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基于放射的导蛋白-1的检测、伴随测试和治疗方法
申请号 CN202280052815.7 申请日 2022-07-26 公开(公告)号 CN117813326A 公开(公告)日 2024-04-02
申请人 奈特里斯药物公司; 国家科学研究中心; 法国国家健康与医学研究院; 克劳德伯纳德里昂第一大学; 莱昂贝拉尔中心; 里昂公立收容所; 发明人 马蒂厄·里绍; 珍妮弗·维施胡森; 达维德·内维斯; 帕特里克·梅伦; 达维德·萨吕; 邦雅曼·吉贝尔; 达维德·克里扎;
摘要 本 发明 基于以下发现：导蛋白‑(1)以更粘的方式保留在癌细胞的细胞外围的细胞基质中，而导蛋白‑(1)在成年人体内特别是在一些 肿瘤 中表达。本文还显示导蛋白‑(1)在肿瘤形成过程中非常早地表达。这使导蛋白‑(1)成为成像和/或靶向 治疗 的预料不到的非常特异性的靶标。因此，本发明涉及包含抗导蛋白‑1 抗体 (尤其是NP(137))、任选地与 放射性 同位素缔合的螯合部分的化合物，以及它们在成像、诊断(尤其是伴随诊断)或靶向治疗中的用途。还提出了可以是伴随测试的新诊断测试，以及可以与所述伴随测试相结合的新 癌症治疗 方法。
权利要求

1.一种化合物，包含：
‑抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段，以及
‑与所述抗体或片段结合的螯合部分，
其中，所述螯合部分任选地与放射性同位素缔合。
2.根据权利要求1所述的化合物，其中，所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，包含：
可变区VH，包含：
‑具有SEQ ID NO：1所示序列的H‑CDR1；
‑具有SEQ ID NO：2所示序列的H‑CDR2；
‑具有SEQ ID NO：3所示序列的H‑CDR3；
可变区VL，包含：
‑具有SEQ ID NO：4所示序列的L‑CDR1；
‑具有序列YAS的L‑CDR2；
‑具有SEQ ID NO：5所示序列的L‑CDR3；
或者
可变区VH，包含：
‑具有SEQ ID NO：22所示序列的H‑CDR1；
‑具有SEQ ID NO：23所示序列的H‑CDR2；
‑具有SEQ ID NO：24所示序列的H‑CDR3；
可变区VL，包含：
‑具有SEQ ID NO：25所示序列的L‑CDR1；
‑具有SEQ ID NO：26所示序列的L‑CDR2；
‑具有SEQ ID NO：5所示序列的L‑CDR3。
3.根据权利要求2所述的化合物，其中，所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，其中，所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，包含选自以下对的VH和VL序列对：SEQ ID NO：21和13、SEQ ID NO：14和8、SEQ ID NO：15和9、SEQ ID NO：16和10、SEQ ID NO：17和11、SEQ ID NO：18和11、SEQ ID NO：19和10、SEQ ID NO：20和11、SEQ ID NO：16和11、SEQ ID NO：19和12、SEQ ID NO：15和10。
4.根据权利要求2或3所述的化合物，其中，所述抗体还包含人IgG1恒定重链(CH)和/或人IgG1恒定轻链(CL)。
5.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，所述螯合部分包括NODAGA、
NODAGA‑NHS、DOTA、DOTA‑NHS、p‑SCN‑Bn‑NOTA、p‑SCN‑Bn‑PCTA、p‑SCN‑Bn‑氧代‑DO3A、去铁胺‑p‑SCN、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)或1,4,8,11‑四氮杂环十四烷‑1,4,8,11‑四乙酸(TETA)。
68 64
6.根据前述权利要求中任一项所述的化合物，其中，所述放射性同位素是 Ga、Cu、
89 186 188 153 111 99m 123 177 90 131 213 212 211 225
Zr、 Re、 Re、 Sm、 In、 Tc、 I、 Lu、Y、 I、 Bi、 Bi、 At或 Ac。
7.一种用于在受试者中成像导蛋白‑1的存在或定位的方法，包括：
a)向所述受试者给药根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，所述化合物包含：
‑抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段，
‑与所述抗体或片段结合的螯合部分，以及
‑与所述螯合部分缔合的放射性同位素；
b)等待4小时～172小时，优选24小时～96小时，获得所述化合物与在肿瘤的细胞外基质中隔离的导蛋白‑1的结合；
c)通过体内成像来检测或定位所述结合的化合物。
8.根据权利要求7所述的方法，其中，步骤b)中的定位包括突出所述化合物在至少一种身体部分的存在或积累，所述身体部分例如器官或组织。
68 64
9.根据权利要求7至8中任一项所述的方法，其中，所述放射性同位素选自由 Ga、Cu
89 186 188 153 111 99m 123
、Zr、 Re、 Re、 Sm、 In、 Tc和 I所组成的组。
10.一种化合物，包含：
‑抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段，
‑与所述抗体或片段结合的螯合部分，以及
‑与所述螯合部分缔合的放射性同位素，
其中，所述化合物为根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，用于通过体内放射疗法治疗表达导蛋白‑1的癌症。
177 90 131
11.根据权利要求10所述的化合物的用途，其中，所述放射性同位素为 Lu、Y、 I、
213 212 211 225
Bi、 Bi、 At或 Ac。
12.一种体内放射疗法治疗患者中表达导蛋白‑1的癌症的方法，所述患者患有表达导蛋白‑1的癌症，所述方法包括给药足量的根据权利要求1至6中任一项所述的化合物。
177 90 131 213
13.根据权利要求12所述的方法，其中，所述化合物包含选自由 Lu、Y、 I、 Bi、
212 211 225
Bi、 At和 Ac所组成的组中的放射性同位素。
14.一种识别和治疗表达导蛋白‑1的癌症患者的方法，包括：
a)向所述受试者给药根据权利要求1至6中任一项所述的化合物；
b)等待4小时～172小时，优选24小时～96小时，获得所述化合物与在肿瘤的细胞外基质中隔离的导蛋白‑1的结合；
c)通过体内成像来检测所述化合物，优选通过PET或SPECT成像来检测所述化合物；
d)可视化定位导蛋白‑1的存在或积累；
e)针对可视化的癌症治疗所述患者。
15.根据权利要求14所述的方法，其中，步骤a)中给药的化合物是根据权利要求1至6中
68 64 89 186 188 153 111 99m 123
任一项所述的化合物，其中，选自由 Ga、Cu、Zr、 Re、 Re、 Sm、 In、 Tc和 I所组成的组。
16.根据权利要求14所述的方法，其中，步骤e)中治疗患者包括向所述患者给药有效量
177 90 131
的根据权利要求1至6中任一项所述的化合物，其中，放射性同位素选自由 Lu、Y、 I、
213 212 211 225
Bi、 Bi、 At和 Ac所组成的组。
17.根据权利要求14所述的方法，其中，步骤e)中治疗患者包括向所述患者给药有效量的根据权利要求1至4中任一项所述的抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段。
说明书全文

基于放射的导蛋白‑1的检测、伴随测试和治疗方法

技术领域

[0001] 本发明涉及用于检测和定位或可视化肿瘤中的导蛋白‑1的方法和试剂，以及基于导蛋白‑1的存在来治疗癌症的方法和试剂。本发明特别涉及一种新诊断测试，其可以是伴随测试，以及可以与伴随测试组合的新癌症治疗方法。

背景技术

[0002] 目前有多种方法用于治疗每种类型的癌症，包括手术、放射疗法、化学疗法、靶向治疗和免疫治疗。成功的癌症治疗针对原发肿瘤和任何转移瘤，无论其是临床上明显的还是微观的。
[0003] 患者关注的是尽早识别癌症的存在并可以定位癌症和确定待治疗癌症的类型。在早期诊断出的癌症更有可能得到成功治疗。如果癌症扩散，有效的治疗会变得更加困难，而且通常生存的机会也会低得多。因此，有必要知道何时立即使用强力且积极的治疗方案，以防止侵袭性癌症的扩散。
