[0001] 本发明属于生态防治技术领域，尤其涉及一种新性信息素美雌醇的应用。

[0002] 克氏原螯虾(Procambarus clarkii)隶属于节肢动物门(Arthropada)、甲壳纲(Crustacea)、十足目(Decapoda)螯虾科(Cambaridae)原螯虾属，俗称淡水小龙虾。克氏原螯虾原产于北美洲，因其生命力强、适应性广、繁殖力强而遍布世界各地，是一种入侵性极强的外来生物入侵物种。一旦引种克氏原螯虾，将成为当地生态环境中具有竞争力的野外优势种，严重危害本地物种，降低本地的生物多样性，对当地的生态环境造成很大的影响。因此，在生态脆弱区、湿地保护区等生态系统，有必要对克氏原螯虾进行防控，保护生态环境。

[0003] 目前防治克氏原螯虾的主要方法有人工捕捉、物理隔离和化学防治，其中化学防治可以使用农药，如杀灭酯、溴氰菊酯等，铲除小水体当中的克氏原螯虾，但是特异性不强，容易危及其他非目标生物，如其他甲壳动物、水生昆虫和鱼类等，对农业生产及生态环境的负面影响也日益突出。克氏原螯虾性信息素目前未知，无法利用性信息素开展生物防治研究。因此，非常有必要寻找特异性强和对环境友好的新性信息素美雌醇用于生物防治。

[0004] 本发明的目的在于提供一种新性信息素美雌醇的应用，以解决上述技术问题。

[0005] 本发明提供的一种新性信息素美雌醇在迷惑或引诱雄性克氏原螯虾中的应用。

[0006] 本发明还提供上述新性信息素美雌醇在制备引诱剂中的应用。

[0007] 本发明还提供了上述新性信息素美雌醇的筛选方法，包括以下步骤：

[0008] 步骤1、采集性成熟的雌性和雄性克氏原螯虾对异性信息源进行生物活性测定，观察克氏原螯虾个体是否表现有趋性行为；

[0009] 步骤2、雄性克氏原螯虾对分子量小于5KDa、5‑10KDa以及大于10KDa的雌性信息源的行为反应实验；

[0010] 步骤3、制备性信息素活性片段，缩小目标化合物的筛选范围；

[0011] 步骤4、测定差异代谢物组成成分，筛选显著差异代谢物；

[0012] 步骤5、从显著差异代谢物中筛选出内源性且无毒害作用的代谢物作为候选信息物，测定候选信息物的行为学，得到克氏原螯虾的性信息素物质：美雌醇。

[0013] 本发明的原理和有益效果在于：

[0014] 针对克氏原螯虾防治薄弱，克氏原螯虾性信息素目前未知，无法利用性信息素开展生物防治研究的问题。本发明提供的美雌醇克服了水生动物代谢物质复杂和分离困难的问题，突破了克氏原螯虾性信息素筛选的研究瓶颈，为克氏原螯虾种群生态防治提供了更为绿色有效的新途径，为科学防控克氏原螯虾的危害奠定理论和技术基础。

[0015] 生态防治时，本发明提供的美雌醇可以通过释放新性信息素美雌醇达到迷惑或引诱雄性克氏原螯虾，阻止雄性克氏原螯虾寻找雌性克氏原螯虾交配。在繁殖季节，美雌醇可以作为引诱剂诱捕雄性克氏原螯虾。一旦大量消灭种群中的雄性克氏原螯虾个体，就可以有效减少交配繁殖率，从而达到快速减小种群大小的目的。这种生物防治方法对环境友好，对人体无害，多数情况下具有物种特异性等优点。

[0016] 本发明提供的美雌醇性信息素分离自雌性克氏原螯虾纯水饲养液，采用超滤离心法分离纯化，并采用超高效液相色谱串联质谱检测代谢物，通过标准化合物和纯水对比分析的生物活性测定的方法进行确定。

