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选择性耐受-选择性生成耐受性树突状细胞的方法

申请号 CN202280052116.2 申请日 2022-07-29 公开(公告)号 CN117813375A 公开(公告)日 2024-04-02
申请人 特兰西穆内有限公司; 耶鲁大学; 发明人 R·埃德尔森; K·亨柯; O·索伯列夫; D·汉隆; A·瓦萨尔; 辰野一树; P·韩;
摘要 本 发明 涉及选择性生成耐受性树突状细胞的方法。本发明还涉及通过所述方法获得的患者特异性耐受性树突状细胞,当在移植前施用时,该方法降低移 植物 的免疫原性。本发明还涉及用于减少或 预防 炎性病况例如移植物抗宿主病的患者特异性耐受性树突状细胞。具体而言,该方法可用于减少移植物抗宿主病。本发明的耐受性树突状细胞还可用于 治疗 自身免疫性 疾病 。
权利要求

1.选择性产生耐受性树突状细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供来自供体的树突状细胞;
b)将步骤a)所述的树突状细胞暴露于凋亡剂;
c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
d)将步骤b)所述的凋亡供体树突状细胞与来自步骤c)的生理受体树突状细胞组合。
2.根据权利要求1的方法,其中在步骤d)之后,进行将步骤b)所述的凋亡供体树突状细胞与步骤c)所述的生理受体树突状细胞共孵育的步骤。
3.根据权利要求2的方法,其中所述共孵育步骤进行至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
4.根据前述权利要求中任一项的方法,其中将所述凋亡供体树突状细胞与来自所述受体的所述生理树突状细胞组合的步骤d)在所述受体内进行。
5.根据前述权利要求中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞衍生自所述供体的体外血液样品。
6.根据前述权利要求中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞已通过来自所述供体的PBMC的板传递获得。
7.根据前述权利要求中任一项的方法,其中步骤b)所述的凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA、和/或5‑基乙酰丙酸和光。
8.根据权利要求7的方法,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
9.根据权利要求7或8的方法,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
10.根据前述权利要求中任一项的方法,其中步骤c)所述的生理树突状细胞已通过来自所述受体的PBMC的板传递获得。
11.根据前述权利要求中任一项的方法,其中所述供体和/或受体是哺乳动物,优选人。
12.选择性产生耐受性树突状细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供来自受体的互补单倍体供体的树突状细胞;
b)将步骤a)所述的树突状细胞暴露于凋亡剂;
c)提供来自所述受体单倍体供体的生理树突状细胞;和
d)将步骤b)所述的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与步骤c)所述的生理单倍体供体树突状细胞组合。
13.根据权利要求12的方法,其中在步骤d)之后,进行将步骤b)所述的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与步骤c)所述的生理单倍体供体树突状细胞共孵育的步骤。
14.根据权利要求13的方法,其中所述共孵育步骤进行至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
15.根据权利要求12的方法,其中将步骤b)所述的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与步骤c)所述的生理单倍体供体树突状细胞组合的步骤d)在所述单倍体供体内进行。
16.根据权利要求12至15中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞衍生自所述受体的互补单倍体供体的体外血液样品。
17.根据权利要求12至15中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞已通过来自所述受体的互补单倍体供体的PBMC的板传递获得。
18.根据权利要求12至17中任一项的方法,其中步骤b)所述的凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或5‑氨基乙酰丙酸和光。
19.根据权利要求18的方法,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
20.根据权利要求18或19的方法,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
21.根据权利要求12至20中任一项的方法,其中步骤c)所述的生理树突状细胞已通过来自所述受体的单倍体供体的PBMC的板传递获得。
22.根据权利要求12至21中任一项的方法,其中所述互补的单倍体供体、所述单倍体供体和/或所述受体是哺乳动物,优选人。
23.选择性产生耐受性树突状细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供来自受体的树突状细胞;
b)将步骤a)所述的树突状细胞暴露于凋亡剂;
c)提供来自所述受体的生理树突状细胞;和
d)将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞组合。
24.根据权利要求23的方法,其中在步骤d)之后,进行将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞共孵育的步骤。
25.根据权利要求24的方法,其中所述共孵育步骤进行至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
26.根据权利要求23的方法,其中将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞组合的步骤c)在所述受体内进行。
27.根据权利要求23至26中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞衍生自所述受体的体外血液样品。
28.根据权利要求23至27中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞已通过来自所述受体的PBMC的板传递获得。
29.根据权利要求23至28中任一项的方法,其中步骤b)所述的凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或5‑氨基乙酰丙酸和光。
30.根据权利要求29的方法,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
31.根据权利要求29或30的方法,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
32.根据权利要求23至31中任一项的方法,其中步骤c)所述的生理树突状细胞已通过来自所述受体的PBMC的板传递获得。
33.根据权利要求23至32中任一项的方法,其中所述供体和受体是哺乳动物,优选人。
34.通过根据权利要求1至11中任一项的方法获得的耐受性树突状细胞。
35.通过根据权利要求12至22中任一项的方法获得的耐受性树突状细胞。
36.通过根据权利要求23至33中任一项的方法获得的耐受性树突状细胞。
37.根据权利要求34至36的耐受性树突状细胞,其用于预防或减少移植物抗宿主病的方法中。
38.选择性产生耐受性树突状细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
a)提供从受试者获得的树突状细胞的第一样品;
b)将步骤a)所述的树突状细胞暴露于凋亡剂;
c)提供从所述受试者获得的树突状细胞的第二样品;和
d)将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的树突状细胞组合。
39.根据权利要求38的方法,其中在步骤d)之后,进行将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞共孵育的步骤。
40.根据权利要求39的方法,其中所述共孵育步骤进行至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
41.根据权利要求38至40中任一项的方法,其中将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的树突状细胞组合的步骤c)在所述受试者体内进行。
42.根据权利要求38至41中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞衍生自所述受试者的体外血液样品。
43.根据权利要求38至42中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞已通过来自所述受试者的PBMC的板传递获得。
44.根据权利要求38至43中任一项的方法,其中所述方法进一步包括将所述树突状细胞与抗原分子一起孵育的步骤a1)。
45.根据权利要求44的方法,其中所述抗原分子是自身抗原。
46.根据权利要求44或45的方法,其中所述抗原分子衍生自天然来源、化学合成或重组产生。
47.根据权利要求44或45的方法,其中所述抗原分子衍生自细胞。
48.根据权利要求45的方法,其中所述自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。
49.根据权利要求38至48中任一项的方法,其中步骤b)所述的凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或5‑氨基乙酰丙酸和光。
50.根据权利要求49的方法,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
51.根据权利要求49或50的方法,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
52.根据权利要求38至51中任一项的方法,其中步骤c)所述的树突状细胞已通过来自所述受试者的PBMC的板传递获得。
53.根据权利要求38至52中任一项的方法,其中所述受试者是哺乳动物,优选人。
54.通过根据权利要求38至53中任一项的方法获得的耐受性树突状细胞。
55.根据权利要求54的耐受性树突状细胞,其用于治疗自身免疫性疾病
56.根据权利要求55使用的耐受性树突状细胞,其中所述自身免疫性疾病选自下组:多发性硬化症、类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症、寻常型天疱疮、皮癣、重症肌无、甲状腺炎、硬皮病、Sjogren综合征、血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、自身免疫性溶血性贫血、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、Addison病、腹泻性乳糜泻、慢性疲劳综合征、结肠炎、Crohn病、纤维肌痛、甲状腺功能亢进症、Graves病、甲状腺功能减退症、Hashimoto病、子宫内膜异位症、恶性贫血、Goodpasture综合征、Wegener病和风湿热。
57.在有此需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的权利要求54所述的耐受性树突状细胞。
58.治疗有此需要的受试者的自身免疫性疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的耐受性树突状细胞,其中所述耐受性树突状细胞包含生理树突状细胞,所述生理树突状细胞包含来自从所述受试者、自身抗原、其片段或其组合获得的凋亡树突状细胞的材料。
59.权利要求57或58的方法,其中所述自身免疫性疾病选自下组:多发性硬化症、类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症、寻常型天疱疮、牛皮癣、重症肌无力、甲状腺炎、硬皮病、Sjogren综合征、血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、自身免疫性溶血性贫血、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、Addison病、腹泻性乳糜泻、慢性疲劳综合征、结肠炎、Crohn病、纤维肌痛、甲状腺功能亢进症、Graves病、甲状腺功能减退症、Hashimoto病、子宫内膜异位症、恶性贫血、Goodpasture综合征、Wegener病和风湿热。
60.权利要求58或69的方法,其中所述自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮钙粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、水通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。
61.离体耐受性树突状细胞,其包含来自从受试者获得的凋亡树突状细胞的材料。
62.权利要求61的离体耐受性树突状细胞,其进一步包含自身抗原或其片段。
63.组合物,其包含:
(a)从受试者获得的树突状细胞样品;
(b)凋亡剂;和
(c)自身抗原或其片段。
64.权利要求63的组合物,其中所述凋亡剂包括补骨脂素、磷酸核黄素或5‑氨基乙酰丙酸。
65.权利要求64的组合物,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
66.权利要求65的组合物,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
67.权利要求61或62的离体耐受性树突状细胞,或权利要求63‑66中任一项的组合物,其中所述自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮钙粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、水通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。

说明书全文

选择性耐受‑选择性生成耐受性树突状细胞的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及选择性产生耐受性树突状细胞的方法。本发明还涉及在移植前通过生成耐受性树突状细胞来降低移植物的免疫原性的方法。本发明还涉及耐受性树突状细胞,