[0004] 此外，即使治疗方案相当成功，也可能在某些地方留下肿瘤细胞或肿瘤干细胞。识别和定位这些细胞也至关重要。
[0005] 患者也可能会关注能够提出抗癌靶向治疗。然而，靶向治疗的情况下，确实需要能够在体内检测和定位癌症并确定癌症的某些分子特征的试剂，以便可以在尽可能早的阶段提供适当的靶向治疗，或仅在患有适合所述治疗的癌症的患者中作为补充方案。
[0006] 导蛋白‑1(Netrin‑1)在生物体的发育，特别是中枢神经系统的建立中发挥着重要作用。因此，它对连合神经元具有有吸引人的作用。多年来，导蛋白‑1在神经发育中被描述为具有扩散等级的分泌分子。信号传导路径由受体转导，该受体称为结直肠癌缺失蛋白(DCC)、UNC‑5(uncoordinated‑5)家族和再生蛋白(Neogenin)。它的所有分子传导路径都暗示导蛋白‑1被描述为在多种疾病或信号传导机制中发挥作用。
[0007] 导蛋白‑1也被证明在许多癌症类型中表达上调，例如乳腺癌、非小细胞肺癌(NSCLC)、髓母细胞瘤。肿瘤细胞的这种过度表达被认为是充当可以阻止由DCC和Unc‑5家族依赖性受体活性诱导的细胞死亡的分子机制。这些受体充当肿瘤抑制基因，并在其配体缺失的情况下引发细胞凋亡。为了抵制这种保护机制，肿瘤细胞激活导蛋白‑1表达，导致该蛋白过度表达，从而抑制细胞死亡，例如在化疗后。因此，重新激活这种分子机制成为肿瘤学的治疗目标。因此，开发出阻断导蛋白‑1的治疗策略，更精确地抑制导蛋白‑1与其癌细胞表面受体之间的相互作用。I‑II期临床试验开始评估名为NP137(人源化单克隆抗体)并能够阻断Unc5‑B/导蛋白‑1相互作用的人IgG1。中期结果显示出作为单一药剂的临床活性令人鼓舞的迹象。因此，导蛋白‑1阻断似乎对小部分患者有效，但缺乏使用已批准的简单伴随测试来预测患者益处，所有基于活组织检查的测试都会受到侵入性组织采集的误差和局限性影响。
[0008] J.Wischhusen等人(Theranostics 2018；8(18)：5126‑5142)公开了在导蛋白‑1‑阳性乳腺肿瘤中导蛋白‑1与内皮CD31共定位。导蛋白‑1位于这些肿瘤的血管内皮上。超声分子成像(USMI)被提议作为乳腺癌中导蛋白‑1干扰治疗的非侵入性伴随诊断。在内皮细胞表面检测到的导蛋白‑1可以在很短的时间内(大约十分钟)成像，并且可以将隔离在构成血管的内皮细胞上的导蛋白‑1可视化。肿瘤合并方面的结果非常低，图5A中的背景与掺入的比率非常低：32％～45％，即实际增加了1.4倍。
[0009] 进行放射性成像和内部放射性治疗以靶向膜受体或表面分子。通常认为或多或少可扩散的分泌因子或配体通常不被选择用于这些技术。
[0010] J.Wischhusen等人(下文)没有公开导蛋白‑1隔离在癌细胞的细胞周围的细胞基质中，并且仅公开了导蛋白‑1被隔离在构成血管的内皮细胞上，并不能使导蛋白‑1检测达到作为稳健工具的标准，来检测并定位表达导蛋白‑1的肿瘤。
[0011] 导蛋白‑1主要被认为是分泌蛋白，或隔离在血管内皮细胞表面的蛋白，并不是成像和/或靶向治疗的主要候选者。

发明内容

[0012] 本文呈现的是出人意料的广泛证明，如导蛋白‑1的肿瘤积累所揭示的，导蛋白‑1以更粘的方式保留在癌细胞的细胞外围的细胞基质中。有趣的是，导蛋白‑1是在胚胎阶段表达的蛋白质，其在成人、特别是在某些肿瘤中表达。再加上导蛋白‑1保留在肿瘤位置的细胞外细胞基质(ECM)中，这使得导蛋白‑1成为出人意料的成像和/或靶向治疗的非常特异性的靶点。在肿瘤细胞的细胞基质中导蛋白‑1的隔离为具有长采集时间(例如从约24小时～约96小时)的成像方法开辟了道路，使得隔离在肿瘤本身的细胞外基质中的导蛋白‑1能够可视化，从而对整个肿瘤进行真实而强力的成像，这与J.Wischhusen等人中描述的USMI相反。例如，如在4T1细胞上获得的，使用例如SPECT的方法的背景掺入比可以很高，例如大约5.8X。同样出乎意料的是，本文显示了导蛋白‑1在肿瘤形成过程中非常早期表达，从而允许人们在出现小病变之前或触诊(如乳房触诊)之前，非常早地检测、定位和/或靶向治疗表达导蛋白‑1的肿瘤细胞。
[0013] 因此，本发明的各方面涉及化合物本身，其可用于成像、诊断、尤其是伴随诊断、或用于靶向治疗。以包含抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段以及与所述抗体或片段结合的螯合部分的化合物为基础，其中，所述螯合部分为任选地与放射性同位素缔合。与其缔合的合适同位素可以决定该化合物在影像治疗和靶向治疗之间的用途。
[0014] 详细描述
[0015] 在第一方面，本发明涉及一种化合物，包含：
[0016] ‑抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段，以及
[0017] ‑与所述抗体或片段结合的螯合部分，
[0018] 其中，所述螯合部分任选地与放射性同位素缔合。
[0019] 通常，抗体或其片段和螯合部分是共价连接的。根据该实施方式，本发明化合物是缀合物。在实施方式中，螯合部分与抗体或其片段的氨基酸侧链结合，特别是赖氨酸的侧链残基结合。
[0020] 通常，放射性同位素通过共价键与螯合部分结合。
[0021] 本发明的化合物特别地有用，因为它们能够在体内与导蛋白‑1特异性结合，从而能够通过抗体与癌细胞周围的细胞基质中的导蛋白‑1结合来使所述癌症或其靶标能够成像。这对于识别癌症的定位和/或追踪癌症的生长或消退特别有利。值得注意的是，放射性标记的化合物通过不同的技术用于流场可视化，例如单光子发射计算机断层成像术(SPECT)和正电子发射断层成像术(PET)。放射性标记的化合物还可用于放射治疗，或可视化和治疗两者。
[0022] 抗体
[0023] 所述化合物优选包含单克隆抗体(mAb)或其抗原结合片段，其中，所述mAb或其片段与导蛋白‑1特异性结合。mAb可以是鼠、嵌合、人源化或全人单克隆抗体。该片段可以是基本上保持整个抗体结合导蛋白‑1的能力的任何类型的mAb片段，其可以是例如Fab或F(ab')2。
[0024] 有用的鼠、嵌合和人源化单克隆抗体的实例在US10,494,427中公开，其通过引用并入本文。该在先文献中公开的并且可以在本文中使用的具体实施方式是表1中列出的以下抗体。表1中第一个列出的对应于鼠的4C11mAb，第二个列出的HUM00对应于将鼠的4C11CDR移植到人IgG1。HUM01至HUM10的十种mAb对应于源自HUM00的人源化mAb，在人IgG的FR区域进行了特定修饰。HUM03也称为NP137。人IgG1 CH的序列来自Genbank AEL33691.1修饰的R97K。人IgG1 CL(Kappa)的序列来自Genbank CAC20459.1。也可以使用其他同种异型。
在US2018/0072800中证明了所有这些mAb、Fab片段和F(ab')2片段与导蛋白‑1的特异性结合。
[0025] 表1：
[0026]
[0027] 在实施方式中，抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，包含：
[0028] 可变区VH，包含：
[0029] ‑具有SEQ ID NO：1所示序列的H‑CDR1；
[0030] ‑具有SEQ ID NO：2所示序列的H‑CDR2；
[0031] ‑具有SEQ ID NO：3所示序列的H‑CDR3；
[0032] 可变区VL，包含：
[0033] ‑具有SEQ ID NO：4所示序列的L‑CDR1；
[0034] ‑具有序列YAS的L‑CDR2；
[0035] ‑具有SEQ ID NO：5所示序列的L‑CDR3；
[0036] 或者
[0037] 可变区VH，包含：
[0038] ‑具有SEQ ID NO：22所示序列的H‑CDR1；
[0039] ‑具有SEQ ID NO：23所示序列的H‑CDR2；
[0040] ‑具有SEQ ID NO：24所示序列的H‑CDR3；
[0041] 可变区VL，包含：
[0042] ‑具有SEQ ID NO：25所示序列的L‑CDR1；
[0043] ‑具有SEQ ID NO：26所示序列的L‑CDR2；
[0044] ‑具有SEQ ID NO：5所示序列的L‑CDR3。
[0045] 优选地，所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，包含选自以下对的VH和VL序列对：SEQ ID NO：21和13、SEQ ID NO：14和8、SEQ ID NO：15和9、SEQ ID NO：16和10、SEQ ID NO：17和11、SEQ ID NO：18和11、SEQ ID NO：19和10、SEQ ID NO：20和11、SEQ ID NO：16和11、SEQ ID NO：19和12、SEQ ID NO：15和10。更优选地，所述抗体是单克隆抗体或其抗原结合片段，包含一对VH和VL序列SEQ ID NO：16和10。
