[0001] 序列表

[0002] 本申请包含序列表，该序列表已以ASCII格式电子提交，并通过引用以其全文特此并入。所述ASCII副本创建于2022年6月6日，名为51666‑002WO2_Sequence_Listing_6_6_22_ST25，并且大小为276,968字节。

[0003] 对于存在于健康组织和患病组织中的原本期望的治疗性靶标来说，不期望的脱靶效应是一个问题。发明内容

[0004] 本披露部分描述了大分子组合物和相关方法，其实现治疗剂向所期望的目的细胞、组织和/或器官中的效应物靶标的靶向递送，同时最小化或避免向其他细胞、组织或器TM官的不期望的递送。一般而言，本文所述的组合物包含大分子，例如ANDbody ，其包含对效应物靶标特异性的效应物靶标结合结构域和对地址靶标特异性的地址结合结构域。地址靶标通常在受试者中被充分限制以将大分子靶向所期望的细胞、组织或器官。在一些实施例中，效应物靶标结合结构域在不存在地址靶标结合结构域的情况下不影响效应物靶标。此外，地址靶标结合结构域不影响结合地址靶标后的信号传导。然而，通过地址靶标结合结构域对效应物靶标结合结构域的定位使得效应物靶标结合结构域能够充分结合效应物靶标，以引起对靶细胞或组织中效应物靶标的信号传导的影响。本文描述的组合物可用于例如将治疗剂特异性递送至受试者的所期望位置，例如细胞、组织或器官，同时避免不期望的脱靶效应。

[0005] 在一个方面，本披露提供了将大分子定位在受试者的靶组织或细胞处的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的该靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并允许该大分子定位于该受试者的该靶组织或细胞。

[0006] 在一些实施例中，在向受试者施用大分子后1天和7天之间的时间点，在靶组织或细胞处检测到受试者中可检测的大分子的至少25％。

[0007] 在一些实施例中，相对于缺少第二结合位点的参考大分子，靶组织或细胞处的第一结合位点的效力显著增加。

[0008] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标具有低亲和力。

[0009] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标具有低亲合力。

[0010] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标的亲和力低于第二结合位点对地址靶标的亲和力。

[0011] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标的亲合力低于第二结合位点对地址靶标的亲合力。

[0012] 在一些实施例中，相对于缺乏第二结合位点的参考大分子，在受试者的非靶组织或细胞中通过大分子的效应物靶标信号传导显著减少。

[0013] 在一些实施例中，地址靶标在受试者中区域表达。在一些实施例中，地址靶标在受试者中局部表达。在一些实施例中，地址靶标的表达限于受试者中的细胞类型。

[0014] 在一些实施例中，地址靶标仅由受试者中的处于特定细胞状态的细胞表达。

[0015] 在一些实施例中，地址靶标仅由受试者中的处于疾病状态的细胞表达。

[0016] 在一些实施例中，第一结合位点或第二结合位点包含多肽。

[0017] 在一些实施例中，多肽是抗体或其抗原结合片段。

[0018] 在一些实施例中，大分子是抗体，其包含对受试者中的效应物靶标特异性的第一结合位点和对地址靶标特异性的第二结合位点。

[0019] 在一些实施例中，多肽是效应物靶标的配体或地址靶标的配体。

[0020] 在一些实施例中，(a)第一结合位点包含抗体或其抗原结合片段并且第二结合位点包含地址靶标的配体；或者(b)第一结合位点包含效应物靶标的配体并且第二结合位点包含抗体或其抗原结合片段。

[0021] 在一些实施例中，靶组织是皮肤并且第二结合位点对桥粒黏蛋白‑1(DSG‑1)是特异性的。

[0022] 在一些实施例中，靶组织是肺组织并且第二结合位点对RAGE是特异性的。

[0023] 在一些实施例中，靶组织是肾组织并且第二结合位点对钙粘蛋白16(CDH16)是特异性的。

[0024] 在一些实施例中，靶组织是肠组织并且第二结合位点对钙粘蛋白17(CDH17)是特异性的。

[0025] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：(a)该第一结合位点对于该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导。

[0026] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并且其中相对于缺少第二结合位点的参考大分子的定位，该大分子对非靶组织或细胞的定位显著减少。

[0027] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并且其中相对于缺少第二结合位点的参考大分子的定位，该大分子对靶组织或细胞的定位显著增加。

[0028] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并且其中在施用后1天至7天之间的时间点在该靶组织或细胞处检测到施用给受试者的大分子的至少25％。

[0029] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并且其中该第一结合位点对该效应物靶标的亲和力低于该第二结合位点对该地址靶标的亲和力。

[0030] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并且其中该第一结合位点对该效应物靶标的亲合力低于该第二结合位点对该地址靶标的亲合力。

[0031] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并且其中相对于缺少第二结合位点的参考大分子，该靶组织或细胞处的该第一结合位点的效力显著增加。

[0032] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标具有低亲和力。

[0033] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标具有低亲合力。

[0034] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标的亲和力低于第二结合位点对地址靶标的亲和力。

[0035] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标的亲合力低于第二结合位点对地址靶标的亲合力。

[0036] 在一些实施例中，(a)第一结合位点对于效应物靶标的Kd高于第二结合位点对于地址靶标的Kd；(b)第一结合位点对效应物靶标的EC50高于第二结合位点对地址靶标的EC50；或(c)第一结合位点对效应物靶标的IC50高于第二结合位点对地址靶标的IC50。

[0037] 在一些实施例中，第一结合位点对效应物靶标的亲和力比第二结合位点对地址靶标的亲和力小至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍。

[0038] 在一些实施例中，第二结合位点对地址靶标的亲和力具有大于约1nM、大于约2nM或大于约50nm的Kd。

[0039] 在一些实施例中，效应物靶标是蛋白质、脂质或糖。

[0040] 在一些实施例中，效应物靶标是细胞膜相关联靶标。

[0041] 在一些实施例中，效应物靶标是蛋白质。在一些实施例中，效应物靶标是分泌型蛋白。

[0042] 在一些实施例中，效应物靶标由选自由表1中列举的基因组成的组的基因编码。

[0043] 在一些实施例中，大分子激动效应物靶标。

[0044] 在一些实施例中，大分子拮抗效应物靶标。

[0045] 在一些实施例中，地址靶标是蛋白质、脂质或糖。

[0046] 在一些实施例中，地址靶标是蛋白质。

[0047] 在一些实施例中，效应物靶标或地址靶标的表达是编码效应物靶标或地址靶标的RNA序列的表达。

[0048] 在一些实施例中，通过使用RNA序列数据集来评估效应物靶标或地址靶标的表达水平。

[0049] 在一些实施例中，RNA序列数据集是基因型‑组织表达(GTEx)数据集或人蛋白质图谱(HPA)数据集。

[0050] 在一些实施例中，效应物靶标或地址靶标的表达是蛋白质表达。

[0051] 在一些实施例中，效应物靶标在受试者中全身表达。

[0052] 在一些实施例中，效应物靶标在受试者中区域表达。

[0053] 在一些实施例中，效应物靶标在受试者中局部表达。

[0054] 在一些实施例中，地址靶标在受试者中区域表达。

[0055] 在一些实施例中，地址靶标在受试者中局部表达。

[0056] 在一些实施例中，地址靶标的表达限于受试者中的细胞类型。

[0057] 在一些实施例中，地址靶标是可溶性蛋白或细胞外基质(ECM)相关联蛋白并且不以可检测的量存在于细胞表面上。

[0058] 在一些实施例中，地址靶标在ECM中表达并且在受试者的其他地方不以可检测的量存在。

[0059] 在一些实施例中，地址靶标仅由受试者中的处于特定细胞状态的细胞表达。

[0060] 在一些实施例中，地址靶标仅由受试者中的处于疾病状态的细胞表达。

[0061] 在一些实施例中，地址靶标不在第二结合位点与效应物靶标的结合对受试者有害的组织中表达。

[0062] 在一些实施例中，地址靶标的结合位点不以可检测的量与地址靶标的天然配体的结合位点结合。

[0063] 在一些实施例中，效应物靶标或地址靶标的表达包括在以下的一个或多个中的表达：小唾液腺、甲状腺、肺、乳腺、乳腺组织、胰腺、肾上腺、肝、肾、肾皮质、肾髓质、脂肪内脏组织、网膜、小肠、回肠末端、输卵管、卵巢、子宫、皮肤、不暴露在阳光下的皮肤、耻骨弓上的皮肤、宫颈、子宫颈内膜、外子宫颈、阴道、暴露在阳光下的皮肤、小腿皮肤、前扣带皮层、布罗德曼分区24(BA24)、基底神经节、尾状核、硬膜、伏核、下丘脑、杏仁核、海马体、小脑、小脑半球、黑质、垂体、脊髓、颈脊髓、动脉、主动脉、心脏、心耳、冠状动脉、左心室、食管、食管粘膜、食管肌层、胃食管连接部、脾、胃、结肠、横结肠、乙状结肠、睾丸、全血细胞、EBV转化的淋巴细胞、胫骨动脉、或神经胫骨组织。

[0064] 在一些实施例中，效应物靶标或地址靶标的表达包括在皮肤组织、肺组织、肾组织或肠组织中的表达。在一些实施例中，地址靶标的表达在皮肤组织、肺组织、肾组织或肠组织中显著高于在任何其他组织中。

[0065] 在一些实施例中，效应物靶标和/或地址靶标在受试者的结构组织上表达。

[0066] 在一些实施例中，效应物靶标和地址靶标位于相同细胞上。

[0067] 在一些实施例中，效应物靶标和地址靶标位于不同细胞上。

[0068] 在一些实施例中，效应物靶标和地址靶标位于相同细胞类型的不同细胞上。

[0069] 在一些实施例中，效应物靶标和地址靶标位于不同细胞类型的不同细胞上。

[0070] 在一些实施例中，效应物靶标和地址靶标位于相同组织中的不同细胞上。

[0071] 在一些实施例中，(a)效应物靶标在循环细胞上并且地址靶标在组织限制型细胞上；或(b)效应物靶标位于组织限制型细胞上并且地址靶标位于循环细胞上。

[0072] 在一些实施例中，效应物靶标和地址靶标位于受试者中彼此相距100nm以内的不同细胞上。

[0073] 在一些实施例中，效应物靶标或地址靶标存在于细胞表面上。

[0074] 在一些实施例中，大分子是DNA多核苷酸。

[0075] 在一些实施例中，大分子包含RNA或RNA‑多肽缀合物。

[0076] 在一些实施例中，大分子包含多肽。在一些实施例中，大分子是多肽。

[0077] 在一些实施例中，多肽是抗体或其抗原结合片段。

[0078] 在一些实施例中，第一结合位点和第二结合位点各自包含VH和/或VL。

[0079] 在一些实施例中，大分子是抗体，其包含对受试者中的效应物靶标特异性的第一结合位点和对地址靶标特异性的第二结合位点。

[0080] 在一些实施例中，大分子是不对称抗体或对称抗体。

[0081] 在一些实施例中，该抗体或其抗原结合片段包含scFv、BsIgG、BsAb片段、BiTE、双亲和力重定向蛋白(DART)、串联双抗体(TandAb)、双抗体、Fab2、di‑scFv、化学连接的F(ab’)2、带有2、3或4个不同的抗原结合位点的Ig分子、DVI‑IgG四合一、ImmTac、HSAbody、IgG‑IgG、Cov‑X‑Body、scFv1‑PEG‑scFv2、附加的IgG、DVD‑IgG、亲和体、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)、亲和多聚体(avimer)、DARPin、Fynomer、单体、nanoCLAMP、bis‑Fab、Fv、Fab、Fab'‑SH、线性抗体、scFv、仅具有重链的抗体(Humabody)、ScFab、IgG抗体片段、单链可变区抗体、单结构域重链抗体、双特异性三体、BiKE、CrossMAb、dsDb、scDb、串联dAb/VHH、三重dAb VHH、四价dAb/VHH、Fab‑scFv、Fab‑Fv、或DART‑Fc、纤维连接蛋(adnectin)、库尼茨型抑制剂(Kunitz‑type inhibitor)、或受体诱饵。

[0082] 在一些实施例中，多肽是效应物靶标的配体或地址靶标的配体。

[0083] 在一些实施例中，配体是天然配体、经修饰配体或合成配体。

[0084] 在一些实施例中，效应物靶标或地址靶标是受体并且多肽是其配体。

[0085] 在一些实施例中，第一结合位点包含抗体或其抗原结合片段并且第二结合位点包含地址靶标的配体。

[0086] 在一些实施例中，第一结合位点包含效应物靶标的配体并且第二结合位点包含抗体或其抗原结合片段。

[0087] 在一些实施例中，第一和第二结合位点的氨基酸序列至少约10％相同、至少约20％相同、至少约30％相同、至少约40％相同、至少约50％相同，至少约60％相同或至少约
70％相同。

[0088] 在一些实施例中，地址靶标具有高于约0.4、约0.5、约0.57、约0.65、约0.7、约0.85、约0.90或约0.95的基尼系数。

[0089] 在一些实施例中，地址靶标具有高于约0.67、约0.75、约0.8、约0.85、约0.90或约0.95的Tau系数。

[0090] 在一些实施例中，效应物靶标具有低于约0.25、约0.20或约0.15的基尼系数。

[0091] 在一些实施例中，效应物靶标具有低于约0.25、约0.20或约0.15的Tau系数。

[0092] 在一些实施例中，大分子进一步包含第三结合位点。在一些实施例中，第三结合位点与第一结合位点相同。在一些实施例中，第三结合位点与第二结合位点相同。

[0093] 在一些实施例中，第一结合位点和第二结合位点在大分子中直接彼此连接。

[0094] 在一些实施例中，大分子中的第一结合位点和第二结合位点通过稳定结构域连接。

[0095] 在一些实施例中，效应物靶标是Notch2并且地址靶标是RAGE。

[0096] 在一些实施例中，RAGE信号传导不受第二位点结合RAGE地址靶标的影响。

[0097] 在一些实施例中，效应物靶标是Notch2并且地址靶标是尿调节素(UMOD)。

[0098] 在一些实施例中，UMOD信号传导不受第二位点结合UMOD地址靶标的影响。

[0099] 在一些实施例中，效应物靶标是Notch2并且地址靶标是穿膜肽酶A亚基β(MEP1B)。

[0100] 在一些实施例中，MEP1B信号传导不受第二位点结合MEP1B地址靶标的影响。

[0101] 在一些实施例中，效应物靶标是IL11Ra并且地址靶标是RAGE。在一些实施例中，RAGE信号传导不受第二位点结合RAGE地址靶标的影响。

[0102] 在一些实施例中，效应物靶标是IL 11Ra并且地址靶标是UMOD。在一些实施例中，UMOD信号传导不受第二位点结合UMOD地址靶标的影响。

[0103] 在一些实施例中，该受试者是人。

[0104] 另一方面，本披露提供了将部分递送至受试者中的靶组织或细胞的方法，该方法包括向受试者施用如权利要求1‑86中任一项所述的大分子，其中该靶组织包括地址靶标。

[0105] 在一些实施例中，该部分是分子。

[0106] 在一些实施例中，该部分不是毒素。

[0107] 在一些实施例中，该部分是细胞。

[0108] 在一些实施例中，该部分不是T细胞或NK细胞。

[0109] 在一些实施例中，该靶组织不是肿瘤。

[0110] 另一方面，本披露提供了调节靶组织中的效应物靶标的方法，该方法包括向该组织施用如权利要求1‑86中任一项所述的大分子，其中该靶组织包括地址靶标和效应物靶标。

[0111] 另一方面，本披露提供了一种当在心脏或肺中发现效应物靶标时使结合剂偏向不与效应物靶标结合的方法，该方法包括施用如权利要求1‑86中任一项所述的大分子，其中该地址靶标基本上不在心脏或肺中表达。

[0112] 另一方面，本披露提供了调节受试者中的靶组织的方法，该方法包括向该受试者施用如权利要求1‑86中任一项所述的大分子，其中该靶组织包括地址靶标和效应物靶标。

[0113] 另一方面，本披露提供了治疗患有与效应物靶标相关的疾病或病症的受试者的方法，该分包括向该受试者施用如权利要求1‑86中任一项所述的大分子，其中该大分子的第一结合位点结合该效应物靶标。

[0114] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导，并且其中该第二结合位点不与该地址靶标的天然配体的结合位点结合。

[0115] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导，并且其中该第一结合位点和第二结合位点在大分子中彼此直接连接。

[0116] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导，并且其中该第一结合位点和第二结合位点通过稳定结构域彼此连接。

[0117] 另一方面，本披露提供了包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导，并且其中该效应物靶标和/或该地址靶标在宿主的结构组织上表达。

[0118] 另一方面，本披露提供了一种药物组合物，其包含上述实施例中任一个所述的大分子。

[0119] 另一方面，本披露提供了包含大分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂的药物组合物，其中该大分子包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，并且其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导。

[0120] 在一些实施例中，药物组合物是RNA药物组合物。

[0121] 在一些实施例中，药物组合物进一步包含载剂。

[0122] 在一些实施例中，载剂是脂质纳米颗粒。

[0123] 在一些实施例中，载剂是病毒载体。

[0124] 在一些实施例中，载剂是基于膜的载剂。

[0125] 在一些实施例中，基于膜的载剂是细胞。

[0126] 在一些实施例中，基于膜的载剂是囊泡。

[0127] 另一方面，本披露提供了用于调节受试者皮肤中效应物靶标的活性的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于桥粒黏蛋白‑1(DSG‑1)是特异性的。

[0128] 另一方面，本披露提供了用于调节受试者肺中效应物靶标的活性的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于RAGE是特异性的。

[0129] 另一方面，本披露提供了用于调节受试者肾中效应物靶标的活性的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对钙粘蛋白16(CDH16)是特异性的。

[0130] 另一方面，本披露提供了用于调节受试者肠中效应物靶标的活性的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对钙粘蛋白17(CDH17)是特异性的。

[0131] 另一方面，本披露提供了将大分子定位在受试者的靶组织或细胞处的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于该受试者中的该靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并允许该大分子定位于该受试者的该靶组织或细胞。

[0132] 另一方面，本披露提供了一种在受试者的靶组织或细胞中浓缩大分子的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中(a)该第一结合位点对受试者中的效应物靶标是特异性的，并且(b)该第二结合位点对于受试者中的该靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中(i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；(ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及(iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；并允许该大分子在该受试者的该靶组织或细胞处浓缩，其中在向该受试者施用该大分子后1天和7天之间的时间点，在该靶组织或细胞处检测到该受试者中可检测的该大分子的至少25％。

[0133] 在一些实施例中，相对于缺少第二结合位点的参考大分子，靶组织或细胞处的第一结合位点的效力显著增加。

[0134] 在一些实施例中，相对于缺乏第二结合位点的参考大分子，在受试者的非靶组织或细胞中通过大分子的效应物靶标信号传导显著减少。

[0135] 在一些实施例中，大分子是上述实施例中任一项所述的大分子。

[0136] 在下面的描述中阐述了本发明的一个或多个实施例的细节。从以下附图和几个实施例的详细描述，以及从所附权利要求书，本发明的其他特征或优点将变得显而易见。

[0137] 图1是说明示例性ANDbodyTM分子及其作为逻辑门控药物的用途的示意图。图1显示了没有地址靶向的人受试者中治疗性靶标(右侧)(例如效应物靶标)的广泛分布，以及具有地址靶向(左侧)时的局部和受限分布，这由地址靶标结合结构域提供。图1还提供了具有连接至效应物靶标结合结构域的地址靶标结合结构域的ANDbody的代表性二分结构，其包括功能部分，例如调节(例如激动或拮抗)地址靶向细胞或组织中的靶标效应物的部分。地址靶标结合结构域将ANDbody引导至所期望位置，例如靶细胞或组织，从而允许效应物靶标结合结构域接合局部且受限分布区域中的治疗性效应物靶标。在一些实施例中，可能不需要效应物结构域对靶效应物的高亲和力；通过地址靶标结合结构域对效应物靶标结合结构域的定位使得效应物靶标结合结构域能够充分结合效应物靶标，以引起对靶细胞或组织中效应物靶标的信号传导的影响，尽管效应物结构域对效应物靶标的亲和力低。地址靶标结合结构域可替代地用于将分子或细胞货物运输至所期望地址。

[0138] 图2是显示示例性效应物靶标的活性的示意图，通过开发包含效应物靶向结构域和地址靶向结构域的ANDbody治疗剂，可以将效应物靶标限制于目的组织或细胞。根据现有技术，这些ANDbody生物制剂代表了有效的、地址受限的药物。

[0139] 图3提供了可以根据本技术进行工程改造的ANDbody生物制剂的示例性结构，这些ANDbody生物制剂包括(但不限于)：不对称抗体、双亲和力再靶向蛋白(DART)、串联双抗体(TandAb)、双抗体、Fab2、IgG(L,H)‑Fv或BiTE。

[0140] 图4显示了与具有地址靶标结合结构域和效应物靶结合结构域的示例性双特异性ANDbody生物制剂(例如di‑scFc)的EC50(实线)相比，示例性单效应物靶向结构域(例如对具有针对效应物靶标的单结合结构域的单特异性生物制剂(例如scFv))的EC50曲线(虚线)，使得单效应物靶向结构域(通常广泛表达)靶向/限制于局部的、地址靶标特异性组织和/或细胞，从而有效增加效应物靶标结合结构域对效应物靶标结合位点的亲和力，如曲线左移所示(较低的EC50，较高的亲和力)。

[0141] 图5A是显示用缀合至 800CW的抗DSG1抗体PRO003处理的小鼠中指定组织中检测到的荧光强度水平的柱形图。数据显示为三只小鼠的平均值。为了控制标记效率的差异，显示的值中最强信号设置为1。

[0142] 图5B是显示用缀合至 800CW的抗DSG1抗体PRO004或用媒介物对照(未处理)处理的小鼠中指定组织中检测到的荧光强度水平的柱形图。数据显示为三只小鼠的平均值。为了控制标记效率的差异，显示的值中最强信号设置为1。

[0143] 图6A是显示用缀合至 800CW的抗RAGE抗体PRO001或用媒介物对照处理的小鼠中指定组织中检测到的荧光强度水平的柱形图。数据显示为三只小鼠的平均值。为了控制标记效率的差异，显示的值中最强信号设置为1。

[0144] 图6B是显示用缀合至 800CW的抗RAGE抗体PRO002或用媒介物对照处理的小鼠中指定组织中检测到的荧光强度水平的柱形图。数据显示为三只小鼠的平均值。为了控制标记效率的差异，显示的值中最强信号设置为1。

[0145] 图7是一对显示通过尾静脉注射3mg/kg的抗RAGE抗体PRO002(左分图)的Balb/C小鼠肺组织中与辣根过氧化物酶缀合的抗人二抗的代表性IHC染色的显微照片，与未处理的小鼠(右分图)相比较。PRO002包含人IgG1主链。

[0146] 图8是显示用缀合至 800CW的抗CDH16抗体PRO056或用媒介物对照处理的小鼠中指定组织中检测到的荧光强度水平的柱形图。数据显示为三只小鼠的平均值。为了控制标记效率的差异，显示的值中最强信号设置为1。

[0147] 图9是显示用缀合至 800CW的抗CDH17抗体PRO061或用媒介物对照处理的小鼠中指定组织中检测到的荧光强度水平的柱形图。数据显示为三只小鼠的平均值。为了控制标记效率的差异，显示的值中最强信号设置为1。

[0148] 图10是一组显微照片，显示Notch2拮抗性mAb PRO034、PRO035和PRO036以及相应的RAGE靶向性ANDbody PRO051、PRO052和PRO053在新鲜冷冻的健康小鼠组织微阵列(FF TMA)切片上的染色。肺切片用方框表示。

[0149] 图11是显示PRO052、结合RAGE和呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白F的对照抗体(RAGE XT‑4/莫维组单抗)、以及结合Notch2和RSV糖蛋白F的对照抗体(Notch2‑2/莫维组单抗)的浓度的图，如通过夹心ELISA检测。点显示三只小鼠的平均值。误差条显示标准偏差。

[0150] 图12是显示PRO023、PRO025、PRO024、PRO027和PRO026 IL‑10/DSG1ANDbody的设计的一组示意图。

[0151] 图13A的柱状图显示了在用hrIL‑10预刺激随后用脂多糖(LPS)处理指定时间长度之后外周血单核细胞(PBMC)细胞培养物中的肿瘤坏死因子α(TNFα)水平。

[0152] 图13B的柱状图显示了用抗DSG1单克隆抗体(mAb)预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后PBMC细胞培养物中的TNFα水平。

[0153] 图13C的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO024预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后PBMC细胞培养物中的TNFα水平。

[0154] 图13D的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO026预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后PBMC细胞培养物中的TNFα水平。

[0155] 图13E的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO023预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后PBMC细胞培养物中的TNFα水平。

[0156] 图13F的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO025预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后PBMC细胞培养物中的TNFα水平。

[0157] 图13G的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO027预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后PBMC细胞培养物中的TNFα水平。

[0158] 图14A的柱状图显示了用hrIL‑10预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后原代巨噬细胞培养物中的TNFα水平。

[0159] 图14B的柱状图显示了用抗DSG1单克隆抗体(mAb)PRO003预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后原代巨噬细胞培养物中的TNFα水平。

[0160] 图14C的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO024预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后原代巨噬细胞培养物中的TNFα水平。

[0161] 图14D的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO026预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后原代巨噬细胞培养物中的TNFα水平。