[0017] 图1为Y型水槽的纵截面剖视图；

[0018] 图2为半制备高效液相分离雌雄5‑10kDa片段色谱图(A)雌性；(B)雄性；

[0019] 图3为克氏原螯虾PFF6和PFM6制备片段代谢物分类；

[0020] 图4为正离子(A)和负离子(B)模式的显著性差异代谢物表达差异倍数图；

[0021] 图5为不同浓度美雌醇对雄性克氏原螯虾的吸引效果。

[0022] 下面通过具体实施方式进一步详细说明：

[0023] 实施例1：一种新性信息素美雌醇

[0024] 具体筛选方法如下：

[0025] 步骤1、克氏原螯虾对异性信息源的行为反应实验(实验1)

[0026] 1.1制备异性信息源

[0027] 雌性克氏原螯虾通过肾孔将性信息素随同尿液排到周围的水环境中，因此，本实验收集饲养克氏原螯虾的池水作为提取性信息素的样品。

[0028] 在4‑10月(克氏原螯虾繁殖季节)，分别采集性成熟的雌性和雄性克氏原螯虾1000只，雌雄分开饲养，每20只饲养于1个水箱中，加入0.5L纯水，每隔3h收集1次水箱中池水，每天收集4次，合并样品并离心(8000g/min)除杂质，取上清液于‑80℃保存得到冷冻样品，或真空冷冻干燥得到冻干样品再保存，检测时取5mL纯水溶解冻干样品。

[0029] 1.2测定克氏原螯虾对异性信息源的生物活性

[0030] 收集的池水样品或分离样品作为信息素样品进行生物活性测试，判断测定样品是否含有活性性信息素。

[0031] 首先采用Y型水槽比较雄性、雌性克氏原螯虾对异性信息源是否存在行为差异。

[0032] 如图1所示的Y型水槽，包括起始臂(Start arm)和两个呈分叉布置的终点臂(End arm)，在起始臂的端部放入性成熟的克氏原螯虾，用海绵块吸取信息素样品(饲养水样品、分离样品和标准化学品)随机放入其中一个终点臂的端部，另一个终点臂的端部以海绵块吸取纯水为对照，观察克氏原螯虾个体是否表现有趋性行为。

[0033] 为避免克氏原螯虾对某一侧终点臂的选择偏好性，每5只克氏原螯虾为一组对换信息素样品和纯水位置，以确保克氏原螯虾对两个终点臂的选择是随机的。

[0034] 克氏原螯虾适应5min后即开始记录选择性，每次实验持续5min，每种信息素样品重复100次以上，整个实验过程采用监控系统全程记录，避免人为干扰。

[0035] 分别比较雄性、雌性克氏原螯虾对异性信息源是否存在行为差异。共选择实验用克氏原螯虾280只，其中，选择160只雄性克氏原螯虾用于雄性克氏原螯虾对雌性信息源的行为反应实验；120只雌性克氏原螯虾用于雌性克氏原螯虾对雄性信息源的行为反应实验。对于雄性克氏原螯虾，选择雌性信息源和纯水的虾数量分别为69只和37只(表1)。而对于雌性克氏原螯虾，选择雄性信息源和纯水的虾数量分别为35只和37只，两者差距很小。

[0036] 实验数据经过非参数卡方检验(表1)结果表明，雌性信息源对雄性克氏原螯虾有2
吸引作用且结果显著(χ＝9.66，df＝1，P<0.01)，而雄性信息源对雌性克氏原螯虾没有明
2
显吸引作用(χ＝0.06，df＝1，P＝0.814)，这说明克氏原螯虾的性吸引现象为雌虾对雄虾的单向性吸引。

[0037] 表1克氏原螯虾对异性信息源行为反应实验卡方检验表

[0038]

[0039] 步骤2、雄性克氏原螯虾对不同截留分子量的雌性信息源的行为反应实验(实验2)[0040] 2.1采集不同截留分子量的雌性信息源

[0041] 取适量0.01g/L饲养水样品溶液置于分离分子量截断值为5KDa的超滤管中，在4℃下离心超滤，在5KDa的超滤管上部补入适量纯水后转入10KDa的超滤管，再次超滤离心，获得分子量小于5KDa、5‑10KDa以及大于10KDa的信息源组分。