[0046] 抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段还可包含人IgG1恒定重链(CH)和/或人IgG1恒定轻链(CL)。在实施方式中，人IgG1 CH的序列来自Genbank AEL33691.1修饰的R97K。人IgG1 CL(Kappa)的序列来自Genbank CAC20459.1。在实施方式中，mAb为NP137并包含SEQ ID NO：16和10分别作为VH、VL序列，以及那些特异性IgG1 CH和CL。
[0047] 表2：序列的说明：
[0048]
[0049]
[0050] 适当情况下，IMGT下的CDR在表1中以粗体突出显示。
[0051] 作为可以使用的抗导蛋白‑1抗体，可以引用针对人导蛋白‑1或针对动物导蛋白‑1开发的其他抗体，尤其是单克隆抗体或其抗原结合片段，导蛋白‑1在物种之间非常同源。可以引用：Abcam抗体ab126729、ab122903、ab201324、ab39370；AF1109、AF6419、AF128。
[0052] 螯合部分：
[0053] 本文所用的“螯合部分”或“螯合试剂”或“螯合剂”是指能够螯合任何放射性同位素的化合物。螯合部分通常从水溶液中隔离相应的游离放射性同位素，从而能够将所述同位素应用于特定的生物应用。所述螯合部分是双功能螯合剂。如本文所用，“双功能螯合剂”或“双功能螯合试剂”是指具有金属结合部分功能和使得能够与抗体结合的化学反应性官能团的化合物。
[0054] 许多双功能螯合剂是本领域已知的。它们中的许多确实可以在市场上买到，并已常规用作PET成像剂。双功能螯合剂的实例有：NODAGA(1,4,7‑三氮杂环壬烷‑1‑戊二酸‑4,7‑二乙酸)、DOTA(1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7,10‑四乙酸)、p‑SCN‑Bn‑NOTA、p‑SCN‑Bn‑PCTA、p‑SCN‑Bn‑氧代‑DO3A、去铁胺‑p‑SCN、二亚乙基三胺五乙酸(DTPA)、1,4,8,11‑四氮杂环十四烷‑1,4,8,11‑四乙酸(TETA)、NOTA(4,7‑三氮杂环壬烷‑1,4,7‑三乙酸)。
[0055] 双官能螯合剂优选为这些螯合剂的酯。优选地，螯合剂是NODAGA‑NHS(NODAGA N‑羟基琥珀酰亚胺酯)或DOTA‑NHS(DOTA N‑羟基琥珀酰亚胺酯)。
[0056] 放射性同位素：
[0057] 本文所用的“放射性同位素”是化学元素的一种形式，其具有不稳定的核并在其衰变为更稳定的或稳定的形式期间发射辐射。本发明化合物的放射性同位素可以是用于成像或放射性核素治疗中的那些。
[0058] 可用于本发明的放射性同位素特别包括68Ga、64Cu、89Zr、186Re、188Re、153Sm、111In、99m 123 177 90 131 213 212 211 225
Tc、 I、 Lu、Y、 I、 Bi、 Bi、 At、 Ac。
[0059] 对于成像，可以更具体地提及68Ga、64Cu、89Zr、186Re、188Re、153Sm、111In、99mTc、123I。
[0060] 对于治疗，放射性核素可以更具体地选自用于体内放射治疗的那些，其是细胞毒177 90
性的金属诱导剂。可以使用β‑发射的放射性核素例如镥‑177( Lu)、钇‑90( Y)和碘‑131
131 213 212 211
( I)。也可使用α‑发射的放射性核素，例如铋‑213( Bi)、铋‑212( Bi)、砹‑211( At)和
225
锕‑225( Ac)。
[0061] 考虑它们的半衰期来优选地选择这些放射性同位素，所述半衰期优选长的半衰期，使得它们特别地适合体内使用，例如PET/SPECT成像或靶向放射治疗。
[0062] 化合物及组合物：
[0063] 一个或多个，例如2～10个螯合剂或螯合部分可以结合至一种抗体。因此，本发明的化合物可以包含：
[0064] ‑抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段，以及
[0065] ‑一个或多个特别是2～10个螯合部分与所述抗体或片段结合的螯合部分，[0066] 其中，所述螯合部分任选地与放射性同位素缔合。在实施方式中，一种或多种螯合部分与放射性同位素缔合。抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段可以是任何上述单克隆抗体或其抗原结合片段。在具体实施方式中，抗体是NP137。
[0067] 本发明的另一方面是包含此化合物的组合物，其包含：
[0068] ‑抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段，以及
[0069] ‑与所述抗体或片段结合的一个或多个螯合部分，特别是2～10个螯合部分，[0070] 其中，所述螯合部分与放射性同位素缔合，
[0071] 以及药学上可接受的载体。在实施方式中，与抗体结合的一个或多个螯合部分与放射性同位素缔合。
[0072] 在实施方式中，组合物可以包含未结合螯合部分的抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段。
[0073] 这些化合物和组合物可以使用已知的方法来制备，例如本文公开的那些方法。
[0074] 这些组合物还可以包含药学上可接受的载体或溶媒。
[0075] 化合物的制备：
[0076] 另一方面，本发明提供了一种制备本发明化合物的方法。所述方法包括以下步骤：
[0077] a)将螯合部分缀合至抗体或其片段；以及
[0078] b)回收抗体或其片段与螯合剂的缀合物。
[0079] 通过将胺反应性螯合部分与抗体或其片段孵育来获得缀合。孵育持续时间足以获得螯合。通常，持续时间为约5分钟～约2小时。孵育在不会使抗体或其片段变性的温度下进行。温度通常可以为约35℃～约42℃，优选为约37℃～约40℃。
[0080] 本文所述的放射性同位素的胺反应性螯合物结构是可商购的，例如DOTA‑NHS和NODAGA‑NHS酯。据认为，NHS酯(N‑羟基琥珀酰亚胺酯)将与抗体的N末端和赖氨酸(Lys、K)氨基酸残基侧链中的伯胺发生反应，就像肽发生这种情况一样。因此此处不需要详细说明该结合。
[0081] 一个或多个螯合剂部分(例如2～10个)可以与包含多个赖氨酸氨基酸的一种抗体结合。
[0082] 优选地，本发明化合物的制备方法还包括步骤：
[0083] c)将抗体或其片段和螯合剂的缀合物与互补的放射性同位素进行孵育；
[0084] 由此，生成本发明的化合物。然后，可以回收该化合物并配制于药物载体或溶媒中。
[0085] 孵育c)的持续时间足以确保放射性同位素结合。通常，持续时间为约5分钟～约2小时。孵育在不会使抗体或其片段变性的温度下进行。温度通常可以为约35℃～约42℃，优选为约37℃～约40℃。
[0086] 成像
[0087] 另一方面，本发明提供了一种对受试者中导蛋白‑1的存在或定位进行成像的方法，或者对器官或组织中导蛋白‑1的存在或积累进行成像的方法，或者对表达导蛋白‑1的癌症进行成像的方法，通过向生物体(动物，特别是哺乳动物，尤其是人类)给药有效量的化合物，其中，该化合物包括适合成像的金属同位素。
[0088] 另一方面，本发明涉及一种化合物用于癌症的体内成像的用途，所述化合物包含抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段、与所述抗体或片段结合的螯合部分、以及与该螯合部分缔合的放射性同位素。有利地，在癌细胞周围的细胞基质中检测到导蛋白‑1，其中，导蛋白‑1积累。
[0089] 在实施方式中，成像给出在本发明化合物存在的检测区域(例如器官或组织)中导蛋白‑1存在或表达的相对水平的信息。
[0090] “导蛋白‑1的积累”特别是指导蛋白‑1在癌细胞周围的细胞基质中的积累。因此，导蛋白‑1可以存在并积累在组织或器官中、癌细胞或肿瘤的附近或周围环境中。
[0091] 成像可以通过本领域技术人员已知的允许检测和/或可视化的任何合适的技术进行，特别是PET或SPECT，尤其是与CT扫描仪(计算机断层扫描)结合。放射性核素，例如由回旋加速器或发生器产生的放射性核素，附着至生物活性分子，形成放射性示踪剂，例如SPECT或PET放射性示踪剂。在本发明的情况下，该分子是由抗体或其片段和螯合剂制成的化合物，并且放射性核素与其结合构成放射性示踪剂。然后，将放射性示踪剂引入患者体内，优选通过注射，例如静脉内(IV)注射。
[0092] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于在受试者中成像导蛋白‑1的存在或定位(例如，可视化)的方法，包括：