包括通过所述方法获得的耐受性树突状细胞。当在移植前施用时,耐受性树突状细胞会降
低移植物的免疫原性。本发明还涉及用于减少或预防炎性病况例如移植物抗宿主病和/或
自身免疫性疾病的耐受性树突状细胞。具体而言,耐受性树突状细胞可用于减少移植物抗
宿主病。
[0002] 发明背景
[0003] 器官、组织或细胞从一个遗传不同的人(供体)到另一个人(受体)的移植仍然是多种疾病的最终疗法,但受到器官和供体可用性的限制。合适的供体是具有相同或接近相同
的细胞表面抗原(称为主要组织相容性抗原(MHC)或HLA抗原)谱的个体。然而,来自同一个
体的移植物(自体移植物(autologous transplant)或自体移植物(autograft))并不总是
可用的,并且来自不同个体的移植物(同种异体移植物(allogeneic transplant)或同种异
体移植物(allograft))的广泛应用受到MHC或HLA抗原差异的限制。每种HLA抗原都有许多
替代形式(等位基因),因此两个不相关的个体HLA紧密匹配的机会极小。将一个遗传不同的个体的器官或组织移植到另一个个体后发生的不良反应可能非常危险。主要不良反应是移
植的器官或组织的免疫排斥。这可能是由于受体(器官、皮肤等)的免疫系统攻击移植物引
起的。此外,移植物还可能攻击受体(GvHD)。为了预防或限制排斥反应,患者通常接受免疫抑制药物的组合。这些药物通常具有全局免疫抑制作用,从而大大增加了受体对严重感染
的易感性。这些不良反应促使人们寻找能够更有选择性地抑制移植的组织的排斥反应,同
时保持免疫系统其余部分完整且不损伤其他重要器官的疗法。逆转移植的器官的排斥反应
的一种方法是应用体外光分离置换术(ECP),该过程涉及使用DNA交联剂(如8‑MOP)和紫外
线处理血液。解释ECP在治疗移植物抗宿主病(GvHD)中的积极作用的一种可能机制是,血液样品中含有的单核细胞在暴露于8‑MOP和紫外线的组合后会分化为免疫抑制的树突状细
胞。这些免疫抑制的树突状细胞被认为可以促进免疫耐受性。然而,这对于提高同种异体移植的选择性耐受以增加合适的供体库,推进治疗和/或预防自身免疫性疾病,特别是移植物抗宿主病,并进一步破译ECP和ECP样过程的免疫抑制作用背后的可能机制具有重要价值。
[0004] 发明概述
[0005] 本发明的一个目的是提供选择性产生耐受性树突状细胞的方法。另一个目的是提供选择性产生抗原特异性耐受性树突状细胞的方法。另一个目的是提供选择性产生在移植
前降低移植物的免疫原性的耐受性树突状细胞的方法。
[0006] 本发明的另一个目的是提供耐受性树突状细胞,包括离体耐受性树突状细胞。
[0007] 本发明的另一个目的是提供通过本发明的方法获得的耐受性树突状细胞。
[0008] 本发明的另一个目的是提供用于预防或减少GvHD的耐受性树突状细胞。
[0009] 本发明的另一个目的是提供用于预防或减少器官移植物(例如皮肤)的排斥反应的耐受性树突状细胞。
[0010] 另一个目的是提供治疗GvHD的方法。
[0011] 本发明的另一个目的是提供用于治疗自身免疫性疾病的耐受性树突状细胞。
[0012] 另一个目的是提供治疗自身免疫性疾病的方法。
[0013] 这些和其他目的将从下文通过独立权利要求的主题来解决的后续描述中变得显而易见。本发明的一些优选实施方案构成了从属权利要求的主题。然而,本发明的其他实施方案可以从后续描述中获得。
[0014] 下面示例性描述的本发明可以在不存在本文未具体公开的任何一个或多个元素、一个或多个限制的情况下适当地实践。
[0015] 本发明就下面的特定实施方案并参考某些图形进行描述,但本发明不限于此,而仅受权利要求书的限制。
[0016] 本发明在某种程度上基于下文呈现的数据和临床试验,其导致这样的理解:如果凋亡树突状细胞被健康树突状细胞吸收,那么凋亡树突状细胞可以耐受未来移植受体针对
同种异体移植物的免疫系统。令人惊讶的是,发明人发现凋亡树突状细胞可以衍生自供体
或未来的受体。而且,如果凋亡树突状细胞衍生自供体,则供体相较于未来的受体可能是
HLA匹配的或错配的。
[0017] 优选地,在本发明的背景下,在ECP衍生的过程中体外产生健康树突状细胞。发明人观察到,当含有单核细胞和血小板的白细胞分离血液样品通过板时,可以有效地生成树
突状细胞。然而,血液样品必须至少含有单核细胞。已经发现,单核细胞在施加剪切应后成熟为健康的树突状细胞。如果血小板存在,则成熟过程可以改善。重要的是,使用这种方法,单核细胞可以成熟为健康的树突状细胞,而不需要添加昂贵的细胞因子混合物。由于上述过程模拟了假定在体内发生的一些方面(参见Han et al.,2020“, Platelet P‑selectin initiates cross‑presentation and dendritic cell differentiation in blood 
monocytes”,Science Advances),通过板传递生成的树突状细胞在下文中被称为“生理树突状细胞(physiological dendritic cells)”(phDC)。
[0018] 因此,假设衍生自移植供体或未来受体的凋亡树突状细胞为来自未来受体的phDC提供抗原来源,从而启动有效的耐受性免疫应答。本发明通过使凋亡树突状细胞与phDC直
接触来促进和改进该过程。直接孵育可以在施用选择性产生的耐受性树突状细胞后改善
未来受体对同种异体移植物的耐受性,从而减少或消除诸如GvHD的炎性病况。本发明的
phDC比通过其他方法例如暴露于细胞因子混合物产生的树突状细胞更有效。此外,phDC可
以以标准化和可重复的方式生产,从而更好地控制生成强耐受性树突状细胞的过程。此外,phDC可用于治疗自身免疫性疾病。
[0019] 上面描述的耐受性树突状细胞的选择性生成可以以不同的方式开发,这些方式在下面作为第一、第二和第三方面进行描述。
[0020] 第一方面:选择性产生耐受性树突状细胞的方法,其中供体树突状细胞呈现凋亡
[0021] 在第一方面,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0022] a)提供来自供体的树突状细胞;
[0023] b)将步骤a)的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0024] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0025] d)将步骤b)的凋亡的供体树突状细胞与来自步骤c)的生理受体树突状细胞结合。
[0026] 在一个实施方案中,该方法在移植之前进行。
[0027] 在一个实施方案中,该方法用于在移植前选择性降低移植物或其一部分的免疫原性。
[0028] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0029] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,来自受体的phDC不会暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,来自受体的phDC在该方法期间的任何时间点都不暴露于凋亡剂。
[0030] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞获自供体。
[0031] 在一个实施方案中,步骤c)的树突状细胞获自受体。
[0032] 原则上,从供体获得树突状细胞后,供体树突状细胞可以是活的或不是活的。供体树突状细胞可以例如使其凋亡并冷冻保存直至它们与来自步骤c)的生理受体树突状细胞结合。
[0033] 在一个实施方案中,供体是同种异体的。在一个实施方案中,供体是单倍体供体。
[0034] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0035] a)提供来自供体的树突状细胞;
[0036] b)将步骤a)的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0037] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0038] d)将步骤b)的凋亡供体树突状细胞与步骤c)的生理受体树突状细胞组合,并且
[0039] d1)共孵育步骤d)的混合物。
[0040] 在一个实施方案中,共培养混合物的步骤d1)进行至少0.5h、1h、2h、3h、4h、5h或6h。
[0041] 在一个实施方案中,将凋亡供体树突状细胞与来自受体的生理树突状细胞组合的步骤d)在受体内进行。
[0042] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0043] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,来自受体的phDC不会暴露于凋亡剂。
[0044] 在该方法的步骤b)中,将在方法步骤a)中从供体获得的树突状细胞暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或基乙酰丙酸和光。特别优选的补骨脂素是8‑MOP和amotosalen。最优选的补骨脂素是8‑MOP。在最优选的实施方案中,凋亡剂是8‑MOP和UVA的组合。
[0045] 实施方案应被优先选择,使得基本上来自供体的树突状细胞都与凋亡剂接触。在8‑MOP/UVA的情况下,基本上来自供体的树突状细胞都与8‑MOP接触并暴露于UVA光。8‑MOP
2 2
和UVA的典型剂量为1J/cm至3J/cmUVA与浓度100ng/mL至300ng/mL的8‑MOP组合。
[0046] 在优选的实施方案中,UVA的剂量等于或低于3J/cm2、等于或低于2J/cm2、或等于或2
低于1J/cm  。在其他优选的实施方案中,8‑MOP的剂量等于或低于300ng/mL、250ng/mL、
200ng/mL或100ng/mL。在特别优选的实施方案中,8‑MOP的剂量为200ng/mL并且UVA的剂量
2
为1J/cm。
[0047] 在本发明的上下文中,树突状细胞尤其可以通过使用体外光分离置换术(ECP)衍生过程的单核细胞的板传递来获得。
[0048] 用于体外激活单核细胞和由其生成树突状细胞的方法和装置描述于WO2014/106629A1、WO2014/106631A1、WO2016/001405A1和WO2017/005700A1中,每一篇均通过引用其整体并入本文。ECP描述了一种过程,其中衍生自血液样品或其级分的单核细胞暴露于机械应力(例如,剪切力)和血浆组分(例如,血小板)或其衍生物或模拟物,从而激活单核细胞分化为健康、生理树突状细胞,本文也称为phDC。ECP和ECP衍生过程,包括将单核细胞分化成phDC,可以在大规模ECP装置(例如,临床ECP装置(例如, 装
置))或小型化ECP装置(例如,如WO2017/005700A1中所述的转免疫板;或诸如塑料袋之类的袋子(例如用于血液、血液组分、细胞疗法等的塑料袋))中进行。
[0049] 发明人发现,通过上述方法获得的phDC与通过其他方法例如细胞因子或直接从受体分离获得的DC相比是有利的,因为phDC是生理生成的(不需要化学物质例如细胞因子),
在精确的体外实验室条件下具有更高的再现性和可控性。
[0050] 因此,在特别优选的实施方案中,通过使血液样品或其级分通过装置的流动室,使血液样品中含有的单核细胞经受剪切力,获得受体的phDC。优选地,流动室中存在血小板,其可以衍生自受体的血液样品或其级分或者单独提供。另外地或替代地,血浆组分可存在于流动室中,其可衍生自受体的血液样品或其级分或单独提供。然而,在没有血小板和/或血浆组分的情况下,也能够生成phDC。
[0051] 受体的单核细胞可以通过任何合适的方式获得,例如从血液样品或其级分获得。血液样品的级分可以是例如包括白细胞和血小板的血沉棕黄层。或者,血液样品的级分可
以是分离的外周血单核细胞(PBMC)。可以使用例如Ficoll‑Hypaque梯度离心(Isolymph,
CTL Scientific)从血液样品中分离PBMC。在另一个实例中,血液样品的级分可以是纯化的或富集的单核细胞制剂。可以使用例如塑料粘附;CD14磁珠正选(例如,来自Miltenyi 
Biotec);和单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)中的一种、两种或全部三种从PBMC
中富集单核细胞。
[0052] 可以使用任何合适体积的血液。血液样品(例如,从其中衍生级分的血液样品)可以在约1μL至约500mL之间,例如约1μL至约10mL之间、约1μL至约5mL之间、约1μL至约1mL之间、约1μL至约750μL之间、约1μL至约500μL之间、约1μL至约250μL之间、约10mL至约450mL之间、约20mL至约400mL、约30mL至约350mL、约40mL至约300mL、约50mL至约200mL、或约50mL至约100mL。在一些实施方案中,血液样品或其级分或者额外的血液样品或其级分小于或等于约100mL(例如,约50mL至约100mL)。
[0053] 在一些实施方案中,ECP装置是小型化ECP装置,例如转免疫(TI)板。在一些实施方案中,ECP装置是塑料袋。技术人员熟知区分树突状细胞(包括phDC)和单核细胞的方法,例如通过评估基因表达。
[0054] 不受科学理论的限制,发明人目前假设本发明的显著效果是由于受损的垂死DC,特别是被凋亡剂例如补骨脂素和UVA的组合(PUVA)、特别是8‑MOP和UVA的组合所损害的垂
死DC,其为受体的生理DC提供抗原,并为受体的免疫系统提供耐受信号。如果phDC已从同种异体的PUVA处理的凋亡DC接收到此类耐受原信号,则phDC(除了接收到的耐受原信号外)可
能会在其表面上展示来自同种异体的PUVA处理的凋亡DC的抗原,从而能够触发抗原‑特异
性耐受反应。类似地,抗原的来源也可以衍生自免疫细胞,例如单核细胞或淋巴细胞。因此,可以使免疫细胞例如单核细胞或淋巴细胞凋亡并与phDC结合以生成抗原特异性耐受性反
应。然而,受损的DC或相关前体细胞(例如单核细胞)是优选的。
[0055] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞衍生自供体的体外血液样品。在另一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞已通过来自供体的PBMC的板传递获得。因此,供体的树突状细胞也可以是phDC。如上文关于受体所述的涉及提供体外血液样品和PBMC的所有实施方
案也适用于供体。
[0056] 在一个实施方案中,受体和供体是哺乳动物。哺乳动物包括例如但不限于人、非人灵长类动物、猪、狗、猫、和啮齿动物。在优选的实施方案中,受体和供体是人。
[0057] 在一个实施方案中,移植是肾移植、胰腺移植、肝移植、心脏移植、移植、肠移植、皮肤移植、骨髓移植或干细胞移植。
[0058] 在一个实施方案中,干细胞移植是造血干细胞移植。
[0059] 所有上述实施方案都可以在体外进行。
[0060] 本发明的方法可以与用于治疗与造血干细胞移植相关的免疫缺陷的其他疗法联合应用。
[0061] 对于第一方面的以下实施方案,所有与第一方面有关的上述实施方案经过必要的修改适用于:
