番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在提高植物对黄萎病抗性中的应用

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番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在提高植物对黄萎病抗性中的应用
申请号	CN202011073407.9	申请日	2020-10-09	公开(公告)号	CN112159816B	公开(公告)日	2022-08-26
申请人	西南大学;			发明人	李先碧; 裴炎; 金丹; 范艳华; 于晓涵; 侯磊; 赵娟; 李美华; 郑雪丽; 唐梦;
摘要	本发明公开了番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在提高植物对黄萎病抗性中的应用，通过番茄中克隆富含羟脯氨酸的系统素前体蛋白基因SlHypSys，采用分子生物学的方法，构建SlHypSys组成性表达的植物表达载体，然后再利用基因工程方法，将SlHypSys基因导入植物，获得了正常转录表达的转基因拟南芥、烟草和棉花株系；获得的转基因植株病情指数都显著低于野生型对照，对黄萎病的抗性显著提高，表明SlHypSys基因能够用于提高植物对黄萎病的抗性，对植物抗病基因工程具有重要意义。
权利要求	1.番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在提高植物对黄萎病抗性中的应用，其特征在于：所述番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于：所述植物为拟南芥、烟草或棉花。 3.利用番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys提高植物对黄萎病抗性的方法，其特征在于：将番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在植物中组成型表达，获得对黄萎病抗性的植物；所述番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在植物中组成型表达的方法是构建含有番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys的组成型植物表达载体，然后通过农杆菌介导获得转基因植物。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于：所述组成型植物表达载体为由组成型启动子调控番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys表达。 6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述组成型启动子为CaMV35S启动子。 7.根据权利要求5所述的方法，其特征在于：所述组成型植物表达载体为将SEQ ID NO.1所示序列通过BamHI和KpnI双酶切构建至植物表达载体pLGN中，获得植物表达载体pLGN‑35S‑SlHypSys。 8.根据权利要求3 7任一项所述的方法，其特征在于：所述植物为拟南芥、烟草或棉花。 ~ 9.一种植物表达载体在制备具有黄萎病抗性的转基因植物中的应用，其特征在于：所述植物表达载体含有组成型启动子调控番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys表达的表达框，所述番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
说明书全文	番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在提高植物对黄萎病抗性中的应用技术领域 [0001] 本发明涉及植物生物技术领域，具体涉及一种利用番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在提高植物对黄萎病抗性中的应用。背景技术 [0002] 植物病害是长期危害农业生产的自然灾害之一，全球因病害年损失10％以上(冯占山等，2013)。植物病害不仅引起农作物减产，而且严重威胁到农产品的质量安全和国际贸易，严重时还会引起食物短缺和一系列社会问题(Punja，2004)。病原菌危害不仅造成直接的经济损失，同时病原菌能产生毒素，带来严重的食品安全问题。因此，提高作物的抗病性不仅是解决粮食问题的关键，同时也是提高食品安全的一项重要措施。 [0003] 黄萎病是世界性的病害，从温带、亚热带到热带地区均有黄萎病发病的报道(Pegg GF,2002)。黄萎病菌是一种土传维管束病原菌，具兼性营养特性(Steven J.Klosterman等，2009)。病原菌变异频率快，生理小种多，在土壤中可以存活20年之久，能感染200多种植物品种，除单子叶植物以外的所有植物，包括各种蔬菜、果树、农作物、林木、花草等等都是黄萎病菌的寄主，每年因黄萎病引起的作物产量损失就达数十亿美元，其中，马铃薯感染黄萎病菌其损失可以达到50％以上，生菜非常容易达到100％，棉花在黄萎病发病严重的年份也容易造成颗粒无收，在所有维管束病害中，黄萎病菌引起的病害损失是最严重的(Pegg GF, 2002；Steven J.Klosterman等,2009；Agrios G，2005)。目前，克隆获得的抗黄萎病基因只有来自番茄的Ve1，该基因在生菜中也存在，但是几年之后抗性也丧失，更为重要的是，绝大多数作物缺乏抗黄萎病的抗原，并且难以获得具有抗性的抗原(Steven J.Klosterman等, 2009)。 [0004] 面对病原菌的快速变异和生理小种的特异性，创制具有广谱抗性的材料才是解决问题的根本。基因工程可以克服许多传统育种的不足，可使用的基因更多，来源更广。此外，基因工程还可以针对更大范围的病原菌获得更广谱的抗病性，对土壤有益微生物的影响也最小(Owen Wally等，2010)。但是，与已在世界各地广泛种植超过10年的抗除草剂和抗虫转基因植物相比，提高对真菌和细菌病害抗性的转基因植物取得的成功非常有限。提高转基因作物对某种病害抗性的成功报道也较多，比如，在胡萝卜中超量表达来自木霉的几丁酶基因CHIT36提高了转基因植株对真菌病害的抗性(Baranski R等，2008)。在番茄和水稻中分别超量表达不同来源的防御素基因RsAFP2和DmAMP提高了它们的抗病性(Jha S等，2009)，在水稻中表达峰毒素基因提高了水稻对白叶枯病的抗性(Wei Shi，2016)等等。这些外源基因提高植物抗病性虽然获得了较大的成功，但尚无应用于生产的报道，主要问题在于获得的抗性只是对某一病原菌或某一个生理小种(或菌株)具有较强的抗性，难以持久且不具广谱抗性(Yan‑Jun Chen，2012)。 [0005] 提高植物自身防御能力是提高植物广谱和持久抗性的重要手段。植物激素在植物防御反应中具有重要作用，调节植物抗病的SA、JA和ET信号途径也一直是研究的热点，随着研究的深入和扩展，近年来一类新的能激活植物对病原菌和昆虫产生抗性的防御信号肽引起了研究者们的关注，特别是来自植物的防御信号肽在调控植物对昆虫和病原菌免疫中的作用起来越受到重视(Yube Yamaguchi等，2011)。 [0006] 植物防御信号肽是肽激素中的一大类，其中之一是来源于有N‑末端分泌信号的前体蛋白肽。这类肽包括烟草、番茄、矮牵牛等植物的富含羟脯氨酸的系统素HypSys。番茄富含羟脯氨酸的系统素(SlHypSys)包含3种富含羟基脯氨酸的糖肽，分别为SlHypSysI、II和III，长度分别为20、18和15个氨基酸，这三种成熟肽来自于同一个前体蛋白，具有相同的功能,具有防御信号的作用。番茄植物受到损伤、系统素和茉莉酸甲酯诱导时，SlproHypSys在叶片的维管束薄壁细胞中合成，并定位于细胞壁基质中(Javier,2005)。 [0007] 植物防御信号肽有着一个重要的特点，他们的前体蛋白或成熟肽在维管组织中积累，并在维管束内放大防御信号，同时还能激活JA信号途径(Yube Yamaguchi等，2013)。黄萎病菌是一种典型的维管束病害，进入植物体内后都在维管组织内继续侵染和扩展，JA信号途径在黄萎病的防御反应中具有重要作用(Wei Gao等，2013)。结合防御信号肽的累积与黄萎病菌的侵染在空间上的重叠，防御信号肽激活的信号途径与黄萎病菌的防御在信号途径上的重叠这两个特点，获得能够抗黄萎病菌的防御信号肽对提高植物黄萎病抗性具有重要意义。发明内容 [0008] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在提高植物对黄萎病抗性中的应用，利用SlHypSys的累积与黄萎病菌的侵染在空间上的重叠，SlHypSys激活的信号途径与黄萎病菌的防御在信号途径上的重叠这两个特点，提出本发明的策略，利用SlHypSys基因提高植物对黄萎病的抗性。 [0009] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案： [0010] 番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在提高植物对黄萎病抗性中的应用，所述番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示核苷酸经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸序列。 [0011] 本发明中，所述植物可以为其他可以感染黄萎病的植物，优选的，所述植物为拟南芥、烟草或棉花。 [0012] 本发明的目的之二在于提供利用番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys提高植物对黄萎病抗性的方法。 [0013] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案： [0014] 利用番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys提高植物对黄萎病抗性的方法，将番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在植物中组成型表达，获得对黄萎病抗性的植物； [0015] 所述番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示核苷酸经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸序列。 [0016] 优选的，所述番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys在植物中组成型表达的方法是构建含有番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys的组成型植物表达载体，然后通过农杆菌介导获得转基因植物。 [0017] 本发明中，所述组成型植物表达载体为由组成型启动子调控番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys表达。 [0018] 本发明中，所述组成型启动子可以为任何在植物中能表达的组成型启动子，优选的，所述组成型启动子CaMV35S启动子。 [0019] 本发明中，所述组成型植物表达载体为将SEQ ID NO.1所示序列通过BamHI和KpnI植物表达载体pLGN中(CN105671076A)，获得植物表达载体pLGN‑35S‑SlHypSys。 [0020] 本发明中，所述植物可以为其他可以感染黄萎病的植物，如茄子、番茄、辣椒、生菜等蔬菜类，油菜、油橄榄等油料植物，红叶等观赏植物；优选的，所述植物为拟南芥、烟草或棉花。 [0021] 具体操作如下：通过从番茄中获得SlHypSys基因(SEQ ID NO.1),将其与启动子可操作地连接，构建组成型表达番茄富含羟脯氨酸的系统素前体蛋白基因SlHypSys的植物表达载体，将该载体转化宿主获得转化体，再将转化体转入植株(如拟南芥、烟草和棉花等)，经过抗性筛选和一系列分子鉴定后，获得转基因植株。 [0022] 本发明中，所述的SlHypSys基因的获得，以及启动子与SlHypSys基因融合构建组成型表达SlHypSys基因的表达载体方法为本领域的常规方法，使用的载体是植物基因工程领域所用的常规载体。 [0023] 将转化体转入植株所使用的方法为根癌农杆菌介导法，为常用的植物转基因方法。 [0024] 本发明的目的之三在于提供具有提高植物对黄萎病抗性的植物表达载体。 [0025] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案： [0026] 一种具有提高植物对黄萎病抗性的植物表达载体，所述植物表达载体含有组成型启动子调控番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys表达的表达框，所述番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，或SEQ ID NO.1所示核苷酸经过一个或几个碱基的取代和/或缺失和/或添加且具有相同功能的核苷酸序列。 [0027] 本发明优选的，应用基因工程技术将SlHypSys基因序列(SEQ ID NO.1)与组成型启动子CaMV35S可操作地连接，构建植物表达载体，转化植株后，在组成型启动子的作用下表达番茄富含羟脯氨酸前体蛋白基因SlHypSys。优选的植物表达载体具有如图1所示的载体结构。其中，番茄富含羟脯氨酸前体蛋白基因SlHypSys正向连接在CaMV35S启动子后，形成组成型表达该基因的植物表达载体pLGN‑35S‑SlHypSys。 [0028] 本发明的目的之四在于提供植物表达载体的应用。 [0029] 为实现上述发明目的，本发明提供如下技术方案： [0030] 所述植物表达载体在制备具有黄萎病抗性的转基因植物中的应用。 [0031] 本发明的有益效果在于：本发明首先从番茄中克隆富含羟脯氨酸的系统素前体蛋白基因SlHypSys，采用分子生物学的方法，构建SlHypSys组成性表达的植物表达载体，然后再利用基因工程方法，将SlHypSys基因导入拟南芥、烟草和棉花中，获得了正常转录表达的转基因拟南芥、烟草和棉花株系。野生型拟南芥的病情指数为50.69时，转基因拟南芥的病情指数只有13.52。野生型烟草的病情指数为50.85时，转基因烟草的病情指数只有9.11；野生型棉花的病情指数为53.43时，转基因棉花的病情指数只有17.22。转基因植物的病情指数都显著低于野生型对照，对黄萎病的抗性显著提高。该发明对于促进SlHypSys基因在植物抗病基因工程中的应用具有重要意义。附图说明 [0032] 为了使本发明的目的、技术方案和有益效果更加清楚，本发明提供如下附图进行说明： [0033] 图1为植物表达载体pLGN‑35S‑SlHypSys图谱。 [0034] 图2为转基因拟南芥中SlHypSys基因转录表达水平(SlHypSys‑2、SlHypSys‑3、SlHypSys‑6、SlHypSys‑12和SlHypSys‑15：转基因拟南芥独立转化子；WT：哥伦比亚生态型野生型拟南芥；数值为三个技术重复的平均值，误差棒为标准误SD)。 [0035] 图3为SlHypSys基因提高拟南芥对黄萎病的抗性(A:种黄萎病菌14天，拟南芥株系的病情指数；B：接种黄萎病菌14天，拟南芥植株的病症。转基因拟南芥的抗病性用病情指数进行评价。数据为三次重复试验的平均值，误差棒为标准误SD。SlHypSys‑3、SlHypSys‑6和SlHypSys‑15：转基因拟南芥独立转化子。WT:哥伦比亚生态型野生型拟南芥。：与野生型拟南芥相比，病情指数差异水平达到极显著性(p<0.01))。 [0036] 图4为转基因烟草中SlHypSys基因转录表达水平(SlHypSys‑1、SlHypSys‑2、SlHypSys‑3、SlHypSys‑4、SlHypSys‑12和SlHypSys‑15：转基因烟草独立转化子；WT:野生型烟草。数值为三个技术重复的平均值，误差棒为三个重复的标准误SD)。 [0037] 图5为SlHypSys基因提高烟草对黄萎病的抗性(A：接种黄萎病菌7天，烟草株系的病情指数；B：接种黄萎病菌7天，烟草叶片的病症；转基因烟草的抗病性用病情指数进行评价，数值为三次重复的平均值，误差棒为标准误SD。SlHypSys‑1和SlHypSys‑4：转基因烟草独立转化子；WT：野生型烟草。：与野生型烟草相比，病情指数差异水平达到极显著性(p<0.01))。 [0038] 图6为转基因棉花中SlHypSys基因的转录表达水平(SlHypSys‑1、SlHypSys‑2和SlHypSys‑5：转基因棉花独立转化子；WT：转基因受体野生型棉花；数值为三个技术重复的平均值，误差棒为三次重复的标准误)。 [0039] 图7SlHypSys转基因棉花提高对黄萎病的抗性(A:转基因棉花叶片接种黄萎病菌5天的病情指数；B：接种黄萎病菌5天，棉花叶片的病症；转基因棉花的抗病性用病情指数进行评价。数据为三次重复试验的平均值，误差棒为标准误SD。SlHypSys‑1、SlHypSys‑2和SlHypSys‑5：转基因棉花独立转化子。WT:基因受体野生型棉花。**：与野生型棉花相比，病情指数差异水平达到极显著性(p<0.01))。具体实施方式 [0040] 下面结合附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。 [0041] 实施例1、番茄SlHypSys基因的克隆 [0042] (1)番茄基因组总RNA的提取及cDNA的合成 [0043] 取4周龄番茄幼苗，用镊子轻轻夹伤叶柄基部，诱导SlHypsys基因的表达。6小时后，剪取受损的叶片立即液氮速冻，并研磨成粉，然后用Promoga的植物快速RNA提取试剂盒提取叶片的总RNA，再利用TaKaRa的一链cDNA合成试剂盒合成cDNA，RNA提取和cDNA的合成均按试剂盒说明书进行。详细操作流程如下： [0044] 将新鲜的番茄叶片用液氮速冻并研磨成粉，取约100mg粉末盛装入无RNA酶和无DNA酶的1.5mL离心管，立即加入RNA裂解液500μL，用移液枪反复吹打直到裂解物中无明显块状组织，然后加入300μL稀释液，颠倒离心管3‑4次混匀，室温放置3‑5min。12000rpm，离心5min后取上清液500μL于一新的1.5mL无核酸酶的离心管中，加入250μL无水乙醇，立即用移液器吹打混匀，然后将混合液转移入RNA吸附柱，10000rpm，离心1min，弃滤液，吸附柱内加入600μL漂洗液，重复漂洗2次后，将吸附柱转移到洗脱管上，在吸附柱内加入100μL无RNA酶和无DNA酶的水，放置约3min后，10000rpm，离心1min，收集洗脱的RNA溶液，RNA保存于‑80℃。 [0045] 取7μL上述提取的RNA溶液中加入1μL无RNA酶的DNA酶，2μL无RNA酶的DNA酶缓冲液，混匀后PCR仪内42℃反应2min，然后加入4μL反转录酶缓冲液，1μL反转录酶，1μL反转录引物混和物，4μL无RNA酶无DNA酶的双蒸水，混匀后37℃反应15min合成cDNA，85℃反应5S，终止反应。合成的cDNA保存于‑20℃。 [0046] (2)番茄SlHypSys基因的克隆 [0047] NCBI网站查找SlHypSys序列(见SEQ ID NO.1)，根据SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，设计并合成完整编码框的上游引物和下游引物，具体如下： [0048] 上游引物F‑SlHypSys：5'‑cgcggatccgcg atgatcagcttcttcagagc‑3'(SEQ ID NO.2)； [0049] 下游引物R‑SlHypSys：5'‑cggggtaccccg ttaataggaagcttgaagaggc‑3'(SEQ ID NO.3)； [0050] 以上述合成的cDNA作为模板，SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3为引物对，利用PrimesSTAR MAX DNA Polymerase进行PCR扩增。扩增程序：98℃预变性3min；98℃变性10s，57℃退火10s，72℃延伸20s，扩增30个循环。 [0051] 扩增获得的SlHypSys片段5μL，加入3μL pTOPO载体质粒，1μL DNA连接酶，1μL缓冲液，混匀后室温放置15min。