[0093] a)向所述受试者给药(优选注射)本文所述的化合物；
[0094] b)通过体内成像(优选PET或SPECT成像)来检测或定位所述化合物。
[0095] 根据本发明的一个方面，提供了一种用于在受试者中进行癌症检测和定位的方法，包括：
[0096] a)向所述受试者给药化合物，包含：
[0097] ‑抗导蛋白‑1抗体或其抗原结合片段，
[0098] ‑与所述抗体或片段结合的螯合部分，以及
[0099] ‑与所述螯合部分缔合的放射性同位素，
[0100] b)通过癌细胞周围的细胞基质中的体内成像，来检测和定位所述癌症。
[0101] 在一个方面，在检测或定位之前，考虑步骤a)和b)之间的时间间隔(time laps)，这是时间或采集时间，例如约4小时～约172小时，特别是约12小时～约172小时，优选地约24小时～约96小时，或约24小时～约48小时，其允许所述化合物与隔离在细胞外基质中的导蛋白‑1结合。更准确地说，这个时间足以让给药的化合物离开血液循环、穿透一个或多个肿瘤并到达隔离在肿瘤细胞基质中的导蛋白‑1。这允许通过体内成像来检测或定位所述结合的化合物的后续步骤。
[0102] 在步骤b)或在“用于”中，体内成像检测或突出化合物在至少一种身体部分(例如，器官或组织)中的存在或积累。这种存在或积累在以下意义上是特异性的，即该化合物与积累到所述身体部分中的导蛋白‑1结合。其是特异性的，因为化合物给药和成像之间存在时间间隔。
[0103] 选择在给药和检测之间的潜伏期或时间间隔，以便在抗体或其片段特异性结合导蛋白‑1的时间来进行检测或成像。事实上，给药后，该化合物在身体及其器官中存在扩散阶段，并且仅在一段时间后，该化合物在器官或身体的部分中的存在对导蛋白‑1的存在和该化合物与其结合的存在是特异性的。时间间隔可以是约4小时～约168小时的数量级；通常，约4小时～约96小时。实际上，保留的时间间隔应与放射性同位素的半衰期相一致，反之亦然。
[0104] 根据本发明的另一个方面，因此提供了本文所述的化合物，其用于成像放射性同位素化合物。该用途特别旨在成像受试者中导蛋白‑1的存在或定位，如上文所述。该化合物特别用于体内成像，优选PET或SPECT成像。
[0105] 在实施方式中，该方法或用途提供身体的部分的图像，特别是器官或组织或其子部分(例如，肺、胰腺、膀胱、脾脏、肾脏、胃、结肠、小肠、肠、食道、肌肉、皮肤、脑)以及任选的周围组织或器官的图像。
[0106] 在实施方式中，该方法或用途提供身体的解剖部分的图像，特别是腿、手臂、胸部、腹部、头部及其子部分的图像。
[0107] 在实施方式中，该方法或用途用于提供全身的图像。
[0108] 在PET中，系统检测由放射性核素(示踪剂)间接发射的成对伽马射线，放射性核素通过放射性示踪剂引入体内。然后通过计算机分析构建体内示踪剂浓度的三维图像。在现代PET‑CT扫描仪中，三维成像通常是借助在同一台机器中同一时间段中对患者进行的CT X射线扫描来完成的。
[0109] 在PET中，可以计算标准摄取值，从而可以获得观察区域(例如，组织或器官)中示踪剂的定量。这可以允许对观察区域中导蛋白‑1的存在或表达进行一定的定量。作为替代方案，放射科医生具有通过简单观察来注意到示踪剂在区域中的积累的技能，该积累可与背景噪声区分开。这在本文中称为“阳性积累检测”。
[0110] 单光子发射计算机断层扫描成像术(SPECT)是一种类似于PET的核医学成像技术。它还使用放射性标记的示踪剂，并基于伽马射线的检测。与PET相比，SPECT中使用的放射性标记会发出可直接测量的伽马辐射。与CT扫描仪相结合，SPECT‑CT还可以提供三维成像。
[0111] 可以利用SPECT成像来比较观察区域(例如组织或器官)和肝脏。这可以允许产生定义为高于、等于或低于肝脏水平的结果。放射科医生具有通过简单观察来注意到示踪剂在区域中的积累的技能，该积累可与背景噪声区分开。这在本文中被称为“阳性积累检测”。
[0112] 由于大多数正电子发射放射性同位素的半衰期较短，放射性示踪剂传统上是使用靠近PET或SPECT成像设施的回旋加速器来产生的。氟18的半衰期足够长，使得用氟18标记68
的放射性示踪剂可以在异地进行商业化生产并运送到成像中心。另一方面，Ga可以在发生
18
器中产生，因此需要回旋加速器来处理。此外，镓68的半衰期接近 F的半衰期，使得这种放射性核素特别适用于PET成像。
[0113] 在实施方式中，111In被用作放射性核素。在其放射性衰变过程中，它会发射低能伽111 111
马(γ)光子，其半衰期为2.8天。 In通常在回旋加速器中产生。 In的半衰期足够长，用它标记的放射性示踪剂可以在异地进行商业化生产并运送到成像中心。
[0114] 该成像方法适合于检测和定位癌组织、癌器官或癌受试者体内的导蛋白‑1。如本文所用，术语“癌症”是指或描述哺乳动物中通常以不受调节的细胞增殖为特征的生理状况。本文使用的术语“癌症”和“癌性”意在涵盖疾病的所有阶段。本文所用的“癌症”是由生物体中受损细胞的不希望的生长、侵袭和在某些条件下的转移引起的任何恶性肿瘤。引起癌症的细胞受到损伤，通常失去了控制细胞分裂、细胞迁移行为、分化状态和/或细胞死亡机制的能力。癌症通常在原发部位形成，从而产生原发性癌症。局部扩散或扩散到身体远处部位的癌症称为转移。本文的成像方法将检测并定位那些在任何阶段表达导蛋白‑1的实体癌。
[0115] 本发明的化合物还可用于诊断患者中的癌症。根据这个方面，本发明提供了一种诊断患者中的癌症的方法，所述方法包括以下步骤：
[0116] a)向所述受试者给药本文所述的化合物或其药学上可接受的盐；
[0117] b)通过体内成像(优选PET或SPECT成像)来检测或定位所述化合物；以及
[0118] c)基于步骤b)诊断癌症。
[0119] 在步骤b)中，体内成像检测或突出化合物在至少一个身体部分例如器官或组织中的存在或积累。这种存在或积累是特异性的，即该化合物与所述身体部分中的积累的导蛋白‑1结合。如上文所述，它是特异性的，因为化合物给药和成像之间存在时间间隔。
[0120] 根据本发明的另一个方面，因此提供了一种本文所述的化合物，其用于为成像诊断放射性同位素化合物的用途。如上所述，该用途可以旨在体内成像受试者的导蛋白‑1的存在或定位。该用途可以有助于癌症的诊断。该化合物特别用于体内成像，优选PET或SPECT成像。
[0121] 本发明的抗体或其片段仅结合导蛋白‑1。因此，PET或SPECT成像中检测到的任何信号都表明导蛋白‑1存在。由于导蛋白‑1在癌细胞周围细胞基质中的积累以及本发明放射性标记化合物的敏感性，可以识别患者体内的癌细胞，从而诊断癌症、确认癌症、定位癌症和/或识别癌症的类型。癌症的类型包括癌变器官或组织的名称。
[0122] 另一方面，本发明涉及患者癌症预后的方法，所述方法包括以下步骤：
[0123] a)向所述受试者给药本文所述的化合物或其药学上可接受的盐；
[0124] b)通过体内成像(优选PET或SPECT成像)检测所述化合物；以及
[0125] c)基于步骤c)的检测来预测癌症。
[0126] 在步骤b)中，体内成像检测或突出化合物在至少一种身体部分例如器官或组织中的存在或积累。这种存在或积累在以下意义上是特异性的，即该化合物与所述身体部分中积累的导蛋白‑1结合。如上文所述，它是特异性的，因为化合物给药和成像之间存在时间间隔。
[0127] 该方法还包括进行医学预测的步骤，例如在正在或已经根据抗癌疗法进行治疗的患者中。
[0128] 根据本发明的另一个方面，因此提供了一种本文所述的化合物，其用于成像预后放射性同位素化合物的用途。如上所述，该用途可以特别旨在体内成像受试者的导蛋白‑1的存在或定位，并预测癌症。该化合物特别用于体内成像，优选PET或SPECT成像。
[0129] 本文所用的“预后”是指从疾病中恢复的可能性或疾病的可能发展或结果的预测。例如，步骤b)中检测到的单个物质越大，患者体内的癌性肿块越大，预后越差。
[0130] 在又一个方面，本发明提供了一种在有需要的受试者中确定癌症定位的方法，包括：
[0131] a)向所述受试者给药本文所述的化合物或其药学上可接受的盐；
[0132] b)通过体内成像(优选PET或SPECT成像)检测所述化合物；
[0133] c)导蛋白‑1存在或积累的可视化定位。
[0134] 在步骤b)中，体内成像突出了化合物在步骤c)中可视化的至少一个身体部分(例如，器官或组织)中的存在或积累。步骤c)中的身体部分(例如器官或组织)被可视化并被确定为包含导蛋白‑1的存在或积累。如果该身体部分由导蛋白‑1的可视化存在或积累，则强烈推测该部位存在癌症。这可以是在所述患者中癌症的发现，或身体癌性部分的识别，或同时识别两者。这种存在或积累在以上意义上是特异性的，即该化合物与所述身体部分中积累的导蛋白‑1结合。如上文所述，它是特异性的，因为化合物给药和成像之间存在时间间隔。
