一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统

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一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统
申请号	CN202011528723.0	申请日	2020-12-22	公开(公告)号	CN112626114A	公开(公告)日	2021-04-09
申请人	南京农业大学;			发明人	盖钧镒; 姜华; 李凯;
摘要	本发明公开了一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，包括如下步骤：(1)筛选SMV基因组中的保守靶标序列并构建其相应的反向重复载体；(2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证各反向重复载体对SMV的功效；(3)将步骤(2)SMV抗性筛选得到的最佳反向重复载体遗传转化进SMV易感大豆，用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆，选出SMV抗性的阳性单株并保留其继续繁种(T1单株“一株两用”)，对所获后代植株SMV的广谱抗性进行评估，以获得广谱抗性的转基因大豆材料。通过本发明的方法，可快速有效、指向性明确的获得对SMV具有广谱抗性的转基因大豆材料。
权利要求	1.一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，包括如下步骤： (1)筛选SMV基因组中的保守靶标序列并构建保守靶标序列的反向重复载体； (2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证反向重复载体对SMV的功效； (3)将步骤(2)SMV抗性筛选得到的反向重复载体通过根癌农杆菌转入SMV易感大豆，用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆，选出SMV抗性的阳性单株并保留其继续繁种，对所获后代植株SMV的广谱抗性进行评估，以获得广谱抗性的转基因大豆材料。 2.根据权利要求1所述的一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，步骤(1)构建保守靶标序列的反向重复载体的具体方法为：对SMV侵染的大豆发病的叶片进行总RNA提取，反转录成cDNA，根据保守靶标序列设计引物对并以cDNA为模板进行PCR扩增并纯化回收PCR产物，与载体pDONR221进行BP反应，转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序；将序列正确的质粒分别与质粒pHellsgate12进行LR反应，反应产物再次转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序正确的质粒即为构建的反向重复载体。 3.根据权利要求2所述的一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，所述大豆品种为NN1138‑2。 4.根据权利要求1所述的一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，步骤(2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证反向重复载体对SMV的功效的具体方法为：a、将反向重复载体转入根癌农杆菌，然后将根癌农杆菌接种到LB固体培养基，挑选单克隆接种至LB液体培养基中培养，收集菌体，然后将菌体注入到本氏烟叶片中； b、同时，SMV分离物侵染的大豆叶片用磷酸缓冲液借助研钵进行研磨，将汁液过滤，即完成病毒病液的准备； c、将b得到的病毒病液通过机械摩擦接种至a处理后的本氏烟叶片中，接种后用qRT‑PCR技术对接种叶中的病毒含量进行检测，筛选出在叶片中病毒的累积量相对值更低的反向重复载体。 5.根据权利要求1所述的一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，其特征在于，步骤(3)中用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆的具体方法为：种植T1代转基因大豆，当一对真叶完全展开后，剪取一片真叶一分为二，其中半片用于SMV接种，半片用于基因组PCR，将接种SMV后的半片叶至于湿润的培养皿中，待接种后，对其中的病毒含量进行ELISA检测，叶片SMV接种试验结合基因组PCR技术对T1代转基因大豆进行初步筛选。
