一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法

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一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法
申请号	CN201810753693.X	申请日	2018-07-10	公开(公告)号	CN108872113A	公开(公告)日	2018-11-23
申请人	南京林业大学;			发明人	张开梅; 朱福远; 沈羽; 方炎明; 陈沫先;
摘要	本发明提出的是一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法，包括如下步骤：1）植物样品流式数据的收集与分析；2）化感作用对细胞危害的验证。本发明的优点：可快速、有效且目的明确的判断化感作用对植物的细胞整体的响应，特别是对植物细胞成活率的变化影响。
权利要求	1.一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法，其特征是包括如下步骤： 1）植物样品流式数据的收集与分析； 2）化感作用对细胞危害的验证。 2.根据权利要求1所述的一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法，其特征是所述的步骤1）具体包括：（1）准备实验材料及器具：选用过滤网为40微米的细胞分选管、切片刀、无菌培养皿、1mL移液器、一次性塑料培养皿15皿、预培养20天的井栏边草配子体、三叶鬼针草根系分泌物、流式细胞仪、解离液；（2）实验处理： ①取预培养20天的井栏边草配子体，放入含有10mL质量浓度梯度分别为100%、50%、 25%、12.5%以及0%的三叶鬼针草根系分泌物的水浸液的一次性塑料培养皿中，保持每皿含有100枚配子体，每组质量浓度梯度有三个平行组；浸泡时间为10天，在第10天进行流式细胞术检测； ②用镊子取出配子体，置于小型锥形瓶中用去离子水流水冲洗30min，后用灭菌纱布控干待用； ③将清洗干净的配子体植物组织材料称取0.5g，置于无菌培养皿中，加入预配好的解离液10mL，需没过植物组织材料；随后用切片刀上下快速均匀切割植物组织材料；待植物组织材料切成浆状后，静置5min，用移液器来回吹打3min；随后将植物组织材料通过过滤网为 40微米的细胞分选管，得到澄清溶液；加入50μL/mL浓度的碘化丙啶，置于暗箱暗处理 10min；（3）上样：采用流式细胞仪进行，具体操作步骤如下：（1）打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲；（2）依此接通电源、打开稳压器电源、变压器电源，稳定5分钟；（3）将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关；（4）结束后自动STANDBY选项，5分钟后即可进行试验；（4）实验数据分析：根据流式细胞仪分析软件测定不同根系分泌物质量浓度下的植物细胞死亡率，并进行对比，得出实验结论。 3.根据权利要求1所述的一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法，其特征是所述的步骤2）具体包括：细胞膜脂过氧化物MDA的含量测定：取质量浓度梯度分别为100%、50%、25%、12.5%以及 0%的三叶鬼针草根系分泌物处理过的井栏边草配子体植物组织材料，采用硫代巴比妥酸法测定配子体中MDA的含量。
说明书全文	一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法技术领域 [0001] 本发明涉及的是一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法，属于生物材料检测技术领域。背景技术 [0002] 化感作用的英文为"Allelopathy”，它源于希腊语“Allelon(相互)”和“Pathos(损害、妨碍)”。植物化感作用的理论是1937年由德国科学家H．Molish第一次提出，他把化感作用定义为：所有类型植物(含微生物)之间生物化学物质的相互作用，这种相互作用包括有害和有益两个方面。