[0162] 图14E的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO023预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后原代巨噬细胞培养物中的TNFα水平。

[0163] 图14F的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO025预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后原代巨噬细胞培养物中的TNFα水平。

[0164] 图14G的柱状图显示了用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO027预刺激随后用LPS处理指定时间长度之后原代巨噬细胞培养物中的TNFα水平。

[0165] 图15的图显示了在稳定表达DSG1的亲本HEK‑BLUETM IL‑10细胞或HEK‑BLUETM IL‑10细胞(+DSG1表达)中检测到的IL‑10信号传导水平，这些细胞用IL‑10/DSG1 ANDbody PRO058(功能上等同于PRO026)或包含IL‑10并结合RSV糖蛋白F(IL‑10/莫维组单抗)的对照抗体以指定浓度处理过夜。使用比色测定法测量IL‑10，以检测分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的表达。OD630：630nm处的光密度。使用GraphPad Prism 9进行曲线拟合，以拟合4参数对数(激动剂)相比于响应。

[0166] 图16A的图显示了来自通过尾静脉注射3mg/kg所示抗体或ANDbody给药的BALB/c小鼠的血清样品中PRO003、PRO024和PRO058随时间的浓度(ng/mL)。通过ELISA测量循环分子的浓度。显示平均浓度和标准偏差。N＝3。

[0167] 图16B的图显示了来自通过尾静脉注射3mg/kg所示抗体或ANDbody给药的BALB/c小鼠的皮肤组织样品中PRO003、PRO024和PRO058(功能上等同于PRO026)随时间的浓度(ng靶蛋白/mg总蛋白)。在指定时间点收集皮肤样品并均质化以提取蛋白质。通过ELISA测量浓度。显示平均浓度和标准偏差。N＝3。

[0168] 图17是一组示意图，显示PRO070、PRO074、PRO075和PRO077 TNFα阻断性抗DSG1 ANDbody的设计。

[0169] 图18A的图显示了在用PRO003、重组人IL‑10(rhIL‑10)或与人Fc结构域融合的重TM组人IL‑10(IL‑10‑Fc)处理过夜的亲本HEK‑BLUE  IL‑10细胞中检测到的IL‑10信号传导水平。使用比色测定法测量IL‑10以检测SEAP的表达。OD630：630nm处的光密度。使用GraphPad Prism 9进行曲线拟合，以拟合4参数对数(激动剂)相比于响应。

[0170] 图18B的图显示了在用IL‑10/DSG1和ANDbody PRO023、PRO024、PRO025、PRO026和TMPRO027处理过夜的亲本HEK‑BLUE  IL‑10细胞中检测到的IL‑10信号传导水平。使用比色测定法测量IL‑10以检测SEAP的表达。OD630：630nm处的光密度。使用GraphPad Prism 9进行曲线拟合，以拟合4参数对数(激动剂)相比于响应。

[0171] 本文提供了ANDbodyTM分子，其包括治疗性效应物靶标结合结构域和地址靶标结合结构域。仅当地址靶标结合结构域也接合靶组织或细胞上的地址靶标以将效应物靶标定位于靶细胞或组织时，ANDbody分子上的治疗性效应物靶标才有效地接合其治疗性效应物靶标，例如以形成逻辑门的AND‑门类型。例如，在一些实施例中，ANDbody是大分子，其包含至少(a)对在哺乳动物受试者上例如细胞表面上表达(例如广泛表达)的治疗性效应物靶标特异性的第一结合位点；以及(b)对于地址靶标特异性的第二结合位点。在实施例中，地址靶标的表达在受试者体内受到限制。在一些实施例中，第一结合位点与治疗性效应物靶标的结合弱于第二结合位点与地址标志物的结合。效应物和地址靶标可以位于同一细胞上，或者位于同一组织内的不同细胞或区室中。

[0172] 在一些实施例中，在施用给受试者大分子(例如ANDbody)后1天和7天之间的时间点(例如1天、2天、3天、4天、5天、6天和/或7天)，在受试者中可检测到的至少25％的大分子(例如ANDbody)在靶组织或细胞处被检测到。例如，在一些实施例中，在对受试者施用大分子后1天和7天之间的时间点，在受试者中至少30％、至少35％、至少40％、至少45％、至少50％、至少55％、至少60％、至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少95％、至少98％或100％(例如25％‑30％、30％‑35％、35％‑40％、40％‑45％、45％‑
50％、50％‑55％、55％‑60％、60％‑65％、65％‑70％、70％‑75％、75％‑80％、80％‑85％、
85％‑90％、90％‑95％、或95％‑100％)的可检测大分子在靶组织或细胞处被检测到。

[0173] 效应物靶标

[0174] 本发明的ANDbodyTM包含调节有需要的受试者(例如哺乳动物受试者，例如人)中的治疗性效应物靶标的效应物。如本文所用，“效应物靶标”是受试者的细胞或组织的离散结构(例如，细胞表面蛋白、跨膜蛋白、受体)，ANDbody的治疗性效应物结合结构域可以与其结合并且对受试者发挥调节作用，例如治疗作用。本文描述的ANDbody具有对效应物靶标特异性的结合位点。当效应物结合结构域与效应物靶标结合时，效应物调节靶细胞或组织以对受试者产生生物学应答，例如治疗性效应。然而，在一些实施例中，本文提供的效应物靶标结合结构域可能不会引发生物学效应，除非它与地址靶向结构域联合提供以将效应物定位于靶细胞或组织中的所期望靶地址。在一些实施例中，此类治疗性信号传导可能需要根据本发明的多个大分子结合多个效应物靶标。

[0175] 在一些实施例中，效应物靶标结合结构域在单独提供时可以产生小/弱的生物学效应，并且在与将效应物定位和集中/聚集到靶向的细胞或组织中期望的靶地址的地址靶向结构域联合提供时提供更大/更强的生物学效应。在一些实施例中，效应物靶标结合结构域在单独提供时可以产生可接受的生物学效应，并且在与地址靶向结构域联合提供时提供甚至更大/更强的生物学效应以将效应物靶标结合结构域定位于靶向的细胞或组织。在一些实施例中，效应物靶标结合结构域在单独提供时可以产生强生物学效应，并且在与地址靶向结构域联合提供强的或更强的靶向作用以将效应物靶标结合结构域定位于靶向的细胞或组织。在一些实施例中，效应物靶标结合结构域当单独提供时可产生具有不期望的脱靶生物学效应的生物学效应，但当与地址靶向联合提供时可被靶向、集中和聚集至靶向的细胞或组织中的所期望地址以减少或消除不期望的脱靶生物学效应。因此，本技术的效应物靶标结合结构域提供了优异的治疗剂，当与本文所述的地址靶标结合结构域联合提供时，其提供更强的靶向生物学效应且具有更少的副作用，包括更少的非预期的脱靶生物学效应。

[0176] 此类治疗性信号传导效应的实例包括但不限于：

[0177] (i)阻断促进或维持疾病状态的信号转导途径；

[0178] (ii)激活减少或预防疾病状态的信号转导途径；

[0179] (iii)促进抗体依赖性细胞毒性(ADCC)；

[0180] (iv)诱导靶细胞或组织上的补体激活；

[0181] (v)促进吞噬作用；

[0182] (vi)阻断或激活促进细胞分化的信号转导途径；

[0183] (vii)诱导组织重塑以减少或预防纤维化。

[0184] 在一些实施例中，治疗性效应物靶标在受试者中比地址靶标更广泛地表达。在一些实施例中，治疗性效应物靶标在生物体中全身、区域或局部表达。治疗性效应物靶标的“全身表达”是指治疗性效应物靶标在受试生物体的大部分中以基本上相同的水平表达。全身表达涉及多个组织。治疗性效应物靶标的“区域表达”是指治疗性靶标在小于全身表达但大于局部表达的区域中表达。区域表达不限于单一组织，而是可以发生在多个不同组织中。治疗性效应物靶标的“局部表达”是指治疗性靶标在单个或少数组织区域中表达。局部表达不限于单个组织，而是可以发生在多个不同组织中。

[0185] 在一些实施例中，效应物靶标结合结构域对效应物靶标具有低亲和力。例如，低亲和力可以是大于10nM的亲和力(例如，10nM‑1μM之间的亲和力，例如10nM与100nM之间的亲和力)。

[0186] 在一些实施例中，效应物靶标结合结构域对效应物靶标具有低亲合力。表1中列出了可用本文披露的ANDbody靶向的治疗性效应物靶标的非限制性实例，以及效应物靶标的示例性功能。

[0187] 表1：示例性效应物靶标

[0188]

[0189]

[0190] 地址靶标

[0191] 本发明的ANDbody还包括地址靶标结合物，其结合到地址靶标以提供效应物的靶向递送。如本文所用，“地址靶标”是细胞或组织上的结构，其表达在生物体中被充分限制以允许其鉴定生物体中的目的器官、组织、细胞或细胞状态。地址靶标可以是例如细胞表面蛋白或定位于细胞外基质的结构。如本文所用，地址靶标的“限制性”表达是指地址靶标具有差异性，例如较不广泛的体内表达，与全身表达相对。在某些实施例中，地址靶标在例如哺乳动物受试者(例如人受试者)中的单一细胞类型、组织或细胞状态中表达。

[0192] 在一些实施例中，当前提供的地址靶标结合结构域基本上不影响与地址靶标结合后的生物信号传导，例如，不调节靶细胞或组织中的信号转导途径或其他生物学应答。例如，地址靶标结合物可以是惰性的或无活性的，其中它在与地址靶标结合之后缺乏任何额外的活性(除了结合)，包括缺乏催化活性。例如，地址靶标结合物结合地址靶标的非信号传导位点或基序。“信号”在本文中用于指示由于靶标结合而发生的构象、酶促和/或电结果。因此，如本文所述，地址靶标结合域在地址靶标结合后不发出信号。如本文所用，“基本上”不影响生物信号传导的结构域是相对于对照条件(例如，相对于没有结构域的情况下的信号传导)调节其结合的靶细胞或组织中的信号转导途径或其他生物学应答不超过25％的结构域。例如，该结构域可以将信号转导途径或其他生物学应答调节(例如，增加或减少)小于
20％、小于15％、小于10％、小于5％、小于2％或小于1％(例如，20％‑25％、15％‑20％、
10％‑15％、5％‑10％、2％‑5％或1％‑2％)。

[0193] 类似地，当效应物靶标结合结构域不被地址靶标结合结构域定位时，效应物靶标结合结构域可以基本上不发信号，或者可以根本不发信号。在实施例中，与当效应物靶标结合结构域不被地址靶标结合结构域定位时的信号相比，当效应物靶标结合结构域被地址靶标结合结构域定位时，效应物靶标结合结构域发出具有更高效力的信号(例如，具有更高的亲合力)。当效应物靶标结合结构域通过作为相同大分子的一部分的地址靶标结合结构域定位于靶向的细胞或组织时，效应物靶标信号传导可如上文所讨论地受到影响。

[0194] 在一些实施例中，地址靶标用于器官特异性寻址、组织特异性寻址或细胞特异性寻址。

[0195] 细胞或组织的地址靶标结合结构域的特异性可以使用本领域已知的方法来检测。在一个实施例中，使用基尼系数(GC)评分，其是一种用于评估数据集中特定基因的表达变异的方法。(参见O’Hagan等人,GeneGini:assessment via the Gini coefficient of reference“housekeeping”genes and diverse human transporter expression profiles[基因基尼:通过参考“持家”基因和不同人转运蛋白表达谱的基尼系数进行评估]。Cell  systems[细胞系统]6,230‑244,https://doi.org/10.1016/
j.cels.2018.01.003(2018)；Wright Muelas等人，The role and robustness of the Gini coefficient as an unbiased tool for the selection of Gini genes for normalising expression profiling data[基尼系数作为选择基尼基因以标准化表达谱数据的无偏工具的作用和稳健性]。Sci Rep[科学报道]9,17960(2019).https://doi.org/
10.1038/s41598‑019‑54288‑7)。可以使用如本文所述的为地址靶标结合物生成的细胞表达数据来鉴定地址靶标结合物(表2A和2B)。在一些实施例中，地址靶标标志物表现出大于
0.4的基尼分得分，例如在0.74与1.00之间。相反，更全身地表达的非地址标志物表现出
0.15至0.19之间的基尼得分。

[0196] 在一个实施例中，使用代表数据集中特定基因的表达变异的Tau得分。计算Tau使用每个组织中基因的表达信息及其在所有组织中的最大表达，同时还考虑了测量表达的组织数量(参见Itai Yanai等人,Genome‑wide midrange transcription profiles reveal expression level relationships in human tissue specification[全基因组中等转录谱揭示了人组织特异性的表达水平关系],Bioinformatics[生物信息学],第21卷,第5期,2005年3月1日,第650‑659页；Kryuchkova‑Mostacci N,Robinson‑Rechavi M.A benchmark of gene expression tissue‑specificity metrics.[基因表达组织特异性指标的基准]。
Brief Bioinform.[生物信息学简报].2017年3月1日；18(2):205‑214.doi:10.1093/bib/bbw008)。在一些实施例中，地址靶标标志物表现出大于0.6的Tau分得分，例如在0.74与
1.00之间。相反，更全身地表达的非地址标志物表现出低于0.3的Tau得分，例如0.15至
0.19。

[0197] 在一些实施例中，地址靶标结合结构域对于特定细胞或组织的特异性，例如由适当的基尼和/或Tau得分指示的特异性，通过基于组织的分析来确定，该分析不包括具有天然的生物隔离屏障(即血脑屏障)的组织。例如，在一些实施例中，可以在没有来自例如(但不限于)以下组织的数据的情况下计算基尼和/或Tau得分：中枢神经系统、脑、眼睛和/或睾丸组织。在一些实施例中，本文提供的地址靶标鉴定细胞状态。如本文所用，“细胞状态”是指细胞的给定生理条件。细胞状态可以是例如疾病状态(相对于细胞或组织的非疾病状态或正常状态)；或激活状态(相对于细胞的非激活状态)。示例性的疾病状态包括炎症、感染(例如细菌、病毒或真菌感染)和与癌症相关的状态(例如癌前或癌性细胞状态)。在一些方面，细胞状态反映了这样一个事实：特定类型的细胞可以在一个或多个特征方面表现出可变性和/或可以存在于多种不同的条件下，同时保留其特定的细胞类型特征，并且不会获得导致它们被分类为不同细胞类型的特征。细胞可以存在的不同状态或条件可以是特定细胞类型的特征(例如，可以涉及仅由该细胞类型表现出的性质或特征和/或涉及仅或主要由该细胞类型执行的功能)或者可以发生在多种不同的细胞类型中。在一些实施例中，细胞状态反映细胞应答特定刺激或环境条件的能力(例如，细胞是否将应答，或将引发的应答类型)或者是细胞的状况由刺激或环境条件引起。处于不同细胞状态的细胞可以通过多种方式彼此区分。例如，它们可以表达、产生或分泌一种或多种不同的基因、蛋白质或其他分子(“标志物”，例如本文提供的地址靶标)，表现出蛋白质修饰的差异，例如磷酸化、乙酰化等，或者可能表现出外观差异。因此，细胞状态可以是细胞的状况，其中细胞表达、产生或分泌一种或多种标志物，表现出一个或多个特定的蛋白质修饰，具有特定的外观，和/或将表现或将不表现出一种或多种对刺激或环境条件的生物学应答。下面的表2A(HPA数据库分析)和2B(Gtex数据库分析)中提供了本技术的示例性地址靶标。

[0198] 表2A：示例地址靶标(HPA数据库分析)

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[0260] 表2B包含基于Gtex数据库分析的地址靶标：

[0261] 表2B：示例性地址靶标(Gtex数据库分析)

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[0315] ANDbody结构

[0316] 一般来说，ANDbody可以是任何大分子，例如含有效应物靶标结合位点或结合结构域和地址靶结合位点或结合结构域的多肽或蛋白质。结合位点可以存在于相同的多肽链或例如通过二硫键连接在一起的不同的多肽链上。

[0317] 在一些实施例中，ANDbody的效应物靶标的结合位点和地址靶标的结合位点各自包含抗体重链和/或轻链结构域。在一些实施例中，ANDbody包含对效应物靶标具有结合特异性的第一抗体可变结构域和对地址靶标具有结合特异性的第二抗体可变结构域。在其他实施例中，ANDbody包含抗体的第一抗原结合位点和抗体的第二抗原结合位点，该第一抗原结合位点对效应物靶标具有结合特异性，该第二抗原结合位点对地址靶标具有结合特异性。

[0318] 在一些实施例中，ANDbody可以具有抗体分子的结构。如本文所用，术语“抗体”包括全长抗体和抗原结合抗体片段(例如，scFv)。在一些实施例中，抗体分子对多于一种，例如2、3、4种抗原具有特异性，例如，抗体分子包含多个可变结构域序列，其中多个可变结构域序列中的第一可变结构域序列对第一表位(例如效应物靶标)具有结合特异性，并且多个可变结构域序列中的第二可变结构域序列对第二表位(例如，地址靶标)具有结合特异性[0319] 在一些实施例中，ANDbody是具有结合效应物靶标的臂或结构域和结合地址靶标的臂或结构域的抗体分子。在实施例中，ANDbody是抗体分子，其包含结合效应物靶标和地址靶标之一的轻链和结合效应物靶标和地址靶标中的另一个的重链。

[0320] 在一些实施例中，ANDbody具有以下的结构：scFv、BsIgG、BsAb片段、BiTE、双亲和力重定向蛋白(DART)、串联双抗体(TandAb)、双抗体、Fab2、di‑scFv、化学连接的F(ab’)2、带有2、3或4个不同的抗原结合位点的Ig分子、DVI‑IgG四合一、ImmTac、HSAbody、IgG‑IgG、Cov‑X‑Body、scFv1‑PEG‑scFv2、附加的IgG、DVD‑IgG、亲和体、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)、亲和多聚体(avimer)、DARPin、Fynomer、单体、nanoCLAMP、bis‑Fab、Fv、Fab、Fab'‑SH、线性抗体、scFv、仅具有重链的抗体(Humabody)、ScFab、IgG抗体片段、单链可变区抗体、单结构域重链抗体、双特异性三体、BiKE、CrossMAb、dsDb、scDb、串联dAb/VHH、三重dAb VHH、四价dAb/VHH、Fab‑scFv、Fab‑Fv、或DART‑Fc、纤维连接蛋(adnectin)、库尼茨型抑制剂(Kunitz‑type inhibitor)、或受体诱饵。

[0321] ANDbody的效应物靶结合位点和地址靶结合位点对其各自结合配偶体的亲和力可能不同。在一些实施例中，第一结合位点与其所结合的治疗性效应物靶标的亲和力弱于第二结合位点与地址靶标的亲和力。在一些实施例中，第一结合位点与其所结合的治疗性效应物靶标的亲和力比第二结合位点对地址靶标的亲和力弱超过2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、15倍、20倍、50倍、100倍、200倍、500倍、1000倍。

[0322] 术语“结合亲和力”和“结合活性”是指大分子例如多肽分子结合或不结合靶标的倾向。为了组合两个结合位点的本发明的目的，两个结合位点的相对亲和力可以通过例如当每个结合位点存在于共同支架上时测量它们各自的亲和力来确定，例如以以下形式：单链抗体。这种比较允许比较两个结合位点的亲和力，同时消除来自本发明大分子上存在的其他结合位点的任何干扰。

[0323] 结合亲和力可以通过测定多肽及其结合物的解离常数(Kd)来定量。较低的Kd表明对结合配偶体的亲和力较高。类似地，多肽与其结合配偶体结合的特异性可以根据多肽与其结合配偶体的相对解离常数(Kd)来定义，该解离常数与多肽和另一种非靶分子的解离常数相比较。

[0324] 该解离常数的值可以通过已知的方法测定。例如，可以使用双滤器硝化纤维素滤膜结合测定来确定Kd，例如Wong&Lohman(Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国国家科学院院刊]90,5428‑5432,1993)披露的测定。用于评估配体(例如抗体)对靶的结合能力的其他标准测定是本领域已知的，包括例如ELISA、Western印迹、RIA和流式细胞术分析。抗体的结合动力学(例如，结合亲和力)也可以通过本领域已知的标准测定来评估，例如通过BiacoreTM系统分析。

[0325] 作为Kd的替代方案，EC50或IC50可用于确定相对亲和力。在本文中，EC50表示多肽与固定量的结合配偶体达到其最大结合的50％时的浓度。IC50表示多肽抑制固定量的竞争剂与固定量的结合配偶体的最大结合的50％时的浓度。在这两种情况下，较低水平的EC50或IC50表明对靶标的亲和力较高。ANDbody结合位点对其结合配偶体的EC50和IC50值均可以通过熟知的方法例如ELISA来确定。

[0326] 在一些实施例中，治疗性效应物靶标结合物的Kd可以高于约1pM、约10pM、约100pM、约1nM、约10nM、约100nM、约500nM或约1uM(例如，可以在1pM与10pM之间、在10pM与
100pM之间、在100pM与1nM之间、在1nM与10nM之间、在10nM与100nM之间、在100nM与500nM之间、或在500nM和1uM之间)。在一些实施例中，地址靶标结合物的Kd可以小于约1uM、约
500nM、约100nM、约10nM、约1nM、约100pM、约10pM或约1pM(例如，可以在1uM与500nM之间、在
500nM与100nM之间、在100nM与10nM之间、在10nM与1nM之间、在1nM和100pM之间、在100pM与
10pM之间、或在10pM与1pM之间)。在一些实施例中，治疗性效应物靶标结合物的Kd可以比地址靶标结合物的Kd高约6倍、约5倍、约4倍、约3倍或约2倍。

[0327] 在一些实施例中，治疗性效应物靶标结合物的EC50可以高于约1pM、约10pM、约100pM、约1nM、约10nM、约100nM、约500nM或约1uM(例如，可以在1pM与10pM之间、在10pM与
100pM之间、在100pM与1nM之间、在1nM与10nM之间、在10nM与100nM之间、在100nM与500nM之间、或在500nM和1uM之间)。在一些实施例中，地址靶标结合物的EC50可以小于约1uM、约
500nM、约100nM、约10nM、约1nM、约100pM、约10pM或约1pM(例如，可以在1uM与500nM之间、在
500nM与100nM之间、在100nM与10nM之间、在10nM与1nM之间、在1nM和100pM之间、在100pM与
10pM之间、或在10pM与1pM之间)。在一些实施例中，治疗性效应物靶标结合物的EC50可以比地址靶标结合物的EC50高约6倍、约5倍、约4倍、约3倍或约2倍。

[0328] 在一些实施例中，治疗性效应物靶标结合物的IC50可以高于约1pM、约10pM、约100pM、约1nM、约10nM、约100nM、约500nM或约1uM(例如，可以在1pM与10pM之间、在10pM与
100pM之间、在100pM与1nM之间、在1nM与10nM之间、在10nM与100nM之间、在100nM与500nM之间、或在500nM和1uM之间)。在一些实施例中，地址靶标结合物的IC50可以小于约1uM、约
500nM、约100nM、约10nM、约1nM、约100pM、约10pM或约1pM(例如，可以在1uM与500nM之间、在
500nM与100nM之间、在100nM与10nM之间、在10nM与1nM之间、在1nM和100pM之间、在100pM与
10pM之间、或在10pM与1pM之间)。在一些实施例中，治疗性效应物靶标结合物的IC50可以比地址靶标结合物的IC50高约6倍、约5倍、约4倍、约3倍或约2倍。

[0329] ANDbody结合的效应物靶标和地址靶标的细胞或组织密度可能不同。在实施例中，由ANDbody的效应物靶标结合位点结合的细胞上的治疗性效应物靶标的密度比由地址靶标结合位点结合的细胞上的地址靶标的密度低大于约2倍、约3倍、约4倍、约5倍、约10倍、约15倍、约20倍、约50倍、约100倍、约200倍、约500倍、约1000倍、约10,000倍、约100,000倍。

[0330] 在一些实施例中，第一结合位点对其结合的治疗性效应物靶标的亲和力比第二结合位点对其结合的地址靶标的亲和力低约一半(1/2)X Kd，并且由第一结合位点结合的细胞上的治疗性效应物靶标的密度比由第二结合位点结合的细胞上的地址靶标的密度小约一半(1/2)X Kd。

[0331] 在一些实施例中，ANDbody具有如上所述的亲和力和密度参数。

[0332] 在一些实施例中，ANDbody中的第一结合位点和第二结合位点彼此直接连接。直接连接是指第一结合位点编码序列邻接第二结合位点编码序列并且不存在衍生自其他序列(例如接头)的序列。在一些实施例中，ANDbody中的第一结合位点和第二结合位点彼此不直接连接。

[0333] 如本文所披露的ANDbody可以连接至另外的一个或多个部分，例如，细胞外成分、细胞内成分、可溶性因子(例如酶、激素、细胞因子、生长因子、毒素、毒液、污染物等)或跨膜蛋白(例如细胞表面受体)。

