利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法

技术领域本发明涉及利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法。通过构建含pmi基因的植物表达载体，利用甘露糖作为选择剂、氯酚红法快速检测抗性植株获得转基因植物的方法，属于生物技术领域。

背景技术甘蔗是一种高度杂合的无性繁殖作物，遗传背景非常复杂，一般表现为异源多倍体和多倍体的非整倍体，其染色体数目多，基因组巨大，在不同种间或同一种内的不同类型之间染色体数目差异很大，从2n＝54到2n＝128。甘蔗的栽培种大都来自热带种、割手密种和印度种等几个种的种间杂种，是带有广泛异质性和不配对染色体的混倍结合体，在细胞分裂过程中，染色体的异源配对、交换、分配等行为都具有特异之处，这给育种工作带来很大的盲目性，想要把亲本多个优良性状都结合起来非常困难(彭绍光，1990，甘蔗育种学，农业出版社)。所以要想通过常规的杂交育种方法和程序在优良品种中引入抗性基因时间长、效率低。转基因技术的日趋成熟在这方面开辟了一条全新的途径，对于甘蔗的遗传改良具有重要的意义。

以前，甘蔗的遗传转化主要还是通过基因枪转导或农杆菌介导法，利用抗生素如潮霉素、G418等进行筛选获得抗性植株，再经生物和分子(PCR、Southern和Northern杂交)检测确定转基因植株来实现的，综观国内外生物技术在改良甘蔗上的应用，转化后再生苗获得周期长、效率低，是制约其发展的主要问题。同时，目前在植物转基因上应用的筛选体系有很多种，根据其对转化体细胞新陈代谢活动的利弊，分为正向筛选体系和负向筛选体系。负向筛选体系使植物产生抗性的机理是它对抗生素类、除草剂类或其它类似物具有解毒作用，解除它们对植物细胞的毒性，从而使转基因植物细胞对抗生素等产生抗性，而非转基因的植物细胞对抗生素等敏感而被杀死。常用的负向筛选体系包括抗生素筛选体系和除草剂类筛选体系等。虽然这些负向筛选体系目前应用比较广泛，但也存在着不可忽视的缺陷，如：选择标记基因与目的基因无关，使用抗生素等物质对植物生长有负面影响，抗性标记基因有潜在的生态环境和食用安全性隐患等。在正向筛选体系中，转化细胞能利用筛选剂糖类作为主要碳源，可以在筛选培养基上生长，而非转化细胞不能利用筛选剂糖类，处于饥饿状态，生长受到抑制但不被杀死。近年来，与负向筛选体系相比，正向筛选体系在安全性方面具有优势，因此得到了快速发展。

甘露糖就是其中一种正向选择系统。D-甘露糖作为筛选剂的选择机理(Joersbo和Okkels.1996)是：D-甘露糖由植物细胞内源的己糖激酶催化转变为6-磷酸甘露糖，反应消耗ATP；pmi基因编码的磷酸甘露糖异构酶(PMI)再将6-磷酸甘露糖催化转变为植物细胞可代谢的6-磷酸果糖。在含D-甘露糖的筛选培养基上，转化细胞不断将甘露糖转变成6-磷酸果糖，但非转化细胞因缺乏PMI，不能继续代谢，造成细胞内6-磷酸甘露糖的积累，伴随着ATP和磷酸基的大量消耗，从而生长受到抑制；(Sheu-Hwa C S，Lewis D H，Wakler D A.Stimulation of photosynthetic starchformation  by  sequestration  of  cytoplamic  orthophosphate.NewPhytol，1975，74：383-392)转化细胞则能将6-磷酸甘露糖转变为6-磷酸果糖，可继续代谢为细胞提供能量，同时避免了筛选剂衍生物6-磷酸甘露糖的积累，因此能在筛选培养基上利用甘露糖作为碳源进行生长和增殖。

发明内容本发明的目的在于建立一种高效、快速获得转基因甘蔗的方法，从而实现甘蔗的高效基因工程育种，以便今后从多方面提高甘蔗品种的抗性和改善其品质。

本发明利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法，利用来自大肠杆菌中的pmi基因(GenBank：accession M15380)构建植物表达载体，建立了以甘露糖为筛选剂的转基因遗传转化筛选体系，并且建立了一整套快速、高效的转基因检测技术，大幅度提高了甘蔗转基因再生植株的获得率，为甘蔗的基因工程育种奠定了坚实的基础。

本发明利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法，包括以下步骤：

1、抗性植株的获得

切取经消毒处理后直径为0.4～0.8cm，厚为1～2mm的甘蔗新叶，接种于诱导培养基上，于暗室中培养，培养温度为25±1℃，每15d继代一次；选择生长良好的甘蔗胚性愈伤组织作为转基因受体，将构建好的含pmi基因的植物表达载体，利用基因枪转导法转化甘蔗细胞；所述诱导培养基的成分为：MS+2，4-D 3.0mg·L-1；所述pUP载体指利用Ubi作为启动子、nos作为终止子、pmi作为标记基因的常规分子生物学方法构建的植物表达载体；MS培养基为植物组织培养的通用培养基。