[0062] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0063] a)将从供体获得的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0064] b)将步骤a)的凋亡供体树突状细胞与从受体获得的生理树突状细胞组合。
[0065] 在上述实施方案中,可以进行对应于如以上实施方案所述的步骤d1)的共孵育。
[0066] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0067] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,从受体获得的phDC不会暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,来自受体的phDC在该方法期间的任何时间点都不暴露于凋亡剂。
[0068] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0069] a)提供来自供体的免疫细胞,优选淋巴细胞;
[0070] b)将步骤a)的免疫细胞,优选淋巴细胞暴露于凋亡剂;
[0071] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0072] d)将步骤b)的凋亡免疫细胞,优选凋亡淋巴细胞与步骤c)的生理受体树突状细胞组合。
[0073] 第一方面的所有实施方案经过必要的修改适用于上述实施方案(即,从供体获得的树突状细胞被从供体获得的免疫细胞,优选淋巴细胞替代)。
[0074] 该方法还可以基于使与树突状细胞相关的细胞例如单核细胞凋亡来实施。因此,在另一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0075] a)提供来自供体的单核细胞;
[0076] b)将步骤a)的单核细胞暴露于凋亡剂;
[0077] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0078] d)将步骤b)的凋亡单核细胞与步骤c)的生理受体树突状细胞组合。
[0079] 第一方面的所有实施方案经过必要的修改适用于上述实施方案(即,从供体获得的树突状细胞被从供体获得的单核细胞替代)。
[0080] 第二方面:选择性产生耐受性树突状细胞的方法,其中互补单倍体供体树突状细胞呈现凋亡
[0081] 在第二方面,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0082] a)提供来自受体的互补单倍体供体的树突状细胞;
[0083] b)将步骤a)的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0084] c)提供来自受体单倍体供体的生理树突状细胞;和
[0085] d)将步骤b)的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与步骤c)的生理单倍体供体树突状细胞组合。
[0086] 在一个实施方案中,该方法在移植之前进行。
[0087] 在一个实施方案中,该方法用于在移植前选择性降低移植物或其一部分的免疫原性。
[0088] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0089] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,来自受体单倍体供体的phDC不会暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,来自受体单倍体供体的phDC在该方法的任何
时间点都不暴露于凋亡剂。
[0090] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞获自受体的互补单倍体供体。
[0091] 在一个实施方案中,步骤c)的树突状细胞获自受体的单倍体供体。
[0092] 原则上,在从互补单倍体供体获得树突状细胞后,树突状细胞可以是活的或不是活的。互补单倍体供体树突状细胞可以例如使其凋亡并冷冻保存直至它们与来自步骤c)的
生理单倍体供体树突状细胞结合。
[0093] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0094] a)提供来自受体的互补单倍体供体的树突状细胞;
[0095] b)将步骤a)的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0096] c)提供来自受体单倍体供体的生理树突状细胞;和
[0097] d)将步骤b)的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与步骤c)的生理单倍体供体树突状细胞组合;和
[0098] d1)共孵育步骤d)的混合物。
[0099] 在一个实施方案中,共培养混合物的步骤d1)进行至少0.5h、1h、2h、3h、4h、5h或6h。
[0100] 在一个实施方案中,将步骤b)的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与来自单倍体供体的生理树突状细胞组合的步骤d)在单倍体供体内进行。
[0101] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0102] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,来自受体单倍体供体的phDC不会暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,来自受体单倍体供体的phDC在该方法的任何
时间点都不暴露于凋亡剂。
[0103] 在该方法的步骤b)中,将在方法步骤a)中从受体的互补单倍体供体获得的树突状细胞暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或氨基乙酰丙酸和光。特别优选的补骨脂素是8‑MOP和amotosalen。最优选的补骨脂素是8‑MOP。在最优选的实施方案中,凋亡剂是8‑MOP和UVA的组合。
[0104] 实施方案应优先被选择,使得基本上所有来自受体的互补单倍体供体的树突状细胞都与凋亡剂接触。在8‑MOP/UVA的情况下,基本上所有来自受体互补单倍体供体的树突状
2 2
细胞都应与8‑MOP接触并暴露于UVA光。8‑MOP和UVA的典型剂量为1J/cm至3J/cm UVA与浓
度100ng/mL至300ng/mL的8‑MOP组合。
[0105] 在优选的实施方案中,UVA的剂量等于或低于3J/cm2、等于或低于2J/cm2、或等于或2
低于1J/cm  。在其他优选的实施方案中,8‑MOP的剂量等于或低于300ng/mL、250ng/mL、
200ng/mL或100ng/mL。在优选的实施方案中,8‑MOP的剂量为200ng/mL,UVA的剂量为1J/
2
cm。
[0106] 如关于第一方面所描述的,本发明上下文中的树突状细胞具体可以通过使用体外光分离置换术(ECP)衍生过程的单核细胞的板传递获得,激活单核细胞分化成健康的phDC。
如针对第一方面描述的涉及phDC的生成的所有实施方案也适用于第二方面中的phDC的生
成。
[0107] 因此,在特别优选的实施方案中,通过使血液样品或其级分通过装置的流动室,使血液样品中含有的单核细胞经受剪切力,获得单倍体供体的phDC。优选地,流动室中存在血小板,其可以衍生自单倍体供体的血液样品或其级分或者单独提供。另外地或替代地,血浆组分可以存在于流动室中,其可以衍生自单倍体供体的血液样品或其部分或者单独提供。然而,在没有血小板和/或血浆组分的情况下,也能够生成phDC。
[0108] 单倍体供体的单核细胞可以通过任何合适的方式获得,例如从血液样品或其级分获得。血液样品的级分可以是例如包括白细胞和血小板的血沉棕黄层。或者,血液样品的级分可以是分离的外周血单核细胞(PBMC)。可以使用例如Ficoll‑Hypaque梯度离心
(Isolymph,CTL Scientific)从血液样品中分离PBMC。在另一个实例中,血液样品的级分可以是纯化的或富集的单核细胞制剂。可以使用例如塑料粘附;CD14磁珠正选(例如,来自
Miltenyi Biotec);和单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)中的一种、两种或全部三种从PBMC中富集单核细胞。
[0109] 可以使用任何合适体积的血液。血液样品(例如,从其中衍生级分的血液样品)可以在约1μL至约500mL之间,例如约1μL至约10mL之间、约1μL至约5mL之间、约1μL至约1mL之间、约1μL至约750μL之间、约1μL至约500μL之间、约1μL至约250μL之间、约10mL至约450mL之间、约20mL至约400mL、约30mL至约350mL、约40mL至约300mL、约50mL至约200mL、或约50mL至约100mL。在一些实施方案中,血液样品或其级分或者额外的血液样品或其级分小于或等于约100mL(例如,约50mL至约100mL)。
[0110] 在一些实施方案中,ECP装置是小型化ECP装置,例如转免疫(TI)板。在一些实施方案中,ECP装置是塑料袋。技术人员熟知区分树突状细胞(包括phDC)和单核细胞的方法,例如通过评估基因表达。
[0111] 不受科学理论的限制,发明人目前假设本发明的显著效果是由于受损的垂死DC,特别是被凋亡剂例如补骨脂素和UVA的组合(PUVA),特别是8‑MOP和UVA的组合所损害的,它们为单倍体供体的生理DC提供抗原,并为单倍体供体的免疫系统提供耐受信号。如果phDC
已从来自互补单倍体供体的PUVA处理的凋亡DC接收到这种耐受原信号,则phDC(除了接收
到的耐受原信号外)可能会在其表面上展示来自PUVA处理的凋亡DC的抗原,从而触发单倍
体供体中的抗原‑特异性耐受性反应。在接受来自如第二方面所述处理的单倍体供体的移
植后,诸如GvHD的炎症状况将得到减轻或消除。类似地,抗原的来源也可以衍生自免疫细
胞,例如淋巴细胞或单核细胞。因此,免疫细胞,例如淋巴细胞或单核细胞,可以使其凋亡并与单倍体供体phDC组合,以生成抗原特异性耐受性反应。然而,优选受损的DC或相关前体细胞,例如单核细胞。
[0112] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞衍生自受体的互补单倍体供体的体外血液样品。在另一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞已通过来自受体的互补单倍体供体的
PBMC的板传递获得。因此,受体的互补单倍体供体的树突状细胞也可以是phDC。
[0113] 在一个实施方案中,互补单倍体供体和单倍体供体是哺乳动物。哺乳动物包括例如但不限于人、非人灵长类动物、猪、狗、猫、马和啮齿动物。在优选的实施方案中,互补单倍体供体和单倍体供体是人。
[0114] 在一种实施方案中,移植是肾移植、胰腺移植、肝移植、心脏移植、肺移植、肠移植、骨髓移植或干细胞移植。
[0115] 在一个实施方案中,干细胞移植是造血干细胞移植。
[0116] 对于第二方面的以下实施方案,所有与第一和第二方面相关的上述实施方案均经过必要的修改适用于:
[0117] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0118] a)将从受体的互补单倍体供体获得的树突状细胞暴露于凋亡剂;和
[0119] b)将步骤a)的凋亡受体的互补单倍体供体树突状细胞与已从受体的单倍体供体获得的生理树突状细胞组合。
[0120] 需要理解的是,所有方法步骤都可以在体外进行。
[0121] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0122] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,从受体的单倍体供体获得的phDC不会暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,来自受体单倍体供体的phDC在该方法的任何时间点都不暴露于凋亡剂。
[0123] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0124] a)提供来自受体的互补单倍体供体的免疫细胞,优选淋巴细胞;
[0125] b)将步骤a)的免疫细胞,优选淋巴细胞暴露于凋亡剂;
[0126] c)提供来自受体单倍体供体的生理树突状细胞;和
[0127] d)将步骤b)的凋亡互补单倍体供体免疫细胞、优选凋亡互补单倍体供体淋巴细胞与步骤c)的生理单倍体供体树突状细胞组合。
[0128] 第二方面的所有实施方案经过必要的修改适用于上述实施方案(即,其中从受体的互补单倍体供体获得的树突状细胞被从受体的互补单倍体供体获得的免疫细胞、优选淋
巴细胞替代)。
[0129] 该方法还可以基于使与树突状细胞相关的细胞例如单核细胞凋亡来实施。因此,在另一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0130] a)从受体的互补单倍体供体中提供单核细胞;
[0131] b)将步骤a)的单核细胞暴露于凋亡剂;
[0132] c)提供来自受体单倍体供体的生理树突状细胞;和
[0133] d)将步骤b)的凋亡互补单倍体供体单核细胞与步骤c)的生理单倍体供体树突状细胞组合。
[0134] 第一方面的所有实施方案经过必要的修改适用于上述实施方案(即,其中从受体的互补单倍体供体获得的树突状细胞被从受体的互补单倍体供体获得的单核细胞替代)。
[0135] 第三方面:选择性产生耐受性树突状细胞的方法,其中受体树突状细胞呈现凋亡
[0136] 在第三方面,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0137] a)提供来自受体的树突状细胞;
[0138] b)将步骤a)的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0139] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0140] d)将步骤b)的凋亡树突状细胞与步骤c)的生理树突状细胞组合。
[0141] 在一个实施方案中,该方法在移植之前进行。
[0142] 在一个实施方案中,该方法用于在移植前选择性降低移植物或其一部分的免疫原性。
[0143] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0144] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,来自受体(步骤c)的phDC不会暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,来自步骤c)的受体的phDC在该方法的任何时间点
都不暴露于凋亡剂。
[0145] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞获自受体。
[0146] 在一种实施方式中,步骤c)的树突状细胞获自受体。
[0147] 原则上,在从受体获得树突状细胞后(步骤a),树突状细胞可以是活的,或不是活的。树突状细胞可以例如使其凋亡并冷冻保存直至它们与来自步骤c)的生理受体树突状细