[0135] 根据本发明的另一个方面，因此提供了一种本文所述的化合物，其用于成像放射性同位素化合物的用途。如上所述，该用途可以旨体内成像受试者中的导蛋白‑1的存在或定位。该化合物特别用于体内成像，优选PET或SPECT成像。旨在检测癌细胞的细胞外周的细胞基质中的导蛋白‑1。
[0136] 该方法或用途还可以包括评估给定组织或器官(或多个组织和/或器官)中癌症的存在的步骤，该存在通过导蛋白‑1的存在或积累来证明。
[0137] 技术人员会立即清楚，本发明还能够在最早阶段来识别癌症的定位。值得注意的是，本发明对于识别太小而无法以其他方式检测的癌症的位点特别有用。
[0138] 用于成像的药物组合物或其单位剂型包含有效量的上述化合物。本发明的组合物或单位剂型可以含有约5GBq～约3GBq、特别是10GBq～500MBq的上述放射性核素标记的成像化合物，与药学上可接受的载体结合。上述使用的方法可以包括向患者、尤其是人类给药组合物或单位剂型，该组合物或单位剂型包含约0.1mCi～约100mCi的上述放射性核素标记的成像化合物。
[0139] 治疗
[0140] 根据另一个方面，提供了一种用于在有需要的受试者中治疗表达导蛋白‑1的癌症的方法，包括向所述受试者给药治疗有效量的如本文所述的化合物。该方法可以用于体内放射治疗。
[0141] 根据另一个方面，提供了本文所述的此类化合物用于治疗受试者中表达导蛋白‑1的癌症的用途。
[0142] 该化合物包含与螯合剂部分缀合的抗体或其片段，该抗体或片段特异性结合导蛋白‑1，该螯合剂部分与放射性核素缔合。放射性核素可以选自体内放射治疗中常用的那些，177
它们是细胞毒性的金属诱导剂。可以使用常用的β发射放射性核素，例如镥‑177( Lu)、钇‑
90 131 213 212
90( Y)和碘‑131( I)。也可以使用α发射放射性核素，例如铋‑213( Bi)、铋‑212( Bi)、
211 225
砹‑211( At)和锕‑225( Ac)。
[0143] 根据另一个方面，提供了用于治疗受试者中表达导蛋白‑1的癌症的本文所述的此类化合物。
[0144] 在实施方式中，177Lu用作放射性核素。它是一种γ和β发射体，半衰期为6.7天。它通常在回旋加速器中产生。它的半衰期足够长，使标记有它的放射治疗药物可以在异地进行商业化生产并运送到治疗中心。
[0145] 在实施方式中，225Ac用作放射性核素。它是发射α粒子的放射性核素，可在短衰变209
链中产生4个净α粒子同位素，成为稳定的 Bi，因此可被描述为α粒子纳米发生器。它有十天的半衰期。技术人员可以参考M.Miederer等人(Adv Drug Deliv Rev.2008；60(12):
1371‑1382)了解更多信息。
[0146] 通过常规途径将化合物递送至患者，优选通过肠胃外途径，例如通过注射。
[0147] 在实施方式中，该方法或用途为用于治疗被识别为对表达导蛋白‑1的癌症阳性的患者。具体地，使用本文公开的成像方法来识别患者。
[0148] 用于治疗的药物组合物或其单位剂型包含有效量的上述化合物。本发明的组合物或单位剂型可含有约5MBq～约1000MBq、特别是10MBq～500MBq的上述放射性核素标记的成像化合物，与药学上可接受的载体结合。
[0149] 成像(诊断)和治疗：
[0150] 在适当的情况下，先前针对“成像”和“治疗”提出的特征适用于“成像和治疗”。
[0151] 根据另一个方面，提供了一种识别适合用单克隆抗体或其片段治疗的癌症患者的方法，所述抗体或其片段能够抑制导蛋白‑1与其在癌细胞表面上的受体的相互作用，该方法包括：
[0152] a)向所述受试者给药本文所述的化合物；
[0153] b)通过体内成像(优选PET或SPECT成像)来检测所述化合物；
[0154] c)可视化定位导蛋白‑1的存在或积累；
[0155] d)针对可视化的癌症治疗所述患者。
[0156] 根据另一个方面，提供了一种识别适合用靶向放射疗法治疗的癌症患者的方法，优选包括：
[0157] a)向所述受试者给药本文所述的化合物；
[0158] b)通过体内成像(优选PET或SPECT成像)来检测所述化合物；
[0159] c)可视化定位导蛋白‑1的存在或积累；
[0160] d)针对可视化的癌症治疗所述患者。
[0161] 根据另一个方面，提供了一种治疗表达导蛋白‑1的癌症的方法，包括：
[0162] a)向所述受试者给药本文所述的化合物；
[0163] b)通过体内成像(优选PET或SPECT成像)来检测所述化合物；
[0164] c)可视化定位导蛋白‑1的存在或积累；
[0165] d)针对可视化的癌症治疗所述患者。
[0166] 在这些方法中，步骤a)和b)之间存在进一步的步骤，其包括上述等待获取时间，特别是4小时～172小时，优选地24小时～96小时，以获得所述化合物与隔离在肿瘤的细胞外基质中的导蛋白‑1的结合。
[0167] 在这些不同的方面，步骤a)中给药的化合物是本文描述的用于体内成像的化合物之一。
[0168] 在这些不同的方面，步骤d)中的治疗可以用现有的抗癌治疗来进行。然而，在优选的实施方式中，用特异性靶向表达导蛋白‑1的癌症的治疗进行治疗。因此，可以通过给药有效量的抗导蛋白‑1抗体来进行这种治疗，如US10,494,427中所公开的。该抗体可以是本文表1中公开的单克隆抗体之一，尤其是所谓的NP137。该方法包括给药治疗有效量的所述mAb或其片段。对于这些抗体的给药，技术人员可以参考所提及的美国专利。
[0169] 在实施方式中，治疗是如上所述的体内放射性治疗。因此，治疗包括向所述受试者给药治疗有效量的本文所述的化合物。该化合物包含与螯合剂部分缀合的抗体或其片段，该抗体或片段与导蛋白‑1特异性结合，该螯合剂部分与放射性核素缔合。所述抗体可以是本文表1中公开的单克隆抗体之一，尤其是所谓的NP137。抗体或片段与螯合部分缀合，螯合部分本身与放射性核素结合，如本文所解释和详述的。该化合物旨在与肿瘤中的导蛋白‑1结合，包括隔离在细胞基质中的导蛋白‑1，放射疗法可以对周围的肿瘤细胞或整个肿瘤发挥其作用。
[0170] 在实施方式中，111In被用作与用于成像的化合物缔合的放射性核素。
[0171] 在实施方式中，177Lu或225Ac用作与用于内部放射治疗的化合物缔合的放射性核素。
[0172] 成像化合物和治疗化合物的剂量如上文所公开。
[0173] 制剂
[0174] 本发明的组合物可以配制为药物组合物，所述药物组合物包含本发明的化合物和药学上可接受的载体。“药学上可接受的载体”是指在非生物学上的或其他方面不需要的材料，即，该材料可以给药于受试者而不会引起任何不期望的生物效应或以有害的方式与含有它的所述药学组合物的任何其他组分相互作用。如本领域技术人员所熟知的那样，自然选择载体以使活性成分的任何降解最小化，并使受试者的任何副作用最小化。对于药学上可接受的载体和药物组合物的其他成分的讨论，参见例如雷明顿的制药科学(Remington's Pharmaceutical Sciences)，第18版，Mack出版公司，1990年。一些合适的药物载体对于技术人员来说是显而易见的，并且包括例如水(包括无菌水和/或去离子水)、合适的缓冲液(例如PBS)、生理盐水、细胞培养基(例如DMEM)、人工脑脊髓液等。
[0175] 本公开的组合物的剂量可以是以单位剂量形式。本文所用的术语“单位剂量形式”是指适合作为单位剂量用于动物(例如，人)受试者的物理上离散的单位，每个单位含有预定量的本发明化合物，以足以产生所需效果的量与药学上可接受的稀释剂、载体或赋形剂一起计算。本领域技术人员可以容易地确定对所使用的组合物的精确配方的适当剂量、时间表和给药方法，以便在个体患者中实现药剂的期望有效量或有效浓度。
[0176] 对于成像，给药于动物、特别是人的本文所述的组合物的剂量应当足以在合理的时间范围内在个体中产生至少可检测量的诊断反应。剂量的规模将由所使用的特定药剂或其组合物可能伴随的任何不良副作用的存在来确定。只要有可能，通常期望将不良副作用保持至最低。
[0177] 对于治疗，给药于动物、特别是人的本文所述的组合物的剂量应当足以在合理的时间范围内在个体中产生至少可检测量的癌细胞细胞毒性、癌细胞死亡、癌症生长减少或消退。剂量的规模将由所使用的特定药剂或其组合物可能伴随的任何不良副作用的存在来确定。只要有可能，通常期望将不良副作用保持至最低。
[0178] 药物组合物或放射性药物组合物可以肠胃外给药，即通过注射，并且最优选地为水溶液。“药学上可接受的载体”是指生物相容性溶液，适当考虑无菌、pH、等渗性、稳定性等，并且可以包括任何和所有溶剂、稀释剂(包括无菌盐水、氯化钠注射液、林格注射液(Ringer's Injection)、葡萄糖注射液、葡萄糖氯化钠注射液、乳酸林格注射液和其它水性缓冲溶液)、分散介质、包衣、抗菌和抗真菌剂、等渗剂等。药学上可接受的载体还可以含有本领域技术人员熟知的稳定剂、防腐剂、抗氧化剂或其他添加剂，或本领域已知的其他媒介物。附图说明