[0334] 表3和序列表中提供了本技术的ANDbody可能具有亲和力的示例性效应物靶标和地址靶标序列。在一些情况下，序列包含全长蛋白质序列和/或具有或不具有信号肽区域的Fc融合序列。在一些实施例中，本技术的ANDbody包括结合地址靶标蛋白或效应物靶标蛋白的结合结构域。在实施例中，本发明ANDbody的结合结构域可以结合包括信号肽的蛋白质序列。在其他实施例中，本发明ANDbody的结合结构域可以结合缺乏信号蛋白的蛋白。在一些实施例中，本发明ANDbody的结合结构域可以结合全长蛋白。在其他实施例中，本发明ANDbody的结合结构域可以结合与其他蛋白质(例如Fc序列)融合的蛋白质融合体，例如全长蛋白质序列或其具有或不具有信号肽区域的肽片段。在其他实施例中，本发明ANDbody的结合结构域可以结合包含少于全长蛋白质序列的蛋白质，例如地址靶标或效应物靶标的肽片段。

[0335] 表3：示例性效应物靶标和地址靶标序列

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[0353]

[0354]

[0355] ANDbody组合物的生产

[0356] ANDbody多肽的生产

[0357] 本发明的ANDbody多肽可以通过任何合适的方法产生。例如，ANDbody的全部或部分可以由包含编码ANDbody的核苷酸的宿主细胞表达。此类制备治疗性多肽的方法是本领域的常规方法。通常，参见Smales和James(编辑),Therapeutic Proteins:Methods and Protocols[治疗性蛋白：方法和方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2005)；以及Crommelin,Sindelar和Meibohm(编辑)，Pharmaceutical Biotechnology:Fundamentals and Applications[药物生物技术：基础与应用],Springer[斯普林格出版社](2013)。

[0358] 用于生产ANDbody的方法可以涉及在哺乳动物细胞中表达，尽管重组蛋白也可以使用昆虫细胞、酵母、细菌或在适当启动子控制下的其他细胞来生产。哺乳动物表达运载体可以包含非转录元件，如复制起点、合适的启动子和增强子、以及其他5'或3’侧翼非转录序列、以及5'或3'非翻译序列，如必要的核糖体结合位点、聚腺苷酸化位点、剪接供体和接受位点、以及终止序列。来源于SV40病毒基因组的DNA序列，例如，SV40起点、早期启动子、增强子、剪接和聚腺苷酸化位点可以用于提供异源DNA序列表达所需的其他遗传元件。在以下文献中描述了用于与细菌、真菌、酵母、和哺乳动物细胞宿主一起使用的适当的克隆和表达载体：Green&Sambrook,Molecular Cloning:A Laboratory Manual[分子克隆‑实验室手册](第四版),Cold Spring Harbor Laboratory Press[冷泉港实验室出版社](2012)。

[0359] 可以采用各种哺乳动物细胞培养系统来表达和制造本文描述的ANDbody。哺乳动物表达系统的实例包括但不限于CHO细胞、COS细胞、HeLA和BHK细胞系。在以下文献中描述了用于生产蛋白治疗剂的宿主细胞培养的过程：例如，Zhou和Kantardjieff(编辑)，Mammalian Cell Cultures for Biologics Manufacturing[用于生物制品制造的哺乳动物细胞培养](Advances in Biochemical Engineering/Biotechnology[生物化学工程/生物科技的进展]),Springer[斯普林格出版社](2014)。在以下文献中描述了蛋白治疗剂的纯化：Franks,Protein  Biotechnology:Isolation,Characterization,and Stabilization[蛋白生物技术：分离、表征、和稳定化],Humana Press[胡玛纳出版社](2013)；以及Cutler,Protein Purification Protocols[蛋白纯化方案](Methods in Molecular Biology[分子生物学方法]),Humana Press[胡玛纳出版社](2010)。以下文献中描述了蛋白治疗剂的配制品：Meyer(编辑),Therapeutic Protein Drug Products:
Practical Approaches to formulation in the Laboratory,Manufacturing,and the Clinic[治疗性蛋白药物产品：实验室、制造和临床中配制品的实践方法],Woodhead Publishing Series[伍德海德出版系列](2012)。

[0360] 抗体生产技术是已知的。例如，参见Zhiqiang(编辑),Therapeutic Monoclonal Antibodies:From Bench to Clinic.[治疗性单克隆抗体:从实验室到临床]第1版.Wiley2009；Greenfiel(编辑)Antibodies:A Laboratory Manual.[抗体：实验室手册]。
(第二版)冷泉港实验室出版社2013；Ferrara等人2012.Using Phage and Yeast Display to Select Hundreds of Monoclonal Antibodies:Application to Antigen 85,a Tuberculosis Biomarker.[使用噬菌体和酵母展示筛选数百种单克隆抗体:应用于抗原85(一种结核病生物标志物)]PLoS ONE[公共科学图书馆‑综合]7(11):e49535，获得制造重组抗体的方法，包括抗体工程改造、简并寡核苷酸的使用、5'‑RACE、噬菌体展示、以及诱变；抗体测试和表征；抗体药代动力学和药效动力学；抗体纯化和储存；以及筛选和标记技术。

[0361] ANDbody RNA的生产

[0362] 在一些实施例中，可以生产ANDbody RNA，例如用于递送至受试者。一般来说，治疗性mRNA由体外转录产生。修饰(例如掺入经修饰的碱基、5’帽类似物和聚A尾)可以优化活性和功能。例如，mRNA的翻译和稳定性可以通过帽和聚A尾修饰来实现。例如，将ARCA(抗反向帽类似物)等帽类似物和100‑200bp的聚(A)尾掺入体外转录(IVT)mRNA中可提高表达和稳定性(Kaczmarek等人Genome Medicine[基因组医学](2017)9:60)。新型帽类似物，例如1,2‑二硫代二磷酸修饰的帽，可以进一步提高翻译效率(Strenkowska等人Nucleic Acids Res.[核酸研究]2016；44:9578‑90)。密码子优化还可以提高蛋白质合成的效率，并限制稀有密码子造成的mRNA不稳定(Presnyak等人Cell.[细胞]2015；160:1111‑24.93；Thess等人Mol Ther.[分子疗法]2015；23:1456‑64)。修饰包含负责募集RNA结合蛋白(RBP)和miRNA的序列的3'和5'非翻译区(UTR)可以提高蛋白质产物(Kaczmarek)的水平。此外，可以修饰UTR来编码调控元件(例如K转角基序和miRNA结合位点)，以便以细胞特异性方式控制RNA表达(Wroblewska等人.Nat Biotechnol.[自然生物技术]2015；33:839‑41)。RNA碱基修饰(例如，掺入mRNA的假尿苷，例如N1‑甲基‑假尿苷)有助于掩盖mRNA免疫刺激活性，并通过增强翻译起始来增加mRNA翻译(Andries等人J Control Release.[控释杂志]2015；217:337‑
44；Svitkin等人Nucleic Acids Res.[核酸研究]2017；45:6023‑36)。mRNA组合物及其制造方法是已知的并且披露于例如以下中：WO 2016011306；WO 2016014846；WO 2016022914；WO 
2016077123；WO 2016164762；WO 2016201377；WO 2017049275；US9937233；US8710200；
US10022425；US9878056；US9572897；Jemielity等人RNA.2003；9:1108‑22.90；Mockey等人Biochem Biophys Res Commun.[生化及生物物理研究通讯]2006；340:1062‑8.91；
Strenkowska的Nucleic Acids Res.[核酸研究]2016；44:9578‑90.92；Presnyak等人Cell.[细胞]2015；160:1111‑24.93；Kaczmarek等人Genome Medicine[基因组医学](2017)9:60。

[0363] 亲和力改变的ANDbody的生产

[0364] 具有亲和力改变的结合位点的ANDbody可以使用本领域已知的方法来制备，例如，ANDbody可被工程改造以具有对效应物靶标的亲和力降低的靶标结合位点。参见，例如，美国专利号10,654,928。一般而言，ANDBody可被修饰以改变效应物靶标结合位点与其效应物靶标的亲和力或改变地址靶标结合位点与其地址靶标的亲和力。修饰可以增加或减少与结合位点的结合配偶体的亲和力。

[0365] 靶标和地址评估

[0366] 可以使用本领域已知的方法在RNA或蛋白质水平评估治疗性靶标的表达。在实施例中，通过测量RNA表达来评估治疗性靶标的表达，例如使用RNA序列数据集作为蛋白质表达水平的代表。RNA数据集包括那些基因型组织表达(GTEx)数据集(参见，例如https://www.genome.gov/Funded‑Programs‑Projects/Genotype‑Tissue‑Expression‑Project)或人蛋白质图谱(HPA)数据集(https://www.proteinatlas.org/)。

[0367] 可以评估治疗性靶标表达的组织的非限制性列表包括例如小唾液腺、甲状腺、肺、乳腺(乳腺组织)、胰腺、肾上腺、肝、肾(皮质)、肾(髓质)、脂肪内脏(大网膜)、小肠‑回肠末端、输卵管、卵巢、子宫、未暴露在阳光下的皮肤(耻骨弓上)；宫颈—子宫颈内膜、宫颈—外子宫颈、阴道、暴露在阳光下的皮肤(小腿)、前扣带皮层细胞(BA24)、尾状核(基底神经节)、壳核(基底神经节)、伏核(基底神经节)、下丘脑、杏仁核、海马、小脑/小脑半球、黑质、垂体、脊髓(颈部)、动脉‑主动脉、心脏‑心耳、动脉‑冠状动脉‑心脏、左心室、食管‑粘膜、食管‑肌层、食管‑胃食管交界处、脾脏、胃、横结肠、乙状结肠、睾丸、全血、细胞(EBV转化的淋巴细胞、动脉‑胫骨或神经‑胫骨组织。

[0368] 可以使用本领域熟知的方法来评估地址标志物，例如，可以使用RNA印迹、cDNA或寡核苷酸微阵列或测序(例如RNA‑Seq)在mRNA水平评估基因表达，或者使用蛋白质微阵列、蛋白质印迹、流式细胞术、免疫组织化学等在蛋白质表达水平评估基因表达。例如，可以使用对蛋白质的特定修饰形式具有特异性的抗体(例如磷酸特异性抗体)或质谱法来评估修饰。

[0369] ANDbody的用途

[0370] 本文提供的ANDbody及其药物组合物适合施用于需要其的受试者，其中受试者是人或非人动物，例如适合于人治疗或兽医用途。

[0371] 兽医用途包括用于治疗哺乳动物，包括商业有关的哺乳动物，例如宠物和牲畜动物，诸如牛、猪、马、绵羊、山羊、猫、狗、小鼠和/或大鼠；和/或鸟类，包括与商业有关的鸟类，诸如鹦鹉、家禽、鸡、鸭、鹅、母鸡或公鸡和/或火鸡；动物园动物，例如猫科动物；非哺乳类动物，例如爬行动物、鱼类、两栖动物等。

[0372] 本发明还涉及包含本文所述的ANDbody组合物的受试者或受试者细胞。在一些实施例中，受试者或受试者细胞是植物、昆虫、细菌、真菌、脊椎动物、哺乳动物(例如，人)或其他生物体或细胞。

[0373] 在一些实施例中，使受试者或受试者细胞与ANDbody组合物接触(例如递送或施用)。在一些实施例中，受试者是哺乳动物(如人)。可以在施用后的任何时间测量受试者中ANDbody组合物、表达产物或两者的量。

[0374] 药物组合物

[0375] 多肽药物组合物

[0376] 本文描述的ANDbody组合物(例如ANDbody多肽或RNA组合物)可以施用于有需要的受试者。本发明包括药物组合物，其包含与一种或多种药学上可接受的赋形剂组合的ANDbody组合物。

[0377] 蛋白质治疗剂的配制是常规的。参见，例如，Ribeiro等人,Insights on the Formulation of Recombinant Proteins.[对重组蛋白配制的见解]Adv Biochem Eng Biotechnol.[高级生物化学工程生物技术]2020；171:23‑54.doi:10.1007/10_2019_119.PMID:31844925。

[0378] RNA药物组合物

[0379] 编码ANDBody的核酸(例如RNA)可以替代地或另外地施用于受试者。一般来说，治疗性mRNA由体外转录产生。修饰(例如掺入经修饰的碱基、5’帽类似物和聚A尾)可以优化活性和功能。例如，mRNA的翻译和稳定性可以通过帽和聚A尾修饰来实现。例如，将ARCA(抗反向帽类似物)等帽类似物和100‑200bp的聚(A)尾掺入体外转录(IVT)mRNA中可提高表达和稳定性(Kaczmarek等人Genome Medicine[基因组医学](2017)9:60)。新型帽类似物，例如1,2‑二硫代二磷酸修饰的帽，可以进一步提高翻译效率(Strenkowska等人Nucleic Acids Res.[核酸研究]2016；44:9578‑90)。密码子优化还可以提高蛋白质合成的效率，并限制稀有密码子造成的mRNA不稳定(Presnyak等人Cell.[细胞]2015；160:1111‑24.93；Thess等人Mol Ther.[分子疗法]2015；23:1456‑64)。修饰包含负责募集RNA结合蛋白(RBP)和miRNA的序列的3'和5'非翻译区(UTR)可以提高蛋白质产物(Kaczmarek)的水平。此外，可以修饰UTR来编码调控元件(例如K转角基序和miRNA结合位点)，以便以细胞特异性方式控制RNA表达(Wroblewska等人.Nat Biotechnol.[自然生物技术]2015；33:839‑41)。RNA碱基修饰(例如，掺入mRNA的假尿苷，例如N1‑甲基‑假尿苷)有助于掩盖mRNA免疫刺激活性，并通过增强翻译起始来增加mRNA翻译(Andries等人J Control Release.[控释杂志]2015；217:337‑
44；Svitkin等人Nucleic Acids Res.[核酸研究]2017；45:6023‑36)。mRNA组合物及其制造方法是已知的并且披露于例如以下中：WO 2016011306；WO 2016014846；WO 2016022914；WO 
2016077123；WO 2016164762；WO 2016201377；WO 2017049275；US9937233；US8710200；
US10022425；US9878056；US9572897；Jemielity等人RNA.2003；9:1108‑22.90；Mockey等人Biochem Biophys Res Commun.[生化及生物物理研究通讯]2006；340:1062‑8.91；
Strenkowska的Nucleic Acids Res.[核酸研究]2016；44:9578‑90.92；Presnyak等人Cell.[细胞]2015；160:1111‑24.93；Kaczmarek等人Genome Medicine[基因组医学](2017)9:60。

[0380] 在实施例中，RNA是环状RNA。参见例如WO 2019118919，描述了从环状RNA表达治疗性RNA，例如抗体RNA。在一些实施例中，本发明包括环状多核糖核苷酸，其包含(a)内部核糖体进入位点(IRES)、(b)编码本文所述的ANDbody并且缺乏聚‑A序列的表达序列，和(c)终止元件。编码本文所述的ANDbody的环状RNA可以裸(即，不与载剂配制)递送或与载剂一起递送。

[0381] 载剂

[0382] 脂质纳米颗粒

[0383] 用于与载剂一起体内递送的本文所述的组合物的配制品(例如，多肽或RNA ANDbody组合物)包括脂质纳米颗粒(LNP)配制品。参见，例如，美国专利9,764,036；美国专利9,682,139；Kauffman等人Nano Lett.[纳米快报]2015；15:7300‑6.37；Fenton等人Adv Mater.[先进材料]2016；28:2939‑43)。在一些实施例中，LNP包含一种或多种离子脂质，诸如非阳离子脂质(例如，中性或阴离子或两性离子脂质)；一种或多种缀合脂质(如WO 2019217941的表5中描述的PEG缀合脂质或缀合至聚合物的脂质；其通过援引以其全文并入本文)；一种或多种固醇(例如，胆固醇)；以及，任选地，一种或多种靶向分子(例如，缀合的受体、受体配体、抗体)；或前述内容的组合。

[0384] 可用于纳米颗粒形成的脂质(例如，脂质纳米颗粒)包括例如WO 2019217941的表4中描述的那些，其通过援引并入本文—例如，含脂质的纳米颗粒可包括WO 2019217941的表4中的一种或多种脂质。脂质纳米颗粒可以包括另外的要素，如聚合物，如通过援引并入的WO 2019217941的表5中描述的聚合物。

[0385] 在一些实施例中，缀合脂质，当存在时，可以包括以下的一种或多种：PEG‑二酰基甘油(DAG)(如l‑(单甲氧基‑聚乙二醇)‑2,3‑二肉豆蔻酰甘油(PEG‑DMG))、PEG‑二烷氧基丙基(DAA)、PEG‑磷脂、PEG‑神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG‑PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS‑DAG)(如4‑0‑(2',3'‑二(十四烷酰氧基)丙基‑l‑0‑(w‑甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG‑S‑DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N‑(羰基‑甲氧基聚乙二醇2000)‑1,2‑二硬脂酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺钠盐，以及在WO 2019051289的表2中描述的那些(通过援引并入)和前述的组合。

[0386] 在一些实施例中，可掺入脂质纳米颗粒中的固醇包括胆固醇或胆固醇衍生物中的一种或多种，如通过援引并入的W02009/127060或US2010/0130588中的那些。另外的示例性固醇包括植物固醇，包括通过引用并入本文的Eygeris等人(2020)，dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。

[0387] 在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质、抑制颗粒聚集的缀合脂质和固醇。这些组分的量可以独立地变化，以获得所需特性。例如，在一些实施例中，脂质纳米颗粒包含：可电离脂质，其量是总脂质的约20mol％至约90mol％(在其他实施例中，它可以是存在于脂质纳米颗粒中的总脂质的20‑70％(mol)、30‑60％(mol)或40‑50％(mol)；约50mol％至约90mol％)；非阳离子脂质，其量是总脂质的约5mol％至约30mol％；缀合脂质，其量是总脂质的约0.5mol％至约20mol％，以及固醇，其量是总脂质的约20mol％至约
50mol％。总脂质与核酸的比率可以根据需要变化。例如，总脂质与核酸(质量或重量)的比率可为约10:1至约30:1。

[0388] 在一些实施例中，脂质与核酸的比率(质量/质量比率；w/w比率)可以在以下范围中：约1:1至约25:1、约10:1至约14:1、约3:1至约15:1、约4:1至约10:1、约5:1至约9:1、或约6:1至约9:1。可以调节脂质和核酸的量以提供所需的N/P比，例如3、4、5、6、7、8、9、10或更高的N/P比。通常，脂质纳米颗粒配制品的总脂质含量可在约5mg/ml至约30mg/mL的范围内。

[0389] 可用于(例如，与其他脂质组分组合)形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA)的脂质纳米颗粒的脂质化合物的一些非限制性实例包括：

[0390] (i)

[0391] 在一些实施例中，包含式(i)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0392] (ii)

[0393] 在一些实施例中，包含式(ii)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0394] (iii)

[0395] 在一些实施例中，包含式(iii)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0396] (iv)

[0398] (v)

[0399] 在一些实施例中，包含式(v)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0400] (vi)

[0401] 在一些实施例中，包含式(vi)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0402] (vii)

[0403] (viii)

[0404] 在一些实施例中，包含式(viii)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0405] (ix)

[0406] 在一些实施例中，包含式(ix)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0407] (x)

[0408] 其中

[0409] X1是O、NR1或直接键，X2是C2‑5亚烷基，X3是C(＝O)或直接键，R1是H或Me，R3是Ci‑3烷基，R2是Ci‑3烷基，或R2与它所附接的氮原子和X2的1‑3个碳原子一起形成4‑元、5‑元或
6‑元环，或X1是NR1，R1和R2与它们所附接的氮原子一起形成5‑元或6‑元环，或R2与R3和它们所附接的氮原子一起形成5‑元、6‑元或7‑元环，Y1是C2‑12亚烷基，Y2选自[0410] (在任一取向上)， (在任一取向上)， (在
任一取向上)，

[0411] n是0至3，R4是Ci‑15烷基，Z1是Ci‑6亚烷基或直接键，

[0412] Z2是 (在任一取向上)或不存在，条件是如果Z1是直接键，则Z2不存在；

[0413] R5是C5‑9烷基或C6‑10烷氧基，R6是C5‑9烷基或C6‑10烷氧基，W是亚甲基或直接键，并且R7是H或Me，或其盐，条件是如果R3和R2是C2烷基，X1是O，X2是直链C3亚烷基，X3是C(＝0)，Y1是直链Ce亚烷基，(Y2)n‑R4是

[0414]

[0415] R4是直链C5烷基，Z1是C2亚烷基，Z2不存在，W是亚甲基，并且R7是H，则R5和R6不是Cx烷氧基。

[0416] 在一些实施例中，包含式(xii)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0417] (xi)

[0418] 在一些实施例中，包含式(xi)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0419] 其中

[0420] (xiii)

[0421] (xiv)

[0422] 在一些实施例中，LNP包含式(xiii)的化合物和式(xiv)的化合物。

[0423] (xv)

[0424] 在一些实施例中，包含式(xv)的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肝和/或肝细胞。

[0425] (xvi)

[0426] 在一些实施例中，包含式(xvi)的配制品的LNP用于将本文所述的ANDbody RNA组合物递送至肺内皮细胞。

[0427] (xvii)

[0428]其中

[0429]

[0430]

[0431] 在一些实施例中，用于形成用于递送本文所述的组合物，例如本文所述的核酸(例如，RNA)的脂质纳米颗粒的脂质化合物通过以下反应之一制成：

[0432]

[0433]

[0434] 在一些实施例中，本文所述的组合物(例如，核酸或蛋白质)在包含可电离脂质的LNP中提供。在一些实施例中，可电离脂质是十七烷‑9‑基8‑((2‑羟乙基)(6‑氧代‑6‑(十一烷氧基)己基)氨基)辛酸酯(SM‑102)；例如，如US 9,867,888的实例1中所述(通过援引以其全文并入本文)。在一些实施例中，可电离脂质是9Z,12Z)‑3‑((4,4‑双(辛氧基)丁酰基)氧基)‑2‑((((3‑(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳‑9,12‑二烯酸酯(LP01)，例如，如WO 2015/095340(通过援引以其全文并入本文)的实例13中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是9‑((4‑二甲基氨基)丁酰基)氧基)十七烷二酸二((Z)‑壬‑2‑烯‑1‑基)酯(L319)，例如如US2012/0027803(通过援引以其全文并入本文)的实例7、实例8或实例9中合成的。在一些实施例中，可电离脂质是1,1'‑((2‑(4‑(2‑((2‑(双(2‑羟基十二烷基)氨基)乙基)(2‑羟基十二烷基)氨基)乙基)哌嗪‑1‑基)乙基)氮烷二基)双(十二烷‑2‑醇)(C12‑200)，例如，如WO 2010/053572(通过援引以其全文并入本文)的实例14和实例16中合成的。
在一些实施例中，可电离脂质是咪唑胆固醇酯(ICE)脂质(3S,10R,13R,17R)‑10,13‑二甲基‑17‑((R)‑6‑甲基庚‑2‑基)‑2,3,4,7,8,9,10,11,12,13,14,15,16,17‑十四氢‑lH‑环戊烯并[a]菲‑3‑基3‑(1H‑咪唑‑4‑基)丙酸酯，例如来自WO 2020/106946(通过援引以其全文并入本文)的结构(I)。

[0435] 在一些实施例中，可电离脂质可以是阳离子脂质、可电离阳离子脂质，例如可以根据pH以带正电荷的形式或中性形式存在的阳离子脂质，或可以容易地质子化的含胺脂质。在一些实施例中，阳离子脂质是例如在生理条件下能够带正电的脂质。示例性的阳离子脂质包括一个或多个带有正电荷的胺基。在一些实施例中，脂质颗粒包含与中性脂质、可电离含胺脂质、可生物降解的炔脂质、类固醇、包括多不饱和脂质的磷脂、结构脂质(例如固醇)、PEG、胆固醇和聚合物缀合脂质中的一种或多种配制的阳离子脂质。在一些实施例中，阳离子脂质可以是可电离的阳离子脂质。如本文所披露的示例性阳离子脂质可具有超过6.0的有效pKa。在实施例中，脂质纳米颗粒可包含具有与第一阳离子脂质不同的有效pKa(例如，大于第一有效pKa)的第二阳离子脂质。脂质纳米颗粒可包括40mol％至60mol％的包封在脂质纳米颗粒内或与脂质纳米颗粒缔合的阳离子脂质、中性脂质、类固醇、聚合物缀合脂质和治疗剂，例如本文所述的核酸(例如，RNA)。在一些实施例中，核酸与阳离子脂质共同配制。
核酸可以吸附到LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)的表面。在一些实施例中，核酸可以包封在LNP(例如包含阳离子脂质的LNP)中。在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含靶向部分，例如用靶向剂包被的靶向部分。在实施例中，LNP配制品是生物可降解的。在一些实施例中，包含一种或多种本文所述的脂质(例如式(i)、(ii)、(ii)、(vii)和/或(ix))的脂质纳米颗粒包封至少1％、至少5％、至少10％、至少20％、至少30％、至少40％、至少50％、至少60％、至少70％、至少80％、至少90％、至少92％、至少95％、至少97％、至少98％或100％的RNA分子。