胞结合。
[0148] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0149] a)提供来自受体的树突状细胞;
[0150] b)将步骤a)的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0151] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0152] d)将步骤b)的凋亡树突状细胞与步骤c)的生理树突状细胞组合;和
[0153] d1)共孵育步骤d)的混合物。
[0154] 在一个实施方案中,共培养混合物的步骤d1)进行至少0.5h、1h、2h、3h、4h、5h或6h。
[0155] 在一个实施方案中,将凋亡的受体树突状细胞与来自受体的生理树突状细胞组合的步骤d)在受体内进行。
[0156] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0157] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,来自受体(步骤c)的phDC不会暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,来自步骤c)的受体的phDC在该方法的任何时间点
都不暴露于细胞凋亡剂。
[0158] 在该方法的步骤b)中,将在方法步骤a)中从受体获得的树突状细胞暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或氨基乙酰丙酸和光。特别优选的补骨脂素是8‑MOP和amotosalen。最优选的补骨脂素是8‑MOP。在最优选的实施方案中,凋亡剂是8‑MOP和UVA的组合。
[0159] 实施方案应被优先选择,使得基本上所有来自受体的树突状细胞都与凋亡剂接触。在8‑MOP/UVA的情况下,基本上所有来自受体的树突状细胞都应与8‑MOP接触并暴露于
2 2
UVA光。8‑MOP和UVA的典型剂量为1J/cm 至3J/cm UVA与浓度100ng/mL至300ng/mL的8‑MOP组合。
[0160] 在优选的实施方案中,UVA的剂量等于或低于3J/cm2、等于或低于2J/cm2、或等于或2
低于1J/cm 。在其他优选的实施方案中,8‑MOP的剂量等于或低于300ng/mL、250ng/mL、
200ng/mL或100ng/mL。在优选的实施方案中,8‑MOP的剂量为200ng/mL,UVA的剂量为1J/
2
cm。
[0161] 如关于第一和第二方面所述,本发明上下文中的树突状细胞具体可以通过使用体外光分离置换术(ECP)衍生过程的单核细胞板传递获得,激活单核细胞分化成健康phDC。如第一方面所述的涉及phDC的生成的所有实施方案也适用于第三方面的phDC的生成。
[0162] 因此,在特别优选的实施方案中,通过使血液样品或其级分穿过装置的流动室,使血液样品中含有的单核细胞经受剪切力,获得受体的phDC。优选地,流动室中存在血小板,其可以衍生自受体的血液样品或其级分或者单独提供。另外地或替代地,血浆组分可存在于流动室中,其可衍生自受体的血液样品或其级分或单独提供。然而,在没有血小板和/或血浆成分的情况下,也能够生成phDC。
[0163] 受体的单核细胞可以通过任何合适的方式获得,例如从血液样品或其级分获得。血液样品的级分可以是例如包括白细胞和血小板的血沉棕黄层。或者,血液样品的级分可
以是分离的外周血单核细胞(PBMC)。可以使用例如Ficoll‑Hypaque梯度离心(Isolymph,
CTL Scientific)从血液样品中分离PBMC。在另一个实例中,血液样品的级分可以是纯化的或富集的单核细胞制剂。可以使用例如塑料粘附;CD14磁珠正选(例如,来自Miltenyi 
Biotec);和单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)中的一种、两种或全部三种从PBMC
中富集单核细胞。
[0164] 可以使用任何合适体积的血液。血液样品(例如,从其中衍生级分的血液样品)可以在约1μL至约500mL之间,例如约1μL至约10mL之间、约1μL至约5mL之间、约1μL至约1mL之间、约1μL至约750μL之间、约1μL至约500μL之间、约1μL至约250μL之间、约10mL至约450mL之间、约20mL至约400mL、约30mL至约350mL、约40mL至约300mL、约50mL至约200mL、或约50mL至约100mL。在一些实施方案中,血液样品或其级分或者额外的血液样品或其级分小于或等于约100mL(例如,约50mL至约100mL)。
[0165] 在一些实施方案中,ECP装置是小型化ECP装置,例如转免疫(TI)板。在一些实施方案中,ECP装置是塑料袋。技术人员熟知区分树突状细胞(包括phDC)和单核细胞的方法,例如通过评估基因表达。
[0166] 不受科学理论的限制,发明人目前假设本发明的显著效果是由于受损的垂死DC,特别是被补骨脂素和UVA的组合(PUVA)所损害的,它们为受体的生理DC提供抗原,并为受体的免疫系统提供耐受信号。如果phDC已从来自PUVA处理的凋亡自体DC接收到这种耐受原信
号,则phDC(除了接收到的耐受原信号外)可能会在其表面上展示来自自体PUVA处理的凋亡
DC,从而触发抗原‑特异性耐受性反应。类似地,抗原的来源也可以衍生自免疫细胞,例如单核细胞或淋巴细胞。因此,免疫细胞,例如单核细胞或淋巴细胞,可以使其凋亡并与phDC组合,以生成抗原特异性耐受性反应。然而,优选受损的DC或相关前体细胞,例如单核细胞。
[0167] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞衍生自受体的体外血液样品。在另一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞已通过来自受体的PBMC的板传递获得。在一个实施方案
中,受体是哺乳动物。哺乳动物包括例如但不限于人、非人灵长类动物、猪、狗、猫、马和啮齿动物。在优选的实施方案中,受体是人。
[0168] 在一个实施方案中,移植是肾移植、胰腺移植、肝移植、心脏移植、肺移植、肠移植、骨髓移植或干细胞移植。在一个实施方案中,干细胞移植是造血干细胞移植。
[0169] 所有上述实施方案都可以在体外进行。
[0170] 本发明的方法可以与用于治疗与造血干细胞移植相关的免疫缺陷的其他疗法联合应用。
[0171] 对于第三方面的以下实施方案,所有与第三方面有关的上述实施方案经过必要的修改适用于:
[0172] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0173] a)将从受体获得的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0174] b)将步骤a)的凋亡受体树突状细胞与已从受体获得的生理树突状细胞组合。
[0175] 在上述实施方案中,可以进行对应于如以上实施方案所述的步骤d1)的共孵育。
[0176] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0177] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,来自受体(步骤b)的phDC不会暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,从步骤b)的受体获得的phDC在该方法的任何时间
点都不暴露于凋亡剂。
[0178] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0179] a)提供来自受体的免疫细胞,优选淋巴细胞;
[0180] b)将步骤a)的免疫细胞,优选淋巴细胞暴露于凋亡剂;
[0181] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0182] d)将步骤b)的凋亡免疫细胞、优选凋亡淋巴细胞与步骤c)的生理树突状细胞组合。
[0183] 第三方面的所有实施方案经过必要的修改适用于上述实施方案(即,从受体获得的树突状细胞被从受体获得的免疫细胞、优选淋巴细胞替代)。
[0184] 该方法还可以基于使树突状细胞相关的细胞例如单核细胞凋亡来实施。因此,在另一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0185] a)提供来自受体的单核细胞;
[0186] b)将步骤a)的单核细胞暴露于凋亡剂;
[0187] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0188] d)将步骤b)的凋亡单核细胞与步骤c)的生理树突状细胞组合。
[0189] 第一方面的所有实施方案经过必要的修改适用于上述实施方案(即,其中从受体获得的树突状细胞被从受体获得的单核细胞替代)。
[0190] 第四方面:通过根据第一方面的方法获得的耐受性树突状细胞
[0191] 在第四方面,本发明涉及通过根据第一方面(包括如上所述的所有实施方案)的方法获得的耐受性受体树突状细胞。
[0192] 在一个实施方案中,通过根据第一方面的方法获得的耐受性受体树突状细胞降低来自供体的未来移植物的免疫原性。
[0193] 第五方面:通过根据第二方面的方法获得的耐受性树突状细胞
[0194] 在第五方面,本发明涉及通过根据第二方面(包括如上所述的所有实施方案)的方法获得的耐受性单倍体供体树突状细胞。
[0195] 在一个实施方案中,通过根据第二方面的方法获得的耐受性单倍体供体树突状细胞降低来自单倍体供体的未来移植物的免疫原性。
[0196] 第六方面:通过根据第三方面的方法获得的耐受性树突状细胞
[0197] 在第六方面,本发明涉及通过根据第三方面(包括如上所述的所有实施方案)的方法获得的耐受性受体树突状细胞。
[0198] 在一个实施方案中,通过根据第三方面的方法获得的耐受性受体树突状细胞降低未来移植物的免疫原性。
[0199] 第七方面:根据第四方面的耐受性树突状细胞用于预防或减少移植物抗宿主病的方法
[0200] 在第七方面,本发明涉及根据第四方面(包括如上所述的第一和第四方面的所有实施方案)的耐受性树突状细胞,其用于预防或减少移植物抗宿主病的方法。
[0201] 在一个实施方案中,通过第一方面的方法获得的耐受性树突状细胞用于治疗需要移植的同种异体或单倍体相合受体。与移植前不施用耐受性树突状细胞相比,在移植前进
行这样的治疗后,发生GvHD的险以及GvHD(如果发生)的严重程度显著降低。
[0202] 第八方面:根据第五方面的耐受性树突状细胞用于预防或减少移植物抗宿主病的方法中
[0203] 在第八方面,本发明涉及根据第五方面(包括如上所述的第二和第五方面的所有实施方案)的耐受性树突状细胞,其用于预防或减少移植物抗宿主病的方法。
[0204] 在一个实施方案中,通过第二方面的方法获得的耐受性树突状细胞用于治疗需要移植的单倍体相合受体。与移植前不施用耐受性树突状细胞相比,在移植前进行这样的治
疗后,发生GvHD的风险以及GvHD(如果发生)的严重程度显著降低。
[0205] 第九方面:根据第六方面的耐受性树突状细胞用于预防或减少移植物抗宿主病的方法
[0206] 在第九方面,本发明涉及根据第六方面(包括如上所述的第三和第六方面的所有实施方案)的耐受性树突状细胞,其用于预防或减少移植物抗宿主病的方法。
[0207] 在一个实施方案中,通过第三方面的方法获得的耐受性树突状细胞用于治疗需要移植的同种异体或单倍体相合受体。与移植前不施用耐受性受体树突状细胞相比,在移植
前进行这样的治疗后,发生GvHD的风险以及GvHD(如果发生)的严重程度显著降低。
[0208] 第十方面:选择性产生耐受性树突状细胞的方法
[0209] 在第十方面,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0210] a)提供从受试者获得的树突状细胞的第一样品;
[0211] b)将步骤a)的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0212] c)提供从受试者获得的树突状细胞的第二样品;和
[0213] d)将步骤b)的凋亡树突状细胞与步骤c)的树突状细胞组合。
[0214] 在一个实施方案中,该方法涉及选择性产生耐受性树突状细胞。
[0215] 在一个实施方案中,将凋亡树突状细胞与树突状细胞组合的步骤d)在受试者体内进行。
[0216] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0217] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,步骤c)的DC不暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,步骤c)的DC在该方法期间的任何时间点都不暴露于凋亡剂。
[0218] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤:
[0219] a)提供从受试者获得的树突状细胞的第一样品;
[0220] b)将步骤a)的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0221] c)提供从受试者获得的树突状细胞的第二样品;和
[0222] d)将步骤b)的凋亡树突状细胞与步骤c)的树突状细胞组合;和
[0223] d1)共孵育步骤d)的混合物。
[0224] 在一个实施方案中,树突状细胞的两个样品(步骤a)和c))均获自同一受试者。在一个实施方案中,共培养混合物的步骤d1)进行至少0.5h、1h、2h、3h、4h、5h或6h。
[0225] 在一个实施方案中,上述方法步骤同时进行。
[0226] 在一个实施方案中,上述方法步骤是顺序进行的。因此,步骤c)的DC不暴露于凋亡剂。
[0227] 在该方法的步骤b)中,将在方法步骤a)中从受试者获得的树突状细胞暴露于凋亡剂。在一个实施方案中,凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或氨基乙酰丙酸和光。特别优选的补骨脂素是8‑MOP和amotosalen。最优选的补骨脂素是8‑MOP。在最优选的实施方案中,凋亡剂是8‑MOP和UVA的组合。
[0228] 实施方案应被优先选择,使得基本上所有来自受试者的树突状细胞都与凋亡剂接触。在8‑MOP/UVA的情况下,基本上所有来自受试者的树突状细胞都应与8‑MOP接触并暴露
2 2
于UVA光。8‑MOP和UVA的典型剂量为1J/cm至3J/cmUVA与浓度100ng/mL至300ng/mL的8‑MOP组合。
[0229] 在优选的实施方案中,UVA的剂量等于或低于3J/cm2、等于或低于2J/cm2、或等于或2
低于1J/cm 。在其他优选的实施方案中,8‑MOP的剂量等于或低于300ng/mL、250ng/mL、
200ng/mL或100ng/mL。在优选的实施方案中,8‑MOP的剂量为200ng/mL,UVA的剂量为1J/
2
cm。
[0230] 如关于第一和第二方面所描述的,在本发明的上下文中,即也关于第十方面,树突状细胞可以特别地通过使用体外光分离置换术(ECP)衍生过程的单核细胞的板传递来获得,激活单核细胞分化为健康的phDC。