说明书全文	一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统技术领域 [0001] 本发明属于转基因技术领域，具体涉及一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统。背景技术 [0002] 大豆是世界上重要的油料和蛋白作物，在其生长周期中，常常遭受多种病虫害的侵害。大豆花叶病毒(SMV)是一种危害较大的病毒性病害，严重影响大豆产量和品质。为便于研究，基于在不同鉴别寄主上的反应，SMV被人为划分成多种株系，随后SMV株系抗性位点被相应鉴定。然而，聚合多个抗性位点到一个大豆品种中是困难的，常常会导入除抗性位点以外的其它非期望的性状。另外，SMV基因组的突变导致突破宿主抗性的情况时有发生。为了改善SMV抗性育种的困境，获得广谱抗性的大豆品种，基于宿主诱导基因沉默(host‑ induced gene silencing,HIGS)策略的转基因育种被考虑。 [0003] 利用HIGS策略结合大豆遗传转化技术成功获得对SMV的广谱抗性关键的第一步是鉴定SMV基因组中的保守片段，然而到目前为止，尚没有研究报道对SMV基因组的保守区域进行系统鉴定。另外，大豆遗传转化技术存在诸多问题，如低效率、耗时、工作量大等问题，这些都阻碍了由SMV保守片段构建的靶标反向重复(target‑inverted‑repeat,TIR)载体对 SMV抗性效果的批量验证。因此需要找到一种快速、有效的对TIR载体功效进行验证的体系，优选对SMV效果最佳的TIR载体。 [0004] 转基因大豆后代的抗性评估，常常使用转基因材料的T2或T3代对SMV抗性进行评估。然而，由于繁殖转基因种子的过程中，对SMV病毒具有抗性的转基因阳性后代和对SMV不具有抗性的转基因阳性后代都进行了繁殖，这无形增加了大量的工作量。另外，如果对转基因T1代材料直接进行SMV接种来评估其抗性，可能会导致转基因材料的生长受到影响、甚至引起一系列级联反应，进而影响其后代。因此，为了避免上述情况的发生，需要找到一种简单有效的方法对早代转基因大豆材料进行初筛，指向明确的找到潜在的抗SMV的转基因材料。发明内容 [0005] 本发明所要解决的技术问题为：如何提供一种快速获得具有SMV广谱抗性的转基因大豆材料的方法。 [0006] 本发明的技术方案为：一种寄主传递小RNA诱发大豆对SMV广谱抗性的速成系统，包括如下步骤： [0007] (1)筛选SMV基因组中的保守靶标序列并构建保守靶标序列的反向重复载体； [0008] (2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证反向重复载体对SMV的功效； [0009] (3)将步骤(2)SMV抗性筛选得到的反向重复载体通过根癌农杆菌转入SMV易感大豆，用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆，选出SMV抗性的阳性单株并保留其继续繁种，对所获后代植株SMV的广谱抗性进行评估，以获得广谱抗性的转基因大豆材料。 [0010] 进一步地，步骤(1)构建保守靶标序列的反向重复载体的具体方法为： [0011] 对SMV侵染的大豆发病的叶片进行总RNA提取，反转录成cDNA，根据保守靶标序列设计引物对并以cDNA为模板进行PCR扩增并纯化回收PCR产物，与载体pDONR221进行BP反应，转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序；将序列正确的质粒分别与质粒pHellsgate12 进行LR反应，反应产物再次转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序正确的质粒即为构建的反向重复载体。 [0012] 进一步地，所述大豆品种为NN1138‑2。 [0013] 进一步地，步骤(2)利用本氏烟与SMV病害系统结合根癌农杆菌介导的瞬时表达系统快速验证反向重复载体对SMV的功效的具体方法为： [0014] a、将反向重复载体转入根癌农杆菌，然后将根癌农杆菌接种到LB固体培养基，挑选单克隆接种至LB液体培养基中培养，收集菌体，然后将菌体注入到本氏烟叶片中； [0015] b、同时，SMV分离物侵染的大豆叶片用磷酸缓冲液借助研钵进行研磨，将汁液过滤，即完成病毒病液的准备； [0016] c、将b得到的病毒病液通过机械摩擦接种至a处理后的本氏烟叶片中，接种后用qRT‑PCR技术对接种叶中的病毒含量进行检测，筛选出在叶片中病毒的累积量相对值更低的反向重复载体。 [0017] 进一步地，步骤(3)中用离体叶片试验初筛T1代转基因大豆的具体方法为： [0018] 种植T1代转基因大豆，当一对真叶完全展开后，剪取一片真叶一分为二，其中半片用于SMV接种，半片用于基因组PCR，将接种SMV后的半片叶至于湿润的培养皿中，待接种后，对其中的病毒含量进行ELISA检测，叶片SMV接种试验结合基因组PCR技术对T1代转基因大豆进行初步筛选。 [0019] 与现有技术相比，本发明具有以下有益效果： [0020] 本发明提供了一个综合的宿主诱导的基因沉默系统，包含三个环节：(1)鉴定SMV基因组中序列的保守靶标，(2)本氏烟‑SMV分离物病害系统结合本氏烟瞬时表达系统对TIR 载体抗SMV功效进行快速验证(3)T1单株“一株两用”：一片真叶用于鉴定抗SMV的阳性植株，原抗性单株继续用于繁种。结合上述3个环节，建立了一个综合的宿主诱导的基因沉默系统，可快速有效、指向性明确的获得潜在的对SMV具有广谱抗性的转基因大豆材料。附图说明 [0021] 图1T1代转化大豆离体叶片中SMV累积的评估，图中(a)为离体叶片SMV接种方法，(b)为基因组PCR鉴定阳性的转基因单株，F1鉴定保守片段，Tubulin鉴定DNA样本的质量。具体实施方式 [0022] 下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为从商业渠道购买得到的。 [0023] 实施例 [0024] (1)通过对SMV基因组进行多序列比对鉴定到5保守片段： [0025] 在NCBI数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)通过对30条SMV全基因组序列进行比对分析(GenBank ID见表1)。 [0026] 表1 30个SMV全基因组序列GenBank ID [0027]NC_002634.1 FJ640959.1 EU871724.1 FJ640967.1 FJ640981.1 AB100443.1 D00507.2 FJ640976.1 FJ640979.1 AJ312439.1 FJ640980.1 AY294045.1 FJ640975.1 FJ640974.1 S42280.1 FJ376388.1 FJ640957.1 FJ640971.1 FJ640972.1 FJ640966.1 FJ640955.1 FJ807701.1 FJ548849.1 FJ640954.1 FJ640968.1 EU871725.1 FJ640963.1 FJ807700.1 AY294044.1 AB100442.1 [0028] 通过Muscle算法对这些SMV基因组序列进行多序列比对，选择长度约300bp到500bp保守性片段，结果鉴定到5个保守片段，分别命名为F1、F2、F3、F4和F5。对SMV株系SC15 侵染的大豆NN1138‑2发病的叶片进行总RNA提取，反转录成cDNA，使用5对引物分别扩增SMV 保守片段，引物序列见表2。各PCR产物送测序，各保守片段序列(源于SMV株系SC15的基因组)，如F1‑SEQ，F2‑SEQ，F3‑SEQ，F4‑SEQ和F5‑SEQ所示。 [0029] 表2扩增SMV保守片段的引物序列 [0030] [0031] [0032] 保守性片段F1其序列如下所示： [0033] GTGGAGTTGTGGATAAGTAAAGAACATAGTGTGGCAAAGATTTTCATCATATTGGAGCAACTCACTAAGAGGGTCGCTGCAAATGACGTGTTACTTGAGCAACTTGAAATGATTTCAGAAACTTCTGAGAGATTCATGAGCATT CTAGAGGACTGTCCTCAAGCTCCACAGTCATACAAGACGGCAAAAGATTTGCTGACAATGTACATAGAAAGAAAAG CATCTAATAGCCAATTAGTGGGGAATGGTTTTGTAGATATGAATGATAAACTGTATATGGCATATGAAAAAATCTA TTCAGATCGCTTGAAGCAGGAATGGCGCGCATTAAGCTGGTTGGAAAAATTTTCTACAACATGGCAATTGAAAAGA