[0436] 可用于脂质纳米颗粒配制品中的示例性可电离脂质包括但不限于通过援引并入本文的WO 2019051289的表1中所列的那些。另外的示例性脂质包括但不限于下式中的一种或多种：US2016/0311759的X；US20150376115或US2016/0376224中的I；US20160151284的I、II或III；US20170210967的I、IA、II或IIA；US20150140070的I‑c；US2013/0178541的A；US2013/0303587或US2013/0123338的I；US2015/0141678的I；US2015/0239926的II、III、IV或V；US2017/0119904的I；WO 2017/117528的I或II；US2012/0149894的A；US2015/0057373的A；WO 2013/116126的A；US2013/0090372的A；US2013/0274523的A；US2013/0274504的A；
US2013/0053572的A；W02013/016058的A；W02012/162210的A；US2008/042973的I；US2012/
01287670的I、II、III或IV；US2014/0200257的I或II；US2015/0203446的I、II或III；
US2015/0005363的I或III；US2014/0308304的I、IA、IB、IC、ID、II、IIA、IIB、IIC、IID或III‑XXIV；US2013/0338210的；W02009/132131的I、II、III或IV；US2012/01011478的A；US2012/
0027796的I或XXXV；US2012/0058144的XIV或XVII；US2013/0323269的；US2011/0117125的I；US2011/0256175的I、II或III；US2012/0202871的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、IX、X、XI、XII；US2011/0076335的I、II、III、IV、V、VI、VII、VIII、X、XII、XIII、XIV、XV或XVI；
US2006/008378的I或II；US2013/0123338的I；US2015/0064242的I或X‑A‑Y‑Z；US2013/
0022649的XVI、XVII或XVIII；US2013/0116307的I、II或III；US2013/0116307的I、II或III；
US2010/0062967的I或II；US2013/0189351的I‑X；US2014/0039032的I；US2018/0028664的V；US2016/0317458的I；US2013/0195920的I；US10,221,127的5、6或10；WO 2018/081480的III‑3；WO 2020/081938的I‑5或I‑8；US9,867,888的18或25；US2019/0136231的A；WO2020/
219876的II；US2012/0027803的1；US2019/0240349的OF‑02；US10,086,013的23；Miao等人(2020)的cKK‑E12/A6；WO 2010/053572的C12‑200；Dahlman等人(2017)的7C1；Whitehead等人的304‑O13或503‑O13；US9,708,628的TS‑P4C2；WO 2020/106946的I；WO2020/106946的I。

[0437] 在一些实施例中，可电离脂质是MC3(6Z,9Z,28Z,3lZ)‑三十七烷‑6,9,28,3l‑四烯‑l9‑基‑4‑(二甲基氨基)丁酸酯(DLin‑MC3‑DMA或MC3)，例如，如WO 2019051289A9(通过引用以其全文并入本文)的实例9中所述。在一些实施例中，可电离脂质是脂质ATX‑002，例如，如WO 2019051289A9(通过援引以其全文并入本文)的实例10中所述。在一些实施例中，可电离脂质是(l3Z,l6Z)‑A,A‑二甲基‑3‑壬基二十二‑l3,l6‑二烯‑l‑胺(化合物32)，例如，如WO 2019051289A9(通过援引以其全文并入本文)的实例11中所述。在一些实施例中，可电离脂质是化合物6或化合物22，例如，如WO 2019051289A9(通过援引以其全文并入本文)的实例12中所述。

[0438] 示例性非阳离子脂质包括但不限于二硬脂酰‑sn‑甘油基‑磷酸乙醇胺、二硬脂酰磷脂酰胆碱(DSPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPC)、二棕榈酰磷脂酰胆碱(DPPC)、二油酰磷脂酰胆碱(DOPG)、二棕榈酰磷脂酰甘油(DPPG)、二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)、棕榈酰油酰磷脂酰胆碱(POPC)、棕榈酰油酰磷脂酰乙醇胺(POPE)、二油酰‑磷脂酰乙醇胺4‑(N‑马来酰亚胺甲基)‑环己烷‑1‑羧酸酯(DOPE‑mal)、二棕榈酰磷脂酰乙醇胺(DPPE)、二肉豆蔻酰磷酸乙醇胺(DMPE)、二硬脂酰‑磷脂酰‑乙醇胺(DSPE)、单甲基‑磷脂酰乙醇胺(诸如16‑O‑单甲基PE)、二甲基‑磷脂酰乙醇胺(诸如16‑O‑二甲基PE)、l8‑l‑反式PE、l‑硬脂酰‑2‑油酰‑磷脂酰乙醇胺(SOPE)、氢化大豆磷脂酰胆碱(HSPC)、卵磷脂酰胆碱(EPC)、二油酰磷脂酰丝氨酸(DOPS)、神经鞘磷脂(SM)、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱(DMPC)、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油(DMPG)、二硬脂酰磷脂酰甘油(DSPG)、二芥酰基磷脂酰胆碱(DEPC)、棕榈酰油酰磷脂酰甘油(POPG)、二反油烯酰‑磷脂酰乙醇胺(DEPE)、卵磷脂、磷脂酰乙醇胺、溶血卵磷脂、溶血磷脂酰乙醇胺、磷脂酰丝氨酸、磷脂酰肌醇、鞘磷脂、卵鞘磷脂(ESM)、脑磷脂、心磷脂、磷脂酸、脑苷脂、双十六烷基磷酸、溶血磷脂酰胆碱、二亚油酰基磷脂酰胆碱或其混合物。应当理解，也可以使用其他二酰基磷脂酰胆碱和二酰基磷脂酰乙醇胺磷脂。这些脂质中的酰基基团优选为源自具有C10‑C24碳链的脂肪酸的酰基基团，例如月桂酰基、肉豆蔻酰基、棕榈酰基、硬脂酰基或油酰基。在某些实施例中，另外的示例性脂质包括但不限于通过援引并入本文的Kim等人(2020)dx.doi.org/10.1021/acs.nanolett.0c01386中描述的那些。在一些实施例中，这样的脂质包括发现会改善用mRNA进行肝转染的植物脂质(例如DGTS)。

[0439] 适用于脂质纳米颗粒中的非阳离子脂质的其他实例包括但不限于非磷脂质，例如硬脂胺、十二烷基胺、十六烷基胺、乙酰基棕榈酸酯、蓖麻酸甘油酯、硬脂酸十六烷基酯、肉豆蔻酸异丙酯、两性丙烯酸聚合物、三乙醇胺‑月桂基硫酸盐、烷基‑芳基硫酸盐、聚乙氧基化脂肪酸酰胺、双十八烷基二甲基溴化铵、神经酰胺、鞘磷脂等。其他非阳离子脂质在WO 2017/099823或美国专利公开US2018/0028664中描述，其内容通过援引以其全文并入本文。

[0440] 在一些实施例中，非阳离子脂质是油酸或通过援引以其全文并入的US2018/0028664的式I、II或IV的化合物。非阳离子脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的例如0‑30％(摩尔)。在一些实施例中，非阳离子脂质含量是脂质纳米颗粒中存在的总脂质的
5％‑20％(mol)或10％‑15％(mol)。在实施例中，可电离脂质与中性脂质的摩尔比为约2:1至约8:1(例如，约2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1或8:1)。

[0441] 在一些实施例中，脂质纳米颗粒不包含任何磷脂。

[0442] 在一些方面，脂质纳米颗粒可进一步包含诸如固醇的组分以提供膜完整性。可用于脂质纳米颗粒中的一种示例性固醇是胆固醇及其衍生物。胆固醇衍生物的非限制性实例包括极性类似物，诸如5a‑胆甾烷醇、53‑粪甾烷醇、胆甾醇基‑(2,‑羟基)‑乙基醚、胆甾醇基‑(4'‑羟基)‑丁基醚和6‑酮胆甾烷醇；非极性类似物，诸如5a‑胆甾烷、胆甾烯酮、5a‑胆甾烷酮、5p‑胆甾烷酮和胆甾醇癸酸酯；及其混合物。在一些实施例中，胆固醇衍生物是极性类似物，例如，胆甾醇基‑(4'‑羟基)‑丁基醚。示例性的胆固醇衍生物在PCT公开WO2009/127060和美国专利公开US2010/0130588中描述，其中每个通过引用以其全文并入本文。

[0443] 在一些实施例中，提供膜完整性的组分，诸如固醇，可占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0‑50％(摩尔)(例如，0‑10％、10％‑20％、20％‑30％、30％‑40％或40％‑50％)。在一些实施例中，这样的组分是脂质纳米颗粒的总脂质含量的20％‑50％(mol)、30％‑40％(mol)。

[0444] 在一些实施例中，脂质纳米颗粒可包含聚乙二醇(PEG)或缀合的脂质分子。通常，这些用于抑制脂质纳米颗粒的聚集和/或提供空间稳定。示例性的缀合脂质包括但不限于PEG‑脂质缀合物、聚噁唑啉(POZ)‑脂质缀合物、聚酰胺‑脂质缀合物(如ATTA‑脂质缀合物)、阳离子聚合物脂质(CPL)缀合物及其混合物。在一些实施例中，缀合脂质分子是PEG‑脂质缀合物，例如(甲氧基聚乙二醇)缀合脂质。

[0445] 示例性的PEG‑脂质缀合物包括但不限于PEG‑二酰基甘油(DAG)(如l‑(单甲氧基‑聚乙二醇)‑2,3‑二肉豆蔻酰甘油(PEG‑DMG))、PEG‑二烷氧基丙基(DAA)、PEG‑磷脂、PEG‑神经酰胺(Cer)、聚乙二醇化磷脂酰乙醇胺(PEG‑PE)、PEG琥珀酸二酰基甘油(PEGS‑DAG)(诸如4‑0‑(2',3'‑二(十四烷酰氧基)丙基‑l‑0‑(w‑甲氧基(聚乙氧基)乙基)丁二酸酯(PEG‑S‑DMG))、PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯、N‑(羰基‑甲氧基聚乙二醇2000)‑l,2‑二硬脂酰‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺钠盐或其混合物。另外的示例性PEG‑脂质缀合物例如在US5,885,6l3、US6,287,59l、

[0446] US2003/0077829、US2003/0077829、US2005/0175682、US2008/0020058、US2011/0117125、US2010/0130588、US2016/0376224、US2017/0119904和US/099823中描述，所有这些的内容通过引用以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG‑脂质是US2018/0028664的式III、III‑a‑I、III‑a‑2、III‑b‑1、III‑b‑2或V的化合物，其内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG‑脂质具有US20150376115或US2016/0376224的式II，两者的内容通过援引以其全文并入本文。在一些实施例中，PEG‑DAA缀合物可以是例如PEG‑二月桂基氧基丙基、PEG‑二肉豆蔻基氧基丙基、PEG‑二棕榈基氧基丙基或PEG‑二硬脂基氧基丙基。PEG‑脂质可以是以下的一种或多种：PEG‑DMG、PEG‑二月桂基甘油、PEG‑二棕榈酰甘油、PEG‑二硬脂基甘油、PEG‑二月桂基甘油脂酰胺、PEG‑二肉豆蔻基甘油脂酰胺、PEG‑二棕榈酰甘油脂酰胺、PEG‑二硬脂基甘油脂酰胺、PEG‑胆固醇(l‑[8'‑(胆甾‑5‑烯‑3[β]‑氧基)甲酰胺基‑3',
6'‑二氧杂辛基]氨基甲酰基‑[ω]‑甲基‑聚(乙二醇))、PEG‑DMB(3,4‑双十四烷氧基苄基‑[ω]‑甲基‑聚(乙二醇)醚)和1,2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺‑N‑[甲氧基(聚乙二醇)‑2000]。在一些实施例中，PEG‑脂质包含PEG‑DMG、1,2‑二肉豆蔻酰基‑sn‑甘油‑3‑磷酸乙醇胺‑N‑[甲氧基(聚乙二醇)‑2000]。在一些实施例中，PEG‑脂质包含选自以下的结构：

[0447]

[0448] 在一些实施例中，与PEG以外的分子缀合的脂质也可用于代替PEG‑脂质。例如，聚噁唑啉(POZ)‑脂质缀合物、聚酰胺‑脂质缀合物(如ATTA‑脂质缀合物)和阳离子聚合物脂质(GPL)缀合物可用于代替PEG‑脂质或与PEG‑脂质一起使用。

[0449] 示例性的缀合脂质，即PEG‑脂质、(POZ)‑脂质缀合物、ATTA‑脂质缀合物和阳离子聚合物‑脂质在WO 2019051289A9的表2中列出的PCT和LIS专利申请中描述，所有这些的内容通过援引以其全文并入本文。

[0450] 在一些实施例中，PEG或缀合脂质可以占脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0‑20％(摩尔)。在一些实施例中，PEG或缀合脂质的含量为脂质纳米颗粒中存在的总脂质的0.5％‑10％或2％‑5％(mol)。可电离脂质、非阳离子脂质、固醇和PEG/缀合脂质的摩尔比可以根据需要变化。例如，脂质颗粒可包含按组合物的摩尔或总重量计30％‑70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计0‑60％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计0‑30％的非阳离子脂质和按组合物的摩尔或总重量计1％‑10％的缀合脂质。优选地，组合物包含按组合物的摩尔或总重量计30％‑40％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计40％‑50％的胆固醇，和按组合物的摩尔或总重量计10％‑20％的非阳离子脂质。在一些其他实施例中，该组合物是按组合物的摩尔或总重量计50％‑75％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计
20％‑40％的胆固醇和按组合物的摩尔或总重量计5％至10％的非阳离子脂质以及按组合物的摩尔或总重量计1％‑10％的缀合脂质。该组合物可以含有按组合物的摩尔或总重量计
60％‑70％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计25％‑35％的胆固醇，以及按组合物的摩尔或总重量计5％‑10％的非阳离子脂质。该组合物还可含有按组合物的摩尔或总重量计至多90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％至15％的非阳离子脂质。配制品也可以是脂质纳米颗粒配制品，例如包含按组合物的摩尔或总重量计8％‑30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计5％‑30％的非阳离子脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计0‑20％的胆固醇；按组合物的摩尔或总重量计4％‑25％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计4％‑25％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％至25％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计10％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计5％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计2％‑30％的可电离脂质，按组合物的摩尔或总重量计2％‑30％的非阳离子脂质，按组合物的摩尔或总重量计1％至15％的胆固醇，按组合物的摩尔或总重量计2％至35％的缀合脂质，以及按组合物的摩尔或总重量计1％‑20％的胆固醇；或按组合物的摩尔或总重量计甚至高达90％的可电离脂质和按组合物的摩尔或总重量计2％‑10％的非阳离子脂质，或按组合物的摩尔或总重量计甚至100％的阳离子脂质。在一些实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质、磷脂、胆固醇和聚乙二醇化脂质。在一些其他实施例中，脂质颗粒配制品包含摩尔比为60:38.5:1.5的可电离脂质、胆固醇和聚乙二醇化脂质。

[0451] 在一些实施例中，脂质颗粒包含可电离脂质、非阳离子脂质(例如磷脂)、固醇(例如胆固醇)和聚乙二醇化脂质，其中可电离脂质的脂质摩尔比在20至70摩尔％的范围内，目标为40‑60摩尔％，非阳离子脂质的摩尔百分比在0至30摩尔％的范围内，目标为0至15摩尔％，固醇的摩尔百分比在20至70摩尔％的范围内，目标为30至50摩尔％，并且聚乙二醇化脂质的摩尔百分比在1至6摩尔％的范围内，目标为2至5摩尔％。

[0452] 在一些实施例中，脂质颗粒包含摩尔比为50:10:38.5:1.5的可电离脂质/非阳离子脂质/固醇/缀合脂质。

[0453] 在一方面，本披露提供了包含磷脂、卵磷脂、磷脂酰胆碱和磷脂酰乙醇胺的脂质纳米颗粒配制品。

[0454] 在一些实施例中，还可以包括一种或多种另外的化合物。那些化合物可以单独施用，或者另外的化合物可以包括在本发明的脂质纳米颗粒中。换言之，除核酸或至少第二核酸之外，脂质纳米颗粒可含有不同于第一核酸的其他化合物。非限制性地，其他另外的化合物可以选自由以下组成的组：小的或大的有机分子或无机分子、单糖、二糖、三糖、寡糖、多糖、肽、蛋白质、其肽类似物和衍生物、肽模拟物、核酸、核酸类似物和衍生物、由生物材料制成的提取物，或其任何组合。

[0455] 在一些实施例中，通过添加LNP靶向结构域将LNP定向至特定组织。例如，可以将生物配体展示在LNP的表面，以增强与展示同源受体的细胞的相互作用，从而推动与细胞表达受体的组织的缔合和向其中的载物递送。在一些实施例中，生物配体可以是驱动递送至肝的配体，例如展示GalNAc的LNP促使核酸载物递送至展示无唾液酸糖蛋白受体(ASGPR)的肝细胞。Akinc等人Mol Ther[分子疗法]18(7):1357‑1364(2010)的工作传授了将三价GalNAc配体与PEG‑脂质缀合(GalNAc‑PEG‑DSG)以产生依赖于ASGPR的LNP以获得可观察的LNP载物效应(参见，例如，Akinc等人2010,同上的图6)。其他展示配体的LNP配制品，例如掺入叶酸、转铁蛋白或抗体的配制品，在WO 2017223135中进行了讨论，其通过引用以其全文并入本文，此外还有在其中使用的参考文献也并入本文：即，Kolhatkar等人,Curr Drug Discov Technol[当代药物发现技术].2011 8:197‑206；Musacchio和Torchilin,Front Biosci.[生物科学前沿]2011 16:1388‑1412；Yu等人,Mol Membr Biol.[分子膜生物学]2010 27:286‑298；Patil等人,Crit Rev Ther Drug Carrier Syst[治疗性药物载剂系统的重要评论].200825:1‑61；Benoit等人,Biomacromolecules[生物大分子].2011 12:2708‑2714；
Zhao等人,Expert Opin Drug Deliv[药物递送专家观点].2008 5:309‑319；Akinc等人,Mol Ther[分子疗法].2010 18:1357‑1364；Srinivasan等人,Methods Mol Biol[分子生物学方法].2012820:105‑116；Ben‑Arie等人,Methods Mol Biol[分子生物学方法].2012 
757:497‑507；Peer 2010J Control Release[控释杂志].20:63‑68；Peer等人,Proc Natl Acad Sci U S A.[美国国家科学院院刊]2007 104:4095‑4100；Kim等人,Methods Mol Biol.[分子生物学方法]2011 721:339‑353；Subramanya等人,Mol Ther[分子疗法].2010 
18:2028‑2037；Song等人,Nat Biotechnol.[自然生物技术]2005 23:709‑717；Peer等人,Science[科学].2008 319:627‑630；以及Peer和Lieberman,Gene Ther[基因疗法].2011 
18:1127‑1133。

[0456] 在一些实施例中，通过将选择性器官靶向(Selective ORgan Targeting，SORT)分子添加至包含传统组分(例如可电离的阳离子脂质、两亲性磷脂、胆固醇和聚(乙二醇)(PEG))的配制品中来针对组织特异性活性对LNP进行选择。Cheng等人Nat Nanotechnol[自然纳米技术]15(4):313‑320(2020)的传授内容证明，添加补充的“SORT”组分可根据SORT分子的百分比和生物物理特性精确地改变体内RNA递送谱并介导组织特异性(例如，肺、肝、脾脏)基因递送和编辑。

[0457] 在一些实施例中，LNP包含生物可降解的可电离脂质。在一些实施例中，LNP包含(9Z,l2Z)‑3‑((4,4‑双(辛氧基)丁酰基)氧基)‑2‑((((3‑(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基十八碳‑9,l2‑二烯酸酯，也称为3‑((4,4‑双(辛氧基)丁酰基)氧基)‑2‑((((3‑(二乙基氨基)丙氧基)羰基)氧基)甲基)丙基(9Z,l2Z)‑十八碳‑9,l2‑二烯酸酯)或另一种可电离脂质。参见，例如WO 2019/067992、WO/2017/173054、WO 2015/095340和WO 2014/136086，以及其中提供的参考文献的脂质。在一些实施例中，在LNP脂质的上下文中术语阳离子和可电离是可互换的，例如，其中可电离脂质根据pH是阳离子的。

[0458] 在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以在数十nm和数百nm之间，例如通过动态光散射(DLS)测量的。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可以为约40nm至约150nm，如约40nm、45nm、50nm、55nm、60nm、65nm、70nm、75nm、80nm、85nm、90nm、95nm、100nm、
105nm、110nm、115nm、120nm、125nm、130nm、135nm、140nm、145nm或150nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约50nm至约100nm、约50nm至约90nm、约50nm至约80nm、约
50nm至约70nm、约50nm至约60nm、约60nm至约100nm、约60nm至约90nm、约60nm至约80nm、约
60nm至约70nm、约70nm至约100nm、约70nm至约90nm、约70nm至约80nm、约80nm至约100nm、约
80nm至约90nm或约90nm至约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约70nm至约100nm。在特定的实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约80nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径可为约100nm。在一些实施例中，LNP配制品的平均LNP直径范围为约l mm至约500mm、约5mm至约200mm、约10mm至约100mm、约20mm至约80mm、约25mm至约60mm、约30mm至约55mm、约35mm至约50mm，或约38mm至约42mm。

[0459] 在一些情况下，LNP可以是相对均质的。多分散性指数可用于指示LNP的均质性，例如脂质纳米颗粒的粒度分布。小的(例如，小于0.3)多分散性指数通常指示窄的粒度分布。LNP的多分散性指数可为约0至约0.25，如0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、
0.09、0.10、0.11、0.12、0.13、0.14、0.15、0.16、0.17、0.18、0.19、0.20、0.21、0.22、0.23、
0.24或0.25。在一些实施例中，LNP的多分散性指数可为约0.10至约0.20。

[0460] LNP的ζ电位可用于指示组合物的电动电位。在一些实施例中，ζ电位可以描述LNP的表面电荷。具有相对低电荷(正电荷或负电荷)的脂质纳米颗粒通常是期望的，因为更高电荷的物质可能不理想地与体内的细胞、组织和其他元素相互作用。在一些实施例中，LNP的ζ电位可为约‑10mV至约+20mV、约‑10mV至约+15mV、约‑10mV至约+10mV、约‑10mV至约+5mV、约‑10mV至约0mV、约‑10mV至约‑5mV、约‑5mV至约+20mV、约‑5mV至约+15mV、约‑5mV至约+10mV、约‑5mV至约+5mV、约‑5mV至约0mV、约0mV至约+20mV、约0mV至约+15mV、约0mV至约+
10mV、约0mV至约+5mV、约+5mV至约+20mV、约+5mV至约+15mV或约+5mV至约+10mV。

[0461] 蛋白质和/或核酸的包封效率描述了相对于所提供的初始量，在制备后被包封或以其他方式与LNP缔合的蛋白质和/或核酸的量。包封效率理想的是较高(例如，接近100％)。包封效率可以例如通过比较在用一种或多种有机溶剂或去垢剂破碎脂质纳米颗粒之前和之后含有脂质纳米颗粒的溶液中蛋白质或核酸的量来测量。阴离子交换树脂可用于测量溶液中游离蛋白质或核酸(例如RNA)的量。荧光可用于测量溶液中游离蛋白质和/或核酸(例如RNA)的量。对于本文所述的脂质纳米颗粒，蛋白质和/或核酸的包封效率可以是至少50％，例如50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％。在一些实施例中，包封效率可以是至少80％。在一些实施例中，包封效率可以是至少90％。在一些实施例中，包封效率可以是至少95％。

[0462] LNP可以任选地包含一层或多层包衣。在一些实施例中，LNP可以配制在具有包衣的胶囊、膜或片剂中。包含本文所述的组合物的胶囊、膜或片剂可具有任何可用的尺寸、拉伸强度、硬度或密度。

[0463] 另外的示例性脂质、配制品、方法和LNP表征由WO 2020061457传授，其通过引用以其全文并入本文。

[0464] 在一些实施例中，使用Lipofectamine MessengerMax(赛默飞世尔(Thermo Fisher))或TransIT‑mRNA转染试剂(米卢斯生物(Mirus Bio))进行体外或离体细胞脂质体转染。在某些实施例中，使用GenVoy_ILM可电离脂质混合物(精密纳米系统(Precision NanoSystems))配制LNP。在某些实施例中，使用2,2‑二亚油烯基‑4‑二甲基氨基乙基‑[1,3]‑二氧戊环(DLin‑KC2‑DMA)或二亚油烯基甲基‑4‑二甲基氨基丁酸酯(DLin‑MC3‑DMA或MC3)配制LNP，其配制和体内用途在Jayaraman等人Angew Chem Int Ed Engl[德国应用化学]51(34):8529‑8533(2012)中传授，其通过援引以其全文并入本文。

[0465] 优化用于递送CRISPR‑Cas系统(例如Cas9‑gRNA RNP、gRNA、Cas9 mRNA)的LNP配制品在两者均通过引用并入的WO 2019067992和WO 2019067910中描述。

[0466] 可用于递送核酸的另外的特定LNP配制品在两者均通过引用并入的US8158601和US8168775中描述，其包括帕替西兰(patisiran)中使用的以名称ONPATTRO销售的配制品。

[0467] 包含本文所述的RNA组合物的LNP的示例性剂量可包括约0.1、0.25、0.3、0.5、1、2、3、4、5、6、8、10或100mg/kg(RNA)。包含编码系统的一种或多种组分的核酸的AAV的示例性给药可包括约1011、1012、1013和1014vg/kg的MOI。

[0468] 在一些实施例中，本发明包括脂质纳米颗粒(LNP)，其包含本文所述的ANDbody多肽(或编码其的RNA)、核酸分子或编码本文所述的ANDbody的DNA。在实施例中，LNP包含阳离子脂质。在一些实施例中，LNP进一步包含一种或多种中性脂质，例如DSPC、DPPC、DMPC、DOPC、POPC、DOPE、SM，类固醇，例如胆固醇，和/或一种或多种聚合物缀合的脂质，例如聚乙二醇化脂质，例如PEG‑DAG、PEG‑PE、PEG‑S‑DAG、PEG‑cer或PEG二烷氧基丙基氨基甲酸酯。在一些实施例中，LNP的阳离子脂质具有根据以下的结构：