反应产物与大肠杆菌DH5α感受态细胞混和并混匀，然后42℃热激1min 30s转入大肠杆菌DH5α，转化的工程菌加入500μL LB培养基，37℃200rpm培养1h，然后涂布于含卡那霉素LB平板，37℃培养过夜，挑取单菌落接种入盛装约3mL LB培养基的试管内，37℃、200rpm振荡培养过夜，取适量菌液送测序公司测序，含有目的片段的阳性克隆工程菌保存于‑80℃。 [0052] 实施例2、组成型表达SlHypSys基因的植物表达载体的构建及工程菌的获得[0053] 提取上述经测序验证正确的克隆载体工程菌质粒，用BamHI和KpnI进行双酶切，酶切后的产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的片段SlHypSys。同时用BamHI和KpnI双酶切植物表达载体pLGN，酶切完成后进行琼脂糖凝胶电泳，回收大片段。回收的基因和载体片段利用T4 DNA连接酶连接，连接产物利用热激法转入大肠杆菌DH5α。提取大肠杆菌工程菌的质粒，然后用BamHI和KpnI进行双酶切验证，获得目的基因SlHypSyss酶切片段的转化菌即为植物表达载体pLGN‑35S‑SlHypSys工程菌，保存于‑80℃，载体图谱见图1。 [0054] 提取大肠杆菌工程菌的质粒，再利用电转化法分别转化农杆菌LBA4404和GV3101，转化的菌分别在附加Km和Sm，Km和Rif(利福平)的YEB平板进行筛选培养，抗性单菌落接种入附加Km和Sm，Km和Rif(利福平)的YEB液体培养基内，收集菌体并提取农杆菌质粒，然后再用BamHI和KpnI进行双酶切验证，正确的工程菌保存于‑80℃。 [0055] 实施例3、拟南芥的遗传转化、转基因拟南芥的筛选及转录表达水平分析[0056] (1)拟南芥的遗传转化 [0057] 参照Steven J.Clough and Andrew F.Bent(1998)的浸花转化法，以哥仑比亚野生型拟南芥为材料进行遗传转化，种子成熟后收获农杆菌浸后的种子。 [0058] (2)转基因拟南芥植株的筛选 [0059] 浸花转化法进行遗传转化后收获的种子用75％的酒精灭菌15min，然后均匀接种于附加100mg/L Km(卡那霉素)的筛选平板上萌芽，若长成的幼苗为绿色即为转基因植株，待植物2叶以上时移栽入培养拟南芥的专用土壤(草碳土：蛭石：珍珠岩为3:1:1)，成熟后收获种子。每一株植株即为一个转化子。 [0060] 拟南芥筛选培养基：MS无机+MS有机+Km 100mg/L+2.5g/L Gelrite(因化剂)，pH6.0 [0061] (3)转基因拟南芥植株RNA的提取及cDNA的合成 [0062] 以转基因植株幼嫩叶片为材料，按照实施例1的方法进行转基因拟南芥RNA的提取和cDNA的合成。 [0063] (4)转基因拟南芥中SlHypSys基因转录表达水平分析 [0064] 利用Real‑time PCR方法检测转基因拟南芥中SlHypSys基因的转录表达水平。 [0065] 以cDNA为模板扩增SlHypSys基因的特异片段。SlHypSys基因的上下游引物分别为SlHypSys UP:5’‑ttaccacctccttctccc‑3’(SEQ ID NO.4)和SlHypSys DN:5’‑tacataatcgtgcctccc‑3’(SEQ ID NO.5)。以拟南芥AtACT2基因为内标。AtACT2基因的上下游引物分别AtACT2 UP:5’‑tatcgctgaccgtatgag‑3’(SEQ ID NO.6)和AtACT2 DN:5’‑ctgagggaagcaagaatg‑3’(SEQ ID NO.7)。 [0066] 20μL Real‑time PCR反应体系包括：cDNA模板1μL，目的基因上下游引物各1μL，2×iQ SYBR Green Supermix 10μL，ddH2O 7μL。 [0067] Real‑time PCR扩增条件：95℃预变性3min；94℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析SlHypSys基因相对表达量。 [0068] Real‑time PCR结果表明(图2)，转基因拟南芥植株内SlHypSys基因都能有效进行转录表达，获得的植株为SlHypSys转基因植株。 [0069] 实施例4、转基因拟南芥对黄萎病的抗性 [0070] (1)转基因拟南芥抗病鉴定接种用黄萎病菌的制备 [0071] 挑取少许固体PD培养基(马铃薯培养基)保存的落叶型黄萎病菌V991菌株(大丽轮枝菌)接种入液体PD培养基，180rpm，26℃振荡培养7d，再按10％(菌液/PD培养基)的比例接种入液体PD培养基，180rpm，26℃振荡培养10d，用四层无菌纱布过滤去除菌液中的菌丝及8 杂质，去离子水调整孢子浓度达到10个/ml作为接种菌液。 [0072] (2)转基因拟南芥抗病鉴定接种方法 [0073] 培养一周的拟南芥幼苗连根拔起，然后带土整齐的摆放入150mm培养皿内，倒入混匀的接种菌液，接种剂量为10mL/株，室温浸泡接种24小时后，再移栽入湿润的土壤中，16小时光照，8小时暗培养，20℃(暗培养)‑24℃(光照培养)，湿度70％的光照培养箱内培养。