID NO：34-如在蝇基部发现的Dm启动子序列
[0492] SEQ ID NO：35-#OX4254Cc topi启动子
[0493] SEQ ID NO：36-#OX4275Cc topi启动子
[0494] SEQ ID NO：37-#OX4371Cc topi启动子
[0495] SEQ ID NO：38-40-LA4254(SEQ ID NO 38)cf LA4275(SEQ ID NO 39)cf LA4371(SEQ ID NO 40)的比对
[0496] SEQ ID NO：41-来自4286的伊蚊topi启动子
[0497] SEQ ID NO：42-来自4286的Ae topi 5’UTR
[0498] SEQ ID NO：43-Topi黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)ORF(编码区域)[0499] SEQ ID NO：44-来自黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)的Aly ORF(编码区域)[0500] SEQ ID NO：45-LA 3671 B2微管蛋白启动子和5’UTR
[0501] SEQ ID NO：46-LA 4353 B2微管蛋白启动子
[0502] SEQ ID NO：47-LA 4353hsp835’UTR
[0503] SEQ ID NO：48-B2微管蛋白5’UTR
[0504] SEQ ID NO：49-Ae鱼精蛋白
[0505] SEQ ID NO：50-SG4
[0506] SEQ ID NO：51-Fok1切割结构域
[0507] SEQ ID NO：52-Ae鱼精蛋白-SG4-Fok1
[0508] SEQ ID NO：53-地中海果蝇(Medfly)B2微管蛋白启动子正向引物
[0509] SEQ ID NO：54-地中海果蝇(Medfly)B2微管蛋白启动子反向引物
[0510] SEQ ID NO：55-TopitestF1引物
[0511] SEQ ID NO：56-Topitest R引物
[0512] SEQ ID NO：23-24
[0513] 黑腹果蝇的b2微管蛋白启动子序列与Dm b2-微管蛋白的mRNA序列比对(5’UTR包括在比对中)
[0514]
[0515]
[0516]
[0517]
[0518]
[0519] SEQ ID NO：38-40-LA4254(SEQ ID NO 38)cf LA4275(SEQ ID NO 39)
[0520] cf LA4371(SEQ ID NO 40)的比对：
[0521]
[0522]
[0523]

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