[0231] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞已通过来自受试者的PBMC的板传递获得。在一个实施方案中,步骤c)的树突状细胞已通过来自受试者的PBMC的板传递获得。因
此,步骤a)和/或步骤c)的树突状细胞可称为生理DC。如第一方面所述的涉及phDC的生成的所有实施方案也适用于第十方面的phDC的生成。在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞
是从获自受试者的体外血液样品获得的。在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞是从获
自受试者的体外血液样品获得的,并且步骤c)的树突状细胞是通过来自受试者的PBMC的板
传递获得的。
[0232] 因此,在特别优选的实施方案中,通过使血液样品或其级分穿过装置的流动室,使血液样品中含有的单核细胞经受剪切力,获得受试者的phDC。优选地,流动室中存在血小板,其可以衍生自受试者的血液样品或其级分或单独提供。另外地或替代地,血浆组分可存在于流动室中,其可衍生自受试者的血液样品或其级分或单独提供。然而,在没有血小板
和/或血浆组分的情况下,也能够生成phDC。
[0233] 受试者的单核细胞可以通过任何合适的方式获得,例如从血液样品或其级分获得。血液样品的级分可以是例如包括白细胞和血小板的血沉棕黄层。或者,血液样品的级分可以是分离的外周血单核细胞(PBMC)。可以使用例如Ficoll‑Hypaque梯度离心(Isolymph,CTL Scientific)从血液样品中分离PBMC。在另一个实例中,血液样品的级分可以是纯化的或富集的单核细胞制剂。可以使用例如塑料粘附;CD14磁珠正选(例如,来自Miltenyi 
Biotec);和单核细胞分离试剂盒II(Miltenyi Biotec)中的一种、两种或全部三种从PBMC
中富集单核细胞。
[0234] 可以使用任何合适体积的血液。血液样品(例如,从其中衍生级分的血液样品)可以在约1μL至约500mL之间,例如约1μL至约10mL之间、约1μL至约5mL之间、约1μL至约1mL之间、约1μL至约750μL之间、约1μL至约500μL之间、约1μL至约250μL之间、约10mL至约450mL之间、约20mL至约400mL、约30mL至约350mL、约40mL至约300mL、约50mL至约200mL、或约50mL至约100mL。在一些实施方案中,血液样品或其级分或者额外的血液样品或其级分小于或等于约100mL(例如,约50mL至约100mL)。
[0235] 在一些实施方案中,ECP装置是小型化ECP装置,例如转免疫(TI)板。在一些实施方案中,ECP装置是塑料袋。技术人员熟知区分树突状细胞(包括phDC)和单核细胞的方法,例如通过评估基因表达。
[0236] 不受科学理论的限制,发明人目前假设本发明的显著效果是由于来自受试者的损伤的垂死DC,特别是被补骨脂素和UVA的组合(PUVA)所损伤的,它们向受试者的生理DC提供抗原并对受试者的免疫系统提供耐受信号。如果phDC已接收到来自PUVA处理的凋亡自体DC
的这种耐受原信号,则phDC(除了接收到的耐受原信号之外)可在其表面上展示来自自体
PUVA处理的凋亡DC的抗原,特别是自身抗原,从而触发抗原‑特异性耐受反应。类似地,抗原的来源也可以衍生自免疫细胞,例如淋巴细胞。因此,免疫细胞,例如淋巴细胞,可以使其凋亡并与受试者的phDC结合以生成抗原‑特异性耐受性应答。
[0237] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞衍生自受试者的体外血液样品。在另一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞已通过来自受试者的PBMC的板传递获得。
[0238] 在一个实施方案中,本发明涉及一种方法,包括以下步骤(上述所有实施方案也经过必要的修改适用于以下实施方案):
[0239] a)提供从受试者获得的树突状细胞的第一样品;
[0240] a1)将树突状细胞与抗原分子一起孵育;
[0241] b)将步骤a1)的孵育的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0242] c)提供从受试者获得的树突状细胞的第二样品;和
[0243] d)将步骤b)的凋亡树突状细胞与步骤c)的树突状细胞组合。
[0244] 在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞已通过来自受试者的PBMC的板传递获得。在一个实施方案中,步骤c)的树突状细胞已通过来自受试者的PBMC的板传递获得。在一个实施方案中,步骤a)的树突状细胞是从受试者的体外血液样品中获得的。在一个实施方
案中,步骤a)的树突状细胞已获自受试者的体外血液样品,并且步骤c)的树突状细胞已通
过来自受试者的PBMC的板传递获得。
[0245] 在一个实施方案中,抗原分子是自身抗原。在一个实施方案中,自身抗原与一种或多种自身免疫性病症相关。在一个实施方案中,抗原分子衍生自天然来源、化学合成或重组产生。在一个实施方案中,抗原分子衍生自细胞。
[0246] 下面的表A显示了与自身免疫性疾病相关的示例性自身抗原的列表,以及可用于使用耐受性phDC来评估自身免疫性疾病的改善的示例性动物模型系统(也参见实验7和8)。
[0247] 表A:示例性自身抗原、相关自身免疫性疾病和动物模型的列表
[0248]
[0249]
[0250]
[0251]
[0252]
[0253]
[0254]
[0255] 在一个实施方案中,自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。在一个实施方案中,自身抗原选自髓鞘碱性蛋白和胶原蛋白。
[0256] 在一个实施方案中,受试者是哺乳动物。哺乳动物包括例如但不限于人、非人灵长类动物、猪、狗、猫、马和啮齿动物。在优选的实施方案中,受试者是人。
[0257] 所有上述实施方案都可以在体外进行。
[0258] 本发明的方法可以与用于治疗自身免疫性疾病的其他疗法联合应用。例如,自身免疫性疾病可以是上表A中描述的任何自身免疫性疾病。其他自身免疫性疾病是本领域已
知的。
[0259] 第十一方面:通过根据第十方面的方法获得的耐受性树突状细胞
[0260] 在第十一方面,本发明涉及通过根据第十方面(包括如上所述的所有实施方案)的方法获得的耐受性树突状细胞。
[0261] 第十二方面:根据第十一方面的耐受性树突状细胞用于治疗自身免疫性疾病
[0262] 在第十二方面,本发明涉及根据第十一方面(包括如上所述的第十和第十一方面的所有实施方案)的耐受性树突状细胞,其用于治疗自身免疫性疾病。
[0263] 对于自身免疫性疾病的治疗,预期施用耐受性树突状细胞将导致一些改善效果,例如生活质量的改善;疾病症状严重程度的减轻;自身免疫细胞数量的减少;延长的生存期等。
[0264] 有益效果的指标是本领域众所周知的,并且用于特定应用的适当的指标可以由技术人员确定。
[0265] 在这样的治疗之后,与不施用耐受性树突状细胞相比,自身免疫性疾病或与其相关的症状的严重程度显著降低。
[0266] 在一个实施方案中,自身免疫性疾病选自下组:多发性硬化症、类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症、寻常型天疱疮、皮癣、重症肌无力、甲状腺炎、硬皮病、Sjogren综合征、血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、自身免疫性溶血性贫血、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、Addison病、腹泻性乳糜泻、慢性疲劳综合征、结肠炎、Crohn病、纤维肌痛、甲状腺功能亢进症、Graves病、甲状腺功能减退症、Hashimoto病、子宫内膜异位症、恶性贫血、Goodpasture综合征、Wegener病和风湿热。
[0267] 在另一个实施方案中,本文提供了治疗有此需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法,该方法包括向受试者施用有效量的本文描述的任何耐受性树突状细胞。
[0268] 在另一个实施方案中,本文提供了治疗有此需要的受试者中的自身免疫性疾病的方法,该方法包括向受试者施用有效量的耐受性树突状细胞,其中耐受性树突状细胞包含
生理树突状细胞,该生理树突状细胞包含从受试者获得的凋亡树突状细胞的材料、自身抗
原、其片段或其组合。
[0269] 在任何前述方法中,自身免疫性疾病可以选自下组:多发性硬化症、类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症、寻常型天疱疮、牛皮癣、重症肌无力、甲状腺炎、硬皮病、Sjogren综合征、血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、自身免疫性溶血性贫血、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、Addison病、腹泻性乳糜泻、慢性疲劳综合征、结肠炎、Crohn病、纤维肌痛、甲状腺功能亢进症、Graves病、甲状腺功能减退症、Hashimoto病、子宫内膜异位症、恶性贫血、Goodpasture综合征、Wegener病和风湿热。
[0270] 在任何前述方法中,自身抗原可以选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮钙粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、水通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白
(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A (SS‑A/Ro)、
Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。
[0271] 第十三方面:离体耐受性树突状细胞
[0272] 在第十三方面,本发明涉及离体耐受性树突状细胞,其包含从受试者获得的凋亡树突状细胞的材料。
[0273] 在一些实施方案中,从受试者获得的凋亡树突状细胞的材料包括多肽、核酸、细胞器或其部分、或任何其他细胞内容物。
[0274] 在一些实施方案中,离体耐受性树突状细胞包括自身抗原或其片段。可以包括任何合适的自身抗原,其包括本文(例如,表A中)描述的任何自身抗原。对于多肽抗原,片段可以具有任何合适的大小,例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、
35、40、45、50、75、100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、
475、500、600、700、800、900或1000个氨基酸。
[0275] 在一些实施方案中,离体耐受性树突状细胞包括一种类型的自身抗原或其片段。在其他实施方案中,离体耐受性树突状细胞可以包括两种、三种、四种、五种、十种或更多种不同的自身抗原或其片段。
[0276] 在一些实施方案中,自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮钙粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、水通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。
[0277] 受试者可能患有自身免疫性疾病,包括本文(例如,表A中)公开的任何自身免疫性疾病。
[0278] 第十四方面:包含从受试者获得的树突状细胞样品的组合物
[0279] 在第十四方面,本发明涉及一种组合物,其包括(a)从受试者获得的树突状细胞样品;(b)凋亡剂;(c)自身抗原或其片段。
[0280] 该组合物可以包括任何合适的凋亡剂,包括本文公开的任何凋亡剂。在一些实施方案中,凋亡剂包括补骨脂素、磷酸核黄素、5‑氨基乙酰丙酸或其组合。在一些实施方案中,凋亡剂是补骨脂素。在一些实施方案中,补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。在一些实施方案中,补骨脂素是8‑MOP。
[0281] 在一些实施方案中,组合物包括自身抗原或其片段。可以包括任何合适的自身抗原,包括本文(例如,表A中)描述的任何自身抗原。对于多肽抗原,片段可以是任何合适的大小,例如约5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、25、30、35、40、45、50、75、100、
125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、600、700、800、
900或1000个氨基酸。
[0282] 在一些实施方案中,组合物包括一种类型的自身抗原或其片段。在其他实施方案中,组合物可以包括两种、三种、四种、五种、十种或更多种不同的自身抗原或其片段。
[0283] 在一些实施方案中,自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮钙粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、水通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。
[0284] 树突状细胞可以获自患有自身免疫性疾病的受试者,所述自身免疫性疾病包括本文(例如,表A中)公开的任何自身免疫性疾病。
附图说明
[0285] 图1ECP白血病单倍体相合试验的示意图。
[0286] 图2ECP白血病单倍体相合试验的示意图。
[0287] 图3Balb/C→B6全错配GVHD系统示意图;还描述了结果。
[0288] 图4移植物的离体补骨脂素UVA处理(PUVA)可改善完全MHC错配模型中的GVHD。在5
第‑4天移植前或第0天移植当天用2x10 MC38肿瘤细胞对小鼠进行皮下注射。在第‑1天对
6
小鼠进行950cGy致死照射。第0天,小鼠经历Balb/c→B6移植。其接受了静脉注射5x 10 个
6
同种异体T细胞耗竭的骨髓(BM)细胞以及10x10个未操作的脾细胞,或在同种异体刺激移
植物的离体PUVA处理后注射。作为对照,一组小鼠在肿瘤接种后接受同系的BM和脾细胞。
(A,图1‑3)所有组的平均体重、GvHD评分和存活的汇总数据。(B)平均肿瘤体积。
[0289] 图5心脏移植Kaplan‑Meier的生存曲线。
[0290] 图6受试者特征
[0291] 图7GVHD等级和分期
[0292] 图8急性GVHD的累积发生率。非相关供体分析包括一名具有5/6HLA匹配的相关供体的患者。
[0293] 图9广泛慢性GVHD的累积发生率。
[0294] 图10总体生存率。非相关供体分析包括一名具有5/6HLA匹配的相关供体的患者。
[0295] 图11移植相关死亡率的累积发生率。非相关供体分析包括一名具有5/6HLA匹配的相关供体的患者。