接种2周后，按0‑4级的标准统计植株病级并计算病情指数。以转化受体材料的野生型植株为对照。 [0074] 病级分级标准：0级：植株叶片无病症；1级：0‑25％叶片出现病症；2级：25％‑50％叶片出现病症；3级：50％‑75％叶片出现病症；4级：75％以上的叶片出现病症。病情指数的计算公式： [0075] 病情指数＝(∑〖病级数×植株数〗)/(4×接种植株总数)×100 [0076] (3)SlHypSys基因提高拟南芥对黄萎病的抗性 [0077] 拟南芥植株接种黄萎病菌14天，野生型植株的病情指数达到50.69，转基因株系SlHypSys‑3、SlHypSys‑6和SlHypSys‑15的病情指数分别为13.52、21.48和20.99。T检测结果显示，与野生型对照的病情指数相比，转基因株系的病情指数极显著的下降(图3中A)。植株病症显示，接种黄萎病菌14天，野生型植株叶片基本出现了病症，而转基因植株只是基部个别叶片出现了病症(图3中B)。结果表明，SlHypSys基因可有效提高拟南芥对黄萎病的抗性。 [0078] 实施例5、烟草的遗传转化及转基因烟草的获得 [0079] (1)烟草遗传转化用组织培养培养基： [0080] 种子萌发培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)+1.0％琼脂粉，自来水配制，自然pH。 [0081] 遗传转化共培养培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)+2mg/L NAA+0.5mg/L 6‑BA+200μmol/L AS，pH5.6，固体培养基添加1.0％琼脂粉进行固化。 [0082] 愈伤诱导培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)+2mg/L NAA+0.5mg/L 6‑BA+1.0％琼脂粉，pH5.8。 [0083] 幼芽诱导培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)+2mg/L 6‑BA+1.0％琼脂粉，pH5.8。 [0084] 生根培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)+1.0％琼脂粉，pH6.0。 [0085] (2)烟草的遗传转化 [0086] 将含pLGN‑35S‑SlHypSys植物表达载体的重组农杆菌接种入液体YEB培养基，28℃、200rpm振荡培养过夜至OD600 1.0～1.2。菌液离心后收集菌体，并用等体积MSB液体培养基重悬菌体，重悬液即为转化用浸染液。 [0087] 培养20d的烟草无菌苗叶片，切成3‑5mm介方的叶盘，于浸染液内浸染1hr，去除菌液，然后将叶盘接种于共培养培养基，24℃暗培养2天。共培养完成后，外植体继代入附加100mg/L卡那霉素和200mg/L头孢霉素的愈伤诱导培养基，25℃、16hr光照/8hr暗培养的光周期培养，20天后继代入幼芽诱导培养基，之后20天继代一次，至叶盘边缘产生幼芽，将幼芽切下继代入生根培养基生根成苗，幼苗生长至3‑4叶移栽入花盆做进一步的分析。 [0088] (3)SlHypSys转基因烟草的获得和分子鉴定 [0089] a.转基因植株的GUS组织化学染色 [0090] GUS染色液：500mg/L X‑Gluc，0.1mol/L K3Fe(CN)6，0.1mol/L K4Fe(CN)6，1％Triton X‑100(V/V)，0.01mol/L Na2EDTA，0.1mol/L磷酸缓冲液(pH7.0)。 [0091] pLGN‑35S‑SlHypSys植物表达载体含有CaMV35S启动子控制的GUS基因，因此，转基因植株首先可以利用GUS组织化学染色法进行快速鉴定。参照Jefferson(1987)的方法剪取Km抗性幼苗的叶片组织少许，加入GUS组织化学染色液中，37℃染色5h，然后95％乙醇脱色，至绿色去净。最后出现蓝色的为转基因植株，否则为非转基因植株。 [0092] b.SlHypSys转录表达水平分析 [0093] SlHypSys转基因烟草植株分别以幼嫩叶片为材料，分别提取GUS阳性和野生型植物叶片的RNA，按cDNA一链合成试剂盒说明书合成各样品RNA的一链cDNA(RNA提取和cDNA合成的方法与实施例1相同)。然后以cDNA为模板扩增SlHypSys基因的特异片段。SlHypSys基因的上下游引物分别为SlHypSys UP:5’‑ttaccacctccttctccc‑3’(SEQ ID NO.4)和SlHypSys DN:5’‑tacataatcgtgcctccc‑3’(SEQ ID NO.5)。以烟草18S基因为内标。18S基因的上下游引物分别Nt18S UP:5’‑aggaattgacggaagggca‑3’(SEQ ID NO.8)和Nt18S DN:5’‑gtgcggcccagaacatctaag‑3’(SEQ ID NO.9)。 [0094] 20μL Real‑time PCR反应体系包括：cDNA模板1μL，目的基因上下游引物各1μL，2×iQ SYBR Green Supermix 10μL，ddH2O 7μL。 [0095] Real‑time PCR扩增条件：95℃变性3min；94℃变性10s，57℃退火30s，72℃延伸30s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析SlHypSys基因相对表达量。 [0096] Real‑time PCR结果表明(图4)，转基因烟草植株内SlHypSys基因都能有效进行转录表达，而野生型植株叶片内都没有检测到该基因的表达。 [0097] 实施例6、转基因烟草对黄萎病的抗性 [0098] (1)转基因烟草抗病鉴定接种用黄萎病菌的制备 [0099] 转基因烟草抗病鉴定接种用黄萎病菌的制备方法与实施例4一致，孢子浓度调整10 为10 个孢子/mL。 [0100] (2)转基因烟草抗病鉴定接种方法 [0101] 7‑8片真叶的烟草植株，剪取从顶端至底部的第三至第五叶，用湿润的吸水纸包裹叶柄后均匀整齐摆放在接种盒内，用移液器吸头轻轻挤压叶片主叶脉和次生叶脉交界处，达到人为损伤的目的，损伤后立即在损伤处接种黄萎病菌接种液10μL。然后覆盖薄膜保湿，并置16小时光照/8小时暗培养，20℃(暗培养)/26℃(光照)的培养箱内培养，接种7天，按0‑4级的5级标准统计叶片的病级并计算病情指数。以转化受体材料的野生型植株为对照。 [0102] 病级分级标准：0级:叶片无病症；1级：0‑25％叶片面积出现病症；2级：25％‑50％叶片面积出现病症；3级：50％‑75％叶片面积出现病症；4级：75％以上的叶片面积出现病症。病情指数的计算公式： [0103] 病情指数＝(∑〖病级数×植株数〗)/(4×接种植株总数)×100。 [0104] (3)SlHypSys基因提高烟草对黄萎病的抗性 [0105] 烟草叶片接种黄萎病菌7天，野生型植株的病情指数达到50.74，转基因株系SlHypSys‑1和SlHypSys‑4的病情指数分别为9.11和15.43。T检测结果显示，与野生型对照的病情指数相比，转基因株系的病情指数极显著的下降(图5中A)。接种黄萎病菌7天，野生型叶片病症面积超过了50％，而转基因烟草叶片病症面积不到10％(图5中B)。结果表明，SlHypSys基因可有效提高烟草对黄萎病的抗性。 [0106] 实施例7、棉花的遗传转化 [0107] (1)棉花遗传转化常用培养基 [0108] 基本培养基：MSB(MS无机盐+B5有机)(T.Murashige，1962；O.L.Gamborg，1968)； [0109] 种子萌发培养基：1/2MSB+20g/L蔗糖+6g/L琼脂，自来水配制，自然pH； [0110] 共培养培养基：MSB+0.5mg/L IAA(吲哚乙酸)+0.1mg/L KT(6‑糠氨基嘌呤)+30g/L葡萄糖+100μmol/L乙酰丁香酮+2.0g/L Gelrite(Sigma)，pH5.4； [0111] 筛选脱菌培养基:MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km(卡那霉素)+500mg/L cef(头孢霉素)+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8； [0112] 愈伤诱导培养基:MSB+0.5mg/L IAA+0.1mg/L KT+75mg/L Km+200mg/L cef+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8； [0113] 胚性愈伤诱导培养基:MSB+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖+2.0g/L Gelrite，pH5.8； [0114] 液体悬浮培养基：MSB+0.1mg/L KT+30g/L葡萄糖,pH5.8； [0115] 体胚成熟培养基：MSB+15g/L蔗糖+15g/L葡萄糖+0.1mg/L KT+2.5g/L Gelrite，pH6.0； [0116] 成苗培养基:SH+0.4g/L活性碳+20g/L蔗糖，pH6.0(Schenk&Hildebrandt，1972)。 [0117] (2)棉花遗传转化的方法 [0118] 转化外植体的获得：陆地棉栽培种冀棉14号种子去壳，籽仁3％双氧水灭菌60min，无菌自来水漂洗5‑6次后，接种于种子萌发培养基，28℃暗培养5d。无菌下胚轴切成3‑5mm长的切段，作为转化外植体。 [0119] 转化用农杆菌浸染液的制备：利用划线法获得整合植物表达载体pLGN‑35S‑SlHypSys的农杆菌单菌落，然后挑取单菌落接种入附加50mg/L Km和125mg/L Sm(链霉素)10mL液体YEB(5g/L蔗糖，1g/L细菌用酵母抽提物，10g/L细菌用胰化蛋白胨，0.5g/L MgSO4·7H2O，pH7.0)，28℃、200rpm培养过夜，然后按5％的比例将菌液接种入20mL不含抗生素的液体YEB，28℃、200rpm培养至OD600约为0.5。取5mL菌液6000rpm离心5min收集菌体，再用5mL不添加Gelrite共培养液体培养基重悬菌体，重悬菌液即为浸染外植体的农杆菌浸染液。 [0120] (3)下胚轴的遗传转化和胚性愈伤的诱导 [0121] 外植体用农杆菌浸染液浸染20min，倾去菌液，再用无菌滤纸吸去外植体表面多余的菌液，浸染后的下胚轴切段接种于共培养培养基，26℃暗培养2d，将下胚轴接种至筛选脱菌培养基，20d后继代入附加卡那霉素(Km)头孢霉素(cef)的愈伤诱导培养基进行愈伤的诱导，间隔20d继代一次，60d后继代入胚性愈伤诱导培养基，获得胚性愈伤后进行液体悬浮培养，以获得大量生长一致的胚性愈伤。 [0122] (4)体胚的诱导和成苗培养 [0123] 液体悬浮培养的胚性愈伤，30目不锈钢筛网过滤，筛下的胚性愈伤均匀分散地接种入体胚成熟培养基，约15d产生大量的体胚，将其继代入SH培养基，促进体胚进一步成苗。3‑4叶的再生苗移栽入温室进行繁殖。 [0124] 实施例8、SlHypSys转基因棉花的获得和分子验证 [0125] 按照实施例7的棉花遗传转化和再生方法，将SlHypSys基因转入棉花基因组。历经Km抗性愈伤、胚性愈伤和体胚的诱导，体胚成苗，然后获得SlHypSys转基因棉花植株。 [0126] (1)转基因植株的GUS组织化学染色 [0127] GUS染色液的配方同实施例5。 [0128] 剪取Km抗性幼苗的叶柄和叶片组织少许，分别加入GUS组织化学染色液中，37℃染色2h，然后95％乙醇脱色，至绿色去净。最后出现蓝色的为转基因植株，否则为非转基因植株。 [0129] (2)SlHypSys基因的转录表达水平分析 [0130] SlHypSys转基因棉花植株分别以幼嫩叶片为材料，分别提取GUS阳性和野生型植物叶片的RNA，按cDNA一链合成试剂盒说明书合成各样品RNA的一链cDNA(RNA提取和cDNA合成方法同实施例1)，然后以cDNA为模板扩增SlHypSys基因的特异片段。SlHypSys基因的上下游引物分别为SlHypSys UP：5’‑TTACCACCTCCTTCTCCC‑3’(SEQ ID NO.4)和SlHypSys DN：5’‑TACATAATCGTGCCTCCC‑3’(SEQ ID NO.5)。以棉花组蛋白GhHIS3基因为内标。GhHIS3基因的上下游引物分别GhHIS3 UP：5’‑GAAGCCTCATCGATACCGTC‑3’(SEQ ID NO.10)和GhHIS3 DN：5’‑CTACCACTACCATCATGGC‑3’(SEQ ID NO.11)(Zhu YQ等，2003)。 [0131] 20μL Real‑time PCR反应体系包括：cDNA模板1μL，目的基因上下游引物各1μL，2×iQ SYBR Green Supermix 10μL，ddH2O 7μL。 [0132] Real‑time PCR扩增条件：95℃3min；94℃10s，57℃30s，72℃30s，共扩增40个循环。扩增完成后利用Gene Study软件分析SlHypSys基因相对表达量。 [0133] Real‑time PCR结果表明(图6)，转基因棉花植株内SlHypSys基因都能有效进行转录表达，而野生型植株内没有检测到该基因的表达。 [0134] 实施例9、SlHypSys转基因棉花对黄萎病的抗性 [0135] (1)抗病鉴定接种用病原菌的制备 [0136] 转基因棉花抗病鉴定病原菌的制备方法同实施例4。 [0137] (2)离体叶片接种方法 [0138] 剪取转基因棉花植株幼嫩叶片，将叶柄整理对齐后插入盛装接种菌液的培养瓶内，菌液内培养24h(即接种24h)，倾弃菌液，培养瓶内注入适量无菌水，将盛装叶片的培养瓶放入16h光照，8小时暗培养的光周期，20℃(暗培养)和26℃(光照)的温度变化周期，70％湿度条件下继续保湿培养，间隔两天统计一次叶片的病级，并计算病情指数。以转化受体材料的野生型植株为对照。病级分级标准：0级：棉花叶片无病症；1级：25％以下叶面积出现病症；2级：25％‑50％叶面积出现病症；3级：50％‑75％叶面积出现病症；4级：75％以上的叶面积出现病症。病情指数的计算公式： [0139] 病情指数＝(∑〖病级数×植株数〗)/(4×接种植株总数)×100。 [0140] (3)SlHypSys基因提高棉花对黄萎病的抗性 [0141] 按照上述方法对所有转基因植株进行黄萎病抗性鉴定，结果显示：接种5d，野生型棉花的病情指数为65.83，转基因株系SlHypSys‑1、SlHypSys‑2和SlHypSys‑5的病情指数分别为23.61、18.65和16.56。T检验结果显示，转基因棉花株系的病情指数极显著低于野生型棉花(图7中A)。接种5天，野生型棉花叶片出现严重的病症，而转基因棉花株系叶片只出现子少许病斑(图7中B)。结果表明，SlHypSys能显著提高棉花对黄萎病的抗性。 [0142] 通过以上的实验证明，本发明将番茄富含羟脯氨酸系统素前体蛋白基因SlHypSys通过转基因手段导入野生型拟南芥、烟草和棉花中得到转基因拟南芥、烟草和棉花，其转基因植株接种黄萎菌后的病情指数都显著低于野生型对照，从而证明该基因可以提高拟南芥、烟草和棉花对黄萎病的抗病性。 [0143] 以上所述实施例仅是为充分说明本发明而所举的较佳的实施例，本发明的保护范围不限于此。本技术领域的技术人员在本发明基础上所作的等同替代或变换，均在本发明的保护范围之内。本发明的保护范围以权利要求书为准。