将基因枪轰击后的胚性愈伤组织放入高渗培养基中10～20小时后转入继代培养基中培养2～10天，后转入总碳源为10g的含甘露糖继代培养基中进行筛选，26～28℃黑暗培养10～20天；之后将生长良好的愈伤组织转接到分化培养基中进行分化6～8周，培养12h·d-1，光照度1000～2000Lux，培养温度为26～28℃；待苗长至6～8cm时转接到生根培养基中促根培养，获得抗性植株；所述高渗培养基成分为：MS+2，4-D 2.0mg·L-1+0.2mol·L-1甘露醇+0.2mol·L-1山梨醇；所述继代培养基成分为：MS+2，4-D2.0mg·L-1；所述含甘露糖继代培养基，指在继代培养基中加入甘露糖和蔗糖，甘露糖取值范围为2g·L-1～8g·L-1，蔗糖取值范围为8g·L-1～2g·L-1，甘露糖与蔗糖总和为10g·L-1；所述分化培养基成分为：MS+6-BA 1.0mg·L-1NAA 0.1mg·L-1+KT 2.0mg·L-1+甘露糖3～4g·L-1+蔗糖7～6g·L-1+琼脂7g·L-1pH5.8；所述生根培养基的成分为：1/2MS+NAA 3.0mg·L-1+6-BA0.1mg·L-1+蔗糖40g·L-1pH5.8。

2、转基因植株的快速检测：

采用氯酚红(chlorophenol red，CPR)法，将待测组织接种到含有甘露糖和氯酚红的MS液体培养基中，在黑暗条件下，20～35℃培养1～5d后，观察培养基颜色变化，培养基颜色变成黄色或橙色，则pmi基因已成功导入。所述的含有甘露糖和氯酚红的MS液体培养基中，甘露糖含量为2～5g·L-1、氯酚红含量为30～60mg·L-1。

具体实施方式实例是为了更详细地解释本发明利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法，但本发明不局限于此。

实施例：利用pmi基因快速获得转基因甘蔗的方法，包括以下步骤：

1、用于遗传转化受体的获得

供试品种为福建农林大学甘蔗研究所培育的甘蔗新品种福农95-1702。首先进行消毒处理，选取生长旺盛的福农95-1702梢部30cm，去其叶片及顶端5cm。用70％酒精表面消毒2～3min后，超净工作台上剥去其最外层，再用70％酒精表面消毒1～2min后剥去次外层，然后小心切取直径为0.4～0.8cm，厚为1～2mm的新叶，接种于诱导培养基上，于暗室中培养，培养温度为(25±1℃)。每15天在继代培养基中继代一次。选取生长良好，富有光泽，颜色鲜黄，组织块颗粒致密的胚性愈伤为遗传转化的受体材料。

2、基因枪法遗传转化甘蔗胚性愈伤

在基因枪轰击前4小时先将受体材料接种在高渗培养基上进行。CaCl2、亚精胺和钨粉各取1个eppendof管放于冰上，取固体CaCl2(充分研磨高压灭菌烘干)0.4～0.6g于灭菌过的小培养皿中，剪好的滤纸片放于其上，然后把含有载体膜的金属环放在滤纸上。钨粉管放于超声波振荡器中充分振荡(若钨粉粘于管上，先在离心机中离心沉于管底)再放于离心机中8000g离心30sec，去上清，再用等体积的无菌水振荡1min，8000g离心1min，去除上清液。用无菌水重复冲洗一次，最后加入60μL无菌水在涡旋仪上涡旋保持振荡的同时依次加入(按处理10个样品的用量)：10μLDNA(1μg·μL-1)，50μL2.5mol·L-1CaCl2，20μL0.1mol·L-1亚精胺将混合物振荡2min后，冰浴5min；8,000g离心5sec，弃上清；用200μL70％乙醇冲洗沉淀一次；8,000rpm离心5sec，弃上清，200μL无水乙醇重新悬浮颗粒；8,000rpm离心5sec，弃上清；最后加入140μL无水乙醇重新悬浮颗粒，混匀。在不停涡旋的上述悬浮液中吸10μL，用枪头迅速均匀涂布于载片中心直径1cm的面积上，涂后立即盖之，放10min，其间不停震动防止结块，涂片应在2h内使用。

3、转基因甘蔗的筛选及培育

轰击后的愈伤组织仍放回高渗培养基上继续处理18h，其后接入MS+2，4-D 2mg·L-1的培养基上，25±1℃暗培养5～8d。恢复后的愈伤组织转接入继代筛选培养基中25±1℃暗培养，继代筛选15天，其后选择生长良好的愈伤接入到分化培养基中，置于光照培养箱中培养(12h·d-1，光照度1000～2000Lux)，培养温度为(27±1)℃，每15天更换一次新的培养基。待苗长至6～8cm时转接到生根培养基中促根培养。

4、转基因甘蔗的快速检测

把获得的的抗性植株叶片在无菌的条件下放入到含有甘露糖和氯酚红的MS液体培养基中显色，29℃暗培养2天，观察其颜色的变化，培养基颜色变成黄色或橙色为转基因植株，若颜色仍为紫色或红色为非转基因植株。配制含有甘露糖和氯酚红的MS液体培养基，即在MS液体培养基中加入甘露糖和氯酚红，使甘露糖含量为2～5g·L-1、氯酚红含量为30～60mg·L-1。