[0001] 本发明涉及一种大豆疫霉无毒基因的标记，具体涉及一种与大豆疫霉无毒基因PsAvr3b基因共分离的分子标记基因PsAvh307，以及在无毒基因标记过程中所用的快速的标记方法。

[0002] 大豆疫霉菌属于鞭毛生物界卵菌门霜霉亚纲腐霉目腐霉科疫霉属(Tyler，2007)，疫霉属包含有80多个疫霉种，很多种都是农业生产上重要的病原菌。与多数疫霉种不同，大豆疫霉菌的寄主范围非常窄，主要侵染大豆，此外仅能侵染羽扇豆属(Lupinus spp.)的几种植物。大豆疫霉菌侵染大豆，引起幼苗的猝死和成株的根腐，是世界范围内大豆生产的主要威胁之一。每年给世界范围内的大豆生产造成直接经济损失高达十几亿美元(Tyler，2007)。该病于1948年首次在美国的印地安那州发现，而后相继在澳大利亚、加拿大、巴西、阿根廷、日本、意大利、新加坡、俄罗斯、白俄罗斯、乌克兰、哈萨克斯坦、匈牙利、德国、英国、法国、瑞士、新西兰、埃及、尼日利亚、印度等国家都发现了该病害(Schmitthenner，1985；
Jee et al.，1998；Wrather et al.，2001)。我国1989年由沈崇尧和苏彦纯(1991)首次在东北大豆主产区分离到该病原菌，之后在黑龙江、吉林、北京、山东、安徽、河南、江苏、浙江、内蒙古、湖北、福建、新疆、四川、天津和贵州(苏彦纯等，1993；朱振东等，2003；陈庆河等，
2004；王华等，2006；徐静静等，2009；唐庆华等，2009)等15个省(市区)也相继被报道分离鉴定到大豆疫霉菌。其中在黑龙江和福建两省发生较为严重，其他省份零星发生，目前仍是我国重要的对外检疫对象。

[0003] 在植物与卵菌的长期协同进化过程中，卵菌为了成功侵染植物，分泌大量效应分子(effectors)到植物细胞的不同部位来破坏或延缓植物的防卫反应(Birch et al.，2006；Kamoun，2006；Vleeshouwers et al.，2008)。大量研究表明大部分卵菌病害的发生符合Flor的“基因对基因”假说，因此，与很多植物病原细菌和真菌一样，卵菌中也存在一类效应分子可以被寄主植物的抗病基因产物(R protein)识别，从而引发强烈的植物免疫反应进而阻止病害的发生，而编码这类效应分子的基因被称为无毒基因(Avr gene)。卵菌分泌的Avr protein与寄主植物的R protein之间的相互作用直接决定着卵菌病害的发生，因此，围绕Avr基因的研究一直是卵菌病害研究的重点之一。以前，卵菌Avr基因的研究主要集中在Avr基因的鉴定以及分子标记上，最近，由于疫霉菌基因组序列的公布以及基因枪等新技术的广泛使用，十多个卵菌Avr基因陆续被克隆。目前，已经克隆到的卵菌NdwsB
Avr基因包括来自来Hyaloperonospora arabidopsis的ATR1 和ATR13；自P.infestans的PiAvr3a、PiAvr4、PiAvrblb1和PiAvrblb2，以及来自P.sojae的PsAvr1b，PsAvr1a，PsAvr3a、PsAvr3c和PsAvr4/6(Allen et al.，2004；Shan et al.，2004；Armstrong etal.，
2005；Rehmany et al.，2005；van Poppel et al.，2008；Vleeshouwers et al.，2008；Dong etal.，2009；Qutob et al.，2009；Sang-Keun et al.，2009；Dou et al.，2010)。此外这些Avr基因在基因和基因组结构上的特征、进入植物细胞的转运机理以及在植物病害中具有的毒性功能研究也成为研究热点。从卵菌无毒基因的克隆入手，探索无毒基因的起源和进化，明确其在病菌致病过程中的功能，了解无毒基因和抗病基因之间的协同进化机理，对于近一步认识和防治该类病害具有重要意义。

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一种简便、快速鉴定大豆疫霉无毒基因PsAvr3b的分子标记、方法及其引物。

[0005] 本发明提供的技术方案是：一种通过分子标记鉴定在大豆疫霉菌株中无毒基因PsAvr3b的引物，其上游引物为SEQ ID NO.1，下游引物为SEQ ID NO.2。

