[0001] 本发明涉及一种检测稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的分子标记引物，以及利用所述引物检测稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的分子标记方法。

[0002] 水稻是重要的粮食作物之一，而稻瘟病是世界分布最广、为害最严重的水稻病害之一，己成为水稻高产、稳产的主要障碍因素（Ou S H.1980,Pathogen variability and host resistance in rice blast disease.Ann Rev Phytopathol.18:167-187.），它造成的危害正严重威胁着人类的粮食安全。防治稻瘟病也同其他水稻病害一样，是通过利用杀菌剂，栽培措施与种植抗病品种相结合的方式进行的，而种植抗病品种是防治稻瘟病最经济有效的办法之一。然而要卓有成效地开展抗病育种工作,除了必须寻找优良的抗源外,还必须深入研究稻瘟病菌的致病机制以及水稻与稻瘟病菌之间的互作机理等，而且在病原菌与寄主协同进化过程中，病原菌毒力基因组成会随着寄主抗病基因组成的变化而改变，最终导致抗病品种抗性的丧失（Zeigler R S.1998,Recombination in Magnaporthe grisea.Annu Rev Phytopathol,36:249-275.）。在分子水平上研究这种互作关系，不仅要不断发现和利用新的抗病基因，进行水稻品种抗病基因分析，将多个抗病基因混合使用外，同时也必须对稻瘟病菌群体中的无毒基因进行分析。对无毒基因产物的研究是进一步了解特异性的分子遗传机制的重要手段，无毒基因可以作为一种分子探针用于研究稻瘟病菌的毒性群体结构特征，揭示其变异规律及动态，也可为抗病品种的合理布局和培育抗病品种及病害防治提供理论依据，从而达到长期、有效地控制该病害的目的（石军等，稻瘟病菌无毒基因研究进展.中国生物工程杂志,2006,26(12)：112~116）。

[0003] 按照传统稻瘟病菌毒性组成（生理小种）鉴定的方法是通过鉴别品种的致病型鉴定划分生理小种来研究稻瘟病菌的群体结构，通过这种方法可了解稻瘟病菌群体中的生理小种组成和优势种群的变化,从而掌握稻瘟病菌的群体结构和遗传变异动态，但划分的生理小种常因鉴别品种而异，且工作量大，结果易受季节限制，环境条件人为因素的影响，难以准确反映稻瘟病菌的群体结构（陈庆河，稻瘟病菌群体遗传多样性及其无毒基因的遗传分析与分子标记定位.2005.南京农业大学博士学位论文）。

[0004] 随着分子遗传学和分子生物学的发展，DNA水平上的指纹分析技术（如，SSR，RAPD，CAPS）为研究稻瘟病菌群体无毒基因的组成提供了高效、快速的方法，避免了通过鉴别品种的致病型鉴定的大量工作，因此国内外都非常重视稻瘟病菌无毒基因的分子标记筛选工作。目前利用DNA分子标记已鉴定了40多个稻瘟病菌的无毒基因(Ma,J.H.,Wang,L.,Feng,S.J.,Lin,F.,Xiao,Y.,and Pan,Q.H.2006.Identification and fine mapping of AvrPi15,a novel avirulence gene of Magnaporthe grisea.Theor Appl Genet113:875-883.)，并已经克隆到了9个无毒基因（Pw11、Pw12、Avr-CO39、Avr-pita、ACE1、Avr-Pia、Avr-Pii、AvrPiz-t和Avr-Pik)，这就为通过分子标记来鉴定毒性组成创造了便捷条件。一些无毒基因连锁的分子标记（尤其是早期定位所用的分子标记）大多是RFLP标记，但由于这类标记需要复杂的操作程序、昂贵的生化试剂和大量样本的DNA，不便于无毒基因的毒性组成分析。近年来，越来越多种类的生物基因组序列公布出来，使得分子标记的发展迅速。

[0005] 本研究 采用 的CAPS标记（酶切扩 增多态 性序 列，Cleaved Amplified Polymorphism Sequences)是基于RFLP标记发展而来，由特异引物PCR与限制性酶切相结合而产生。当SCAR或STS的特异扩增产物的电泳谱带不表现多态性时，可以用限制性内切酶对扩增产物进行酶切，然后再通过琼脂糖或聚丙烯酰胺凝胶电泳检测其多态性。它揭示的是特异PCR产物DNA序列内限制性酶切位点变异的信息，目前已经在分子生物学、遗传学、育种学等研究领域得到广泛应用。CAPS是一种基于PCR技术的分子标记，具有共显性、位点特异性、重复性好、操作简单和成本低等特点,是一种值得推广的标记手段，有助于揭示大田中无毒基因的变异规律及动态，能大大增加目标染色体区段的PCR标记饱和度，加快无毒基因的克隆工作。