[0179] 现在将参照附图使用非限制性实施例更详细地描述本发明，附图包括：
[0180] 图1：导蛋白‑1结合并保留在细胞外基质内。通过生物层干涉测定法分析h‑导蛋白‑1(人重组导蛋白‑1)与细胞外基质成分的结合：重组小鼠层粘连蛋白(m‑Laminin)、重组人纤连蛋白(h‑纤连蛋白)和重组人玻连蛋白(h‑玻连蛋白)。
[0181] 图2：片段缀合物的表征。a.表示DOTA(1,4,7,10‑四氮杂环十二烷‑1,4,7,10‑四乙酸)‑HS酯和NODAGA(1,4,7‑三氮杂环壬烷，1‑戊二酸‑5,7乙酸)‑HS酯分子用于螯合金属的化学。b.表示完整抗导蛋白‑1(NP137)、F(ab)'2和Fab与NODAGA或DOTA螯合物缀合。c.NP137)、F(ab)'2和Fab缀合物已通过合成和酶裂解产生，并在变性或非变性条件下进行电泳。d.与NODAGA螯合后，对NP137)、F(ab)'2和Fab的生物层干涉分析。数字表示NP137‑NODAGA、F(ab)'2‑NODAGA和Fab‑NODAGA的浓度。
[0182] 图3：肿瘤中的SPECT/Ct分析和导蛋白‑1检测。a.通过Q‑RT‑PCR对4T1和67NR细胞系的导蛋白‑1表达进行定量。b.携带4T1肿瘤(导蛋白‑1阳性)的Balb/c小鼠全身的断层闪烁成像(Tomographic scintigraphy)和X射线CT的最大强度投影，从左到右为在NP137‑111
NODAGA‑ In的IV注射后4小时、24小时、48小时和72小时采集。c.携带67NR(导蛋白‑1阴性)肿瘤的Balb/c小鼠全身的断层闪烁成像和X射线CT的最大强度投影，从左到右为在NP137‑
111
NODAGA‑ In的IV注射后24小时、48小时和72小时采集。
[0183] 图4：放射性积累的测量。在携带4T1异种移植物(导蛋白‑1阳性)的Balb/cJ小鼠中111
与67NR异种移植物(导蛋白‑1阴性)中，在24小时、48小时、72小时和96小时的a. In‑
111 111
NODAGA‑NP137‑Fab，b. In‑NODAGANP137‑F(ab)'2和c.‑ In‑NODAGA‑NP137的肿瘤生物分布比例的比较。放射性掺入通过注射剂量占肿瘤克数的百分比来定量。d.携带4T1异种移植
111
物的Balb/cJ小鼠中的 In‑NODAGA‑NP137在48小时、72小时和96小时的生物分布特性，并测量了所有器官。放射性掺入通过注射剂量占器官克数的百分比来定量。
[0184] 图5：放射性积累的测量
[0185] a.遗传修饰以发展乳腺肿瘤的MMTV/neuT小鼠肿瘤的全身的断层闪烁成像和X射111
线CT的最大强度投影，从左到右为在NP137‑NODAGA‑ In注射后24小时、48小时和72小时采
111
集。b.小鼠10个乳腺的示意图和位置。c.MMTV/NeuT小鼠中 In‑NODAGA‑NP137在72小时的生物分布特性，并测量肿瘤和所有小鼠器官。放射性掺入通过注射剂量占器官克数的百分比来定量。
[0186] 图6：新抗癌疗法
[0187] a.通过皮下注射100万个细胞，将EMT6细胞移植到Balb/cJ小鼠中。5天后，对动物177
IV注射PBS；DOTA‑NP137(抗导蛋白1)；DOTA‑NP137‑ Lu。对于PBS和DOTA‑NP137，n＝9只动
177 177
物/组；对于DOTA‑NP137‑ Lu，n＝12只动物/组；PBS和DOTA‑NP137‑ Lu之间以及DOTA‑
177 177
NP137和DOTA‑NP137‑ Lu之间p＜0.0001。b.DOTA‑NP137‑ Lu增强移植EMT6细胞系的小鼠的存活率(参见A)。对接受或未接受NP137处理的小鼠的存活进行Kaplan‑Meier生存曲线分
177
析。Mantel Cox测试；对于PBS和DOTA‑NP137，n＝9只动物/组；对于DOTA‑NP137‑ Lu，n＝12
177 177
只动物/组；PBS和DOTA‑NP137‑ Lu之间以及DOTA‑NP137和DOTA‑NP137‑ Lu之间p＜
0.0001。c.通过皮下注射100万个细胞，将4T1细胞移植到Balb/c小鼠中。8天后，对动物IV注
177
射PBS；DOTA‑NP137(抗导蛋白‑1)；DOTA‑NP137‑ Lu。对于PBS和DOTA‑NP137，n＝5只动物/
177 177
组；对于DOTA‑NP137‑ Lu，n＝6只动物/组。d.DOTA‑NP137‑ Lu提高移植4T1细胞系的小鼠的存活率(参见c)。对接受或未接受NP137处理的小鼠的存活进行Kaplan‑Meier生存曲线分
177
析。Mantel Cox测试；对于PBS和DOTA‑NP137，n＝5只动物/组；对于DOTA‑NP137‑ Lu，n＝6
177 177
只动物/组；PBS和DOTA‑NP137‑ Lu之间以及DOTA‑NP137和DOTA‑NP137‑ Lu之间p＜
0.0001。e.通过皮下注射500万个细胞，将SYO1细胞移植到NMRI裸鼠中。8天后，对动物IV注
177
射PBS；DOTA‑NP137(抗导蛋白‑1)；DOTA‑NP137‑ Lu。对于PBS和DOTA‑NP137，n＝9只动物/
177 177
组；对于DOTA‑NP137‑ Lu，n＝12只动物/组；PBS和DOTA‑NP137‑ Lu之间以及DOTA‑NP137
177 177
和DOTA‑NP137‑ Lu之间p＜0.0001。f.移植H358细胞的小鼠的NP137‑ Lu存活。对接受或未接受DOTA‑NP137处理的小鼠的Kaplan‑Meier生存曲线。Mantel Cox测试；对于PBS和
177 177
DOTA‑NP137，n＝8只动物/组；对于NP137‑ Lu，n＝9只动物/组；PBS和NP137‑ Lu之间以及
177
DOTA‑NP137和NP137‑ Lu之间p＝0.025。
[0188] 图7：对接受或未接受肝素处理的细胞的浓缩上清液中导蛋白‑1的定量。
[0189] 图8：携带H358(导蛋白‑1阳性)肿瘤的NMRI裸鼠全身的断层闪烁成像和X射线CT的111
最大强度投影，在NP137‑NODAGA‑ In注射后在24小时、48小时和72小时采集。

具体实施方式

[0190] 材料和方法：
[0191] 肿瘤细胞系
[0192] 4T1和67NR鼠乳腺癌细胞获自ATCC，并在补充有10％胎牛血清(FBS，Gibco)和抗生素(链霉素和青霉素)的RPMI‑1640(ATCC)培养基中培养。EMT‑6鼠乳腺癌细胞获自ATCC，并在补充有10％胎牛血清(FBS，Gibco)和抗生素(链霉素和青霉素)的伊格尔最低基础培养基(EMEM，ATCC)中培养。H358人肺腺癌H358细胞获自ATCC并在补充有10％BBS(Gibco)和抗生素的RPMI‑1640培养基(ATCC)中培养。将细胞维持在37℃下、由20％O2和5％CO2组成的湿润气氛下培养。
[0193] 蛋白质印迹：
[0194] 用冷PBS洗涤融合细胞并丢弃在裂解缓冲液(Tris 10mM pH7.6；SDS 5；甘油10％；Triton X‑100 1％，DTT 100mM)中。超声处理后，使用Pierce 660nm蛋白质测定试剂(Thermo Fisher Scientific)测定蛋白质，上样到SDS 4‑15％聚丙烯酰胺凝胶(Bio‑Rad)上后，使用Trans‑Blot Turbo转印(Bio‑Rad)转移至硝酸纤维素膜。将膜在室温下用导蛋白‑1的5％脱脂奶粉和5％BSA封闭一小时。使用一抗：导蛋白‑1抗体(Ab126729，Abcam)进行过夜染色。洗涤后，将膜与二抗(与HRP偶联的抗山羊兔抗体)在室温下孵育1小时。使用West Dura(Pierce)化学发光系统来增强信号。使用Chemidoch Touch(Bio‑Rad)进行成像。
[0195] 为了结合细胞基质中的导蛋白‑1，将1×106个细胞铺板于100mm3培养皿中。24小时后，用200μg/mL来自猪小肠粘膜的稀释在4mL不含FBS的培养基中的肝素钠盐(H3147‑100KU，Sigma)处理细胞。孵育一晚后，收集上清液。Centricons离心过滤器用于浓缩收集的上清液中的蛋白质。然后，使用Pierce660nm蛋白质测定试剂(22660，Thermo fisher Scientific)测定蛋白质浓度，将30μg蛋白质上样到免疫印迹上。
[0196] 体内临床前模型：
[0197] NP137人单克隆抗体(抗导蛋白‑1，HUM03)由Netris Pharma(里昂，法国)友情提供。8周龄雌性Balbc/J小鼠获自Janvier实验室(LeGenest‑Saint‑Isle，法国)。所有同基因6 5 6