[0296] 图12历史对照的选择标准。
[0297] 图13研究和历史对照受试者的特征。
[0298] 图14多变量分析中移植结果的相对风险和95%置信区间(对照组作为参考,指定相对风险为1.0)。
[0299] 图15II‑IV级急性GVHD的累积发生率。
[0300] 图16调整后的无病生存概率。
[0301] 图17调整后的生存概率。
[0302] 图18与8‑MOP/UVA损伤的同系PBMC(PUVAsyn PBMC)或8‑MOP/UVA损伤的同种异体PBMC(PUVA allo PBMC)一起孵育的phDC相比,单独的新鲜的PBMC的PD‑L1表达。
[0303] 图19来自一名供体的CFSE标记的应答T细胞(T细胞)与来自同一供体(syn.培养物)或来自不相关供体(MLR)的γ照射刺激物PBMC共孵育。为了抑制MLR反应,一些培养物另外补充了同系8‑MOP/UVA处理的PBMC和同源TI板通过的phDC(MLR+PUVA syn.PBMC+phDC)。
通过流式细胞术(FACS)测量CFSE稀释度来测定应答者CD8和CD4 T细胞的增殖(A,B)。另外
通过FACS评估应答者CD8 T细胞和CD4 T细胞的激活状态,使用CD44和PD1表达来检测激活
的T细胞(C,D)。N=分析的血液供体的数量;p‑值=用Welch校正的未配对t检验。
[0304] 发明详述
[0305] 提供了以下一般定义。
[0306] 当术语“包含”在本说明书和权利要求中使用时,其不排除其他元素。出于本发明的目的,术语“由......组成”被认为是术语“包含”的优选实施方案。如果在下文中组被定义为包含至少一定数量的实施方案,则这也应当理解为公开了优选地仅由这些实施方案组成的组。
[0307] 出于本发明的目的,术语“获得的”被认为是术语“可获得的”的优选实施方案。如果下文中例如抗体被定义为从特定来源可获得的,则这也应理解为公开了从该来源获得的抗体。
[0308] 指代单数名词时用不定冠词或定冠词时,例如“一(a)”、“一(an)”或“该(the)”,除非另有明确说明,否则这包括该名词的复数形式。在本发明的上下文中,术语“大约(about)”或“大约(approximately)”表示本领域技术人员将理解的准确度区间,以仍然确保所讨论的特征的技术效果。该术语通常表示与所示数值±20%,优选±15%,更优选±
10%,甚至更优选±5%的偏差。
[0309] 此外,说明书和权利要求书中的术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”或“(i)”、“(ii)”、“(iii)”、“(iv)”等用于区分相似的元素,而不一定用于描述顺序或时间顺序。应当理解,如此使用的术语在适当的情况下是可以互换的,并且本文描述的本发明的实施方案能够以不同于本文描述或说明的其他顺序操作。
[0310] 如果术语“第一”、“第二”、“第三”或“(a)”、“(b)”、“(c)”、“(d)”或“(i)”、“(ii)”、“(iii)”、“(iv)”等涉及方法或用途或测定的步骤,除非另有说明,否则步骤之间没有时间或时间间隔一致性,即步骤可以同时进行或这些步骤之间可以是秒、分钟、小时、天、周、月甚至年的时间间隔,除非在上文或下文阐述的申请中另有说明。
[0311] 技术术语按其常识使用。如果某些术语表达了特定含义,则下面将在使用这些术语的上下文中给出术语的定义。
[0312] 如本文所用,“移植物”是指从哺乳动物个体(“供体”)取出并适合全部或部分重新引入相同(“自体”)或不同(“同种异体”)哺乳动物个体(“受体”)的任何细胞样品。移植物可以是新鲜获得的、培养的或冷冻的,但已在适合保持无菌和促进活力的条件下保存。术语移植物(transplant)可与术语移植物(graft)互换使用。
[0313] 本发明的方法可以对HLA紧密匹配、共享全部或几乎全部I类和II类HLA抗原的个体实施;单倍体相合,例如兄弟姐妹共享一半的HLA抗原;或不相关,因此HLA匹配不良。在本发明的上下文中,“单倍体供体”是指未来受体的一个遗传亲本,而术语“互补单倍体供体”是指另一遗传亲本。因此,未来的受体就是子代。换句话说,如果母本是单倍体供体,那么父本就是子代的互补单倍体供体(未来的受体),反之亦然。在第一方面的优选实施方案中,受体和供体是不相关的。在第二方面的优选实施方案中,单倍体供体和互补单倍体供体各自
具有未来受体的HLA抗原的一半。
[0314] 个体之间的HLA同一性程度可以通过本领域已知的方法容易地证明,包括聚合酶链式反应、混合淋巴细胞反应(MLR)和血清学测量。
[0315] 如本文所用,术语“抗原”是指可以刺激动物中抗体产生或T细胞应答的化合物、组合物或物质,包括注射或吸收到动物体内的组合物。抗原与特定体液或细胞免疫的产物发生反应,包括由异源免疫原诱导的产物。该术语与术语“免疫原”或“抗原分子”可互换使用。
术语“抗原”包括所有相关的抗原表位。术语“抗原”、“抗原分子”或“免疫原”包括其仍能作为抗原起作用的片段。“表位”或“抗原决定簇”是指抗原上B和/或T细胞应答的位点。在一个实例中,受体抗原包括来自树突状细胞的抗原,例如从外周血白细胞(包括单核细胞或单核细胞衍生细胞)的板传递获得的树突状细胞。
[0316] 如本文所用,术语“免疫原性”是指物质、细胞或其部分例如抗原在人或动物体内激发免疫应答的能力。
[0317] 如本文所用,术语“自身抗原”是指本领域技术人员认为的与自身免疫性疾病相关的宿主抗原(或微生物超抗原),使得自身抗原特异性的活化T细胞的存在与疾病的发生或进展相关。
[0318] 自身抗原可以是确定的自身免疫靶抗原,例如,确定的自身免疫靶抗原,例如在多发性硬化症中,该靶抗原被鉴定为髓鞘碱性蛋白(MBP)MBP 84‑102或MBP 143‑168;胰岛细胞抗原;在葡萄膜炎中,为S抗原;或在类风湿性关节炎中,为II型或其他类型的胶原蛋白;在SLE中,为细胞质接头蛋白170(CLIP‑170);Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL);硬皮病抗原70(Scl‑70);在Grave病中,为甲状腺受体;在重症肌无力中,被鉴定为乙酰胆碱受体。本发明的自身抗原还包含从已知与自身免疫相关的MHC分子洗脱的肽混合物,例如HLA‑DQ和‑DR分子,其赋予对几种常见自身免疫性疾病(例如1型糖尿病、类风湿性关节炎和多发性硬化症)的易感性,或已知会赋予对反应性关节炎和强直性脊柱炎易感性的HLA‑B27分子。本发明的自身抗原还可以是预测结合至
与自身免疫性疾病相关的WIC分子的合成肽。对于其中个体自身抗原尚未表征的其他自身
免疫性疾病,适合于实施本发明方法的自身抗原可以是来自受影响组织的细胞或细胞提取
物(例如类风湿性关节炎的滑膜细胞、牛皮癣的皮肤损伤等)。术语自身抗原还包括其充当
自身抗原的片段。
[0319] 如本文所用,“免疫细胞”广泛地指属于造血来源并在免疫应答中发挥作用的细胞。免疫细胞包括淋巴细胞,如B细胞和T细胞;白细胞;自然杀伤细胞;和骨髓细胞,例如单核细胞、树突状细胞、巨噬细胞、嗜酸性粒细胞、肥大细胞、嗜碱性粒细胞和粒细胞。
[0320] “树突状细胞”在本文中也称为“DC”,是抗原呈递免疫细胞,其处理抗原物质并将其呈递给免疫系统的其他细胞,最显著的是T细胞。DC的功能是捕获和处理抗原。当DC内吞抗原时,它们会将抗原加工成更小的片段(通常是肽),这些片段展示在DC表面上,并通过MHC分子呈递给例如抗原特异性T细胞。吸收抗原后,DC迁移至淋巴结。在成熟过程中,DC可以由各种信号促进,包括通过Toll样受体(TLR)发出的信号,以表达诱导同源效应T细胞
(Teff)被激活并增殖的共刺激信号,从而启动T细胞介导的针对抗原的免疫应答。或者,DC可以将抗原呈递给抗原特异性T细胞,而不提供共刺激信号(或同时提供共抑制信号),从而导致Teff无法正确激活。这种呈递可以引起例如识别抗原的T细胞的死亡或无反应性,或者可以诱导调节性T细胞(Treg)的产生和/或扩增。术语“树突状细胞”包括分化的树突状细胞、未成熟的和成熟的树突状细胞。这些细胞的特征在于表达某些细胞表面标志物(例如CD11c、
MHC II类以及至少低水平的CD80和CD86)、CD11b、CD304(BDCA4))。在一些实施方案中,DC表达CD8、CD103、CD1d等。其他DC可通过不存在谱系标志物例如CD3、CD14、CD19、CD56等来鉴定。此外,树突状细胞可通过其刺激同种异体和混合淋巴细胞反应(MLR)的能力来进行功能表征。
[0321] “耐受性DC”是指能够抑制免疫应答或生成耐受性免疫应答的树突状细胞,例如抗原特异性T细胞介导的免疫应答,例如通过减少效应T细胞对特定抗原的应答、通过影响抗原特异性调节性T细胞数量的增加等。耐受性DC的特征在于离体和/或体内诱导抗原特异性
耐受性免疫应答。这种诱导是指对由诱导的耐受性树突状细胞呈递的一种或多种感兴趣的
抗原的耐受性免疫应答的诱导。耐受性树突状细胞具有耐受性表型,其特征在于至少一种
以下特性i)能够离体和/或体内将幼稚T细胞转化为Foxp3+T调节细胞(例如,诱导幼稚T细
胞中FoxP3的表达);ii)能够离体和/或体内缺失效应T细胞;iii)在用至少一种TLR激动剂
离体刺激后保留其耐受性表型(并且,在一些实施方案中,增加共刺激分子的表达作为对此类刺激的响应);iv)离体使用至少一种TLR激动剂刺激后,不会暂时增加其耗率;v)表达标志物PDL1增加的表达和/或vi)表达标志物GILZ增加的表达。条款v)和vi)可以通过与单
核细胞或PBMC比较来评估。
[0322] “耐受性免疫应答”意指可导致对抗原或表达此类抗原的细胞、组织、器官等特异性的免疫抑制的任何免疫应答。此类免疫应答包括对抗原或表达此类抗原的细胞、组织、器官等特异的不期望的免疫应答中的任何减少、延迟或抑制。此类免疫应答还包括对抗原或表达此类抗原的细胞、组织、器官等特异性的期望的免疫应答中的任何刺激、产生、诱导、促进或募集。因此,耐受性免疫应答包括不存在或减少可以由抗原反应性细胞介导的对抗原
的不期望的免疫应答,以及抑制性细胞的存在或促进。本文提供的耐受性免疫应答包括免
疫耐受性。“生成耐受性免疫应答”是指生成对抗原或表达此类抗原的细胞、组织、器官等特异性的任何前述免疫应答。
[0323] 耐受性免疫应答包括CD4+T细胞、CD8+T细胞或B细胞增殖和/或活性的任何减少、延迟或抑制。耐受性免疫应答还包括抗原特异性抗体产生的减少。耐受性免疫应答还可以
包括导致调节细胞(例如CD4+Treg细胞、CD8+Treg细胞、Breg细胞等)的刺激、诱导、产生或募集的任何反应。在一些实施方案中,耐受性免疫应答是导致向调节表型转化的应答,其特征在于调节细胞的产生、诱导、刺激或募集。
[0324] 耐受性免疫应答还包括导致CD4+Treg细胞和/或CD8+Treg细胞的刺激、产生或募集的任何应答。CD4+Treg细胞可以表达转录因子FoxP3并抑制炎症反应和自身免疫性炎症疾病(Human regulatory T cells in autoimmune diseases.Cvetanovich G L,Hafler D 
A.Curr Opin Immunol.2010December;22(6):753‑60.Regulatory T cells and 
autoimmunity.Vila J,Isaacs J D,Anderson AE.Curr Opin Hematol.2009July;16(4):
274‑9)。这些细胞还抑制T细胞对B细胞的辅助,并诱导对自身和外来抗原的耐受性
(Therapeutic approaches to allergy and autoimmunity based on FoxP3+regulatory 
T‑cell activation and expansion.Miyara M,Wing K,Sakaguchi S.J Allergy Clin 
Immunol.2009April;123(4):749‑55)。CD4+Treg细胞在APC上的II类蛋白呈递时识别抗原。
CD8+Treg细胞识别I类呈递的抗原,也可以抑制T细胞对B细胞的辅助,并导致抗原特异性抑制的激活,从而诱导对自身和外来抗原的耐受。在一些实施方案中,所提供的耐受性树突状细胞可以有效地导致两种类型的应答(CD4+Treg和CD8+Treg)。在其他实施方案中,FoxP3可以在其他免疫细胞例如巨噬细胞、iNKT细胞等中诱导,本文提供的耐受性树突状细胞也可以
导致这些应答中的一种或多种。
[0325] 耐受性免疫应答还包括但不限于诱导调节性细胞因子,例如Treg细胞因子;诱导抑制性细胞因子;抑制炎症细胞因子(例如,IL‑4、IL‑1b、IL‑5、TNF‑α、IL‑6、GM‑CSF、IFN‑γ、IL‑2、IL‑9、IL‑12、IL‑17、IL‑18、IL‑21、IL‑22、IL‑23、M‑CSF、C反应蛋白、急性期蛋白)、趋化因子(例如,CCL‑2、CXCL8、MCP‑1、RANTES、MIP‑1α、MIP‑1β、MIG、ITAC或IP‑10)、产生抗炎细胞因子(例如,IL‑4、IL‑13、IL‑10等)、蛋白酶(例如,MMP‑3、MMP‑9)、白细胞三烯(例如,CysLT‑1、CysLT‑2)、前列腺素(例如,PGE2)或组织胺;抑制Th17、Th1或Th2免疫应答的极化;抑制效应细胞特异性细胞因子:Th17(例如,IL‑17、IL‑25)、Th1(IFN‑γ)、Th2(例如,IL‑4、IL‑13);抑制Th1、Th2或Th17特异性转录因子;抑制效应T细胞的增殖;诱导效应T细胞凋亡;
诱导耐受性树突状细胞特异性基因;诱导FoxP3表达;抑制IgE诱导或IgE介导的免疫应答;
抑制抗体反应(例如,抗原特异性抗体的产生);抑制T辅助细胞反应;TGF‑β和/或IL‑10的产生;自身抗体效应功能的抑制(例如,抑制细胞耗竭、细胞或组织损伤或补体激活);等。
[0326] 任何前述事项可以在一种或多种动物模型中体内测量或者可以在体外测量。本领域普通技术人员熟悉这种体内或体外测量。可以使用例如评估免疫细胞数量和/或功能的
方法、四聚体分析、ELISPOT、基于流式细胞术的细胞因子表达分析、细胞因子分泌、细胞因子表达谱、基因表达谱、蛋白质表达谱、细胞表面标志物分析、基于PCR的免疫细胞受体基因使用检测(参见T.Clay et al.,“Assays for Monitoring Cellular Immune Response to Active Immunotherapy of Cancer”Clinical Cancer Research 7:1127‑1135(2001))等
来监测不期望的免疫应答或耐受性免疫应答。也可以使用例如评估血浆或血清中的蛋白质
水平、T细胞或B细胞增殖和功能测定等的方法来监测不期望的免疫应答或耐受性免疫应
答。在一些实施方案中,可以通过评估FoxP3的诱导来监测耐受性免疫应答。
[0327] 优选地,耐受性免疫应答导致本文所述的疾病、病症或病况、特别是GvHD的发生、进展或病理学的抑制。在一些实施方案中,可以通过确定临床终点、临床功效、临床症状、疾病生物标志物和/或临床评分来评估不期望的免疫应答的减少或耐受性免疫应答的生成。
[0328] 如本文所用,术语“动物”或“哺乳动物”涵盖所有哺乳动物,包括人类。优选地,本发明的哺乳动物是人类受试者。
[0329] 如本文所用,术语“暴露”是指进入紧邻或直接接触的状态或状况。
[0330] 本文使用的术语“造血细胞移植”(HCT)是指血液和骨髓移植(BMT),这是一种涉及输注细胞(造血干细胞;也称为造血祖细胞)以重建患者造血系统的程序。