[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种利用分子标记快速、准确检测稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的方法，筛选获得与无毒基因Avr-Pit紧密连锁且不受环境影响的分子标记并进行染色体定位，将分子标记与病菌的毒性组成紧密地联系起来。

[0007] 本发明提供的技术方案是：一种检测稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的分子标记引物，其上游引物序列如SEQ ID No.1所述，下游引物序列如SEQ ID No.2所述。

[0008] 一种稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的分子标记检测方法：利用上述的引物扩增待测稻瘟病菌基因组DNA，取扩增产物用酶EarI进行酶切，然后对酶切片段进行凝胶电泳，若出现两条长度分别为268bp和101bp的片段，则待测稻瘟病菌基因组含有无毒基因Avr-Pit。

[0009] 上述的检测方法，其中EarI酶切体系为：10×4buffer2.0μl，DNA0.5μg，EarI酶0.5μl，加无菌超纯水至20μl。

[0010] 本发明提供另一种检测稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的分子标记引物，其上游引物序列如SEQ ID No.3所述，下游引物序列如SEQ ID No.4所述。

[0011] 本发明提供另一种稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit的分子标记检测方法：利用上述的引物扩增待测稻瘟病菌基因组DNA，取扩增产物用酶PciI进行酶切，然后对酶切片段进行凝胶电泳，若出现两条长度分别为472bp和382bp的片段，则待测稻瘟病菌基因组含有无毒基因Avr-Pit。

[0012] 上述的检测方法，其PciI酶切体系为：10×3buffer 2.0μl，DNA 0.5μg，100×BSA 0.2μl，PciI酶0.5μl，加无菌超纯水至20μl。

[0013] 上述的检测方法，扩增待测稻瘟病菌基因组DNA的PCR反应体系为：10×Ex Taqbuffer 5.0μl，MgCl2 2mM，dNTPs 0.2mM，Ex Taq DNA聚合酶1.25U，上、下引物各为0.5μM，模板DNA2.5ng，加无菌超纯水至50μl；PCR反应参数为：94℃预变性5min；94℃变性30S,57℃退火30S,72℃延伸1min,31个循环；72℃延伸8min。

[0014] 本发明具有以下有益效果：

[0015] 与现有的分子标记技术相比，其优点和积极效果表现在：

[0016] （1）标记稳定：本发明获得的无毒基因分子标记为CAPS标记，两个连锁的分子标记稳定，不易受反应体系、条件、DNA浓度的影响，而且操作简单，结果明确。

[0017] （2）节约时间和成本：稻瘟病菌群体毒性组成监测的传统方法是通过鉴别品种的致病型鉴定划分生理小种来研究稻瘟病菌的群体结构，通过这种方法可了解稻瘟病菌群体中的生理小种组成和优势种群的变化,从而掌握稻瘟病菌的群体结构和遗传变异动态，但鉴定受季节的限制、划分的生理小种常因鉴别品种而异，且结果易受环境条件人为因素的影响，准确性低，难以准确反映稻瘟病菌的群体结构。通过本发明筛选出的与无毒基因紧密连锁的分子标记不受环境影响，可以准确地靶定无毒基因，节约大量时间和成本，快速分析田间稻瘟病菌无毒基因的组成、分布及演变规律。

[0018] 本发明通过对稻瘟菌株交配产生的子囊孢子后代群体进行遗传分析，运用CAPS标记技术，可以构建并定位稻瘟菌无毒基因Avr-pit的遗传图谱，获得了与无毒基因紧密连锁的分子标记。通过获得与稻瘟病菌无毒基因紧密连锁的分子标记，不仅可利用该无毒基因的标记作探针，研究该无毒基因在自然群体中的分布情况，揭示病菌群体毒性组成和变异特点，且为进一步物理作图法克隆该无毒基因奠定基础。本发明用分子标记技术，定位了稻瘟病菌的无毒基因Avr-pit。

[0019] 图1a为电泳检测由CAPS标记引物CAPS77扩增稻瘟病菌亲本菌株基因组DNA产物的酶切结果；图1b为电泳检测由CAPS标记引物CAPS77扩增稻瘟病菌部分杂交后代基因组DNA产物的酶切结果；A：无毒菌株，V：毒性菌株；M：2kb plus marker。

[0020] 图2为电泳检测由CAPS标记引物CAPS88扩增稻瘟病菌亲本菌株及部分杂交后代基因组DNA产物的酶切结果；A：无毒菌株，V：毒性菌株；M：2kb plus marker。