20世纪70年代中期E．L．Rice根据H．Molish的定义和对植物化感作用的进一步研究，界定植物化感作用是指植物(含微生物)通过释放到环境中的化学物质产生对其他植物(含微生物)的直接或间接的有害作用。Rice的定义中的化感作用物质是由植物所释放的化学物质，并强调了化感作用的结果对其他植物或微生物均是有害的。近年来，研究表明，化感物质作用的对象不仅仅是其他植物，有时甚至是同种植物。而化感作用的结果不仅包括有害的，同时也包括一些相互促进的效果。因此，又有人把化感作用称之为植物的相生相克。1984年Rice在《Allelopathy》第二版中，将化感作用给出了较完整的定义：植物或微生物的代谢分泌物对环境中其他植物或微生物有利或不利的作用，现在这个定义已被广泛的接受。 [0003] 化感物质(Allelochemical)是生物体内产生的非营养性物质，能影响其他植物生长、发育、行为或种群的关系，作为化感作用的媒介，其主要是植物的次生代谢物质。植物化感作用的媒介是化学物质，被称为“化感物质”。化感物质是指植物所产生并影响其他生物生长、行为和种群的化学物质，不仅包括植物间的化学作用物质，也包括植物和动物间的化学作用物质，而且这些化学物质并没有被要求必须进入环境，也可以在体内进行。现已发现，许多化感物质不仅对植物，而且对微生物、动物特别是昆虫都有作用。 [0004] 流式细胞术是应用流式细胞仪进行分析、分选的技术，对处于液流中各种荧光标记的微粒进行多参数快速准确地定性、定量测定。20世纪80年代以来，随着流式细胞仪和荧光探针标记技术的不断发展，流式细胞术在生物科学研究与医学研究及临床实践中的作用越来越重要。在植物学研究中，流式细胞术主要用于检测植物细胞核DNA含量及其倍性水平，其中 G1期的 DNA 含量可间接反映该细胞的倍性水平，因此测定植物核DNA含量的同时可以获取倍性水平相关数据。运用流式细胞术验证植物化感作用的方法是一种最快速的验证植物化感作用对于细胞整体性损害的手段。发明内容 [0005] 本发明提出的是一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法，其目的在于快速、有效且目的明确的判断化感作用对植物的细胞整体的响应，特别是对植物细胞成活率的变化影响。 [0006] 本发明的技术解决方案：一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法，包括如下步骤：1）植物样品流式数据的收集与分析； 2）化感作用对细胞危害的验证。 [0007] 本发明的优点：可在最快20分钟内、通过活细胞的数量变化来判断化感作用对植物的细胞整体的响应，特别是对植物细胞成活率的变化影响。附图说明 [0008] 附图1 附图5是实施例中各浓度梯度下的植物细胞死亡率统计图，其中图1浓度为~0%、图2浓度为12.5%、图3浓度为25%、图4浓度为50%、图5浓度为100%。 [0009] 附图6是各浓度梯度下植物细胞内的MDA的含量变化图。具体实施方式 [0010] 一种用流式细胞术验证植物化感作用的方法，包括如下步骤：1）植物样品流式数据的收集与分析； 2）化感作用对细胞危害的验证。 [0011] 所述的步骤1）具体包括：（1）准备实验材料及器具：选用过滤网为40微米的细胞分选管（采用型号为BD Falcon 352235）、切片刀、无菌培养皿、1mL移液器、一次性塑料培养皿15皿、预培养20天的井栏边草配子体、三叶鬼针草根系分泌物、流式细胞仪、解离液；（2）实验处理： ①取预培养20天的井栏边草配子体，放入含有10mL质量浓度梯度分别为100%、50%、 25%、12.5%以及0%的三叶鬼针草根系分泌物的水浸液的一次性塑料培养皿中，保持每皿含有100枚配子体，每组质量浓度梯度有三个平行组；浸泡时间为10天，在第10天进行流式细胞术检测； ②用镊子取出配子体，置于小型锥形瓶中用去离子水流水冲洗30min，后用灭菌纱布控干待用； ③将清洗干净的配子体植物组织材料称取0.5g，置于无菌培养皿中，加入预配好的解离液10mL，一般需没过植物组织材料；随后用切片刀上下快速均匀切割植物组织材料，整个过程刀片只能上下运动；待植物组织材料切成浆状后，静置5min，用移液器来回吹打3min；随后将植物组织材料通过过滤网为40微米的细胞分选管，得到澄清溶液；加入50μL/mL浓度的碘化丙啶，置于暗箱暗处理10min；（3）上样：采用流式细胞仪进行，具体操作步骤如下：（1）打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲；（2）依此接通电源、打开稳压器电源、变压器电源，稳定5分钟；（3）将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关；（4）结束后自动STANDBY选项，5分钟后即可进行试验；（4）实验数据分析：根据流式细胞仪分析软件测定不同根系分泌物质量浓度下的植物细胞死亡率，并进行对比，得出实验结论。 [0012] 所述的步骤2）具体包括：细胞膜脂过氧化物MDA的含量测定： MDA（丙二醛）是膜脂过氧化最重要的产物之一，它的产生能加剧膜的损伤，因此在植物衰老生理和抗性生理研究中MDA含量是一个常用指标，可通过MDA了解膜脂过氧化的程度，以间接测定膜系统受损程度以及植物的抗逆性。取质量浓度梯度分别为100%、50%、25%、12.5%以及0%的三叶鬼针草根系分泌物处理过的井栏边草配子体植物组织材料，采用硫代巴比妥酸法测定配子体中丙二醛的含量。实施例 [0013] 下面根据实施例进一步说明本发明的技术方案。 [0014] 用流式细胞术验证三叶鬼针草根系分泌物对井栏边草配子体的化感作用的方法，包括如下步骤：1）植物样品流式数据的收集与分析；（1）准备实验材料及器具：选用过滤网为40微米的细胞分选管（采用型号为BD Falcon 352235）、切片刀、无菌培养皿、1mL移液器、一次性塑料培养皿15皿、预培养20天的井栏边草配子体、三叶鬼针草根系分泌物、流式细胞仪、解离液；（2）实验处理： ①取预培养20天的井栏边草配子体，放入含有10mL质量浓度梯度分别为100%、50%、 25%、12.5%以及0%的三叶鬼针草根系分泌物的水浸液的一次性塑料培养皿中，保持每皿含有100枚配子体，每组质量浓度梯度有三个平行组；浸泡时间为10天，在第10天进行流式细胞术检测； ②用镊子取出配子体，置于小型锥形瓶中用去离子水流水冲洗30min，后用灭菌纱布控干待用； ③将清洗干净的配子体植物组织材料称取0.5g，置于无菌培养皿中，加入预配好的解离液10mL，一般需没过植物组织材料；随后用切片刀上下快速均匀切割植物组织材料，整个过程刀片只能上下运动；待植物组织材料切成浆状后，静置5min，用移液器来回吹打3min；随后将植物组织材料通过过滤网为40微米的细胞分选管，得到澄清溶液；加入50μL/mL浓度的碘化丙啶，置于暗箱暗处理10min；（3）上样：采用流式细胞仪进行，具体操作步骤如下：（1）打开液流抽屉，确认气压阀处于减压状态；打开金属挡板；取出鞘液桶，倒掉废液，拧紧鞘液桶盖，安上金属挡板，保证管路畅通无扭曲；（2）依此接通电源、打开稳压器电源、变压器电源，稳定5分钟；（3）将压力阀置于加压位置，轻拍过滤器，使气泡位于滤器的上方，打开管路开关，将过滤器中的气泡排除，关闭管路开关；（4）结束后自动STANDBY选项，5分钟后即可进行试验。 [0015] （4）实验数据分析：根据流式细胞仪分析软件测定不同根系分泌物质量浓度下的植物细胞死亡率，并进行对比，得出实验结论。 [0016] 如图1 图5所示，根据分析软件测定，在三叶鬼针草根系分泌物质量浓度分别为~100%、50%、25%、12.5%以及0%的处理下，井栏边草配子体的细胞死亡率分别为：46.93± 4.69%，41.46±1.10%，37.86±1.60%，31.15±1.38%和6.18±1.03%。在不同浓度梯度的三叶鬼针草根系分泌物处理下，细胞死亡率呈现出上升趋势，说明了三叶鬼针草根系分泌物能增加井栏边草配子体的细胞死亡率，得证：随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势。 [0017] 2）化感作用对细胞危害的验证：细胞膜脂过氧化物MDA（丙二醛）的含量测定：取质量浓度梯度分别为100%、50%、25%、 12.5%以及0%的三叶鬼针草根系分泌物处理过的井栏边草配子体植物组织材料，采用硫代巴比妥酸法测定配子体中丙二醛的含量。 [0018] 如图6所示，随着三叶鬼针草根系分泌物浓度的升高，根系分泌物对配子体的MDA含量呈现增加趋势，说明了根系分泌物对配子体的化感作用呈加强趋势。