[0469]

[0470] 有关LNP的综述，另参见Li等人2017,Nanomaterials[纳米材料]7,122；doi:10.3390/nano7060122。

[0471] 其他载剂

[0472] 病毒载体

[0473] 本文所述的组合物(例如，多肽或RNA ANDbody组合物)可以通过病毒载体(例如，表达RNA的病毒载体)递送。病毒载体可以施用于细胞或受试者(例如，人受试者或非人动物)。病毒载体可以局部或全身施用。

[0474] 病毒载体的实例包括逆转录病毒(例如，逆转录病毒科病毒载体)、腺病毒(例如Ad5、Ad26、Ad34、Ad35和Ad48)、细小病毒(例如，腺相关病毒)、冠状病毒、负链RNA病毒(诸如正粘病毒(例如流感病毒)、弹状病毒(例如狂犬病和水泡性口炎病毒)、副粘病毒(例如麻疹和仙台病毒))、正链RNA病毒(诸如微核糖核酸病毒和甲病毒)、以及双链DNA病毒(包括腺病毒、疱疹病毒(例如单纯疱疹病毒1型和2型、爱泼斯坦‑巴尔病毒、巨细胞病毒、复制缺陷疱疹病毒)和痘病毒(例如牛痘、改良安卡拉牛痘(MVA)、鸡痘和金丝雀痘))。其他病毒包括例如诺沃克病毒、披膜病毒、黄病毒、呼肠孤病毒、乳多空病毒、肝炎病毒、人乳头瘤病毒、人泡沫病毒和肝炎病毒。逆转录病毒的实例包括：禽白血病肉瘤，禽C型病毒，哺乳动物C型病毒、B型病毒、D型病毒，致癌反转录病毒，HTLV‑BLV群，慢病毒，α逆转录病毒，γ逆转录病毒，泡沫病毒(Coffin,J.M.,Retroviridae:The viruses and their replication[逆转录病毒：病毒及其复制],Virology[病毒学](第三版)Lippincott‑Raven[利平科特‑瑞文],费城,
1996)。其他实例包括鼠白血病病毒、鼠肉瘤病毒、小鼠乳腺肿瘤病毒、牛白血病病毒、猫白血病病毒、猫肉瘤病毒、禽白血病病毒、人T细胞白血病病毒、狒狒内源病毒、长臂猿白血病病毒、梅森辉瑞(Mason Pfizer)猴病毒、猴免疫缺陷病毒、猴肉瘤病毒、劳斯肉瘤病毒和慢病毒。载体的其他实例描述于例如美国专利号5,801,030中，其教导以引用的方式并入本文。

[0475] 指环病毒载体还可用于递送本文所述的ANDbody组合物。指环载体是本领域已知的并且描述于例如WO 2020123773、WO 2020123816、WO 2018232017和WO 2020123773中。在某些实施例中，指环载体组合物包含基因组元件，所述基因组元件包含与编码本文所述的ANDbody的核酸序列可操作地连接的启动子，所述遗传元件被包含指环病毒ORF1例如指环病毒衣壳蛋白的蛋白质外部包封。

[0476] 基于细胞和囊泡的载剂

[0477] 本文所述的组合物(例如，多肽或RNA ANDbody组合物)本文所述可以施用于细胞、囊泡或其他基于膜的载剂中的细胞。在一个实施例中，本文所述的组合物和系统可以配制在脂质体或其他类似的囊泡中。脂质体是球形囊泡结构，这些球形囊泡结构由围绕内部水性隔室的单层或多层的脂质双层和相对不可渗透的外部亲脂性磷脂双层构成。脂质体可以是阴离子的、中性的或阳离子的。脂质体具有生物相容性，无毒，可以递送亲水性和亲脂性药物分子，保护其货物免受血浆酶的降解，并将其负载运输穿过生物膜和血脑屏障(BBB)(有关综述，参见，例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。囊泡可以由若干种不同类型的脂质制成；然而，磷脂最常用于生成脂质体作为药物载剂。用于制备多层囊泡脂质的方法是本领域已知的(参见例如美国专利号6,693,086，其关于多层囊泡脂质制备的传授内容通过援引并入本文)。尽管当脂质膜与水溶液混合时，囊泡形成可以是自发的，但也可以通过经由使用均质器、超声波仪或挤压设备以振荡的形式施加力来加快囊泡形成(关于综述，参见例如，Spuch和Navarro,Journal of Drug Delivery[药物递送杂志],第2011卷,文章ID 469679,第12页,2011.doi:10.1155/2011/469679)。可以通过挤出通过具有减小尺寸的过滤器来制备挤出的脂质，如Templeton等人,Nature Biotech[自然生物技术],15:
647‑652,1997中所述，该文献关于挤出脂质制备的传授内容通过援引并入本文。

[0478] 外泌体也可用作本文所述的组合物和系统的药物递送媒介物。对于综述，参见Ha等人2016年7月.Acta Pharmaceutica Sinica B[药学学报]第6卷第4期,第287‑296页；https://doi.org/10.1016/j.apsb.2016.02.001。

[0479] 离体分化的红细胞也可以用作本文所述的药剂(例如，抑制剂)，例如本文所述的抗体或核酸的载剂。参见，例如，WO 2015073587；WO 2017123646；WO 2017123644；WO 2018102740；WO 2016183482；WO 2015153102；WO 2018151829；WO 2018009838；Shi等人
2014.Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]111(28):10131‑10136；美国专利
9,644,180；Huang等人2017.Nature Communications[自然通讯]8:423；Shi等人2014.Proc Natl Acad Sci USA.[美国国家科学院院刊]111(28):10131‑10136。

[0480] 融合体组合物，例如，如WO 2018208728中所述，也可用作载剂以递送本文所述的[药剂]或制剂。

[0481] 例如如WO 2011097480、WO 2013070324、WO 2017004526、或WO 2020041784中所述的植物纳米囊泡和植物信使包(PMP)也可以用作递送本文所述的组合物的载剂。

[0482] 无需进一步详细阐述，相信本领域的普通技术人员可以基于以上描述在其最大程度上利用本发明。因此以下特定实施例将被解释为仅是说明性的，并且无论如何并非以任何方式限制本公开的其余内容。出于本文引用的目的或主题，本文引用的所有出版物及其章节均通过引用并入本文。

[0483] 实例

[0484] 本发明将在以下非限制性实例中进一步说明。

[0485] 目录

[0486]

[0487]

[0488] 实例1.ANDBODY结合小鼠和人RAGE和NOTCH2

[0489] 1.1接种疫苗以产生抗RAGE抗体

[0490] 针对人RAGE细胞外结构域(本技术的示例性地址靶标)的抗体是通过免疫产生的。与人IgG1 Fc区(UniProt ID P01857位置P100‑K330)融合的人RAGE细胞外结构域(NCBI蛋白登录号Q15109位置N24‑A344)(huRAGE)在HEK293F细胞中表达。简而言之，DNA序列针对哺乳动物表达进行了密码子优化，并在pcDNA3.4‑TOPO表达载体(赛默飞世尔科技公司(ThermoFisher Scientific))中订购。将蛋白质瞬时转染至HEK293细胞中，并根据制造商的说明(通用健康医疗集团(GE Healthcare))使用rProtein A Sepharose Fast Flow树脂类似于现有技术方法(Rothschilds等人2019)进行纯化。使用50ug huRAGE‑Fc融合蛋白通过在CFA/IFA(密理博西格玛公司(Millipore Sigma)，目录号F5881‑10ML和F5506‑10ML)佐剂中腹腔注射免疫雌性BALB/c小鼠。随后，产生杂交瘤(Listek等人2020)。首先以ELISA形式筛选对用于免疫的huRAGE‑Fc融合蛋白具有特异性IgG反应性的克隆，然后使用稳定(CHO)或瞬时(HEK293F)转染全长huRAGE的细胞进行流式细胞术研究。接下来根据鼠交叉反应性评估抗RAGE杂交瘤克隆。使用稳定(CHO)或瞬时(HEK293F)转染全长小鼠RAGE(mRAGE)的细胞进行流式细胞术研究，并选择与mRAGE结合的克隆。然后通过有限稀释克隆进一步纯化表达在人和小鼠之间具有交叉反应性的抗RAGE mAb的阳性克隆。杂交瘤在DMEM/2％超低IgG血清中生长，并根据制造商的说明(密理博西格玛公司，P3296‑1ML)通过蛋白G色谱法纯化mAb。

[0491] 1.2选择惰性抗RAGE抗体

[0492] 本技术的地址靶标结合位点被设计成在结合地址靶标(例如示例性RAGE地址靶标)后不影响信号传导。因此，根据如上所述产生的抗RAGE杂交瘤克隆不能阻断RAGE配体结合，进一步评估它们。测试的人RAGE配体包括HMGB1(全长，来自Creative BioMart公司目录号HMGB1‑29332TH)、高级糖基化终产物(与牛血清白蛋白融合，密理博西格玛公司目录号121800‑10MG‑M)、S100A12(全长，来自R&D系统公司目录号1052‑ER‑050)、S100A1(全长，来自R&D系统公司目录号9705‑S1‑100)、S100A4(R&D系统公司目录号4137‑S4‑050)、S100A10(全长，来自Creative BioMart公司目录号S100A10‑157H)、S100A11(R&D系统公司目录号
9015‑S11‑050)、S100A13(R&D系统公司目录号4327‑SA‑050)、S100B(R&D系统公司目录号
1820‑SB‑050)、淀粉样蛋白‑β‑肽(DAEFRHDSGYEVHHQKLVFFAEDVGSNKGAIIGLMVGGVVIA，来自NM_000484.2、密理博西格玛公司目录号AG912‑1MG)和Mac‑1(来自NP_001139280的F17‑N1105和来自UniProt P05107的Q23‑N700，R&D系统公司目录号4047‑AM‑050)。ELISA用于定量配体在抗RAGE抗体存在下的结合能力。HuRAGE‑Fc吸附到ELISA板上，然后封闭后，将板与来自杂交瘤的浓度为10fM至10uM的抗RAGE抗体克隆一起孵育(每个浓度和每个克隆一个条件)。洗涤板后，根据制造商的说明(赛默飞世尔公司(ThermoFisher)产品目录号21435)对每种配体进行生物素化，然后以10fM至10uM的浓度在板上孵育。洗涤后，添加SA连接的HRP二抗，然后添加TMB底物和通过吸光度定量比色读数。在有抗RAGE抗体相比于没有抗RAGE抗体情况下比较给定配体内的配体结合，以分离惰性且不影响一种或多种配体结合的抗RAGE克隆。

[0493] 还评估了抗RAGE抗体抑制IFNα诱导的基因特征的能力，并根据IFNα诱导的基因特征测定选择不改变细胞信号传导的抗RAGE杂交瘤克隆。用来自SLE患者的50％血清刺激来自健康人供体的PBMC 4小时。该测定在抗RAGE抗体或不相关(阴性)同种型对照人IgG1抗体(Bio X Cell目录号BE0297)存在下完成，抗体浓度范围为10fM至10uM。此外，使用huRAGE‑Fc融合分子作为阳性对照。纯化总RNA并如现有技术方法(WO 2008/137552 A2，https://patentimages.storage.googleapis.com/94/26/c8/7b9f27f693c4b6/WO 2008137552A2.pdf)那样通过实时qRT‑PCR分析测量I型IFN诱导基因(包括DDX58、G1P2、MXl、OAS3、RSAD2、IFITl、IFI35)的表达。将基因表达的抑制值针对阴性对照Ab进行归一化。

[0494] 1.3接种疫苗以产生抗Notch2抗体

[0495] 针对与人IgG1的Fc区融合的人Notch2的细胞外结构域(huNotch2)(本技术的示例性效应物靶标)的抗体通过类似于如上所述的RAGE的免疫来产生。免疫和杂交瘤生成后，与上述完全相同地进行克隆的筛选，但与全长人和小鼠Notch2(而不是RAGE)结合。然后通过有限稀释克隆进一步纯化表达在人和小鼠之间具有交叉反应性的抗Notch2 mAb的阳性克隆。杂交瘤在DMEM/2％超低IgG血清中生长，并通过蛋白G色谱法纯化mAb。

[0496] 1.4在宽IC50范围选择活性抗Notch2抗体

[0497] 本技术的效应物靶标结合位点，例如Notch2，被设计在结合效应物靶标后为不影响信号传导，除非它们通过地址靶标结合位点，例如RAGE定位于靶组织。因此，分析效应物靶标(例如，Notch2)结合位点的结合亲和力。具体而言，使用流式细胞仪评估Notch2抗体对与表面Notch2结合的配体人Jagged‑2‑Fc融合蛋白(Creative BioMart公司，JAG2‑382H)的IC50，以选择IC50在小于1nM至5uM范围内的抗体。根据制造商的说明(赛默飞世尔公司,A20186)和之前描述的方法(Tzeng等人2015)，Jagged‑2‑Fc用Alexa flor 647(AF647)进行标记。

[0498] HEK293F细胞瞬时转染全长huNotch2。将细胞与抗Notch2抗体一起孵育，浓度从1pM增加至50uM。随后(不洗涤细胞)，将细胞与恒定浓度的经AF647标记的Jagged‑2‑Fc在4摄氏度下孵育1小时，浓度范围(对于不同的IC50测定)从1pM至50uM。对于每个IC50测定，选择一个恒定浓度的AF647 Jagged‑2‑Fc和不同的抗Notch2。使用赛默飞世尔公司Attune NxT(B2R3Y3V6)通过流式细胞术对细胞上AF647 Jagged‑2‑Fc与增加的抗Notch2抗体浓度的结合进行定量。

[0499] 1.5将ANDbody作为双特异性物进行表达和纯化

[0500] 使用In‑Fusion HD克隆(宝生物公司(Takara Bio)，目录号638911)将IC50(从<1nM到5uM)范围内的10个RAGE抗体和10个Notch2抗体的DNA序列根据“受控Fab‑臂交换”(cFAE)方法(Labrijn等人，2014)克隆到人IgG1框架(在CH3结构域Fc区域中具有单匹配点突变)中。从瞬时HEK293表达中分别表达抗体并使用蛋白A亲和树脂纯化每种抗体后，根据cFAE方法将亲本抗体(1个RAGE抗体与1个Notch2抗体的组合)制成双特异性RAGE/Notch2 ANDbody。简而言之，亲本抗体在允许的氧化还原条件下混合，以实现半分子的重组。随后，除去还原剂以允许链间二硫键的再氧化。最后，使用基于色谱或基于质谱的方法定量交换效率。大约制作了RAGExNotch2的100个变体ANDbody。

[0501] 1.6ANDbody变体的亲和力

[0502] 为了鉴定满足所期望效应物靶标并满足地址靶标结合亲和力标准的ANDbodyTM变体，基于SPR的亲和力测量在25℃下在BIAcore型号2000或T100(Biacore/通用健康医疗集团，皮斯卡塔韦，新泽西州)上使用含有0.1mg/ml BSA(密理博西格玛公司目录号A9418)的HBS‑EP+缓冲液(思拓凡公司(Cytiva)目录号BR100669)作为运行缓冲液进行。传感器芯片蛋白A(思拓凡公司目录号29127557)用于捕获小鼠RAGE‑Fc、人RAGE‑Fc、小鼠Notch2‑Fc或人Notch2‑Fc。ANDbody以60至0.74nM的3倍稀释系列注射，并监测所有蛋白质的解离10分钟。动力学分析是通过使用制造商提供的BIAevaluation软件(Biacore)中的1:1Langmuir结合模型同时拟合传感图的缔合和解离相来完成的。每次分析中均应用双参考，以消除参考表面和仅缓冲液对照的背景应答。

[0503] 该测定可以定量评估每个ANDbody变体对RAGE和Notch2的亲和力。对RAGE的亲和力高于Notch2的ANDbody变体以及对Notch2没有亲和力差异或具有更高亲和力的变体用于后续体外和体内实验。

[0504] 1.7对有或没有RAGE表达的细胞上Notch2拮抗作用的体外测定

[0505] 为了分析ANDbody特征，在体外，HEK293F细胞用全长huRAGE(R+)或全长huNotch2(N+)瞬时转染，或用两者共转染(RN+)。根据制造商的说明(赛默飞世尔公司,A20186)和之前描述的方法(Tzeng等人2015)，许多变体RAGExNotch2ANDbody均使用Alexa flor 647(AF647)进行荧光团标记。随后，ANDbody与R+、N+、RN+或组合的R+加N+细胞一起孵育，ANDbody浓度范围为10fM至10uM。根据制造商的说明(赛默飞世尔公司，53027)，亲本抗Notch2单特异性抗体(每个变体各一个)用FITC进行荧光团标记。在某些条件下，将亲本抗Notch2 FITC标记抗体与预结合AF647 RAGExNotch2(匹配Notch2变体)的细胞以浓度为10fM至10uM一起孵育以饱和Notch2的剩余结合位点。使用流式细胞术对AF647标记的RAGExNotch2 ANDbody变体和亲本FITC标记的亲本抗Notch2抗体的结合EC50进行定量。当在AF647 RAGExNotch2之后添加FITC Notch2抗体时，从细胞上单独FITC Notch2的FITC信号中减去来自这些细胞的FITC信号(然后针对单独的Notch2信号进行标准化)，以定量RAGExNotch2结合的％Notch2。RAGExNotch2 ANDbody不同浓度下的这些数字用于创建EC50曲线。该测定还使用AF647标记的抗Notch2抗体替换AF647标记的ANDbody进行。

[0506] N+细胞相比于RN+细胞上观察到的EC50s的差异表明，当RAGE时存在增强的Notch2阻断，并鉴定出表达RAGExNotch2 ANDbody的细胞。

[0507] 1.8ANDbody和亲本抗体的生物分布(体内)

[0508] 为了分析ANDbody分布，在体内，RAGExNotch2 ANDbody以及每个亲本抗体(针对ANDbody的cFAE使用的抗Notch2或抗RAGE)的生物分布在雌性Balb/c和C57BL/6小鼠中进行定量。

[0509] 为了定量细胞生物分布，首先根据制造商的说明(赛默飞世尔公司,A20186)和之前描述的方法(Tzeng等人2015)用AF647单独标记蛋白质(ANDbody和抗体)。然后，以10ug、100ug和500ug IV(尾静脉)的剂量单独注射每种经标记的抗体。还注射等体积的盐水(PBS)作为对照。

[0510] 对于细胞生物分布，在注射后12小时、1天、2天、3天、7天和14天的时间点，使用CO2对小鼠实施安乐死，并根据之前描述的方法(Tzeng等人，2015)将包括心脏、肺、脾、血液、肾、肝和肠道在内的组织加工成单细胞悬浮液。简而言之，通过心脏穿刺将血液收集到EDTA处理的试管中(BD目录号365974)，并收获其他组织、称重、在毛玻璃载玻片之间机械分离，并通过70μm网筛(密理博西格玛公司，目录号CLS431751‑50EA)过滤制成单细胞悬浮液。脾细胞、全血和肺用氯化铵钾(ACK)裂解缓冲液(赛默飞世尔科技公司，目录号A1049201)处理。根据之前的方法(Covarrubias等人2019)，用胶原酶消化心脏并加工成单细胞悬浮液。使用CD8 T细胞(CD3e+CD8+)、CD4 T细胞(CD3e+CD4+Foxp3‑)、调节性T细胞(CD4+CD25+FOXP3+)、单核细胞/巨噬细胞(CD3e‑CD11b+CD11c‑/lo NK1.1‑Ly6G‑SSClo)、树突细胞(CD3e‑CD11chi)、NK细胞(NK1.1+CD3e‑)和NKT细胞(NK1.1+CD3e+)的标志物如前所述(Tzeng等人，2015)对免疫细胞进行流式细胞术。包括上皮细胞(CD326+CD31‑CD45‑)、内皮细胞(CD326‑CD31+CD45‑)和造血谱系(CD326‑CD31‑CD45+)的肺细胞也按照之前的定义(Singer等人2016)进行分析。抗体购自博奇公司(Biolegend)，流式细胞术在赛默飞世尔公司Attune NxT(B2R3Y3V6)上运行。细胞表面上标记的ANDbody或其他标记的抗体的存在由AF647的荧光来定义(并且在流动组中避免了该荧光团)。

[0511] 为了定量组织生物分布，首先按照制造商的说明用NHS‑5/6‑FAM(赛默飞世尔科技公司，目录号46409)单独标记蛋白质(ANDbody和抗体)。

[0512] 对于组织生物分布，在注射后12小时、1天、2天、3天、7天和14天的时间点，使用CO2对小鼠实施安乐死，收获包括肺、脾、血液、肾、肝和肠在内的组织，称重并在IVIS光谱成像系统(卡尺生命科学公司(Caliper Life Sciences)；激发，500nm；发射，540nm)上成像。使用Living Image软件对图像进行分析。

[0513] 1.9体内生物活性定量基因表达变化

[0514] 为了分析ANDbody活性，在体内，使用雌性Balb/c和C57BL/6小鼠对生物活性进行定量。为了定量跨组织的生物活性，以10ug、100ug和500ug IV(尾静脉)的剂量注射RAGExNotch2 ANDbody或各自的每种亲本抗体(针对ANDbody的cFAE使用的抗Notch2或抗RAGE)。还注射等体积的盐水(PBS)作为对照。

[0515] 在注射后12小时、1天、2天、3天、7天、14天时间点，根据之前描述的方法(Tzeng等人，2015)将肺、脾、血液、肾、肝、心脏、肠等组织加工成单细胞悬浮液。简而言之，通过心脏穿刺将血液收集到EDTA处理的试管中(BD目录号365974)，并收获其他组织、称重、在毛玻璃载玻片之间机械分离，并通过70μm网筛(密理博西格玛公司，目录号CLS431751‑50EA)过滤制成单细胞悬浮液。脾细胞和全血用氯化铵钾(ACK)裂解缓冲液(赛默飞世尔科技公司目录号A1049201)处理。

[0516] qRT‑PCR使用先前描述的方法(Nandagopal等人，2018)进行。使用RNeasy试剂盒(凯杰公司(QIAGEN))制备RNA。使用iScript cDNA合成试剂盒(伯乐公司(Bio‑Rad))从500ng RNA制备cDNA。每10μL RT‑qPCR反应混合物使用0.5μL cDNA，反应混合物中包含1X iqSYBR Green Supermix(伯乐公司)和450nM总正向和反向引物。反应在伯乐公司CFX实时PCR检测系统上使用2步扩增方案用以下热循环参数进行：95℃，3分钟，然后是40个循环的
95℃，10秒(熔化)和55℃，30秒(退火+延伸)。所有反应均一式两份进行。

[0517] 与Notch2信号传导相关的基因是小鼠Hes1、Hey1和HeyL，参考基因是SdhA。用于扩增的引物是先前已描述(Nandagopal等人，2018)的小鼠Hes1引物组(正向，5'‑CAACACGACACCGGACAAAC‑3'和反向，5'‑AAGAATAAATGAAAGTCTAAGCCAA‑3')，小鼠Hey1引物组(正向，5'‑GCCGAAGTTG CCCGTTATCT‑3'和反向，5′‑CGCTGGGATG CGTAGTTGTT‑3′)、小鼠HeyL引物组(正向，5′‑GAGCTGAC TTCCCACAACCA‑3′和反向，5′‑GAGAGG TGCCTTTGCGTAGA‑3′)和小鼠SdhA引物组(正向，5′‑AGTGGGCT GTCTTCCTTAAC‑3'和反向，5'‑GGATTGCTTCT GTTTGCTTGG‑3')。所有引物均购自IDT DNA公司。

[0518] 在ANDbody处理的小鼠、未处理的小鼠和抗Notch2处理的小鼠(包括肺中)中测量Hes1、Hey1和HeyL基因表达。

[0519] 1.10使用重量和组织学时的体内生物活性

[0520] 使用雌性Balb/c和C57BL/6小鼠，对脾、肾、肝、心脏、肠、牙齿和肺等器官进行组织学检查，以将病理学与ANDbody处理、单独使用抗Notch2或盐水(PBS)处理进行比较。从8周龄开始，每周1x或2x IV(尾静脉)注射10ug、100ug和500ug的ANDbody或相应的Notch2抗体(在cFAE之前)。还每周注射等体积1x或2x的盐水(PBS)作为对照。在第一次处理之前开始每周对小鼠称重2x。处理2周、4周和6周后，对小鼠实施安乐死，并对器官进行组织学处理。

[0521] 除非另有说明，否则将器官移入盒中，然后直接放入10％中性缓冲福尔马林(西格玛‑奥尔德里奇公司(Sigma‑Aldrich))中12‑24小时，然后包埋在石蜡中。将肺放入盒中浸泡在中性缓冲福尔马林中之前，先用10％中性缓冲福尔马林灌注。将肠彻底冲洗，然后放入盒中浸泡在10％中性缓冲福尔马林中。在组织化学染色之前切割石蜡切片(1‑2μm)并脱蜡。切片用苏木精/伊红(H&E；默克公司(Merck)，达姆施塔特，德国)染色，并根据免疫浸润和组织形态进行盲法评分。

[0522] 除了肺形态学之外，将ANDbody处理的小鼠在治疗过程中体重减轻(或不减轻)与用抗Notch2处理的小鼠体重减轻(或不减轻)以及未处理的小鼠的体重减轻(或不减轻)进行比较。