[0331] 本文使用的术语“自身免疫性病症”或“自身免疫综合征”是指当免疫系统错误地攻击和破坏健康身体组织的自身组分时发生的病况。自身免疫性病症可能影响一种或多种器官或组织类型。通常受自身免疫性病症影响的器官和组织包括:血管、结缔组织、内分泌腺(如甲状腺或胰腺)、关节、肌肉、红细胞和皮肤。
[0332] 在使用暴露于凋亡剂的本发明的任何方法步骤中,凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或氨基乙酰丙酸和光。特别优选的补骨脂素是8‑MOP和amotosalen。以下数量用于指导目的。技术人员可以容易地发现所施用的达到使细胞凋亡的效果的浓度和剂
量。磷酸核黄素的浓度可以是1μM至100μM。amotosalen的浓度可以是50μM至500μM。伴随上
2 2
述核黄素或amotosalen的光剂量可以是1J/cm 至10J/cm 。相应的光可以是UVA或蓝光。8‑
2
MOP的浓度可以是0.2μM至2.5μM(或43ng/mL至540ng/mL)。伴随的光剂量可以是0.5J/cm 至
2
5J/cm。光可以是UVA或蓝光。
[0333] 本发明的方法或该方法的具体步骤可以在袋子例如塑料袋中实施。如果考虑使用塑料材料,则可以使用由以下塑料薄膜制成的袋子:聚烯、聚乙烯、含氟聚合物、聚氯乙烯、乙烯‑乙酸乙烯酯共聚物、乙烯乙烯醇、聚偏二氟乙烯或批准用于医疗用途的其他塑料薄膜。在本发明的优选实施方案中,袋子由乙烯‑乙酸乙烯酯共聚物制成。袋子可以由提供一定透明程度的材料制成,使得样品或细胞混合物可以用可见光或UV光照射。
[0334] 现在参考一些具体实施例来描述本发明,然而,这些实施例是出于说明性目的而不是以限制方式解释的。
[0335] 实验
[0336] 实验1‑phDC的产生
[0337] 所有研究均使用健康人类志愿者捐献的血液进行。将外周血收集到1:100 5,000U/mL肝素(McKesson Packaging Services)中,并按照制造商的方案通过Isolymph(CTL Scientific Supply Corp.)密度梯度离心分离含血小板的PBMC。收集并保留自体血浆(也
含有血小板)。将洗涤后的PBMC和血小板重悬于自体血浆中,并在转免疫(TI)室或临床ECP
板中孵育1小时。
[0338] 在TI室中,使用注射以0.09mL/min的速率通过细胞。板传递后,收集细胞,并用100% FBS以0.49mL/min清洗TI室,同时通过轻弹或轻敲板表面进行物理扰动,以帮助从室中分离任何贴壁细胞。在临床ECP板中,细胞以24mL/min的流速通过,然后用人AB血清
(Lonza BioWhittaker)以100mL/min的流速洗涤,通过轻弹或敲击板表面进行物理扰动,以帮助分离任何贴壁细胞。收集、洗涤通过TI室或ECP板的PBMC,并在标准条件下在不含酚红并补充有15%人AB血清(Lonza BioWhittaker)、1%青霉素/链霉素(Invitrogen,
Carlsbad,CA)和1% L‑谷氨酰胺(Invitrogen,Carlsbad,CA)的RPMI(Gibco,Carlsbad,CA)中培养过夜。第二天,收获生理树突状细胞(包括通过刮擦收获任何贴壁细胞)。
[0339] 实验2:ECP白血病单倍体移植试验‑方案设计和预期结果
[0340] 1.母亲(未来的供体)通过输入父亲经ECP处理的血液而对父亲抗原产生耐受
[0341] 2.检查母亲确实对父亲抗原具有耐受性(对父亲细胞的MLR反应减少,没有针对父亲HLA类型的抗体)
[0342] 3.将接受治疗的母亲的骨髓移植给白血病儿童
[0343] 4.评估儿童骨髓移植
[0344] 5.评估试验终点‑骨髓移植、GvHD发生率和严重程度、癌症复发率上述处理如图1所示。
[0345] 采用上述处理后,由于移植物已预先耐受,儿童不会出现GvHD或表现出减轻的GvHD症状。
[0346] 实验3:ECP白血病单倍体移植试验‑方案设计和预期结果
[0347] 1.在单倍型骨髓移植或任何免疫消融预处理之前,受体接受耐受ECP治疗(遵循Francine Foss的完全匹配移植试验设计,参见实验1)
[0348] 2.进行移植,但移植后环磷酰胺剂量(PTCy)减少。
[0349] 3.评估骨髓移植
[0350] 4.评估试验终点‑骨髓移植、GvHD发生率和严重程度、癌症复发率上述处理如图2所示。
[0351] 应用上述处理,可以降低PTCy以保持抗肿瘤免疫力。PTCy可以完全省略并用ECP替换。
[0352] 实验4:PUVA处理的树突状细胞对GvHD的预防
[0353] 材料和方法
[0354] 1在第‑4天,用C57BL/6肿瘤(MC38结肠癌)皮下(侧腹)接种未来移植物受体小鼠(C57BL/6,H2b MHC单倍型)。
[0355] 2在第‑1天,未来的移植物受体(携带肿瘤)接受致死剂量(950cGy)的γ辐射,从而消除其自身的免疫系统。
[0356] 3在移植当天(第0天),准备组织用于移植。
[0357] a.在无移植物对照中,受辐射的C57BL/6小鼠不接受任何移植。
[0358] b.在同系对照中,通过回输C57BL/6骨髓和脾细胞来重建天然C57BL/6免疫系统
[0359] c.在同种异体对照移植物中,受体是用来自Balb/c供体小鼠(H2d MHC单倍型)的完全错配的骨髓和脾细胞重建的。
[0360] d.在同种异体PUVA移植物中,Balb/c骨髓和脾细胞(含有树突状细胞)与经致死辐射的C57BL/6脾细胞一起孵育5小时,然后在培养皿中用极低剂量的PUVA(200ng/mL 8‑MOP,
2
0.1J/cm UVA)处理。
[0361] 4将准备好的组织移植到受辐射的携带肿瘤的受体中。
[0362] 5然后监测受体的骨髓移植(存活率,随后通过血液分析证实)、GvHD和肿瘤生长。
[0363] ·接受辐射但未接受任何移植物的小鼠均在第14天死亡。
[0364] ·同系对照小鼠移植良好,不发生GvHD(合乎预期,因为移植物完全匹配),并且长出大肿瘤。
[0365] ·同种异体对照小鼠移植良好,在约第25天出现严重的GvHD,均致死(合乎预期,因为移植物完全错配),并且肿瘤生长难以评估因为其相对缓慢,而致死很快。
[0366] ·同种异体PUVA小鼠移植良好,没有显示任何GvHD迹象(第47天),尽管肿瘤生长,但生长速率似乎为同系对照小鼠的约50%,即部分受GvT效应控制。
[0367] 结果描述于下表1以及图3和4中。图3还示意性地描述了上述方法。
[0368] 结果
[0369] 表1:不同处理组的结果
[0370]
[0371] 发明人惊奇地发现,用低剂量的8‑MOP/UVA(即根据本发明的方法)处理的移植物可预防GvHD。其基本原理是吸收了垂死的树突状细胞的健康的树突状细胞为受体提供了对
移植物的耐受性。
[0372] 实验5:移植前输注经体外光分离置换术(ECP)处理的供体脾细胞对心脏移植存活率的影响
[0373] 供体小鼠为BALB/c(H‑2d),雄性,8‑14周龄。受体小鼠为C57BL/c,雄性,10‑14周龄(n=24)。收集供体小鼠的脾细胞并分成两组。第1组的供体细胞在流动室中承受剪切力(图5中的“未处理”)。第2组的供体细胞在流动室和ECP中承受剪切力(图5中的“ECP”)。10只受体小鼠接受未经处理的供体细胞,而14只受体小鼠接受ECP处理的供体细胞。
[0374] 在输注至受体小鼠之前对供体细胞的处理如下:
[0375] 在37℃下,将0.4mL PRP级分引入流动室60分钟,使流动室包被有富血小板血浆(PRP)。
[0376] 用60mL注射器将供体脾细胞以13.33mL中4亿个细胞的浓度注射到流动室中。
[0377] ECP的实施方式为:每1亿个细胞添加200μL 8‑MOP于20mL PBS中(200ng/mL)。将细2
胞暴露于约20‑22mW/cm的UVA下200s。受体小鼠接受了经过处理的供体细胞,每只受体小
鼠接受了大约5000万个细胞。
[0378] 向受体小鼠输注供体细胞7天后进行心脏移植。图5中报告的结果为术后生存率百分比(以天为单位)。从图5中可以看出,接受未经处理的供体细胞的受体小鼠(即第1组,供体细胞仅受到剪切力)在手术后第9天左右死亡,而接受ECP供体细胞的受体小鼠(即第2组,供体细胞经受剪切力和ECP)术后存活期最长达29天。因此,如果受体在移植前接受了ECP处理的供体细胞,例如ECP处理的脾细胞(脾细胞包括健康的树突状细胞),则受体对同种异体移植物的耐受性明显更好。可以得出结论,用ECP处理的供体细胞对受体进行预处理可导致同种异体移植物的长期存活和供体特异性耐受。
[0379] 实验6:体外光分离置换术预防经受标准清髓性调节和同种异体造血干细胞移植的患者发生急性GVHD
[0380] 材料和方法
[0381] 受试者
[0382] 该研究和同意书得到了所有参与地点的机构审查委员会或同等机构的批准。所有受试者在开始研究治疗前都签署了批准的同意书。资格标准包括18‑60岁患有血液恶性肿
瘤且器官功能不妨碍清髓性准备方案和同种异体HCT治疗的受试者。如果受试者被诊断患
有血液恶性肿瘤,并且其治疗选择是同种异体骨髓或PBSC移植,则他们有资格参加该研究。
无论受试者的疾病是否缓解,或者在疾病第一次或第二次复发后,受试者都可以登记入组。
受试者被要求体重为至少40kg,血小板计数高于20 000/cmm,并且对补骨脂素或柠檬酸
产品没有已知的敏感性。受试者必须拥有相关供体,该供体在所有HLA‑A、B和DR基因座上血清学或分子匹配,或者在一个HLA‑A或‑B基因座上错配,但在HLA‑DR基因座上分子匹配,或者在HLA‑A、‑B和DR基因座上具有分子匹配的无关供体。由于登记是在2002年10月至2004年
1月期间进行的,因此并未定期进行HLA‑C匹配。准备方案和预防针对接受了CY(每天60mg/kg,连续2天)和TBI(10‑13.5Gy分剂量递送,3或4天)GVHD受试者。GVHD预防为CSP 3–5mg/kg,从D‑1开始静脉注射,并调整至维持在200至600ng/mL之间的波谷水平。当临床耐受时,CSP改为口服施用,并在D 100之前逐渐减量,复发或对CSP不耐受的受试者除外。从匹配的
2
相关供体接受HCT的受试者在第1天静脉注射接受MTX 10mg/m,并在第3、6和11天接受5mg/
2 2
m,而具有错配的相关供体或匹配的非相关供体的受试者在第1天接受MTX 15mg/m,第3、6
2
和11天接受10mg/m 。MTX的剂量基于研究人员之间的共识,以便为急性GVHD提供统一的预
防。根据每个研究地点的机构指南给予支持性护理和预防性抗微生物治疗。
[0383] 体外光分离置换术
[0384] 如前所述,ECP使用UVAR XTS机器(Therakos,Exton,PA,USA)进行(Miller et al.,2004)。一般情况下,在使用甲氧沙林(methoxsalen)溶液(UVADEX Therakos)之前,每次处理至少收集1500mL的血沉棕黄层血,在血沉棕黄层收集完成后,在光活化过程之前,将其注射到ECP回路的再循环袋中。光活化完成后,将处理过的血沉棕黄层重新注入受试者体内。患者在开始准备方案前4天内连续2天接受ECP。
[0385] GVHD和不良事件分级
[0386] 根据既定标准(不良事件通用术语标准,3.0版,2003年12月12日)对不良事件进行分级。修改后的Seattle‑Glucksberg标准用于急性GVHD的分期(Glucksberg et al.,
1974),有限和广泛的慢性GVHD的诊断标准如Schulman et al.,1980所述。为了确保急性和慢性GVHD诊断的一致性,研究人员在试验开始前经历了诊断标准的培训。每位研究者在其
研究地点采用适当的诊断方法来确定是否存在急性或慢性GVHD。
[0387] 统计学
[0388] 研究分析。主要分析是移植后前100天内II‑IV级急性GVHD的发生率,并使用累积发生率函数进行计算,以适应在不发生急性GVHD的情况下死亡的竞争风险。同样,累积发病率法用于计算慢性GVHD、移植相关死亡率(TRM)和复发的发病率,以适应竞争风险。总生存期(OS)和无病生存期(DFS)的概率使用Kaplan‑Meier乘积极限法(95%置信区间)进行描
述。治疗失败(死亡或复发)是DFS评估中使用的事件。还计算了描述性统计数据,例如事件发生的中位时间。
[0389] 与历史对照的比较。历史对照是使用CIBMTR维护的数据库来鉴定的。CIBMTR是威斯康星医学院国际骨髓移植登记处(IBMTR)和国家骨髓捐赠计划的研究附属机构,该计划
由全球超过450多个移植中心组成的自愿工作组组成,这些工作组向协调统计中心提供有
关连续同种异体和自体HCT的详细数据。参与中心被要求连续报告所有移植,并通过现场审计来监控合规。数据库中的所有患者均受到纵向随访,并包括年度评估。计算机化的误差检查、医生对提交数据的审查以及参与中心的现场审计可确保数据质量。CIBMTR在此期间进
行的观察性研究是在放弃知情同意的情况下进行的,并符合机构审查委员会和威斯康星医
学院隐私官员确定的HIPAA法规。CIBMTR在两个层面收集数据:登记和研究。登记数据包括
疾病类型、年龄、性别、移植前疾病阶段和化疗反应、诊断日期、移植类型(骨髓衍生和/或血液衍生的干细胞)、高剂量预处理方案、移植后疾病进展和生存、新恶性肿瘤的发展和死亡原因。每隔6个月请求一次登记患者的进展或死亡数据。所有参与CIBMTR的站点都会提供登记数据。研究数据是使用加权随机方案选择的登记患者子集收集的,以确保代表性,并包括详细的疾病、移植前和移植后临床信息。本研究的历史对照衍生自研究数据库。ECP研究受试者在2002年和2004年之间进行移植。通过将本研究的资格标准应用于1997年和2004年之
间移植的受试者来选择CIBMTR对照。对照的较长时间范围用于确保足够数量的受试者进行
调整后的比较,具有合理的统计效力。研究受试者和对照受试者的结果数据均在一年时进
行审查,以调整随访时间长短的差异。由于研究受试者和对照在两个不同的时间段进行移
植,因此检查了移植年份(1997‑1999年与2000‑2004年)对对照结果的潜在影响。1997‑1999年移植的对照受试者与2000‑2004年移植的对照受试者的1年结果没有差异。使用多变量
Cox回归分析对研究对象和对照进行比较。通过添加时间依赖性协变量来进行比例检验。这些测试表明比例假设是有效的。使用逐步向后方法来鉴定与结果相关的显著协变量(除了
使用ECP)。模型构建中考虑的变量包括年龄、性别、种族、供体关系、HLA匹配、移植物类型、疾病类型、移植时疾病状态和CMV血清学状态。治疗效果(ECP)包含在模型构建的每个步骤
中。对ECP治疗和其他显著协变量之间潜在相互作用的测试显示没有显著的相互作用。一年调整后的总体概率和DFS是根据最终的Cox模型估计的,根据接受的治疗进行分层,并根据
每个预后因素的汇总样品比例值进行加权。这些调整后的概率估计了具有相似预后因素的
人群中结果的可能性。
[0390] 结果
[0391] 受试者和供体特征
[0392] 66名受试者参加了ECP研究。9个研究中心各招收1至16名受试者(平均每个研究中心7名受试者)。然而,3名受试者未接受ECP研究治疗;一名患者撤回了研究同意书,一名患者移植延迟,一个中心的ECP仪器出现机械问题。一名受试者接受了ECP,但由于疾病进展迅速而没有进行移植。研究完成后,62名受试者被认为可以在修改后的意向治疗人群数据集