TTTGCTCCACATACGGAGAAATGTTTGACAAAGAAAGTTGTAGAAGAAAGCAGCGCATCTTCAGGAAACTTTGCGA GTGTGTGCTTCATG(SEQ ID No.11) [0034] 保守性片段F2其序列如下所示： [0035] GTGGCTATCTTCACTTTAGTGGGTGGCGGTTGGATGTTATGGGATTACTTCACAAGAGTTATACGTGAGCCAGTATCAACTCAAGGAAAGAAGAGGCAGATACAAAAACTCAAATTTAGGGATGCCTTTGATAGAAAAGTAGGC CGTGAGGTGTATGCAGATGACTACACCATGGAGCACACCTTTGGGGAGGCCTACACCAAGAAAGGAAAGCAGAAAG GTAGCACTCGCACAAAAGGGATGGGTCGCAAGTCCAGAAATTTCATACACTTGTATGGAGTTGAGCCAGAGAATTA CAGCATGATCAGATTTGTTGACCCGCTAACTGGACACACGATGGATGAACACCCCAGAGTTGATATCAGAATGGTG CAACAAGAGTTTGAGGAGATAAGGAAAGACATGATTGGGGA(SEQ ID No.12) [0036] 保守性片段F3其序列如下所示： [0037] GAGTTCAAAATATCAAAGCTTGTGTCAGATATTTTTGGAAGTACAGTGACAGTACAAGGGAAGAAGGAAAGATGGGTTTTGGATGCAATGGAAGGCAACCTAGTGGCTTGTGGGCAGGCAGACAGTGCATTGGTGACAAAGCAC GTTGTTAAAGGAAAGTGCCCTTATTTTGCACAATATCTTTCAGTGAATCAAGAGGCAAAGTCCTTCTTTGAACCAC TTATGGGTGCGTATCAACCAAGTCGGTTAAACAAAGATGCATTCAAACGAGACTTCTTCAAATACAACAAACCAGT TGTTTTAAATGAAGTTGATTTTCAATCTTTTGAGAAGGCAGTGGCTGGAGTGAAACTTATGATGATGGAATTTGAT TTCAAGGAGTGTGTGTATGTGACTGATCCTGATGAAATATACGACTCCTTGAATATGAAAGCTGCAGTTGGTGCAC AATACAAAGGGAAGAAGCAAGATTATTTCTCTGGAATGGACAGTTTTGA(SEQ ID No.13) [0038] 保守性片段F4其序列如下所示： [0039] AGAGCTTATGCATCGCACTGAGGCGATATGTGCAGCAATGATTGAGGCATGGGGATACACTGAATTGCTGCAAGAGATCCGCAAATTTTATTTATGGCTCCTAAACAAGGATGAATTTAAGGAGCTCGCTTCGTCTGGAAAAGC ACCATATATTGCAGAGACAGCTTTGAGAAAGCTGTACACAGATATCAATGCTCAAACAAGTGAGCTACAAAGATAT CTTGAAGTGCTGGATTTCAATCATGCTGATGACTGTTGTGAATCAGTTTCCTTACAATCAGGCAAGGAGAAAGAAG GAGACATGGATGCAGGTAAGGATCCA(SEQ ID No.14) [0040] 保守性片段F5其序列如下所示： [0041] GTGTGGGTGATGATGGATGGAGAGGAACAAATTGAATATCCGTTGAAGCCCATTGTCGAAAATGCAAAACCAACTTTGAGGCAAATCATGCATCATTTTTCAGATGCAGCAGAAGCTTACATTGAGATGAGGAATTCTGAAAGT CCGTATATGCCTAGATATGGACTACTGAGGAATTTGAGAGATAGAGAGCTAGCCCGCTATGCTTTTGACTTCTATG AGGTCACTTCTAAAACACCAAACAGGGCAAGGGAAGCAATAGCGCAAATGAAGGCTGCAGCTCTCTCGGGAGTTAA CAACAAGTTGTTTGGACTTGATGGAAATATCTCAACCAACTCCGAAAATACTGAAAGGCA(SEQ ID