[0523] 实例2.ANDBODY结合小鼠和人UMOD和NOTCH2

[0524] 2.1酵母表面展示以产生抗UMOD抗体

[0525] 酵母表面展示(Chao等人，2006)用于工程改造针对小鼠UMOD(Creative BioMart公司，目录号UMOD‑17835M，未加标签)(本技术的示例性地址靶标)的抗体。这是通过使用之前描述(Angelini等人2015)并且总结如下的方法来完成的。酵母展示从Sidhu实验室的合成抗体库开始，该库基于天然框架文库“G”(Van Deventer等人，2015)。针对与小鼠UMOD的结合选择酵母表面上展示的scFv。随后可以针对人UMOD抗原(Creative BioMart公司，目录号UMOD‑001H，未加标签)进行分选，使得结合物可以在人和小鼠形式之间发生交叉反应。为了增加scFv结合物的亲和力，如前所述(Angelini等人，2015)使用易错PCR进行亲和力成熟，并针对与小鼠和人UMOD的结合对所得文库进行重新分选。经过工程改造后，许多具有多物种交叉反应性的scFv被克隆回人IgG1抗体形式。

[0526] 2.2选择惰性抗UMOD抗体

[0527] 本技术的地址靶标结合位点被设计成在结合地址靶标(例如示例性UMOD地址靶标)后不影响信号传导。因此，在诸如上述针对RAGE抗体的测定或体内测定中，根据抗UMOD抗体不能阻断UMOD配体结合来进一步评估它们。可以在这样的测定中鉴定惰性UMOD抗体，由此筛选的UMOD抗体不会影响或改变肾结构。

[0528] 2.3接种疫苗以产生抗Notch2抗体

[0529] 根据如上所述的现有技术方法，将与小鼠和人Notch2交叉反应的抗体创建、克隆到人IgG1框架中并表达。

[0530] 2.4在宽IC50范围选择活性Notch2抗体

[0531] 如上所述，针对Notch2的抗体将在宽IC50范围内进行选择。

[0532] 2.5将ANDbody作为双特异性物进行表达和纯化

[0533] 如上所述，将来自IC50(从<1nM至5uM)范围内的10个UMOD抗体和10个Notch2抗体的DNA序列制成约100个变体ANDbody。

[0534] 2.6ANDbody变体对UMOD和Notch2的亲和力

[0535] ANDbody对UMOD和Notch2的亲和力使用BIAcore与上述类似地进行评估(如上所述)。在这种情况下，人和小鼠版本的带His标签的UMOD固定在传感器芯片NTA(思拓凡公司目录号BR100034)上。人和小鼠notch2‑Fc如上所述被固定。

[0536] 2.7ANDbody和亲本抗体的生物分布(体内)

[0537] 使用上述方法进行细胞和组织生物分布研究(如上所述)。然而，这种情况中使用的ANDbody是UMODxNotch2，亲本抗体对应于抗UMOD和抗Notch2。

[0538] 2.8体内生物活性定量基因表达变化

[0539] 使用上述基因表达方法对UMODxNotch2 ANDbody的体内生物活性进行定量。

[0540] 2.9使用重量和组织学时的体内生物活性

[0541] 使用上述重量和组织学方法对UMODxNotch2 ANDbody的体内生物活性进行定量。

[0542] 实例3.ANDBODY结合小鼠和人MEP1B和NOTCH2

[0543] 3.1酵母表面展示以产生抗MEP1B抗体

[0544] 酵母表面展示(Chao等人，2006)用于工程改造针对小鼠MEP1B(库萨比奥公司(Cusabio)，CSB‑MP730755MO)(本技术的示例性地址靶标)的抗体。如上所述进行酵母展示(0)，以获得交叉反应性小鼠/人MEP1B结合物(人MEP1B，库萨比奥公司，CSB‑MP618098HU)。工程改造后，许多与小鼠和人MEP1B有交叉反应的scFv被克隆到人IgG1中，瞬时转染到HEK293F细胞中，并使用如上所述的地板A树脂进行纯化。

[0545] 3.2接种疫苗以产生抗Notch2抗体

[0546] 根据如上所述的现有技术方法，将与小鼠和人Notch2交叉反应的抗体创建、克隆到人IgG1框架中并表达。

[0547] 3.3在宽IC50范围选择活性Notch2抗体

[0548] 如上所述，针对Notch2的抗体在宽IC50范围内进行选择。

[0549] 3.4将ANDbody作为双特异性物进行表达和纯化

[0550] 如上所述，将来自IC50(从<1nM至5uM)范围内的10个MEP1B抗体和10个Notch2抗体的DNA序列制成约100个变体ANDbody。

[0551] 3.5ANDbody变体对MEP1B和Notch2的亲和力

[0552] ANDbody对MEP1B和Notch2的亲和力使用BIAcore与上述类似地进行评估。在这种情况下，人和小鼠版本的带His标签的MEP1B固定在传感器芯片NTA(思拓凡公司目录号BR100034)上。人和小鼠notch2‑Fc如上所述被固定。

[0553] 3.6ANDbody和亲本抗体的生物分布(体内)

[0554] 使用上述方法进行细胞和组织生物分布研究。然而，这种情况中使用的ANDbody是MEP1BxNotch2，亲本抗体对应于抗MEP1B和抗Notch2。

[0555] 3.7体内生物活性定量基因表达变化

[0556] 使用上述基因表达方法对MEP1BxNotch2 ANDbody的体内生物活性进行定量。

[0557] 3.8使用重量和组织学时的体内生物活性

[0558] 使用上述重量和组织学方法对MEP1BxNotch2 ANDbody的体内生物活性进行定量。

[0559] 实例4.ANDBODY结合小鼠和人RAGE和IL11RA

[0560] 4.1接种疫苗以产生抗RAGE抗体

[0561] 上文描述了接种疫苗以产生小鼠/人交叉反应性抗RAGE抗体的方法。

[0562] 4.2选择惰性抗RAGE抗体

[0563] 上文描述了选择惰性抗RAGE抗体的方法。

[0564] 4.3酵母表面展示以产生抗IL11Ra抗体

[0565] 与上文类似，使用酵母表面展示来产生与小鼠和人IL11Ra(本技术的示例性效应物靶标)交叉反应的不同亲和力的抗体。编码小鼠IL11Ra细胞外结构域(UniProt ID Q64385的位置24‑372)和人IL11Ra细胞外结构域(UniProt ID Q14626的位置24‑370)的DNA序列针对哺乳动物表达进行了密码子优化，并在pcDNA3.4‑TOPO表达载体(赛默飞世尔科技公司)中带C末端His标签订购。将蛋白质瞬时转染至HEK293F细胞中，并根据制造商的说明(克隆技术公司(Clontech))使用 金属亲和树脂类似于现有技术方法(Rothschilds等人2019)进行纯化。这些可溶性重组小鼠和人IL11Ra用作酵母表面展示的抗原。

[0566] 与小鼠和人IL11Ra有交叉反应的scFv被克隆到人IgG1中，瞬时转染到HEK293F细胞中，并使用如上所述的地板A树脂进行纯化。

[0567] 4.4在宽IC50范围选择活性抗IL11Ra抗体

[0568] 如上所述，使用流式细胞仪评估IL11Ra抗体对与表面IL11Ra结合的配体人IL11(R&D系统公司(R&D Systems)，目录号218‑IL‑025/CF)的IC50，以选择IC50在小于1nM至5uM范围内的抗体。在当前实例中，全长人IL11Ra瞬时转染至HEK293F细胞表面。使用之前实例中的方法，将IL11Ra抗体替换为Notch2抗体，并且将IL11替换为Jagged‑2‑Fc。

[0569] 4.5将ANDbody作为双特异性物进行表达和纯化

[0570] 如上所述，将来自IC50(从<1nM至5uM)范围内的10个RAGE抗体和10个IL11Ra抗体的DNA序列制成约100个变体ANDbody。

[0571] 4.6ANDbody变体对RAGE和IL11Ra的亲和力

[0572] ANDbody对RAGE和IL11Ra的亲和力使用BIAcore与上述类似地进行评估。在这种情况下，人和小鼠版本的带His标签的IL11Ra固定在传感器芯片NTA(思拓凡公司目录号BR100034)上，人和小鼠版本的RAGE‑Fc捕获在传感器芯片蛋白A上(思拓凡公司目录号29127557)。

[0573] 4.7对有或没有RAGE表达的细胞上IL11Ra拮抗作用的体外测定

[0574] 如上所述进行该测定，不同之处在于用全长人IL11Ra代替Notch2，以及用抗IL11Ra抗体代替抗Notch抗体。还使用相应的RAGExIL11Ra ANDbody。

[0575] 4.8ANDbody和亲本抗体的生物分布(体内)

[0576] 使用上述方法进行细胞和组织生物分布研究。然而，这种情况中使用的ANDbody是RAGExIL11Ra，亲本抗体对应于抗RAGE和抗IL11Ra。

[0577] 4.9RAGExIL11Ra ANDbody的体内生物活性

[0578] 响应于使用鼠IL11处理小鼠，心室和肾中的胶原蛋白含量都增加(Schafer等人，2017)。因此，测量胶原蛋白含量以定量ANDbody处理后IL11Ra生物活性的量。

[0579] 与现有技术方法类似(Schafer等人2017)，10周大的雄性C57BL/6小鼠每天皮下注射2ug小鼠IL11或相同体积的盐水，持续21天。小鼠IL11是通过以下来重组制备的：使用带C末端His标签的小鼠IL11序列(UniProt ID P47873)合成密码子优化的DNA，进行HEK293F瞬时转染，并如上所述用TALON树脂纯化带有is标签的IL11。从第一次IL11注射前3天开始，然后每周2x，IL11和盐水处理的小鼠接受由250ug ANDbody RAGExIL11Ra、单独的亲本抗IL11Ra或等体积的盐水(PBS)构成的治疗性IP注射。

[0580] IL11处理21天结束时，对小鼠实施安乐死，并使用Quickzyme总胶原蛋白测定试剂盒(Quickzyme Biosciences)和类似于现有技术方法(Schafer等人，2017年)基于羟脯氨酸的比色检测来定量肺、脾、血液、肾、肝、心脏和肠道中的总胶原蛋白量。

[0581] 实例5.ANDBODY结合小鼠和人UMOD和IL11RA

[0582] 5.1酵母表面展示以产生抗UMOD抗体

[0583] 如上所述选择抗UMOD(例如，地址靶标)抗体并克隆到人IgG1中。

[0584] 5.2选择惰性抗UMOD抗体

[0585] 在诸如上述的测定中，根据抗UMOD抗体不能阻断UMOD配体结合来进一步评估抗它们。

[0586] 5.3酵母表面展示以产生抗IL11Ra抗体

[0587] 如上所述，此处将使用上面在酵母表面展示中产生的相同IL11Ra抗体。与小鼠和人IL11Ra有交叉反应的scFv被克隆到人IgG1中，瞬时转染到HEK293F细胞中，并使用如上所述的地板A树脂进行纯化。

[0588] 5.4在宽IC50范围选择活性IL11Ra抗体

[0589] 上述方法用于选择不同IC50的IL11Ra抗体。

[0590] 5.5将ANDbody作为双特异性物进行表达和纯化

[0591] 如上所述，将来自IC50(从<1nM至5uM)范围内的10个UMOD抗体和10个IL11Ra抗体的DNA序列制成约100个变体ANDbody。

[0592] 5.6ANDbody变体对UMOD和IL11Ra的亲和力

[0593] ANDbody对UMOD和IL11Ra的亲和力使用BIAcore与上述类似地进行评估。在这种情况下，人和小鼠版本的带His标签的UMOD和带His标签的IL11Ra固定在传感器芯片NTA(思拓凡公司目录号BR100034)上。尽管所有变体都在未来的测定中进行了测试，但预计一些ANDbody变体对UMOD的亲和力高于对IL11Ra的亲和力。

[0594] 5.7ANDbody和亲本抗体的生物分布(体内)

[0595] 使用上述方法进行细胞和组织生物分布研究。然而，本实例中使用的ANDbody是UMODxIL11Ra，亲本抗体对应于抗UMOD和抗IL11Ra。

[0596] 5.8UMODxIL11Ra ANDbody的体内生物活性

[0597] 使用上述相同方法对UMODxIL11Ra ANDbody的体内生物活性进行定量。

[0598] 实例6.ANDBODY结合小鼠和人MEP1B和IL11RA

[0599] 6.1酵母表面展示以产生抗MEP1B抗体

[0600] 如上所述选择抗MEP1B(例如，地址靶标)抗体并克隆到人IgG1中。

[0601] 6.2酵母表面展示以产生抗IL11Ra抗体

[0602] 此处将使用上面在酵母表面展示中产生的相同IL11Ra(例如，效应物靶标)抗体。与小鼠和人IL11Ra有交叉反应的scFv被克隆到人IgG2中，瞬时转染到HEK293F细胞中，并使用如上所述的地板A树脂进行纯化。

[0603] 6.3在宽IC50范围选择活性抗IL11Ra抗体

[0604] 上述方法用于选择不同IC50的IL11Ra抗体。

[0605] 6.4将ANDbody作为与人IgG2的融合蛋白表达并纯化

[0606] 10个亲和力最高的MEP1B scFv和亲和力范围(从<1nM到5uM)的10个IL11Ra抗体制成与人IgG2 Fc区域的ANDbody。为此，将来自MEP1B变体的scFv序列分别克隆到IgG2 IL11Ra抗体变体上。MEP1B scFv通过柔性接头(3xGGGGS)与IL11Ra抗体轻链或重链的N或C末端分开(每个ANDbody有2个MEP1B scFv)。通过分别在重链或轻链的N末端之前和C末端之后克隆MEP1B scFv(始终由接头分开)，制备每个ANDbody有总共4个MEP1B scFv的变体。通过在以下混合和匹配IL11Ra抗体上scFv的位置，制备MEP1BxIL11Ra ANDbody上每个IL11Ra抗体有4个或更多个MEP1B scFv的其他变体：在重链和轻链的N末端；在重链和轻链的C末端；在重链的N末端和轻链的C末端；在重链的C末端和轻链的N末端；以及在3或4个不同位置有scFv的其他变体(分别产生每个ANDbody有总共6或8个scFv)。

[0607] 6.5ANDbody变体对MEP1B和IL11Ra的亲和力

[0608] ANDbody对MEP1B和IL11Ra的亲和力使用BIAcore与上述类似地进行评估。在这种情况下，人和小鼠版本的带His标签的MEP1B和带His标签的IL11Ra固定在传感器芯片NTA(思拓凡公司目录号BR100034)上。

[0609] 6.6ANDbody和亲本抗体的生物分布(体内)

[0610] 使用上述方法进行细胞和组织生物分布研究。然而，这种情况中使用的ANDbody是MEP1BxIL11Ra，亲本抗体对应于抗MEP1B和抗IL11Ra。

[0611] 6.7MEP1BxIL11Ra ANDbody的体内生物活性

[0612] 使用上述相同方法对MEP1BxIL11Ra ANDbody的体内生物活性进行定量。

[0613] 实例7.示例性的皮肤地址限制性结合剂

[0614] 本实例演示了抗DSG1抗体(地址结合物)在皮肤中的限制性表达。

[0615] 7.1抗DSG1单克隆抗体的表达和纯化

[0616] 编码命名为3‑09*5和3‑07/1e的两种抗桥粒黏蛋白‑1(抗DSG1)抗体的可变重链区(HC：SEQ ID NO:24和SEQ ID NO:26，见表4)的序列(Yamagami等人,J Immunol.[免疫学杂志],183(9):5615‑5621,2009)与具有效应物无效突变L234A、L235A和P329G(LALA‑PG)的人TMIgG 1(huIgG1)主链融合，并克隆到PCDNA3.4 载体(赛默飞世尔科技公司)中。将可变轻链区(SEQ ID NO:25和SEQ ID NO:27)与恒定κ轻链(对于3‑09*5)(SEQ ID NO:22)或恒定λ轻TM
链(对于3‑07/1e)(SEQ ID NO:23)融合并克隆到PCDNA3.4 中。

[0617] 为了表达和纯化抗体，使用EXPIFECTAMINETM 293转染试剂盒(赛默飞世尔科技公TM司)遵循制造商的建议将重链与轻链DNA按1:1的比例转染至EXPI293F 细胞(赛默飞世尔科技公司)中。转染后5天，通过滤出转染的细胞，从条件培养基中纯化瞬时表达的抗体。条件培养基与蛋白A琼脂糖珠一起孵育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涤结合的珠，然后用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的抗体，并用1/10体积的Tris pH 8.5中和。将中和的洗出液进行缓冲液交换至PBS中。所得mAb被命名为PRO003(3‑09*5HC)(重链序列：SEQ ID NO:
28；轻链序列：SEQ ID NO:29)和PRO004(3‑07/1e HC)(重链序列：SEQ ID NO:30；轻链序列：
SEQ ID NO:31)。

[0618] 通过分析型尺寸排阻色谱(SEC)分析纯化的mAb的单分散性，并通过SDS‑PAGE分析纯度。

[0619] 表4.PRO003和PRO004序列

[0620]

[0621]

[0622]

[0623] 7.2抗DSG1抗体PRO003和PRO004与细胞上表达的鼠DSG1结合

[0624] 根据制造商的方案，使用LIPOFECTAMINETM 3000(赛默飞世尔科技公司)在RAW 264.7细胞中瞬时表达在蛋白C末端具有c‑Myc表位标签的鼠DSG1(NCBI登录号NP_
034209.2)。通过固定和透化细胞，然后用抗c‑Myc抗体(生命技术公司(Life 
Technologies)A‑21281)染色并通过流式细胞术进行分析来确认DSG1的表达。PRO003和PRO004与转染小鼠DSG1的细胞特异性结合，证实它们具有预期的结合特异性，适合在小鼠中进行研究。

[0625] 7.3注射到小鼠中的抗DSG1抗体优先在皮肤中积聚

[0626] 为了证明与皮肤地址的结合会导致抗体在皮肤中积聚，根据制造商的说明(LI‑928‑38044)，将抗DSG1抗体PRO003和PRO004与近红外(IR)染料 800CW化学
缀合。

[0627] 通过尾静脉注射将经标记的抗体分别以3mg/kg的剂量水平施用于小鼠。将每种抗体施用给两组，每组3只小鼠，在给药后第3天和第7天将其安乐死。安乐死后，收集了9个器官(心脏、肺、胰腺、肾、小肠、大肠、皮肤、肝、胃)，并在 成像仪2
上测量每个组织的近IR荧光。为了对皮肤进行成像，将一块皮肤剃毛并收集大约1cm用于成像。将来自每只小鼠的样品按照标准格式排列并测量总荧光强度。通过测量总信号并减去局部背景，对每个器官的荧光强度进行定量和平均。在所有处理小鼠的肝中观察到高背景信号，因此肝被排除在分析之外。不希望受理论束缚，据信肝可以独立于抗体靶向而摄取荧光染料。同样，在所有组的胃中都观察到背景信号，包括未用任何抗体处理的小鼠。从喂给小鼠的食物中观察到荧光，因此胃被排除在分析之外。

[0628] 图5A和5B显示PRO003(图5A)和PRO004(图5B)跨组织的荧光信号。两种抗体的分布都强烈偏向皮肤。这些数据表明DSG1抗体可用作ANDbody优先皮肤靶向的地址。

[0629] 实例8.示例性的肺地址限制性结合剂

[0630] 本实例演示了抗RAGE抗体(地址结合物)在肺中的限制性表达。

[0631] 8.1抗RAGE单克隆抗体的表达和纯化

[0632] 编码命名为h11E6.8和XT‑M4(创造性实验室(Creative Biolabs))的两种抗RAGE mAb的可变重链区的序列(SEQ ID NO:32和SEQ ID NO:34，示于表5)与具有效应物无效突变L234A、L235A和P329G(LALA‑PG)的huIgG1主链融合，并克隆到PCDNA3.4TM载体(赛默飞世尔科技公司)中。将编码可变轻链区的序列(SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:35)与恒定κ轻链融合TM并克隆至PCDNA3.4 中。

[0633] 为了表达和纯化，使用EXPIFECTAMINETM 293转染试剂盒(赛默飞世尔科技公司)遵TM循制造商的建议将重链与轻链DNA按1:1的比例转染至EXPI293F 细胞(赛默飞世尔科技公司)中。转染后5天，通过滤出转染的细胞，从条件培养基中纯化瞬时表达的抗体。条件培养基与蛋白A琼脂糖珠一起孵育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涤结合的珠，然后用
0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的抗体，并用1/10体积的Tris pH8.5中和。将中和的洗出液进行缓冲液交换至PBS中。所得mAb被命名为PRO001(h11E6.8)(重链序列：SEQ ID NO:36；轻链序列：SEQ ID NO:37)和PRO002(XT‑M4)(重链序列：SEQ ID NO:38；轻链序列：SEQ ID NO:
39)。

[0634] 通过分析型尺寸排阻色谱分析纯化的mAb的单分散性，并通过SDS‑PAGE分析纯度。PRO001和PRO002高度单分散表达，并在SDS‑PAGE上以预期分子量解析。结合研究证实与RAGE抗原结合(未显示)。

[0635] 表5.PRO001和PRO002序列

[0636]

[0637]

[0638] 为了通过ELISA测试抗RAGE抗体的结合，将重组的带His标签的鼠RAGE蛋白(来自TM TM艾博抗公司(Abcam)的ab276858)以1μg/mL浓度包被在NUNC‑IMMUNO  MAXISORP  ELISA板上过夜。第二天，除去包被的抗原，并用1％无IgG的牛血清白蛋白(BSA)封闭孔，然后与11个四倍连续稀释(起始浓度为20nM)的抗RAGE抗体(PRO001和PRO002)一起孵育。使用过氧化物酶缀合的抗人IgG抗体以及四甲基联苯胺(TMB)和酸终止试剂检测结合的抗体。通过ELISA，PRO001和PRO002均以相似的亲和力结合鼠RAGE抗原，表观亲和力约为90pM，表明两种抗体都是紧密结合物。

[0639] 8.2抗RAGE抗体PRO001和PRO002与细胞上表达的鼠RAGE结合

[0640] 在细胞培养物中测试了PRO001和PRO002与小鼠RAGE的结合。为了确认两种抗体的TM结合活性和特异性，使用EXPIFECTAMINE (赛默飞世尔科技公司)根据制造商的方案在TM
EXPI293 细胞(赛默飞世尔科技公司)中瞬时表达在蛋白C末端带有c‑Myc表位标签的小鼠RAGE(NCBI登录号NP_031451.2)。通过固定和透化细胞，然后用抗c‑Myc抗体(生命技术公司A‑21281)染色并通过流式细胞术进行分析来确认RAGE的表达。两种抗体都与细胞上表达的鼠RAGE特异性结合，证实它们具有预期的结合特异性，适合在小鼠中进行研究。

[0641] 8.3注射到小鼠中的抗RAGE抗体优先在肺中积聚

[0642] 为了证明与肺地址的结合可以导致抗体在肺中积聚，将抗RAGE抗体PRO001和PRO002化学缀合至近IR染料，如实例7中所述。

[0643] 如实施例7中所述，通过尾静脉注射将经标记的抗体分别施用于小鼠并成像。图6A和6B显示了从用两种抗体处理的小鼠的组织中测量的荧光信号，每种抗体都经过归一化以使最亮的信号等于1。一组三只未经处理的小鼠被包括作为自发荧光的阴性对照。与测试的其他抗体相比，这两种抗体的分布强烈偏向肺。这些数据表明，与RAGE结合的两种抗体优先在肺中积聚，证明它们可以用作ANDbody优先肺靶向的地址。

[0644] 8.4抗RAGE抗体特异性积聚在肺泡细胞上

[0645] 单细胞表达分析表明，RAGE在1型肺泡细胞中特异表达，在2型肺泡细胞中表达较低。为了测试抗体可以寻址特定细胞类型的假设，通过尾静脉注射3mg/kg的PRO002对三只Balb/C小鼠进行处理。三只未处理的小鼠用作阴性对照。给药后三天，将小鼠安乐死，收集肺和其他组织，并将所有组织固定在福尔马林中。使用与辣根过氧化物酶缀合的抗人二抗通过免疫组织化学(IHC)分析每个组织的切片。图7显示了处理和未处理小鼠的代表性染色。在用PRO002处理的小鼠的肺泡组织中观察到强染色，但在邻近气道或阴性对照条件下没有。该结果表明，针对特定细胞类型的特异性地址的结合物可用于将抗体分配至较大组织内的那些细胞。

[0646] 实例9.示例性的肾地址限制性结合剂

[0647] 本实例演示了抗CDH16抗体(地址结合物)在肾中的限制性表达。

[0648] 9.1抗CDH16单克隆抗体的表达和纯化

[0649] 将编码抗钙粘蛋白16(抗CDH16)mAb Ab270263(艾博抗公司)的可变重链区(SEQ ID NO:40；示于表6)的序列与具有效应物无效突变L234A、L235A和P329G(LALA‑PG)的huIgG1主链融合，并克隆到PCDNA3.4TM载体(赛默飞世尔科技公司)中。将编码可变轻链区TM的序列(SEQ ID NO:41)与恒定κ轻链融合并克隆到PCDNA3.4 中。