[0042] 2.2测定不同截留分子量的雌性信息源的生物活性

[0043] 以雄性克氏原螯虾为实验对象，分别比较分子量小于5KDa，5‑10KDa和大于10KDa雌性克氏原螯虾代谢饲养水为信息源时，采用Y型水槽，判断雄性克氏原螯虾是否存在选择差异。共选择实验用雄性克氏原螯虾300只，分子量小于5KDa、5‑10KDa以及大于10KDa雌性信息源的行为反应实验分别选择了100只克氏原螯虾样本。

[0044] 实验结果见表2，选择分子量小于5KDa雌性信息源、纯水的雄性克氏原螯虾数量分别为42只、52只；选择分子量5‑10KDa雌性信息源和纯水的雄性克氏原螯虾数量分别为55只、28只；而选择分子量大于10KDa雌性信息源和纯水的雄性克氏原螯虾数量分别为28只、29只。

[0045] 实验数据经过非参数卡方检验(表2)显示，分子量5‑10KDa的雌性信息源对雄性克2 2
氏原螯虾有吸引作用，且结果显著(χ＝8.78，df＝1，P<0.01)，而分子量小于5KDa(χ＝
2
0.26，df＝1，P＝0.611)和大于10KDa(χ＝0.02，df＝1，P＝0.895)的雌性信息源对雄性克氏原螯虾没有吸引作用。说明有效吸引成分分布在5‑10KDa的截留液中。

[0046] 表2雄性克氏原螯虾对不同截留分子量的雌性信息源下行为反应卡方检验表[0047]

[0048] 步骤3、分离性信息素活性片段

[0049] 称取5‑10kDa雌性克氏原螯虾性信息素活性片段干燥物1g，加入1L超纯水充分溶解后制成原液(原液浓度：1g/L)。设置半制备高效液相色谱实验参数：流动相比例为甲醇/超纯水(60/40，v/v)；波长：210nm和254nm；单次进样量：2ml；样品流速：4ml/min；实验持续时间：40min。

[0050] 根据样品出峰顺序分为6个片段，将雌性样品制备片段分别命名为Preparation fragment of female 1‑6(PFF1‑PFF6)(图2A)。

[0051] 将不同分离片段冷冻保存于‑80℃冰箱至冷冻干燥。采用冷冻干燥机去除样品内甲醇，干燥过程中会出现爆沸现象，爆沸结束表明甲醇基本去除完全。重新保存样品至超低温冰箱直至行为学Y型迷宫实验。

[0052] 重复上述操作收集雄性克氏原螯虾5‑10kDa样品的不同制备片段，并命名为Preparation fragment ofmale 1‑6(PFM1‑PFM6)(图2B)，作为后续代谢组学对照组。

[0053] 行为学结果显示：雌性代谢水的5‑10kDa获得的6个制备片段中只有片段6(PFF6)2
能够显著吸引雄性克氏原螯虾个体(χ＝18.233，P＜0.01)，其中选择实验组数量为114只，对照组数量为58只。同时，剩余5中分离片段(PFF1‑PFF5)对雄性克氏原螯虾均无显著吸引效果(P＞0.05)(表3)。因此，选取雌性克氏原螯虾片段6(PFF6)进行后续代谢组学分析，并以雄性克氏原螯虾片段6(PFM6)为对照组比较筛选差异代谢物。

[0054] 表3雄性克氏原螯虾对不同制备片段的行为学实验卡方检验表

[0055] 制备片段名称 对照组选择数 实验组选择数 无反应数 2 df PPFF1 92 89 19 0.05 1 0.824
PFF2 80 78 42 0.025 1 0.874
PFF3 80 72 48 0.421 1 0.516
PFF4 76 92 32 1.524 1 0.217
PFF5 84 93 23 0.458 1 0.499
PFF6 58 114 28 18.233 1 ＜0.01**