乳腺癌细胞1×10EMT‑6；将5×104T1和1×1067‑NR皮下移植到8周龄雌性Balbc/J小鼠的背侧。将小鼠饲养在特定的无病原体条件下(Anican，里昂‑法国和Imthernat设施，HCL里昂，法国)，并存放在带有过滤盖的消毒笼中。它们的照料和住宿符合当地CECCAP道德委员
6 6
会制定的欧洲和法国机构准则。将人细胞系H358(1×10个细胞)或SKBR7(2×10个细胞)移植到8周龄雌性NMRI免疫受损小鼠上，并维持在相同条件下。
[0198] 通过每周三次用卡尺测量两个垂直的肿瘤直径来评估肿瘤体积。个体肿瘤体积计3
算如下：V＝(a*b2)/2。a为最大直径，b为最小直径。当肿瘤达到200‑400mm体积时，将小鼠
111 111 111
随机分成动物组，并接受 In‑NODAGA‑NP137、 In‑NODAGA‑NP137‑Fab、 In‑NODAGA‑
177
NP137‑F(ab')2或 Lu‑DOTA‑NP137的治疗，并提交进行影像/治疗。对于所有实验，小鼠均使用气体方案(异氟烷/氧气(2.5％/2.5％)进行麻醉。
[0199] 缀合：
[0200] 1mL抗导蛋白1单克隆抗体‑NP137(或其适当片段，所有条件相同)添加到Amicon Ultra‑1550k(UFC905096)上。使用含有1.2g/L Chelex 100的0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8)进行渗滤。使用10mL 0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8)溶液重复此步骤七次，每次洗涤之间以4900rpm离心25分钟。然后，使用超微量分光光度计来计算抗导蛋白1抗体浓度。然后，将抗体的浓度调整为50μM。将DOTA‑NHS酯/NODAGA(1,4,7‑三氮杂环壬烷，1‑戊二酸‑5,7乙酸)‑HS酯(CheMatech(C084))的储备液溶解在超纯水中，浓度为10mg/mL(＝13.13mM)。将50μM的抗导蛋白1抗体与所需的NODAGA‑NHS溶液的DOTA‑NHS以1：25的比例混合。反应在室温下进行4小时，然后转移至4℃下连续颠倒混合过夜。对PBS(Chelex)进行渗滤。使用10mL的PBS(Chelex)重复此步骤七次，每次洗涤之间以4900rpm离心25分钟。然后，使用超微量分光光度计计算DOTA/NODAGA‑抗‑导蛋白1抗体浓度。
[0201] 放射性标记：
[0202] 通过加入400μL的100mM醋酸盐缓冲液pH 5和40‑400MBq高纯度111In‑氯化物(Covidien，Petten，荷兰)，对NODAGA‑NP137、NODAGA‑NP137‑Fab或NODAGA‑NP137‑F(ab')2(40‑70μL，5mg/mL)进行放射性标记。将混合物在37℃下孵育30分钟。用100μl的1mM DTPA溶111
液终止反应。使用PD‑10柱去除游离 In。首先用15ml的0.1M醋酸盐缓冲液洗涤柱，然后将
111 111
标记的混合物上样到柱上并用醋酸盐缓冲液洗脱。 In‑NODAGA‑NP137、 In‑NODAGA‑
111
NP137‑Fab或 In‑NODAGA‑NP137‑F(ab')2首先被洗脱。使用ITLC‑SG(Biodex，Tec‑controlblack)和50mM柠檬酸盐缓冲液(pH 5)作为流动相评估每个0.5ml级分的放射化学
111
纯度(RCP)。放射性标记的NP‑137保留在原点，而未结合的 In则以0.9‑1的Rf迁移。合并最高放射化学物质纯度的级分。
[0203] 为了进行稳定性测试，将放射性标记的111In‑NODAGA‑NP137、111In‑NODAGA‑NP137‑111
Fab或 In‑NODAGA‑NP137‑F(ab')2的等分试样在37℃的2mL磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中孵育，并使用ITLC‑SG和0.1M柠檬酸盐缓冲液pH 5作为流动相评估放射性标记化合物的放射化学纯度(RCP)。
[0204] 相同方案可以应用于111In‑DOTA‑NP137、111In‑DOTA‑NP137‑Fab或111In‑DOTA‑NP137‑F(ab')2。
[0205] 相同方案用于与DOTA‑NHS生产177Lu–DOTA‑NP137。
[0206] 生物分布研究
[0207] 1MBq～10MBq的放射性标记的111In‑NODAGA‑NP137、111In‑NODAGA‑NP137‑Fab或111 111
In‑NODAGA‑NP137‑F(ab')2或 In DOTA‑NP137最大体积100μL，静脉注射到荷瘤小鼠中(每组n＝3或4)。在规定的时间：注射后4小时、24小时、48小时、72小时和96小时通过颈脱位牺牲小鼠。取出关注的组织(血液、心脏、肺、脾脏、肾脏、肌肉、脑和皮肤)，称重并在伽马闪烁计数器( 伽马计数器，Perkin Elmer，美国)中对放射性计数5分钟。尿液和粪便收集在单独的代谢笼中用于容纳和计数。组织分布表示为每克注射剂量的百分比(％ID/g)。肾脏和肝胆消除表示为注射的总活性下的积累放射性。
[0208] 成像：
[0209] 这些采集是使用对小动物的Nano‑SPECT/CT系统(Bioscan，华盛顿，DC，美国)进行2
的。该系统由四个探测器(215×230mm NaI，33PMT)组成，配备可互换的多针孔开口。
SPECT/CT采集是在IV注射5MBq～15MBq(兆贝克勒尔(mega Becquerel))放射性标记的分子后在不同时间进行的：24小时、48小时、72小时和96小时。CT(55kVp管电压、500ms曝光时间和180次投影)和SPECT/CT采集在取仰卧位的荷瘤小鼠中进行，该荷瘤小鼠放置在温控床上(Minerve，Esternay，法国)，以维持体温(设定为37℃)。采集进行的时间为40分钟，两个
111
15％窗口以 In的两个峰值171keV和245keV为中心。所有图像数据均使用InVivo‑Scope(Bioscan，华盛顿特区，美国)重建和分析。
[0210] Fab和F(ab')2片段的产生以及DOTA和NODAGA免疫缀合物的合成
[0211] 根据制造商的说明，使用PierceTMFab和F(ab')2制备试剂盒来产生NP137的蛋白水解片段。为了将DOTA或NODAGA与表面赖氨酸残基缀合，将NP137及其片段以螯合物：抗体为25：1的摩尔比与DOTA‑NHS‑酯或NODAGA‑NHS酯(Chematech，Dijon，法国)在无金属缓冲液中缀合，该缓冲液使用Chelex100树脂制备。简而言之，通过0.1M磷酸盐缓冲液(pH 8)渗滤交换50μM抗体，然后与1.25mM DOTA‑NHS‑酯或NODAGA‑NHS酯在旋转器上于25℃下反应4小时。
将反应转移到4℃下，连续颠倒混合过夜。通过对PBS渗滤去除过量的螯合剂。免疫缀合物储存在4℃下。
[0212] 抗体亲和力测定
[0213] 通过生物层干涉法测定抗体片段对导蛋白‑1的亲和力，所述生物层干涉法使用OctetRed96系统(ForteBio)在30℃下，在PBS、0.02％吐温‑20、0.1％ BSA(BB)中以1000rpm恒定振荡。简而言之，将重组人导蛋白‑1(R&D)‑包被的HIS1K生物传感器与一系列浓度的抗体或片段一起孵育，并观察缔合5分钟。然后，将生物传感器在BB中再孵育5分钟，以观察复合物的解离。使用ForteBio Octet RED评估软件6.1评估结合动力学，使用1：1结合模型得出kon、koff和KD值。
[0214] 结果
[0215] 导蛋白‑1是扩散性差的基质结合蛋白：
[0216] 多年来，免疫组织化学(IHC)一直是表征癌症靶标表达的参照。然而，这种策略最近因免疫检查点抑制剂获得的最新数据而受到质疑，因为患者体内的靶标表达和反应之间存在很大差异。因此，对PDL‑1抗体有反应的患者在IHC中PDL‑1的表达可以呈阴性，反之亦然。可以假设靶标表达随着时间的推移并不稳定，并且IHC是用诊断原发肿瘤时采集的石蜡块制备的，并且靶标表达在转移瘤中是不同的。因此，需要开发新的诊断策略来在全身范围内实时分析靶标表达，以突出肿瘤和转移瘤中蛋白质表达的所有变化。
[0217] 本发明人发现导蛋白‑1在肿瘤细胞中是不可扩散的，正如在描述轴突引导生长模型时所认为的那样。他们获得了子宫内膜和卵巢人肿瘤石蜡包埋肿瘤切片中的导蛋白‑1免疫组织化学图片(未显示)。IHC染色后发现人类肿瘤中的导蛋白‑1存在于细胞的基底膜中，表明在细胞外基质内积累。为了完成并确认此新发现，我们对基质成分中导蛋白‑1的分子伴侣进行了表征。使用生物层干涉(BLI)测定法筛选了导蛋白‑1与基质蛋白的相互作用。因此，导蛋白‑1能够与纤连蛋白、层粘连蛋白和玻连蛋白牢固地结合(图1)。