[0006] 一种利用所述的引物鉴定大豆疫霉无毒基因PsAvr3b的方法，包括如下步骤：

[0007] 提取大豆疫霉基因组DNA；

[0008] 以大豆疫霉基因组DNA为模板，用权利要求1所述的引物进行扩增；

[0009] 回收扩增片段，用Dra I进行酶切；

[0010] 检测量酶切后的片段大小，若得到大小为1271bp的片段，则表明所述大豆疫霉是毒性菌株；若得到大小为349bp和928bp的片段，则表明所述大豆疫霉为无毒菌株。

[0011] 所述大豆疫霉无毒基因PsAvr3b为PsAvh307基因。

[0012] 本发明具有以下有益效果：利用本发明所述的引物及方法能够简便、快速鉴定大豆疫霉菌株是有毒菌株还是无毒菌株。本发明人利用不同毒力的菌株杂交产生F1代杂合子，再自交产生F2代。通过致病性测定和候选基因的CAPS标记对F2代表现型和基因型进行比较，发现PsAvh307的基因型和PsAvr3b的表现型相吻合，从而确定PsAvh307与该无毒基因为共分离，证明Avh307是无毒基因Avr3b。本发明不仅可以研究该无毒基因在自然群体中的分布情况，揭示大豆疫霉菌在田间致病型分化变异的特点，而且为克隆该无毒基因奠定了基础，同时可以对含有大豆疫霉抗病基因Rps3b的大豆抗病品种抗性鉴定提供相关的借鉴。

[0013] 图1表明F2中PsAvh307的基因型和PsAvr3b的表现型相吻合。

[0014] 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

[0015] 实施例1

[0016] 1、无毒基因的候选基因

[0017] 根据无毒基因可能的基因组结构特征和无毒基因可能的转录特征，将两者结合找到同时具有多拷贝和在某一侵染阶段高量特异转录的RXLR基因。找到了符合条件的Avh基因，即PsAvh307。该基因被认为是大豆疫霉无毒基因的最佳候选基因。

[0018] 2、设计CAPS标记

[0019] 根据候选基因在2个菌株R2(P6497)和R19(P7076)中核苷酸的序列差异(PsAvr3b在R2(P6497)菌株中的核苷酸序列见SEQ ID NO.3，PsAvr3b在R19(P7076)菌株中的核苷酸序列见SEQ ID NO.4)，从而产生不同的酶切位点，根据酶切位点的不同设计出如下候选基因的CAPS标记(见表1)。

[0020] 表1候选无毒基因的CAPS标记

[0021]

[0022] 3、供试菌株

[0023] 大豆疫霉全基因组测序菌株R2(P6497)和R19(P7076)(Shan et al.，2004)为BrettM.Tyler教授(美国Virginia生物信息研究所)馈赠，由南京农业大学植病系真菌分子生物学实验室保存。菌株保存于10％V8固体培养基，保存温度为10℃。

[0024] 4、供试大豆幼苗的准备

[0025] 鉴别寄主大豆播种于装有蛭石(d＝2-4mm)的塑料花盆(d＝10cm)中，每盆种12粒种子，放入24-28℃、14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中生长，7天后两片真叶长出但未展开，间苗使每盆10颗幼苗并充分浇水用于接种。所用鉴别寄主(由弗吉尼亚理工大学Brett Tyler教授提供)为PRX146-36(Rps3b)。感病对照品种为Williams。

[0026] 5、大豆疫霉菌致病型的测定

[0027] 采用下胚轴伤口接种法(Laviolette et al.，1981)，测定大豆疫霉菌株对鉴别寄主的毒性。大豆疫霉菌株在LBA平板上黑暗25℃培养7天，之后切成2mm×3mm的小块作为接种体；用解剖刀在大豆幼苗的子叶下1cm处向下划约0.5cm长的伤口，然后将接种体菌丝面朝内贴在伤口处。接种后保湿12h，然后放入24-28℃、14h光照(强光照射)/10h黑暗的温室中，5天后调查结果。每个鉴别寄主接种10株，以植株死亡率作为抗感的分类标准，植株死亡率≤30％，记为抗病(A)；植株死亡率≥70％，记为感病(V)；植株死亡率在30％-70％之间，记为中间类型(I)(Anderson et al.，1992；Barreto et al.，1995；Yang et al.，1996；Ryley et al.，1998)。试验重复2次。