[0056] 步骤4、测定差异代谢物组成成分(实验4)

[0057] 4.1样本提取

[0058] 将冷冻样本(雌性PFF6和雄性PFM6)置于4℃环境下缓慢解冻，加入预冷甲醇/乙腈/水溶液(2∶2∶1，v/v)后，涡旋混合，低温超声30min，‑20℃静置10min，4℃离心(14000g/min，20min)，吸取上清真空干燥。质谱分析时加入100μL乙腈水溶液(乙腈:水＝1:1，v/v)复溶，涡旋，14000g 4℃离心15min，取上清液过0.22μm滤膜，待进样分析。

[0059] 4.2UPLC‑MS/MS采集条件

[0060] 4.2.1色谱条件

[0061] 样品采用Agilent 1290InfinityLC超高效液相色谱系统(UHPLC)HILIC色谱柱进行分离；柱温25℃；流速0.5mL/min；进样量2μL；流动相组成A：水+25mM乙酸铵+25mM氨水，B：乙腈；

[0062] 梯度洗脱程序如下：0～0.5min，95％ B；0.5～7min，95％～65％B；7～8min，65％～40％ B；8～9min，40％ B；9～9.1min，40％～95％ B；9.1～12min，95％ B。

[0063] 4.2.2Q‑TOF质谱条件

[0064] 采用AB Triple TOF 6600质谱仪(AB SCIEX)进行样本一级、二级谱图的采集：

[0065] 离子源：电喷雾电离(ESI)正离子和负离子源；

[0066] 离子源温度：600℃；

[0067] 雾化气辅助加热气1(Gas1)：60；

[0068] 辅助加热气2(Gas2)：60；

[0069] 气帘气(CUR)：30psi；

[0070] 喷雾电压(ISVF)：±5500V(正负两种模式)；

[0071] 一级质荷比检测范围：60‑1000Da；

[0072] 二级子离子质荷比检测范围：25‑1000Da；

[0073] 一级质谱扫描累积时间：0.20s/spectra；

[0074] 二级质谱扫描累积时间0.05s/spectra；二级质谱采用数据依赖型采集模式(IDA)获得，并且采用峰强度值筛选模式；

[0075] 去簇电压(DP)：±60V(正负两种模式)；

[0076] 碰撞能量：35±15eV；

[0077] 动态排除同位素离子范围：4Da。

[0078] 4.3克氏原螯虾制备片段RF6和RM6代谢物类别分析

[0079] 超高效液相色谱‑质谱联用分析结果显示：通过正负离子模式共从雌雄克氏原螯虾PFF6和PFM6片段内鉴定出471种代谢物(图3)，包括脂类物质(Lipids andLipid‑like molecules：39.703％)、未分类物质(Undefined：15.074％)、有机酸类物质及其衍生物(Organic acids and derivatives：12.951％)、苯环形化合物(Benzenoids：8.493％)、有机氧化合物(Organic  oxygen  compounds：7.431％)、苯并米唑化合物(Organoheterocyclic compounds：6.582％)、有机含氮化合物(Organic nitrogen compounds：5.096％)等。

[0080] 4.4差异代谢物的筛选与筛选

[0081] 采用非靶代谢组分析比较筛选雌性半制备片段PFF6的样本代谢物，以雄性半制备分离片段PFM6样本为对照组，进行多变量统计分析，并采用严格的正交偏最小二乘法判别FC分析(OPLS‑DA)变量重要性投影值VIP>1、P值<0.05和∣log2 ∣>1(FC：差异倍数)作为显著性差异代谢物筛选标准，以筛选具有显著差异表达的代谢物。