No.15) [0042] (2)构建F1‑TIR、F2‑TIR、F3‑TIR、F4‑TIR、F5‑TIR载体： [0043] 对SMV株系SC15侵染的大豆NN1138‑2发病的叶片进行总RNA提取，反转录成cDNA，使用表3中引物对该cDNA进行PCR扩增并纯化回收PCR产物，与载体pDONR221(购自Thermo Fisher Scientific公司)进行BP反应，转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序；将序列正确的质粒分别与质粒pHellsgate12(Karimi M,InzéD,Depicker A.Trends in plant TM science,2002,7(5):193‑195.GATEWAY vectors for Agrobacterium‑mediated plant transformation)进行LR反应，反应产物再次转化大肠杆菌DH5a并提取阳性质粒，测序正确的质粒即为载体F1‑TIR、F2‑TIR、F3‑TIR、F4‑TIR、F5‑TIR；将这些载体分别转化根癌农杆菌 GV3101和EHA105(购自Life Science Market)，进一步用于本氏烟瞬时表达和大豆稳定遗传转化。 [0044] 表3构建RNAi的载体 [0045] [0046] [0047] (3)本氏烟‑SMV分离物病害系统结合本氏烟瞬时表达系统对TIR载体抗SMV功效进行快速验证 [0048] ‑80℃冰箱中冻存的包含各TIR载体(F1‑TIR、F2‑TIR、F3‑TIR、F4‑TIR、F5‑TIR)的根癌农杆菌GV3101甘油菌，置于冰上解冻，超净台内用无菌接种环蘸取少量菌液，在壮观霉素抗性(50μg/ml)的LB固体培养基平板上划线，然后倒置于28℃培养箱中孵育48h；挑取单克隆于含有4ml壮观霉素抗性的LB液体培养基中，在28℃，200rpm摇床上振荡培养34h， 4000rpm离心5min收集菌体，弃上清；移液器吸取1ml 10mM MgCl2对菌体沉淀轻柔悬浮，重悬液用混合液(含终浓度10mM MgCl2，10mM MES pH＝5.7和150μM乙酰丁香酮)稀释至OD600 ＝0.5。 [0049] 将这些TIR载体的GV3101菌液分别用1ml注射器注入到苗龄4周大的本氏烟叶片中。同时，SMV分离物侵染的大豆叶片用0.01M磷酸缓冲液借助研钵进行研磨，将汁液用两层纱布过滤，即完成病毒病液的准备。然后农杆菌注射的本氏烟叶片被机械摩擦接种病毒病液，0.01M磷酸盐缓冲液(pH＝7.4)作为接种对照(即Mock)，于接种后3天、5天，用qRT‑PCR技术对接种叶中的病毒含量进行检测。qRT‑PCR试剂购自TAKARA，具体操作参照该试剂说明书。结果如表4所示，F1‑TIR和F5‑TIR对SMV的抗性效果表现优于F2‑TIR、F3‑TIR、F4‑TIR，尽管F1‑TIR和F5‑TIR对SMV的抗性效果之间无显著差异，但是F1‑TIR相对于F5‑TIR，在叶片中病毒的累积量相对值更低。因此，本氏烟‑SMV分离物病害系统结合本氏烟瞬时表达系统成功用于了TIR载体对SMV功效的验证，且F1‑TIR表现效果较好。 [0050] 表4表达不同TIR载体的本氏烟叶片中SMV含量的实时荧光定量检测 [0051] [0052] 空载体的相对值与各TIR载体的相对值之比。 [0053] (4)利用离体叶片试验鉴定SMV抗性的阳性转F1‑TIR大豆植株 [0054] 根癌农杆菌EHA105介导了F1‑TIR载体转入SMV易感的大豆品种NN1138‑2，大豆遗传转化方法参照文献(Shuxuan L,Yahui C,Yaping L,et al.Optimization of Agrobacterium‑Mediated Transformation in Soybean[J].Frontiers in Plant Science,2017,8.)。T1代转基因大豆被种植与花盆中，当一对真叶完全展开后，剪取一片真叶一分为二，其中半片用于SMV接种，半片用于基因组PCR。将接种SMV后的半片叶至于湿润的培养皿中，待接种后7天，对其中的病毒含量进行ELISA检测。ELISA所用的SMV抗体购自 ACD Inc.(cat#V094‑R1)，具体操作参照该试剂说明书。如图1所示，结果表明离体叶片试验结合基因组PCR技术可以对T1代转基因大豆进行初步筛选，挑选出潜在的抗SMV的大豆单株继续繁种，用其后代对SMV的广谱抗性进行验证。在后续繁种中，将非抗性的转基因大豆和假阳性的转基因大豆进行了有效过滤。