[0650] 为了表达和纯化，使用EXPIFECTAMINETM转染试剂盒(赛默飞世尔科技公司)遵循制TM造商的建议将重链与轻链DNA按1:1的比例转染至EXPI293F 细胞(赛默飞世尔科技公司)中。转染后5天，通过滤出转染的细胞，从条件培养基中纯化瞬时表达的抗体。条件培养基与蛋白A琼脂糖珠一起孵育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涤结合的珠，然后用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的抗体，并用1/10体积的Tris pH 8.5中和。将中和的洗出液进行缓冲液交换至PBS中。所得mAb被命名为PRO056(重链序列：SEQ ID NO:42；轻链序列：SEQ ID NO:43)。

[0651] 通过分析型尺寸排阻色谱分析纯化的mAb的单分散性，并通过SDS‑PAGE分析纯度。PRO056高度单分散表达，并在SDS‑PAGE上以预期分子量解析。

[0652] 表6.PRO056序列

[0653]

[0654] 为了通过ELISA测试抗CDH16抗体的结合，将内部表达和纯化的重组的带His标签TM TM的鼠CDH16蛋白以1μg/mL浓度包被在NUNC‑IMMUNO  MAXISORP  ELISA板上过夜。第二天，除去包被的抗原，用1％无IgG的BSA封闭孔，然后与11个三倍连续稀释(起始浓度为533nM)的抗CDH16抗体(PRO056)一起孵育。使用过氧化物酶缀合的抗人IgG抗体以及TMB和酸终止试剂检测结合的抗体。通过ELISA，PRO056以200pM的亲和力结合鼠CDH16抗原。

[0655] 9.2抗CDH16抗体优先在肾中积聚

[0656] 将抗CDH16抗体PRO056化学缀合至近IR荧光染料 800CW，如实例7中所述。通过尾静脉注射将经标记的抗体以3mg/kg的剂量水平施用于小鼠。使用两组，每组3只小鼠，在给药后第3天和第7天将其安乐死。安乐死后，收集器官，并在型号 成像仪上测量每个组织的近IR荧光，如上所述。通过测量总信号并减去局部
背景，对每个器官的荧光强度进行定量和平均。图8显示了从用PRO056处理的小鼠的组织中测量到的荧光信号。每个信号都经过归一化，以便最亮的信号等于1。一组三只未经处理的小鼠被包括作为自发荧光的阴性对照。

[0657] 当与本文提供的靶向皮肤、肺或肾中的地址的抗体相比时，该分布强烈偏向肾。这些数据表明，与CDH16结合的抗体优先在肾中积聚，表明它们可以用作ANDbody优先肾靶向的地址竞价结构域。

[0658] 实例10.示例性的肠地址限制性结合剂

[0659] 本实例演示了抗CDH17抗体(地址结合物)在肠中的限制性表达。

[0660] 10.1抗CDH17单克隆抗体的表达和纯化

[0661] 将编码抗钙粘蛋白17(抗CDH17)mAb MAB8524(R&D系统公司)的可变重链区(SEQ ID NO:44；示于表7)的序列与具有效应物无效突变L234A、L235A和P329G(LALA‑PG)的huIgG1主链融合，并克隆到PCDNA3.4TM载体(赛默飞世尔科技公司)中。将编码可变轻链区TM的序列(SEQ ID NO:45)与恒定κ轻链融合并克隆到PCDNA3.4 中。

[0662] 为了表达和纯化，使用EXPIFECTAMINETM 293转染试剂盒(赛默飞世尔科技公司)遵TM循制造商的建议将重链与轻链DNA按1:1的比例转染至EXPI293F 细胞(赛默飞世尔科技公司)中。转染后5天，通过滤出转染的细胞，从条件培养基中纯化瞬时表达的抗体。条件培养基与蛋白A琼脂糖珠一起孵育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涤结合的珠，然后用
0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的抗体，并用1/10体积的Tris pH 8.5中和。将中和的洗出液进行缓冲液交换至PBS中。所得mAb被命名为PRO061(重链序列：SEQ ID NO:46；轻链序列：SEQ ID NO:47)。

[0663] 通过分析型尺寸排阻色谱分析纯化的mAb的单分散性，并通过SDS‑PAGE分析纯度。PRO061高度单分散表达，并在SDS‑PAGE上以预期分子量解析。

[0664] 表7.PRO061序列

[0665]

[0666] 为了确认结合活性和特异性，根据制造商的方案，使用LIPOFECTAMINETM 3000(赛默飞世尔科技公司)在RAW 264.7细胞中瞬时表达在蛋白C末端具有c‑Myc表位标签的小鼠CDH17(NCBI登录号NP_062727.1)。通过固定和透化细胞，然后用抗c‑Myc抗体(生命技术公司(Life Technologies)A‑21281)染色并通过流式细胞术进行分析来确认CDH17的表达。PRO061与转染小鼠CDH17的细胞特异性结合，证实它具有预期的结合特异性，适合在小鼠中进行研究。

[0667] 10.2注射到小鼠中的抗CDH17抗体优先在肠中积聚

[0668] 将PRO061化学缀合至近IR荧光染料 800CW，如实例7中所述。通过尾静脉注射将经标记的抗体以3mg/kg的剂量水平施用于小鼠。使用两组，每组3只小鼠，在给药后第3天和第7天将其安乐死。安乐死后，收集器官，并在型号 成像仪
上测量每个组织的近IR荧光，如上所述。通过测量总信号并减去局部
背景，对每个器官的荧光强度进行定量和平均。图9显示了从用PRO061处理的小鼠的组织中测量到的荧光信号。每个信号都经过归一化，以便最亮的信号等于1。一组三只未经处理的小鼠被包括作为自发荧光的阴性对照。该分布强烈偏向肠，表明与CDH17结合的抗体优先在肠中积聚，并且可以用作ANDbody优先肠靶向的地址靶向结构域。

[0669] 实例11.预测地址的组织限制

[0670] 对安装在载玻片上的新鲜冷冻(FF)健康小鼠组织微阵列(TMA)切片进行免疫组织化学(IHC)，用于分析预测的器官特异性或优先表达的地址实际上在预定器官中是否具有最高丰度，并用于确定哪种单克隆抗体克隆(mAb)最优先地与所期望器官结合。

[0671] 通过首先组装新鲜冷冻组织微阵列块来生成包被有FF TMA的载玻片。为了能够形成TMA块，将新鲜处死的C57BL/6小鼠的各个器官包埋在单独冷冻模具中的最佳切割(OCT)介质中并冷冻。然后从每个块中取出圆柱形组织核心并放入块中以创建最终的FF TMA。然后使用低温恒温器切下TMA的层，装载到带正电的显微镜载玻片上，并储存在‑80℃下直至染色。

[0672] 通过将FF TMA包被的载玻片与针对相关地址产生的多克隆抗体或mAb直接结合来验证地址。这些地址特异性抗体是用辣根过氧化物酶(HRP)缀合的抗体检测的，这些抗体对产生主要地址特异性抗体的宿主的IgG具有特异性。结合的位置和强度通过添加HRP底物3,3'二氨基联苯胺(DAB)来确定，在一抗结合位点会产生棕色，与沉积抗体的丰度成比例。细胞核用苏木精复染以产生蓝色。对于每个各自的地址，分析了一系列不同的mAb克隆的组织特异性，并通过对上述相同的FF TMA进行IHC来评估它们的组织结合模式。

[0673] 表8总结了所观察到的测试抗体的结合。所有测试的抗体主要与预期的靶组织发生反应，对其他组织具有不同程度的较弱反应性。不希望受理论的束缚，许多组织外反应性可能反映了抗体的非特异性结合。例如，测试与RAGE结合的四种抗体均显示与肺的结合，但3种抗体显示与其他组织的可变低水平结合。

[0674] 表8.通过IHC在小鼠组织微阵列上评估的候选地址

[0675]

[0676] 实例12.ANDBODY的生产和用途

[0677] 本实例演示了会阻断Notch2并结合作为地址的RAGE的示例性ANDbody的生成。

[0678] 12.1抗Notch2单克隆抗体的表达和纯化

[0679] 编码四种抗Notch2 mAb(Wu等人,Nature[自然],464:1052‑1057,2010)的可变重链区(SEQ ID NO:48、50、52和54；如表9所示)的序列分别与具有效应物无效突变L234A、TML235A和P329G(LALA‑PG)的huIgG1主链融合，并克隆到PCDNA3.4 载体(赛默飞世尔科技公司)中。将编码相应可变轻链区的序列(SEQ ID NO:49、51、53和55)与恒定κ轻链融合并克隆TM
到PCDNA3.4 中。

[0680] 为了表达和纯化，使用EXPIFECTAMINETM 293转染试剂盒(赛默飞世尔科技公司)遵TM循制造商的建议将重链与轻链DNA按1:1的比例转染至EXPI293F 细胞(赛默飞世尔科技公司)中。转染后5天，通过滤出转染的细胞，从条件培养基中纯化瞬时表达的抗体。条件培养基与蛋白A琼脂糖珠一起孵育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涤结合的珠，然后用
0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的抗体，并用1/10体积的Tris pH 8.5中和。将中和的洗出液进行缓冲液交换至PBS中。所得mAb被命名为PRO034(重链序列：SEQ ID NO:56；轻链序列：SEQ ID NO:57)、PRO035(重链序列：SEQ ID NO:58；轻链序列：SEQ ID NO:59)、PRO036(重链序列：SEQ ID NO:60；轻链序列：SEQ ID NO:61)和PRO037(重链序列：SEQ ID NO:62；轻链序列：SEQ ID NO:63)。

[0681] 表9.PRO034、PRO035、PRO036和PRO037序列

[0682]

[0683]

[0684]

[0685]

[0686] 12.2抗Notch2结合和亲和力测试

[0687] 为了通过ELISA测试抗Notch2抗体的结合，将内部表达和纯化的重组的带His标签TM TM的人和鼠Notch2 NRR结构域以1μg/mL浓度包被在NUNC‑IMMUNO  MAXISORP  ELISA板上过夜。第二天，除去包被的抗原，用1％无IgG的BSA封闭孔，然后与11个三倍连续稀释(PRO035和PRO037的起始浓度为200nM，PRO034和PRO036的起始浓度为666nM)的抗Notch2抗体(PRO034、PRO035、PRO036和PRO037)一起孵育。使用过氧化物酶缀合的抗人IgG抗体以及TMB和酸终止试剂检测结合的抗体。每种抗体均以47pM至140nM之间的亲和力结合人和鼠的Notch2 NRR结构域。

[0688] 为了通过生物层干涉测量(BLI)测试抗Notch2抗体的结合亲和力，将PRO034、PRO035、PRO036和PRO037各自固定在抗人IgG Fc生物传感器上，并浸入以1000nM至31nM的不同浓度的重组的带His标签的鼠和人Notch2 NRR蛋白中以测量与抗原的缔合速率。然后通过将生物传感器浸入缓冲液中来测量解离速率。结合亲和力计算为解离速率与缔合速率的比率。BLI测定的内在亲合力均在nM范围内，表明亲合力可提高ELISA格式中的亲和力。

[0689] 12.3Notch2/RAGE ANDbody的设计和生产

[0690] 使用受控Fab臂交换(cFAE)反应产生含有上述抗Notch2抗体(PRO034、PRO035和PRO036)的第一片段抗原结合(Fab)臂和抗RAGE抗体PRO002(实例8)的第二Fab臂的ANDbody(Labrijn等人,Proc Natl Acad Sci U.S.A.[美国国家科学院院刊],110(13):5145‑5150,2013)。进行定点诱变以在抗RAGE抗体(PRO002)的Fc片段中引入F405L氨基酸取代突变，并在每种抗Notch2抗体(PRO034、PRO035和PRO036)的Fc片段中引入K409R氨基酸取代突变。这些抗体的表达和纯化如先前针对亲本抗体所述。然后，各个单克隆抗体在受控还原和再氧化反应中以等摩尔比混合，该反应驱动由匹配点突变(F405L‑K409R)引导的双特异性抗体的重组。通过分析型色谱和SDS‑PAGE分析ANDbody的形成。所得ANDbody被指定为PRO051、PRO052和PRO053(分别包含PRO034、PRO035和PRO036)。

[0691] SDS‑PAGE和分析型尺寸排阻色谱显示cFAE反应后形成的主要产物具有典型IgG1的分子量(150kDa)，表明完全再氧化。分析型疏水相互作用色谱表明形成了新产物，即所期望的异二聚体抗体。

[0692] 12.4BLI显示Notch2/RAGE ANDbody同时结合Notch2和RAGE

[0693] 为了测试BLI对Notch2/RAGE ANDbody的同时双抗原结合，将PRO051、PRO052和PRO053以及单价亲本抗体对照固定在抗人IgG Fc生物传感器上，并浸入150nM的重组的带His标签的鼠RAGE蛋白中，然后进行第二次缔合步骤，进入含有150nM重组鼠Notch2 NRR的孔中，以测量双抗原结合。然后通过将生物传感器浸入缓冲液中来测量解离速率。

[0694] 传感图显示ANDbody PRO051、PRO052和PRO053能够同时结合RAGE和Notch2抗原，但单价亲本抗体仅结合RAGE和Notch2 NRR之一。这支持了以下结论：ANDbody是正确的组合物并且在同时结合两种抗原方面具有功能。

[0695] 12.5免疫组织化学显示Notch2/RAGE ANDbody优先与人肺组织结合

[0696] 使用装载在载玻片上的新鲜冷冻健康小鼠组织微阵列(FF TMA)切片上的免疫组织化学(IHC)来评估含有上述Notch2抑制性抗体的ANDbody的组织结合。TMA如实例11中所述构建和染色。图10显示了三种抗Notch2抗体PRO034、PRO035和PRO036对小鼠TMA的染色以及Notch2/RAGE ANDbody PRO051、PRO052和PRO053的染色。在每种情况下，RAGE靶向性ANDbody中与肺组织的结合均显著增强。这些数据表明，以抗体形式将受体靶向结合物与寻址结合物组合可以将寻址臂的组织特异性赋予ANDbody。

[0697] 12.6与匹配的非靶向抗Notch2抗体相比，Notch2/RAGE ANDbody优先分布到肺[0698] 为了评估靶向Notch2和RAGE的ANDbody在体内的表现，对小鼠进行了3mg/kg的PRO051、PRO052和PRO053抗体的IV给药处理。所有组均包含3只小鼠。给药后第3、7、14和21天，从每只小鼠收集组织。通过匀化固定量的肺组织，将每个样品针对固定量的提取蛋白质进行归一化，然后通过夹心ELISA检测人抗体，来测量肺中每种抗体的积聚。

[0699] 图11显示了与结合RAGE和对照靶呼吸道合胞病毒(RSV)糖蛋白F(RAGE XT‑M4/莫维组单抗)的匹配抗体以及结合Notch2和RSV糖蛋白F(Notch2‑2/莫维组单抗)的匹配抗体相比，PRO052在肺中的积聚。在任何时间点均未在肺中检测到针对RSV糖蛋白F和Notch2的抗体。相比之下，Notch2/RAGE ANDbody在肺中至少两周内可清晰检测到。PRO052的总体积聚低于结合RAGE和RSV糖蛋白F的双特异性抗体的总体积聚，表明PRO052的总体特异性独立地处于两个臂之间的中间。这些结果表明ANDbody中的寻址臂可以显著重定向靶标结合臂的结合特异性。

[0700] 实例13.ANDBODY的生产和用途

[0701] 本实例描述了示例性ANDbody的生产，其(i)包含靶向IL‑10途径的配体效应物，并且(ii)结合作为地址的DSG1。

[0702] 13.1IL‑10/DSG1 ANDbody的描述、设计和生产

[0703] 为了测试IL‑10/抗DSG1 ANDbody的形式，探索了三个参数：IL‑10的价(1或2个IL‑10部分)、抗DSG1臂的化合价(1或2个Fab臂)和两个版本的IL‑10(二聚体或单体IL‑10)。评估了代表IL‑10分子、IL‑10价和抗体价的不同组合的形式。对于二价形式，野生型(WT)IL‑
10(登录号P22301)、单体的经工程改造的IL‑10序列(Josephson等人,J Biol Chem.[生物化学杂志],275(18):13552‑7,2000)和二聚体的经工程改造的IL‑10序列(Minshawi等人,Front Immunol.[免疫学前沿],11:1794,2020)与PRO003序列(实例7)在重链的C末端与融合。对于单价形式，单体和二聚体IL‑10与PRO003在Fc的N末端融合并共表达。单价形式是不对称的，Fc结构域的突变(链A：S364K/K409S；链B：K370S/F405K(WO 2017/106462 A1)用于执行不对称配对。

[0704] 为了表达和纯化抗体，使用EXPIFECTAMINETM 293转染试剂盒(赛默飞世尔科技公司)遵循制造商的建议将重链比轻链DNA按1:1比例或重链比轻链比IL‑10‑Fc(如下所列)按TM1:1:1比例转染至EXPI293F 细胞(赛默飞世尔科技公司)中。转染后5天，通过滤出转染的细胞，从条件培养基中纯化瞬时表达的抗体。条件培养基与蛋白A琼脂糖珠一起孵育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涤结合的珠，然后用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的抗体，并用1/10体积的Tris pH 8.5中和。将中和的洗出液进行缓冲液交换至PBS中。

[0705] 所得mAb被命名为PRO023、PRO024、PRO025、PRO026和PRO027(图12)。

[0706] PRO023包含(a)重链序列(SEQ ID NO:67)，其包含PRO003的重链序列(SEQ ID NO:28)和野生型人IL‑10序列(SEQ ID NO:64)和(b)PRO003的轻链序列(SEQ ID NO:29)。

[0707] PRO024包含(a)重链序列(SEQ ID NO:68)，其包含PRO003的重链序列(SEQ ID NO:28)和单体人IL‑10序列(SEQ ID NO:64)和(b)PRO003的轻链序列(SEQ ID NO:29)。

[0708] PRO025包含(a)重链序列(SEQ ID NO:69)，其包含PRO003的重链序列(SEQ ID NO:28)和二聚体人IL‑10序列(SEQ ID NO:66)和(b)PRO003的轻链序列(SEQ ID NO:29)。

[0709] PRO026包含(a)PRO003的重链序列，其进一步包含Fc结构域中的突变以执行不对称配对(SEQ ID NO:70)，(b)PRO003的轻链序列(SEQ ID NO:29)，和(c)IL‑10‑Fc融合蛋白(SEQ ID NO:72)，其包含含有突变以执行不对称配对的Fc区(SEQ ID NO:71)和单体人IL‑10序列(SEQ ID NO:64)。

[0710] PRO027包含(a)PRO003的重链序列，其进一步包含Fc结构域中的突变以执行不对称配对(SEQ ID NO:70)，(b)PRO003的轻链序列(SEQ ID NO:29)，和(c)IL‑10‑Fc融合蛋白(SEQ ID NO:73)，其包含含有突变以执行不对称配对的Fc区(SEQ ID NO:71)和二聚体人IL‑10序列(SEQ ID NO:66)。

[0711] 通过分析型尺寸排阻色谱分析纯化的ANDbody的单分散性，并通过SDS‑PAGE分析纯度。经过一步纯化后，PRO024和PRO026具有最高的产率和单分散度。PRO023和PRO027具有中等产率并且单分散度约为70％。PRO025具有较低产率，单分散度为约89％。

[0712] 表10.PRO023、PRO024、PRO025、PRO026、PRO058和PRO027序列

[0713]

[0714]

[0715]

[0716]

[0717] 13.2IL‑10/DSG1 ANDbody与两种IL‑10受体结合

[0718] 为了通过ELISA测试IL‑10/抗DSG1 ANDbody与IL‑10受体α(IL‑10Ra)的结合，将重TM组的带His标签的人IL‑10Ra(Creative Biomart公司)以1μg/mL浓度包被在NUNC‑IMMUNO  TM
MAXISORP  ELISA板上过夜。第二天，除去包被的抗原，用1％无IgG的BSA封闭孔，然后与11个三倍连续稀释(起始浓度为30μg/mL)的抗IL‑10/抗DSG1 ANDbody(如上所述)一起孵育。
使用过氧化物酶缀合的抗人IgG抗体以及TMB和酸终止试剂检测结合的抗体。

[0719] 在测试的分子中，只有含有IL‑10部分的分子(PRO023、PRO024、PRO025、PRO026、PRO027和阳性对照IL‑10Fc)(Creative Biomart公司IL10‑326H)结合IL‑10Ra，证明该结合是由IL‑10而不是阴性对照抗DSG1抗体(PRO003)驱动，并且IL‑10部分在结合其受体方面具有功能。

[0720] 13.3IL‑10/DSG1 ANDbody激活IL‑10信号传导途径

[0721] 为了表明IL‑10作为上述各种ANDbody的一部分保留了其生物活性，测试了每个IL‑10/DSG1 ANDbody激活IL‑10信号传导途径的能力。

[0722] HEK‑BLUETM IL‑10细胞(英杰公司(InvivoGen))用于评估每个分子的信号传导活性和相对效力。这些细胞表达IL‑10信号传导途径的所有成分，包括编码分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)的IL‑10可诱导基因。当这些细胞中的IL‑10信号传导被激活时，它们表达SEAPTM并将其分泌到细胞培养基中。通过向细胞培养基中添加QUANTI‑BLUE 溶液比色试剂(英杰公司)，然后读取630nm处的吸光度来测量IL‑10信号的程度。

[0723] 在此实验中，PRO023、PRO024、PRO025、PRO026和PRO027各自在细胞培养物中孵育过夜情况下从1pM滴定至>1nM。图18A和18B显示了每种IL‑10/DSG1ANDbody以及表11中所述TM的阳性和阴性对照的代表性活性数据。表11显示HEK‑BLUE 细胞对三种对照分子((1)重组人IL‑10(博奇公司#573204)(rhIL‑10)，(2)重组人IL‑10融合至人Fc结构域(hIL‑10Fc融合体)，和(3)亲本抗DSG1抗体(PRO003))以及上文描述的每个IL‑10/DSG1 ANDbody的应答EC50。这些数据证实所有五种IL‑10/DSG1 ANDbody保留了人IL‑10的信号传导活性。它们显示出一系列效力，表明ANDbody的相对生物效力可以通过分子形式、生物活性部分的结构和活性部分的价的变化来调整。

[0724] 表11.IL‑10/DSG1 ANDbody在HEK‑BLUETM IL‑10信号转导测定中的效力[0725]

[0726] 13.4IL‑10/DSG1 ANDbody抑制原代小鼠巨噬细胞的炎症应答

[0727] 为了证明IL‑10/DSG1 ANDbody能够抑制炎症免疫应答，评估了IL‑10/DSG1 ANDbody对用脂多糖(LPS)作为炎症刺激物处理的小鼠外周血单核细胞(PBMC)和巨噬细胞的影响。在这些实验中，通过磁珠负富集(美天旎生物技术公司(Miltenyi Biotech)#130‑110‑434)从Balb/C小鼠的血液中分离出PBMC，并从其脾中分离出巨噬细胞。通过测量LPS刺激3小时和5‑6小时后培养基中存在的TNFα细胞因子水平来测定巨噬细胞激活。

[0728] 图13A‑13G显示了用指定的IL‑10/DSG1 ANDbody或对照分子预刺激、随后用LPS处理指定的时间长度后PBMC细胞培养物中肿瘤坏死因子α(TNFα)的水平。图14A‑14G显示了用指定的IL‑10/DSG1 ANDbody或对照分子预刺激、随后用LPS处理指定的时间长度后原代巨噬细胞培养物中的TNFα水平。由于这些组代表了多天运行的实验，因此组之间的数据不具有可比性。这些数据表明所有五种IL‑10/DSG1 ANDbody都能够抑制原代巨噬细胞中的炎症刺激。

[0729] 13.5地址靶标的接合增强了ANDbody的效应物功能的活性/效力

[0730] 寻址(例如，使用地址靶向结构域)与生物活性分子的组合具有以多种方式增强生物活性的潜力。一种示例性的增强是通过增加效应物部分对也存在地址靶标的特定细胞的效力。

[0731] 为了测试效应物靶向结构域的信号传导效力是否可以通过地址靶向结构域的存TM在来增强，用慢病毒使用稳定表达在HEK‑BLUE  IL‑10细胞上表达人DSG1(稳定表达细胞称TM
为HEKBLUE  IL‑10/DSG1)。将DSG1基因(NP_034209.2)克隆到合适的慢病毒质粒主链中，使TM
用VIRAPOWER 慢病毒包装混合物(赛默飞世尔科技公司)包装成病毒颗粒，并根据制造商的说明进行转导。DSG1的表达通过qPCR得到证实。

[0732] 重组人IL‑10、ANDbody(其中单体IL‑10替代了抗DSG1 mAb(PRO058，功能上等同于PRO026)的一个Fab)以及匹配对照(其中抗体序列包含莫维组单抗作为阴性对照)的效力进TM TM行了评估。在HEK‑BLUE  IL‑10细胞和稳定表达DSG1的HEK‑BLUE  IL‑10细胞上测试活性。
TM TM
图15显示了亲本HEK‑BLUE  IL‑10细胞和HEK‑BLUE  IL‑10/DSG1细胞中每种分子的代表性信号传导应答。这两种细胞系对重组IL‑10的应答相似，证实DSG1表达对其对IL‑10的敏感性没有大的影响。当DSG1在靶细胞上表达时，DSG1/IL‑10ANDbody显示出约15倍的效力增加。没有发现对匹配的IL‑10/莫维组单抗蛋白的效力有影响，证实了该影响是通过与DSG1结合介导的。这表明本文提供的ANDbody设计能够实现生物效力的通过地址介导的增强，这允许在ANDbody中使用效力较低的靶结合物部分以进一步减少不需要的脱靶效应。