[0021] 图3为无毒基因Avr-Pit的部分连锁遗传图。

[0022] 下面通过具体实施方式的详细描述来进一步阐明本发明，但并不是对本发明的限制，仅仅作示例说明。

[0023] 实施例1：

[0024] 稻瘟病菌无毒基因Avr-Pit连锁的分子标记、定位，是通过以下方法获得的：

[0025] 1）利用亲本Guy11与JS153（亲本菌株为南京农业大学植病系保存菌株）以及杂交获得的有性后代（陈庆河等鉴定），在初步得到的与无毒基因Avr-Pit连锁遗传的SSR标记m355-356基础上（Chen QH,Wang YC,Li AN,Zhang ZG,Zheng XB.2007.Molecular mapping of two cultivar-specific avirulence genes in the rice blast fungus Magnaporthe grisea.Mol Genet Genomics.277(2)：139-48.），设计CAPS标记引物，引物序列如表1：

[0026] 表1

[0027]

[0028] 2）采用含CAPS标记CAPS77、CAPS88的两对CAPS分子标记引物扩增获得的分子标记在两个亲本中进行与无毒基因Avr-Pit连锁标记的筛选。CAPS标记的PCR反应程序为：10×Ex Taq buffer5.0μl，MgCl2 2mM，dNTPs 0.2mM，Ex Taq DNA聚合酶1.25U，引物各为0.5μM，模板DNA2.5ng，加无菌超纯水至50μl。PCR反应参数：94℃预变性5min;94℃变性30S,57℃退火30S,72℃延伸1min,31个循环；72℃延伸8min；PCR反应在MJ Rsearch PT200热循环仪上进行。反应结束后每样品50μl,以1%的琼脂糖凝胶于1×TAE(10mM Tri s,pH7.8,5mM醋酸钠，0.5mM EDTA)中电泳,然后将扩增产物在含有溴化乙锭(0.5μg/ml)的溶液中浸泡10～15min后移至清水中漂洗5～10min,在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相、查看。

[0029] 3）将片段回收，分别用对应的酶EarI、PciI进行酶切，EarI酶切体系：10×4buffer2.0μl，DNA0.5μg，EarI酶0.5μl，加无菌超纯水至20μl。PciI酶切体系：
10×3buffer2.0μl，DNA0.5μg，100×BSA0.2μl，PciI酶0.5μl，加无菌超纯水至20μl。
酶切10h后，每样品取10μl,以1.5%的琼脂糖凝胶于1×TAE(10mM Tris,pH7.8,5mM醋酸钠，0.5mM EDTA)中电泳,然后将扩增产物分别在含有溴化乙锭(0.5μg/ml)的溶液中浸泡10～15min后移至清水中漂洗5～10min，在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相、查看，若用酶EarI进行酶切出现两条长度分别为268bp和101bp的片段，则待测稻瘟病菌基因组含有无毒基因Avr-Pit；若用酶PciI进行酶切出现两条长度分别为472bp和
382bp的片段，则待测稻瘟病菌基因组含有无毒基因Avr-Pit。

[0030] 实施例2：

[0031] 将实施例1中的引物CAPS77、CAPS88在65个子代中进行扩增，PCR反应体系和程序与实施例1相同，反应结束后每样品50μl,以1%的琼脂糖凝胶于1×TAE(10mM Tris,pH7.8,5mM醋酸钠，0.5mM EDTA)中电泳,然后将扩增产物在含有溴化乙锭(0.5μg/ml)的溶液中浸泡10～15min后移至清水中漂洗5～10min,在紫外灯下观察并用Bio-rad凝胶成像系统照相。将片段回收，用对应的酶EarI、PciI进行酶切，10h后电泳观察结果。若用酶EarI进行酶切出现两条长度分别为268bp和101bp的片段，则待测稻瘟病菌基因组含有无毒基因Avr-Pit；若用酶PciI进行酶切出现两条长度分别为472bp和382bp的片段，则待测稻瘟病菌基因组含有无毒基因Avr-Pit。

[0032] 本发明共筛选获得2个紧密连锁的分子标记，根据连锁交换规律进行遗传连锁分析，利用群体基因型资料构建稻瘟菌的遗传连锁图谱，所用软件为JoinMap3.0，最小LOD值设为7，获得遗传距离连锁图谱（见图3）：第1染色体端粒附近的CAPS标记CAPS77、CAPS88与无毒基因Avr-Pit连锁，遗传距离分别为0.9cM和2.7cM。本发明不仅可利用该无毒基因的标记作探针，研究该无毒基因在自然群体中的分布情况，揭示病菌群体毒性组成和变异特点，且作为进一步物理作图法克隆该无毒基因的起点。