[0218] 肝素阻止导蛋白‑1与塑料材料的相互作用。虽然在非肝素处理条件下表达导蛋白‑1的4T1/EMT6细胞的条件化培养基中未检测到导蛋白‑1，但当添加肝素时，检测到导蛋白‑1(图7)。
[0219] 所有这些元素都表明导蛋白‑1被隔离在癌细胞的细胞外基质中，而不是扩散性的。
[0220] 用于导蛋白‑1实时检测的新伴随测试(伴随测试)的特征：
[0221] 所产生的化合物中片段(Fab或F(ab')2)的NP137与铟1111(111In)融合，以通过SPECT/Ct分子成像进行检测(图2a)。形成的三种分子被认为在体内具有不同的分子活性，完整的抗体在血流中具有更长的半衰期，并且Fab’能够更快地渗透到肿瘤中，F(ab')2是中间形式(图2b)。更准确地说，抗体或其片段已与金属螯合剂(DOTA或NODAGA)缀合，该金属螯合剂与抗体或其片段的赖氨酸残基结合；并且螯合剂与铟同位素缔合或结合，以完成放射性示踪剂。空间排阻色谱纯化后，获得放射性标记的NP‑137、Fab和F(ab')2，放射化学纯度111 111
(RCP)超过98％。 In‑NODAGA‑NP137的放射化学收率为70％， In‑NODAGA‑NP137‑Fab的放
111
射化学收率为60％， In‑NODAGA‑NP137‑F(ab')2的放射化学收率为65％。孵育5天后，磷酸盐缓冲盐水(pH7.4)中的RCP仍大于95％，表明具有适合进行体外和体内实验的动力学稳定性。我们通过生物层干涉法表明，这种结合同位素所必需的化学修饰不会干扰结合导蛋白‑
1的三种形式的能力(图2d)。
[0222] 图2d所示实验的生物层干涉分析后的KD计算显示高亲和力KD如下：
[0223] NP137‑NODAGA：1.72E‑10
[0224] F(ab')2‑NODAGA：1.51E‑10
[0225] Fab‑NODAGA：1,52E‑10。
[0226] 为了分析这些分子在体内检测导蛋白‑1的能力，我们使用了两种同基因肿瘤模型：导蛋白‑1表达阳性的4T1细胞和导蛋白‑1阴性的67NR细胞作为阴性对照。
[0227] 首先，通过Q‑RT‑PCR对4T1和67NR细胞系进行导蛋白‑1表达的定量。图3a的结果证实仅在4T1细胞中存在导蛋白‑1表达。
[0228] 第二，携带4T1(导蛋白‑1阳性)肿瘤的Balb/cJ小鼠全身的断层闪烁成像和X射线111 111 111
CT的最大强度投影，在 In‑NODAGA‑NP137‑F(ab')2、 In‑NODAGA‑NP137‑Fab或 In‑NODAGA‑NP137的VI注射后在24小时、48小时、72小时和96小时采集。类似地，携带67NR(导蛋
111
白‑1阴性)肿瘤的Balb/c小鼠全身的断层闪烁成像和X射线CT的最大强度投影，在 In‑
111 111
NODAGA‑NP137‑F(ab')2、 In‑NODAGA‑NP137‑Fab或 In‑NODAGA‑NP137的VI注射后在24小时、48小时和72小时采集。
[0229] 111In‑NODAGA‑NP137组的4T1肿瘤中可检测到较强的肿瘤摄入(图3b)，而在111In‑111
NODAGA‑NP137‑F(ab')2组和 In‑NODAGA‑NP137‑Fab组中可检测到较慢的摄入(数据未显示)。有趣的是，在携带67NR的小鼠中所有分子都没有检测到摄入，这表明肿瘤摄入是肿瘤导蛋白‑1特异性的(比较图3B和3C)。在图8的H358肿瘤中也可以看到局部肿瘤摄入。
[0230] 我们对67NR和4T1细胞之间的摄入比率进行了体外定量，其表明在处理后48小时检测到最佳的特异性掺入(图4a‑c)。这些数据证实，全抗体比其他形式的肿瘤掺入更好。
[0231] 在48小时、72小时和96小时，在携带4T1异种移植物的Balb/cJ小鼠中测量所有器111
官的 In‑NODAGA‑NP137的生物分布特性。放射性掺入通过注射剂量占器官克数的百分比来定量。经过指定时间间隔后，在肿瘤中检测到接近注射剂量(ID)25％的强肿瘤摄入量。在其他器官中的掺入没有显示出非特异性结合(图4d)。
[0232] 一种新的诊断工具
[0233] 在表达内源水平导蛋白‑1的乳腺管腔乳腺癌MMTV‑NeuT(20)转基因模型中进行了111
进一步的测试。图5a显示了注射 In‑NODAGA‑NP137后，从左到右在24小时、48小时和72小时的时间的发展。
[0234] 在脂肪垫组织以及动物的10个乳腺中检测到强烈染色(见图5b)。
[0235] 非常有趣的是，一些肿瘤甚至在通过乳腺触诊检测到之前被可视化，这增强了该示踪剂作为对表达导蛋白‑1的肿瘤的早期检测工具的相关性。这个结果是出乎意料的。在肿瘤掺入测量后，可以检测到接近注射剂量(ID)8％的强烈肿瘤摄入，在所有肿瘤中认为111
In‑NODAGA‑NP137可以是良好的诊断工具，用于描述在肿瘤块方面出现小病变时导蛋白‑
1的表达(图5c)。
[0236] 图8显示NP137‑NODAGA‑111In在导蛋白‑1阳性人异种移植鼠模型H358(人非小细胞肺癌模型)中的强烈积累。EMT6(鼠乳腺癌细胞系)获得了类似的结果(未显示)。两种模型中的肿瘤摄取均超过ID/g(注射剂量/器官重量(以克计))的10％。
[0237] NP137‑DOTA‑177Lu是靶向耐药肿瘤的新型治疗诊断化合物。
[0238] 我们开发了一种与镥177融合的抗体(图6中称为DOTA‑NP137‑177Lu)，它会发射β辐射，有效损伤癌细胞。镥会发射1.8mm范围内的强剂量辐射，与靶向治疗相结合时具有高特异性。
[0239] 我们首先使用该分子处理4T1和EMT6细胞系。这些细胞系对作为单一药剂的NP137具有耐药性，并且已知属于最具攻击性的临床前模型。然而，与使用PBS或DOTA‑NP137的对177
照组相比，用单次10MBq剂量的NP137‑DOTA‑ Lu处理后，肿瘤生长减少(图6a、c和e)。结果，
177
NP137‑DOTA‑ Lu处理组中小鼠的存活率增加(图6b和d)。这些结果表明，这种新分子可以在表达导蛋白‑1的肿瘤中导致体内的抗肿瘤活性。在人肺癌异种移植模型H358中进一步评
177
估了NP137‑ Lu的治疗功效，其中治疗再次显著降低了肿瘤生长速率，证实了明显的抗肿瘤作用(p<0.001)(图6f)。
[0240] 讨论
[0241] 在此研究中，我们描述了通过核医学SPECT/CT在体内检测导蛋白‑1的新伴随测试。导蛋白‑1已被表征为目前在临床测定中评估的多种类型癌症的治疗靶标，但由于常规测试中缺乏试剂(即，用Elisa试剂进行血清检测、质谱分析、揭示FFPE样品中导蛋白‑1的病理学稳定性)，我们开发了新颖、简单且稳健的伴随测试来检测体内癌细胞中导蛋白‑1的高111
表达。根据我们的结果，我们可以表明在我们的临床前模型中检测到 In‑NODAGA‑NP137
111
或 In‑DOTA‑NP137的非特异性结合或非常低的非特异性结合，正如导蛋白‑1阴性肿瘤模型67NR中的RCP所揭示的那样。这些结果表明导蛋白‑1在成人水平上并未广泛表达，并且对肿瘤组织表现出高度特异性。因此，在肿瘤形成过程中重新表达的发育性导蛋白‑1基因的靶向似乎是提高肿瘤成像特异性的关键解决方案。
[0242] 为了确定SPECT或PET成像的最佳分子，我们基于临床使用的人抗导蛋白‑1NP137单克隆抗体设计了三种不同的药剂：NP137‑IgG1完整形式、NP137‑F(ab')2和NP137‑Fab。所有这些分子都可以与导蛋白‑1强有力地结合。对于含有完整NP137‑IgG1和NP137‑Fab的放射性示踪剂，观察到了具有肿瘤特异性的最佳体内积累；最佳的是含有完整抗体的放射性示踪剂。完整NP137‑IgG1显示出在肿瘤内最佳的积累，以及在临床中转移的最有希望的结果。这种转移可以假设用于分子成像的所有金属和化合物。
[0243] 在更基础的研究方面，导蛋白‑1多年来在神经发育中被描述为具有可扩散梯度的分泌分子。导蛋白‑1是配体，因此不是成像或内部放射治疗的靶标的主要选择。
[0244] 此外，基于此证明的肿瘤掺入，我们设计了新型分子，其中，我们将NP137‑DOTA与177
镥177融合以形成NP137‑DOTA‑ Lu。结果，该分子也在表达导蛋白‑1的肿瘤内特异性积累。
镥177是一种β发射体，能够在肿瘤组织内提供1.8mm范围内的强剂量辐射。因此，我们注意到肿瘤生长的显著减少与荷瘤小鼠更好的存活率相关。值得注意的是，这些肿瘤类型对作为单一药剂的NP137完全耐药。生存研究表明，在小鼠肿瘤模型和人类肿瘤模型中，用此化合物治疗的小鼠的寿命是对照组的两倍。由于NP137已证明其作为单一药剂的安全性，并
177
且 Lu剂量已很好地表征，使该分子可以以简单的方式转移来治疗肿瘤。

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