[0082] 以柱状图直观展示各组间在正离子和负离子模式下筛选到的显著性差异代谢物的上下调情况(图4)。共从雌雄两组中筛选出18种显著差异代谢物(DMs)，其中在雌性组别中上调15种，下调3种。正离子模式结果显示，共有11种DMs在雌性组别中上调，包括吲哚‑3‑乙腈(Indole‑3‑acetonitrile)、二甲基亚砜(Dimethyl sulfoxide，DMSO)、尼古丁(Nicotine)、可替宁((‑)‑cotinine)、四甘醇(Tetraethylene glycol)、麦斯明(Myosmine)、无水肌酸(Creatine)、肌酐(Creatinine)、戊二醛(Glutaraldehyde)、4‑氨基苯酚(4‑aminophenol)和2‑羟基吡啶(2(1h)‑pyridinone)，1种下调DM为葫芦巴碱(Trigonelline)(图4A)；负离子模式共获得6种DMs，雌性实验组中4种DMs上调，包括2,4‑二硝基苯酚(2,4‑dinitrophenol)、美雌醇(Mestranol)、顺式己二烯二酸(Cis,cis‑muconic acid) 、百日菊链格孢醇(Zinniol) ，下调DMs包括十四烷基膦酸酯(Tetradecylphosphonate)和反式愈伤酸(Trans‑traumatic acid)(图4B)。

[0083] 步骤5、测定候选信息物的行为学

[0084] 从实验4中上调的显著差异代谢物DMs中筛选出6种内源性且无害的DMs，包括无水肌酸、肌酐、顺式己二烯二酸、2‑羟基吡啶、美雌醇、吲哚‑3‑乙腈进行行为学实验。6种差异代谢物均购于麦克林生化科技公司，并配置浓度至0.01mol/L。美雌醇和吲哚‑3‑乙腈为不溶于水物质，溶剂选择二甲基亚砜(DMSO)，后续行为学实验对照组相应设置为DMSO而非超纯水。筛选出有效吸引物后配置不同浓度以测定其对克氏原螯虾的有效吸引浓度范围，浓‑7 ‑3度配置范围为10 mol/L‑10 mol/L。行为学实验步骤及后续数据处理方法参照实验1。

[0085] 结果显示选取的6中DMs中，只有美雌醇能够显著吸引雄性克氏原螯虾个体(χ2＝10.215，P<0.01)，而无法显著吸引雌性个体；剩余5种DMs对雌雄克氏原螯虾个体均无显著性吸引力(表4)。

[0086] 美雌醇CAS号：72‑33‑3，分子量：310.43，中文别名：3‑甲氧基‑17α‑乙炔雌二醇、17Α‑乙炔雌二醇3‑甲醚、炔雌醇甲醚等。

[0087] 不同浓度美雌醇对雄性克氏原螯虾的吸引力结果显示，美雌醇的最低有效吸引浓‑6 ‑5 ‑5度在10 mol/L‑10 mol/L之间，浓度≥10 mol/L时可稳定显著的吸引雄性克氏原螯虾，且其对雄性个体的吸引力随浓度上升而增强(图5)。

[0088] 本实验筛选得到的美雌醇可以用于迷惑或引诱雄性克氏原螯虾，生态防治时，可以通过释放新性信息素美雌醇达到迷惑雄性克氏原螯虾的目的，从而阻止雄性克氏原螯虾寻找雌性克氏原螯虾交配。在繁殖季节，还可以用新性信息素美雌醇作为引诱剂诱捕雄性克氏原螯虾，达到生态防治的目的。美雌醇还可以作为引诱剂，或者混合其他辅料制备引诱剂。辅料可以用于延长美雌醇的保存时间，延长美雌醇的引诱时间等等。

[0089] 表4 6种DMs对雌雄克氏原螯虾行为反应实验卡方检验表

[0090]

[0091] 以上详细描述了本发明的较佳具体实施例。应当理解，本领域的普通技术人员无需创造性劳动就可以根据本发明的构思作出诸多修改和变化。因此，凡本技术领域中技术人员依本发明的构思在现有技术的基础上通过逻辑分析、推理或者有限的实验可以得到的技术方案，皆应在由权利要求书所确定的保护范围内。