[0733] 13.6IL‑10/DSG1 ANDbody保留亲本抗DSG1抗体的药代动力学和组织分布特性[0734] 在一些ANDbody中，靶向部分旨在将亲本mAb或其他靶向分子的组织或细胞靶向赋予生物活性部分，否则该生物活性部分将具有不期望的药代动力学或组织分布。

[0735] IL‑10/DSG1 ANDbody旨在将IL‑10活性引导至皮肤。在实例7中，表明该抗DSG1抗体优先分布到小鼠的皮肤中。相比之下，据报道IL‑10可从人体循环中清除，半衰期约为2小时(Radwanski等人,Pharm Res.[药物研究]1998年12月；15(12):1895‑901。因此，我们评估了IL‑10/DSG1 ANDbody是否保留亲本抗体的皮肤靶向能力。

[0736] BALB/c小鼠通过尾静脉注射3mg/kg的PRO003、PRO024或PRO058给药。PRO058的功能与PRO026相同，只是Fc结构域中进行了取代，以改善重组蛋白的纯化。PRO058包含(a)PRO0026的重链序列(SEQ ID NO:70)、(b)PRO003的轻链序列(SEQ ID NO:29)、和(c)IL‑10‑Fc融合蛋白(SEQ ID NO:75)，其包含Fc区(SEQ ID NO:74)和单体人IL‑10序列(SEQ ID NO:64)。

[0737] 在1小时至48小时的时间点收集血清样品。在给药后1、2、4和7天收集组织样品。通过ELISA测量每个血清或组织样品中抗DSG1或ANDbody的量。图16A和16B显示了IL‑10/抗DSG1 ANDbody PRO024和PRO058在皮肤和血清中具有与亲本抗DSG1抗体PRO003类似的PK特性。这些数据证明包含重组IL‑10的抗体‑细胞因子融合体可以保留亲本抗体的药代动力学特性。

[0738] 实例14.TNFα阻断性分子与DSG1靶向部分偶联

[0739] 本实例描述了阻断TNFα并结合作为地址的DSG1的示例性ANDbody的产生。

[0740] 14.1抗TNFα单克隆抗体的表达和纯化

[0741] 产生了具有来自与具有效应物无效突变L234A、L235A、P329G(LALA‑PG)的huIgG1主链融合的商业抗体的VH和VL序列的抗TNFα抗体，并且如上所述表征了它们与TNFα的结合和亲和力。所得mAb被命名为PRO076和PRO078。

[0742] 14.2抗TNFα‑DSG1 ANDbody设计、表达和纯化

[0743] 通过将PRO004(实例7)与先前报道的显性阴性TNFα(Steed等人Science.[科学]2003年9月26日；301(5641))或以下列出的经临床验证的抗TNFα抗体(其目的是局部下调发炎皮肤细胞外环境中的TNFα)组合来设计ANDbody。TNFα阻断性抗DSG1 ANDbody设计探索了各种形式和价，包括细胞因子/抗体和TNF受体2(TNFR2)/抗体融合体。

[0744] 为了表达和纯化抗体，使用EXPIFECTAMINETM 293转染试剂盒(赛默飞世尔科技公TM司)遵循制造商的建议将重链与轻链DNA按1:1的比例转染至EXPI293F 细胞(赛默飞世尔科技公司)中。转染后5天，通过滤出转染的细胞，从条件培养基中纯化瞬时表达的抗体。条件培养基与蛋白A琼脂糖珠一起孵育1小时。用磷酸盐缓冲盐水(PBS)pH 7.4洗涤结合的珠，然后用0.1M甘氨酸pH 2.5洗脱结合的抗体，并用1/10体积的Tris pH 8.5中和。将中和的洗出液进行缓冲液交换至PBS中。所得mAb被命名为PRO070、PRO074、PRO075和PRO077(图17)。

[0745] 通过分析型尺寸排阻色谱分析纯化的ANDbody的单分散性，并通过SDS‑PAGE分析纯度。进行标准的另外纯化步骤以去除聚集。PRO077的最终产率最高，其次是PRO074和PRO075，而PRO070的最终产率最低。如SDS‑PAGE所示，精制的ANDbody是纯的且具有正确的组成。

[0746] 14.3抗TNFα‑DSG1 ANDbody结合和亲和力测试

[0747] ELISA结合测定表明，所有构建体均有活性以不同的亲和力结合人和鼠TNFα。PRO074和PRO075对人和鼠TNFα具有相似的亲和力，与亲本抗体相差在两倍/三倍以内。与亲本抗体相比，PRO077对人和鼠TNFα的结合亲和力分别降低了5倍和12倍。这种亲和力的降低可能是由于从Fab到单链可变片段(scFv)的形式变化。

[0748] 14.4抗TNFα‑DSG1 ANDbody体外活性测定

[0749] 使用HEK‑BLUETM TNFα细胞(英杰公司)评估每种抗TNFα/抗DSG1 ANDbody抑制TNFα信号传导的能力。这些细胞经过工程改造以应答于至TNFα信号传导的信号传导而表达分泌型胚胎碱性磷酸酶(SEAP)。TNFα根据制造商的说明进行测量。为了评估抑制活性，将TNFα的浓度固定在225pm(约是本测定中重组人TNFα的EC80)，并将细胞与10nM至约10pM的TNFα阻断性分子一起预孵育。表12显示了每种抗TNFα/DSG1 ANDbody以及作为阳性对照的匹配亲本抗体的IC50。这些数据表明，与原始抗TNFα亲本抗体相比，ANDbody保留了TNFα阻断性活性。

[0750] 表12.与匹配对照相比，抗TNFα/抗DSG1 ANDbody的IC50

[0751]

[0752] VII.其他实施例

[0753] 本文描述的技术的一些实施例可以根据以下编号的实施例中的任何一个来定义：

[0754] 1.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0755] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0756] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0757] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0758] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0759] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导。

[0760] 2.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0761] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0762] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0763] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0764] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0765] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；

[0766] 并且其中相对于缺少第二结合位点的参考大分子的定位，该大分子对非靶组织或细胞的定位显著减少。

[0767] 3.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0768] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0769] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0770] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0771] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0772] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；

[0773] 并且其中相对于缺少第二结合位点的参考大分子的定位，该大分子对靶组织或细胞的定位显著增加。

[0774] 4.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0775] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0776] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0777] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0778] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0779] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；

[0780] 并且其中在施用后1天至7天之间的时间点在该靶组织或细胞处检测到施用给受试者的大分子的至少25％。

[0781] 5.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0782] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0783] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0784] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0785] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0786] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；

[0787] 并且其中该第一结合位点对该效应物靶标的亲和力低于该第二结合位点对该地址靶标的亲和力。

[0788] 6.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0789] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0790] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0791] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0792] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0793] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；

[0794] 并且其中该第一结合位点对该效应物靶标的亲合力低于该第二结合位点对该地址靶标的亲合力。

[0795] 7.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0796] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0797] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0798] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0799] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0800] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；

[0801] 并且其中相对于缺少第二结合位点的参考大分子，该靶组织或细胞处的该第一结合位点的效力显著增加。

[0802] 8.如实施例1‑7中任一项所述的大分子，其中该第一结合位点对该效应物靶标具有低亲和力。

[0803] 9.如实施例1‑7中任一项所述的大分子，其中该第一结合位点对该效应物靶标具有低亲合力。

[0804] 10.如实施例1‑4和6‑9中任一项所述的大分子，其中该第一结合位点对该效应物靶标的亲和力低于该第二结合位点对该地址靶标的亲和力。

[0805] 11.如实施例1‑10中任一项所述的大分子，其中该第一结合位点对该效应物靶标的亲合力低于该第二结合位点对该地址靶标的亲合力。

[0806] 12.如实施例1‑11中任一项所述的大分子，其中：

[0807] (a)该第一结合位点对该效应物靶标的Kd高于该第二结合位点对该地址靶标的Kd；

[0808] (b)该第一结合位点对该效应物靶标的EC50高于该第二结合位点对该地址靶标的EC50；或

[0809] (c)该第一结合位点对该效应物靶标的IC50高于该第二结合位点对该地址靶标的IC50。

[0810] 13.如实施例1‑12中任一项所述的大分子，其中该第一结合位点对该效应物靶标的亲和力比该第二结合位点对该地址靶标的亲和力小至少约2倍、至少约5倍或至少约10倍。

[0811] 14.如实施例1‑13中任一项所述的大分子，其中该第二结合位点对该地址靶标的亲和力具有大于约1nM、大于约2nM或大于约50nm的Kd。

[0812] 15.如实施例1‑14中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标是蛋白质、脂质或糖。

[0813] 16.如实施例1‑15中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标是细胞膜相关联靶标。

[0814] 17.如实施例15或16所述的大分子，其中该效应物靶标是蛋白质。

[0815] 18.如实施例17所述的大分子，其中该效应物靶标是分泌型蛋白。

[0816] 19.如实施例17或18所述的大分子，其中该效应物靶标由选自由表1中列举的基因组成的组的基因编码。

[0817] 20.如实施例1‑19中任一项所述的大分子，其中所述大分子激动该效应物靶标。

[0818] 21.如实施例1‑19中任一项所述的大分子，其中该大分子拮抗该效应物靶标。

[0819] 22.如实施例1‑21中任一项所述的大分子，其中该地址靶标是蛋白质、脂质或糖。

[0820] 23.如实施例22所述的大分子，其中该地址靶标是蛋白质。

[0821] 24.如实施例17‑23中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标或该地址靶标的表达是编码该效应物靶标或该地址靶标的RNA序列的表达。

[0822] 25.如实施例24所述的大分子，其中通过使用RNA序列数据集来评估该效应物靶标或该地址靶标的表达水平。

[0823] 26.如实施例25所述的大分子，其中该RNA序列数据集是基因型‑组织表达(GTEx)数据集或人蛋白质图谱(HPA)数据集。

[0824] 27.如实施例23所述的大分子，其中该效应物靶标或该地址靶标的表达是蛋白质表达。

[0825] 28.如实施例1‑27中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标在该受试者中全身表达。

[0826] 29.如实施例1‑27中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标在该受试者中区域表达。

[0827] 30.如实施例1‑27中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标在该受试者中局部表达。

[0828] 31.如实施例1‑30中任一项所述的大分子，其中该地址靶标在该受试者中区域表达。

[0829] 32.如实施例1‑30中任一项所述的大分子，其中该地址靶标在该受试者中局部表达。

[0830] 33.如实施例1‑30中任一项所述的大分子，其中该地址靶标的表达限于该受试者中的细胞类型。

[0831] 34.如实施例1‑33中任一项所述的大分子，其中该地址靶标是可溶性蛋白或细胞外基质(ECM)相关联蛋白并且不以可检测的量存在于细胞表面上。

[0832] 35.如实施例34所述的大分子，其中该地址靶标在该ECM中表达并且在该受试者的其他地方不以可检测的量存在。

[0833] 36.如实施例1‑35中任一项所述的大分子，其中该地址靶标仅由该受试者中的处于特定细胞状态的细胞表达。

[0834] 37.如实施例1‑36中任一项所述的大分子，其中该地址靶标仅由该受试者中的处于疾病状态的细胞表达。

[0835] 38.如实施例1‑37中任一项所述的大分子，其中该地址靶标不在该第二结合位点与该效应物靶标的结合对该受试者有害的组织中表达。

[0836] 39.如实施例1‑38中任一项所述的大分子，其中该地址靶标的结合位点不以可检测的量与该地址靶标的天然配体的结合位点结合。

[0837] 40.如实施例1‑39中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标或地址靶标的表达包括在以下的一种或多种中的表达：小唾液腺、甲状腺、肺、乳腺、乳腺组织、胰腺、肾上腺、肝、肾、肾皮质、肾髓质、脂肪内脏组织、网膜、小肠、回肠末端、输卵管、卵巢、子宫、皮肤、不暴露在阳光下的皮肤、耻骨弓上的皮肤、宫颈、子宫颈内膜、外子宫颈、阴道、暴露在阳光下的皮肤、小腿皮肤、前扣带皮层、布罗德曼分区24(BA24)、基底神经节、尾状核、硬膜、伏核、下丘脑、杏仁核、海马体、小脑、小脑半球、黑质、垂体、脊髓、颈脊髓、动脉、主动脉、心脏、心耳、冠状动脉、左心室、食管、食管粘膜、食管肌层、胃食管连接部、脾、胃、结肠、横结肠、乙状结肠、睾丸、全血细胞、EBV转化的淋巴细胞、胫骨动脉、或神经胫骨组织。

[0838] 41.如实施例40所述的大分子，其中该效应物靶标或地址靶标的表达包括在皮肤组织、肺组织、肾组织或肠组织中的表达。

[0839] 42.如实施例41所述的大分子，其中该地址靶标的表达在皮肤组织、肺组织、肾组织或肠组织中显著高于在任何其他组织中。

[0840] 43.如实施例1‑42中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标和/或地址靶标在该受试者中的结构组织上表达。

[0841] 44.如实施例1‑43中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标和地址靶标位于相同细胞上。

[0842] 45.如实施例1‑43中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标和地址靶标位于不同细胞上。

[0843] 46.如实施例45所述的大分子，其中该效应物靶标和地址靶标位于相同细胞类型的不同细胞上。

[0844] 47.如实施例45所述的大分子，其中该效应物靶标和地址靶标位于不同细胞类型的不同细胞上。

[0845] 48.如实施例45所述的大分子，其中该效应物靶标和地址靶标位于相同组织中的不同细胞上。

[0846] 49.如实施例45、47和48中任一项所述的大分子，其中：

[0847] (a)该效应物靶标在循环细胞上并且该地址靶标在组织限制型细胞上；或

[0848] (b)该效应物靶标位于组织限制型细胞上并且该地址靶标位于循环细胞上。

[0849] 50.如实施例45‑49中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标和地址靶标位于该受试者中彼此相距100nm以内的不同细胞上。

[0850] 51.如实施例45‑49中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标或该地址靶标存在于细胞表面上。

[0851] 52.如实施例1‑51中任一项所述的大分子，其中该大分子是DNA多核苷酸。

[0852] 53.如实施例1‑51中任一项所述的大分子，其中该大分子包含RNA或RNA‑多肽缀合物。

[0853] 54.如实施例1‑51和53中任一项所述的大分子，其中该大分子包含多肽。

[0854] 55.如实施例1‑51中任一项所述的大分子，其中该大分子是多肽。

[0855] 56.如实施例54或55所述的大分子，其中该多肽是抗体或其抗原结合片段。

[0856] 57.如实施例56所述的大分子，其中该第一结合位点和该第二结合位点各自包含VH和/或VL。

[0857] 58.如实施例57所述的大分子，其中该大分子是抗体，其包含对该受试者中的该效应物靶标特异性的第一结合位点和对该地址靶标特异性的第二结合位点。

[0858] 59.如实施例57或58所述的大分子，其中该大分子是不对称抗体或对称抗体。

[0859] 60.如实施例56‑59中任一项所述的大分子，其中该抗体或其抗原结合片段包含scFv、BsIgG、BsAb片段、BiTE、双亲和力重定向蛋白(DART)、串联双抗体(TandAb)、双抗体、Fab2、di‑scFv、化学连接的F(ab’)2、带有2、3或4个不同的抗原结合位点的Ig分子、DVI‑IgG四合一、ImmTac、HSAbody、IgG‑IgG、Cov‑X‑Body、scFv1‑PEG‑scFv2、附加的IgG、DVD‑IgG、亲和体、affilin、affimer、affitin、α体(alphabody)、抗运载蛋白(anticalin)、亲和多聚体(avimer)、DARPin、Fynomer、单体、nanoCLAMP、bis‑Fab、Fv、Fab、Fab'‑SH、线性抗体、scFv、仅具有重链的抗体(Humabody)、ScFab、IgG抗体片段、单链可变区抗体、单结构域重链抗体、双特异性三体、BiKE、CrossMAb、dsDb、scDb、串联dAb/VHH、三重dAb VHH、四价dAb/VHH、Fab‑scFv、Fab‑Fv、或DART‑Fc、纤维连接蛋(adnectin)、库尼茨型抑制剂(Kunitz‑type inhibitor)、或受体诱饵。

[0860] 61.如实施例54所述的大分子，其中该多肽是该效应物靶标的配体或该地址靶标的配体。

[0861] 62.如实施例61所述的大分子，其中该配体是天然配体、经修饰配体或合成配体。

[0862] 63.如实施例61或62所述的大分子，其中该效应物靶标或地址靶标是受体并且该多肽是其配体。

[0863] 64.如实施例61‑63中任一项所述的大分子，其中该第一结合位点包含抗体或其抗原结合片段并且该第二结合位点包含该地址靶标的配体。

[0864] 65.如实施例61‑63中任一项所述的大分子，其中该第一结合位点包含该效应物靶标的配体并且该第二结合位点包含抗体或其抗原结合片段。

[0865] 66.如实施例1‑51和54‑65中任一项所述的大分子，其中该第一和第二结合位点的氨基酸序列至少约10％相同、至少约20％相同、至少约30％相同、至少约40％相同、至少约50％相同，至少约60％相同或至少约70％相同。

[0866] 67.如实施例1‑66中任一项所述的大分子，其中该地址靶标具有高于约0.4、约0.5、约0.57、约0.65、约0.7、约0.85、约0.90或约0.95的基尼系数。

[0867] 68.如实施例1‑67中任一项所述的大分子，其中该地址靶标具有高于约0.67、约0.75、约0.8、约0.85、约0.90或约0.95的Tau系数。

[0868] 69.如实施例1‑68中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标具有低于约0.25、约0.20或约0.15的基尼系数。

[0869] 70.如实施例1‑69中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标具有低于约0.25、约0.20或约0.15的Tau系数。

[0870] 71.如实施例1‑70中任一项所述的大分子，其进一步包含第三结合位点。

[0871] 72.如实施例71所述的大分子，其中该第三结合位点与该第一结合位点相同。

[0872] 73.如实施例71所述的大分子，其中该第三结合位点与该第二结合位点相同。

[0873] 74.如实施例1‑73中任一项所述的大分子，其中该第一结合位点和第二结合位点在该大分子中直接彼此连接。

[0874] 75.如实施例1‑73中任一项所述的大分子，其中该大分子中的第一结合位点和第二结合位点通过稳定结构域连接。

[0875] 76.如实施例1‑75中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标是Notch2并且该地址靶标是RAGE。

[0876] 77.如实施例76所述的大分子，其中该RAGE信号传导不受该第二位点结合该RAGE地址靶标的影响。

[0877] 78.如实施例1‑75中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标是Notch2并且该地址靶标是尿调节素(UMOD)。

[0878] 79.如实施例78所述的大分子，其中该UMOD信号传导不受该第二位点结合该UMOD地址靶标的影响。

[0879] 80.如实施例1‑75中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标是Notch2并且该地址靶标是穿膜肽酶A亚基β(MEP1B)。

[0880] 81.如实施例80所述的大分子，其中该MEP1B信号传导不受该第二位点结合该MEP1B地址靶标的影响。

[0881] 82.如实施例1‑75中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标是IL11Ra并且该地址靶标是RAGE。

[0882] 83.如实施例82所述的大分子，其中该RAGE信号传导不受该第二位点结合该RAGE地址靶标的影响。

[0883] 84.如实施例1‑75中任一项所述的大分子，其中该效应物靶标是IL 11Ra并且该地址靶标是UMOD。

[0884] 85.如实施例84所述的大分子，其中该UMOD信号传导不受该第二位点结合该UMOD地址靶标的影响。

[0885] 86.如实施例1‑85中任一项所述的大分子，其中该受试者是人。

[0886] 87.一种将部分递送至受试者中的靶组织或细胞的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例1‑86中任一项所述的大分子，其中该靶组织包含地址靶标。

[0887] 88.如实施例87所述的方法，其中该部分是分子。

[0888] 89.如实施例87或88所述的方法，其中该部分不是毒素。

[0889] 90.如实施例87所述的方法，其中该部分是细胞。

[0890] 91.如实施例90所述的方法，其中该部分不是T细胞或NK细胞。

[0891] 92.如实施例87‑91中任一项所述的方法，其中该靶组织不是肿瘤。

[0892] 93.一种调节靶组织中的效应物靶标的方法，该方法包括向该组织施用如实施例1‑86中任一项所述的大分子，其中该靶组织包含地址靶标和效应物靶标。

[0893] 94.一种当在心脏或肺中发现效应物靶标时使结合剂偏向不与该效应物靶标结合的方法，该方法包括施用如实施例1‑86中任一项所述的大分子，其中地址靶标基本上不在心脏或肺中表达。

[0894] 95.一种调节受试者中的靶组织的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例1‑86中任一项所述的大分子，其中该靶组织包含地址靶标和效应物靶标。

[0895] 96.一种治疗患有与效应物靶标相关的疾病或病症的受试者的方法，该方法包括向该受试者施用如实施例1‑86中任一项所述的大分子，其中该大分子的第一结合位点结合该效应物靶标。

[0896] 97.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0897] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0898] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；

[0899] 其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，

[0900] 其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导，并且

[0901] 其中该第二结合位点不结合该地址靶标的天然配体的结合位点。

[0902] 98.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0903] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0904] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；

[0905] 其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，

[0906] 其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导，并且

[0907] 其中该第一结合位点和第二结合位点在该大分子中直接彼此连接。

[0908] 99.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0909] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0910] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；

[0911] 其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，

[0912] 其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导，并且

[0913] 其中该第一结合位点和第二结合位点通过稳定结构域彼此连接。

[0914] 100.一种包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0915] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0916] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；

[0917] 其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，

[0918] 其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导，并且

[0919] 其中该效应物靶标和/或该地址靶标在宿主的结构组织上表达。

[0920] 101.一种药物组合物，其包含如实施例1‑86中任一项所述的大分子。

[0921] 102.一种药物组合物，其包含大分子和一种或多种药学上可接受的赋形剂，[0922] 其中该大分子包含第一结合位点和第二结合位点，其中：

[0923] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0924] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；

[0925] 其中该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导，并且

[0926] 其中该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导。

[0927] 103.如实施例101或102所述的药物组合物，其中该药物组合物是RNA药物组合物。

[0928] 104.如实施例101‑103中任一项所述的药物组合物，其进一步包含载剂。

[0929] 105.如实施例104所述的药物组合物，其中该载剂是脂质纳米颗粒。

[0930] 106.如实施例104所述的药物组合物，其中该载剂是病毒载体。

[0931] 107.如实施例104所述的药物组合物，其中该载剂是基于膜的载剂。

[0932] 108.如实施例107所述的药物组合物，其中该基于膜的载剂是细胞。

[0933] 109.如实施例107所述的药物组合物，其中该基于膜的载剂是囊泡。

[0934] 110.一种用于调节受试者皮肤中的效应物靶标的活性的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0935] (a)该第一结合位点对于该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0936] (b)该第二结合位点对于桥粒黏蛋白‑1(DSG‑1)是特异性的。

[0937] 111.一种用于调节受试者肺中的效应物靶标的活性的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0938] (a)该第一结合位点对于该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0939] (b)该第二结合位点对于RAGE是特异性的。

[0940] 112.一种用于调节受试者肾中的效应物靶标的活性的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0941] (a)该第一结合位点对于该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0942] (b)该第二结合位点对于钙粘蛋白16(CDH16)是特异性的。

[0943] 113.一种用于调节受试者肠中的效应物靶标的活性的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0944] (a)该第一结合位点对于该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0945] (b)该第二结合位点对于钙粘蛋白17(CDH17)是特异性的。

[0946] 114.一种将大分子定位在受试者的靶组织或细胞处的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0947] (a)该第一结合位点对于该受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0948] (b)该第二结合位点对于该受试者中的该靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0949] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0950] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0951] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；以及

[0952] 允许该大分子定位于该受试者的该靶组织或细胞处。

[0953] 115.一种在受试者的靶组织或细胞中浓缩大分子的方法，该方法包括向该受试者施用包含第一结合位点和第二结合位点的大分子，其中：

[0954] (a)该第一结合位点对于受试者中的效应物靶标是特异性的，并且

[0955] (b)该第二结合位点对于该受试者中的靶组织或细胞中表达的地址靶标是特异性的；其中：

[0956] (i)该第二结合位点将该第一结合位点定位于该地址靶标，使得该第一结合位点影响该靶组织或细胞中的效应物靶标信号传导；

[0957] (ii)该第二结合位点在结合该地址靶标后基本上不影响信号传导；以及

[0958] (iii)该第一结合位点在没有被该第二结合位点定位的情况下基本上不影响效应物靶标信号传导；

[0959] 并允许该大分子在该受试者的该靶组织或细胞处浓缩，其中在向该受试者施用该大分子后1天和7天之间的时间点，在该靶组织或细胞处检测到该受试者中可检测的该大分子的至少25％。

[0960] 116.如实施例114或115所述的方法，其中相对于缺少该第二结合位点的参考大分子，该靶组织或细胞处的该第一结合位点的效力显著增加。

[0961] 117.如实施例114或115所述的方法，其中相对于缺乏该第二结合位点的参考大分子，在该受试者的非靶组织或细胞中通过该大分子的效应物靶标信号传导显著减少。

[0962] 118.如实施例110‑117所述的方法，其中该大分子是如实施例1‑86中任一项所述的大分子。

[0963] 尽管出于清楚理解的目的，已经通过说明和实例详细地描述了前述发明，但是描述和实例不应被解释为限制本发明的范围。