[0028] 6、基因组DNA的提取

[0029] 采用CTAB(Cetyltrimethylammonium bromide)法提取大豆疫霉基因组DNA(Doyle &Doyle，1987)，具体操作如下：

[0030] (1)取大约50mg冷冻干燥后的菌丝粉于1.5ml EP管中，加入900μl 2％CTAB(十六烷基三甲基溴化铵)提取液(2％CTAB；100mmol/L Tris-HCl，PH 8.0；20mmol/L EDTA，PH8.0；1.4mol/L NaCl)和90μl 10％SDS(十二烷基苯磺酸钠)后漩涡混合器上充分混匀；

[0031] (2)55-60℃水浴1h，每15min振荡混匀一次；

[0032] (3)12000rpm/min离心10min，取上清液，加等体积的酚\氯仿\异戊醇(25∶24∶1)提1次；

[0033] (4)12000rpm/min离心10min，吸取上清液，加等体积氯仿抽提1次；

[0034] (5)12000rpm/min离心10min，吸取上清液，加0.1×体积的3MNaAC溶液和2×体积的冰无水乙醇过夜沉淀基因组DNA；

[0035] (6)用预冷的70％乙醇洗涤两次，然后置37℃下干燥；

[0036] (7)干燥后的DNA用40μl 1×TE(10mmol/L Tris-HCL，0.1mmol/L EDTA，PH8.0)溶解后(TE中含50μg/ml RNase)，于37℃静置1h降解RNA；

[0037] (8)取2μl DNA样品在1％的Agarose胶上电泳，紫外分光光度计检测DNA浓度和纯度，并稀释至约25ng/μl后-20℃冰箱中备用。

[0038] 7、PCR扩增和酶切检测

[0039] PCR反应体系为：2.5μl 10×PCR反应缓冲液，1.5μl 1.5mM MgCl2，0.5μl2.5mMdNTPs，0.25μl Taq DNA聚合酶(5.0U/μl)，0.5μl引物，0.5μl模板DNA，加无菌超纯水至25μl。

[0040] PCR反应参数：95℃变性30S，95℃变性30S，55-60℃退火30S，72℃延伸90S，30个循环，72℃延伸10min。PCR反应在MJ Rsearch PT200热循环仪上进行。

[0041] 电泳：PCR产物用1％琼脂糖凝胶电泳，120V电泳20-30min，用0.5μg/ml溴化乙锭溶液染色，紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相。

[0042] 酶切体系：1.0μl DraI限制性内切酶，2.0μl 10×M反应缓冲液，5.0μl PCR扩增产物，加无菌超纯水至20μl。37℃反应4-5h。

[0043] 通过上述方法进行电泳检测。

[0044] 若得到大小为1271bp的片段，则表明所述大豆疫霉是毒性菌株；若得到大小为349bp和928bp的片段，则表明所述大豆疫霉为无毒菌株。

[0045] 实施例2

[0046] 为进一步验证上述CAPS标记，对来源于R2(P6497)和R19(P7076)的有性交配的F1和F2后代进行检测。

[0047] 1、大豆疫霉F1和F2后代的产生

[0048] F1代来源于R2(P6497)和R19(P7076)的有性交配：分别将两种菌丝切5mm的小块放在同一块含2.5％(v/v)V-8和10μg/ml β-sitosterol的琼脂平板上，25℃黑暗生长至少30天挑取单卵孢子，提取单卵孢子基因组DNA，用CAPS标记确认是杂合子。将杂合子F1代菌丝切5mm的小块放在含2.5％(v/v)V-8和10μg/ml β-sitosterol的琼脂平板上，同样的方法通过F1代自交获得F2后代。

[0049] 2、F2中PsAvh307的基因型和PsAvr3b的表现型相吻合

[0050] 从F1代自交产生F2代并随机挑选了40个F2代，分别提取了基因组DNA。以R2和R19为对照，将每一个F2代的基因型(Avh307的CAPS标记)和表现型(在含抗性基因Rps3b的大豆PRX146-36上的毒性)进行了比对(图1)，发现Avh307的基因型和表现型在R2和R19以及F2代的分离可以完全吻合，证明Avh307是无毒基因Avr3b。