中进行评估。其中两名受试者在开始准备方案之前仅接受了一次ECP治疗,因为随后ECP仪
器出现了机械问题。图6总结了受试者、疾病、供体特征和疾病状态信息。
[0393] 移植
[0394] 一名受试者没有移植并在第28天死于呼吸衰竭(原因未知)。所有其他受试者具有令人满意的中性粒细胞和血小板恢复,并且没有晚期移植失败。接受骨髓移植的受试者达
到中性粒细胞计数4500/mL的中位(范围)时间为21(14‑39)天,接受外周血移植的受试者为
14(13‑28)天。达到血小板420000/cmm的相应时间分别为14(11‑43)天和14(6‑56)天。
[0395] GVHD
[0396] 62名受试者中有22名(36%)出现II‑IV级急性GVHD,其中包括30名相关供体HCT受体中的9名(30%)和32名匹配的无关或一种HLA抗原错配的相关供体HCT受体中的13名
(41%)(图7)。皮肤是最常见且受累最严重的器官,38%的受试者患有2期或更高级别的皮
肤受累,而16%和13%的受试者分别患有2期或更高级别的胃肠道或肝脏受累(图7)。II‑IV级急性GVHD的100天累积发生率为35%(95% CI,23%‑48%)(图8)。四十名(66%)患者患有活检证实的急性GVHD。没有患者被描述为在第100天之前患有早期慢性GVHD或在第100天
之后患有晚期急性GVHD。首次诊断和II‑IV级急性GVHD的最高级别的中位时间均为35天,其中首次诊断范围为18‑52天,最高级别范围为22‑96天。53名受试者可评估慢性GVHD。7名患者在第100天前死亡(急性GVHD 3例,特发性肺炎1例,多器官系统衰竭3例),两名患者收集的数据不足,无法确定是否发生慢性GVHD。53名受试者中有21名(40%)发生慢性GVHD(有限性:8名(15%);广泛性:13名(25%))。有限性和广泛性慢性GVHD的1年累积发生率为38%
(95% CI,21%‑47%)(图9)。
[0397] 毒性
[0398] 研究期间最常见的严重不良事件是发烧8名(13%)、发热性中性粒细胞减少症4名(7%)和多器官系统衰竭3名(5%)。直接归因于ECP的不良事件包括两名在经历ECP时出现
低血压的受试者。17名(27%)受试者发生CMV再激活,其中2名受试者在支气管镜活检标本
中发现肺组织有CMV疾病。两名(3%)受试者在参与研究时患有全身真菌感染,一名发生在
移植后19天,另一名发生在移植后9个月。
[0399] 存活
[0400] 幸存患者的中位随访时间为371天(范围为366‑643天),其中62名受试者中有48名(77%)幸存。移植后100天和1年的Kaplan Meier估计生存率分别为89%(95% CI,78%‑
97%)和77%(95% CI,64%‑86%)。相关和无关供体HCT受体的一年OS概率分别为89%
(95% CI,70%‑96%)和66%(95% CI,46%‑80%)(图10)。所有患者的一年DFS概率为
69%(95% CI,64%‑86%),相关供体HCT后为79%(95% CI,59%‑90%),无关供体HCT后为60%(95%CI,40%‑75%)。7名(11%)患者出现复发。14名受试者(23%)死亡:3名在相关供体移植后死亡,11名在无关供体移植后死亡。死亡原因为复发(1)、急性GVHD(3)、慢性
GVHD(1)、感染(4)、多器官系统衰竭(3)和特发性肺炎(2)。TRM的1年累积发生率为21%
(95% CI,11%‑31%);相关和无关供体移植后的累积发生率分别为10%(95% CI,1%‑
20%)和31%(95% CI,18%‑50%),图11)。
[0401] ECP研究受试者与CIBMTR对照进行比较
[0402] CIBMTR数据库用于搜索具有与研究受试者相似特征的历史对照。对照受试者需要满足图12中定义的资格标准。总共确定了347名对照受试者。将他们的特征与图13中的研究受试者的特征进行比较。接受ECP治疗的受试者比对照更有可能年龄超过40岁、是白种人、并且有不相关的供体。基础疾病的分布也存在显著差异。在多变量分析中考虑了这些差异
的潜在影响。多变量分析显示,与历史对照相比,ECP治疗的受试者发生II‑IV级急性GVHD的比率显著降低(相对风险[RR],0.61;95% CI,0.38‑0.97)(P=0.04)(图14)。这一较低的比率是由于ECP治疗的受试者的急性GVHD发病明显延迟,而不是发病率绝对下降(图15)。研究患者中II‑IV级急性GVHD的累积发生概率为36%(95% CI,25%‑48%),历史对照队列中为
39%(95% CI,33%‑44%)(图15)。与历史对照相比,接受ECP治疗的受试者的TRM也较少,但这并不具有统计学意义(RR,0.55;95% CI,0.29‑1.04)(P=0.065)。各组之间的静脉闭塞性疾病或间质性肺炎没有差异。然而,85名(24%)对照患者和5名(8%)研究患者发生了
机会性感染(P=0.008)。ECP治疗的受试者的DFS和OS的调整后概率显著高于历史对照(图
16和17)。ECP治疗的受试者1年调整后DFS率为74%(95% CI,62%‑82%),历史对照队列为
63%(95% CI,58%‑67%)(治疗失败[复发或死亡]的RR),0.60;95% CI,0.36–0.99)(P=
0.045)。ECP治疗的受试者1年调整后OS率为83%(95% CI,72%‑90%),历史对照为67%(95% CI,62%‑71%)(死亡率RR,0.44;95% CI,0.24–0.80)(P=0.007)。
[0403] 讨论
[0404] 研究完成后,我们与CIBMTR进行了合作,以确定合适的历史对照,以便与ECP研究受试者进行比较,从而正确看待这项单一II期研究的结果。使用本研究中患者的资格标准
选择对照。然而,如图13所示,各组之间的特征分布存在一些差异,ECP研究受试者更有可能年龄较大并且接受不相关的供体移植物,两者都与GVHD风险增加相关。尽管存在这些有利
于历史对照组的关键人口统计学差异,但ECP治疗队列中急性GVHD的发生较慢。调整预后因素的差异的多变量分析显示各组之间急性GVHD(II‑IV级)的比率存在显著差异(图15),急
性GVHD发病时间显著延迟。尽管ECP的急性GVHD绝对发生率并未降低,但多变量分析显示,与历史对照队列相比,ECP研究队列中TRM较少、治疗失败(复发和TRM)较少、总体和DFS较高的趋势。除了与历史对照组相比,ECP治疗的患者中机会性感染明显减少外,各组之间与方案相关的毒性相似。较晚发生的急性GVHD本身可能是有益的,因为它可能允许从准备方案
和移植手术中获得更多恢复,以及更高程度的免疫重建,使这些患者能够更好地耐受皮质
类固醇的副作用,减少终末器官损伤,并克服感染。ECP似乎并没有抑制同种免疫介导的移植物抗恶性肿瘤效应,因为两组之间的复发率没有显著差异,尽管评估复发的随访时间很
短。实验7:使用耐受性phDC改善自身免疫性疾病
[0405] 在此实施例中,使用动物模型来评估使用耐受性phDC对自身免疫性疾病的改善。
[0406] 有许多公认的自身免疫性疾病动物模型可供使用;示例性动物模型如上表A所示。如有必要,在用耐受性phDC或对照处理之前诱导自身免疫性疾病。根据动物模型的相关临
床标准对动物进行检查和评分。在一些实施例中,将动物分为四个处理组,如下:
[0407] a)未经处理的动物
[0408] b)用呈递自身抗原的健康phDC进行处理
[0409] c)用呈递自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC处理
[0410] d)用具有已内化的含有自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC进行处理
[0411] 上述处理组的phDC可以按如下方式生成:
[0412] b)呈递自身抗原的健康的phDC:
[0413] 单核细胞取自健康的同系动物,按照所述通过TI板(Ventura et al.J Vis Exp.2019May 17;147),并与自身抗原一起孵育过夜以确保抗原吸收。
[0414] c)呈递自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC:
[0415] 从健康的同系动物中获得单核细胞,并如上所述通过TI板,然后暴露于足以诱导细胞损伤的剂量的8‑MOP和UVA,并与自身抗原一起孵育过夜。
[0416] d)具有已内化的含有自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC:
[0417] 来自c)组的细胞与等量的新鲜单核细胞结合,如上所述通过TI板,并共孵育过夜以确保健康phDC吸收含有自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的phDC。
[0418] 将如上所述生成的phDC以适当的剂量(例如,至少1x106个细胞/动物)、在适当时间间隔下静脉内施用于适当组中的小鼠,通常至少三次用于动物模型。
[0419] 对于特定模型,在合适的时间段内监测(例如每天)动物的自身免疫性疾病。此外,动物可能在实验过程中的不同时间点被处死:
[0420] (i)在疾病诱导之前,即健康动物;
[0421] (ii)疾病诱导后,但未经处理,即免疫动物;
[0422] (iii)第二次和第三次疫苗接种之间,即中间时间点;
[0423] (iv)实验结束时,即终点
[0424] 安乐死后,获取动物样品(例如,脾脏和腹股沟和腋窝淋巴结),将其解离成单细胞悬浮液,并用于评估对免疫和处理的免疫应答。标准免疫应答测定包括通过细胞表面或细胞内流式细胞术进行的免疫细胞表型分析、炎症或抗炎细胞因子分泌测定(例如ELISA、
Luminex、ELISpot)以及响应自身抗原再刺激的T细胞增殖(例如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯
(CFSE)稀释)。
[0425] 示例性结果将包括:
[0426] a)未经处理的动物:
[0427] ‑进行性疾病与模型中的预期一致。
[0428] b)用呈递自身抗原的健康phDC处理:
[0429] ‑进行性疾病,由于健康phDC的额外免疫作用,可能比模型中预期的更严重。
[0430] c)用呈递自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC处理:
[0431] ‑进行性疾病,由于8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的一些耐受作用被注射动物中的健康DC吸收,可能没有模型中预期的那么严重。
[0432] d)用具有已内化的含有自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC进行治疗:
[0433] ‑显著减少的疾病,由于健康phDC的耐受性作用,这些phDC吸收了8‑MOP/UVA损伤的携带自身抗原的凋亡phDC,因此能够控制和减少疾病。实验8:使用耐受性phDC改善包括多发性硬化症(MS)的自身免疫性疾病
[0434] 在此实施例中,使用小鼠模型来评估耐受性phDC是否可以改善自身免疫性疾病例如MS。
[0435] 实验性自身免疫性脑脊髓炎(EAE)是被广泛接受的人类MS小鼠模型,与人类临床疾病有许多相似之处。小鼠EAE模型的特点是进行性瘫痪、中枢神经系统炎症和脱髓鞘,主要由髓磷脂特异性CD4+细胞介导,尽管CD8+细胞和B细胞也发挥作用。因此,EAE小鼠可用于造模自身免疫性疾病环境中树突状细胞的耐受性诱导。
[0436] 1.在11‑13周龄雌性C57BL/6小鼠中诱导EAE,通过用弗氏完全佐剂(CFA)乳剂中的髓鞘少突胶质细胞糖蛋白(MOG)肽MOG35‑55或MOG1‑125进行免疫,然后在PBS中施用百日咳毒素(PTX),遵循本领域已知的标准方案。
[0437] 2.EAE预计在免疫后8至18天出现。疾病诱导后,每天检查所有动物的健康状况并根据以下标准EAE临床标准进行评分:0,无症状;0.5,尾部远端半部失去张力;1,整个尾部失去张力;1.5,后肢无力;2,后肢瘫痪;2.5,后肢截瘫;3,前肢无力;4,四肢轻瘫;4.5,严重四肢轻瘫;5,四肢瘫痪;和6,死亡。处理在平均临床评分超过1.0的第一天开始,这反映了大多数小鼠的临床相关疾病发病。
[0438] 3.将小鼠分为4个处理组,每组至少10只动物,如下:
[0439] a)未经处理的小鼠
[0440] b)用呈递MOG抗原的健康phDC处理
[0441] c)用呈递MOG抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC处理
[0442] d)用具有已内化的含有MOG抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC进行处理
[0443] 4.上述处理组的phDC将如下生成:
[0444] b)呈递MOG抗原的健康phDC:
[0445] 单核细胞取自健康同系小鼠,如所述(Ventura et al.J Vis Exp.2019May17;147)通过TI板,并与MOG抗原一起孵育过夜以确保抗原吸收。
[0446] c)用呈递MOG抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC:
[0447] 从健康同系小鼠获得单核细胞,如上所述通过TI板,然后暴露于足以诱导细胞损伤的剂量的8‑MOP和UVA,并与MOG抗原一起孵育过夜。
[0448] d)具有已内化的含有MOG抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC:
[0449] 来自c)组的细胞与等量的新鲜单核细胞结合,如上所述通过TI板,并共孵育过夜以确保健康phDC吸收含有MOG抗原的8‑MOP/UVA损伤的phDC。
[0450] 5.将如上所述(参见4.)生成的phDC以至少1x 106个细胞/小鼠的剂量静脉内施用于适当组(参见3.)中的小鼠,至少3次,例如如下:
[0451] ‑平均临床评分超过1.0的第一天,这反映了大多数小鼠的临床相关疾病发病(例如,免疫后第13天)
[0452] ‑第一次处理剂量后四天(例如,免疫后第17天)
[0453] ‑第二次处理剂量后四天(例如,免疫后第21天)
[0454] 6.每天监测小鼠的EAE临床评分,直到免疫后至少4周。
[0455] 7.此外,实验过程中可能会在不同时间点处死小鼠:
[0456] (i)EAE诱导前,即健康小鼠;
[0457] (ii)EAE诱导后,但未经处理,即免疫小鼠;
[0458] (iii)第二次和第三次疫苗接种之间,即中间时间点;
[0459] (iv)实验结束时,即终点
[0460] 安乐死后,获得脾脏和腹股沟和腋窝淋巴结,解离成单细胞悬浮液,并用于评估对免疫和处理的免疫应答。标准免疫应答测定包括通过细胞表面或细胞内流式细胞术进行的免疫细胞表型分析、炎症或抗炎细胞因子分泌测定(例如,ELISA、Luminex、ELISpot)以及响应MOG肽再刺激的T细胞增殖(例如,羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)稀释)。
[0461] 在安乐死时获得脊髓,固定在4%多聚甲(PFA)中,并用于通过组织学和免疫组织化学对疾病进行额外评估。典型的组织学分析包括炎性病灶计数、凋亡细胞计数和脱髓
鞘程度(髓磷脂碱性蛋白的免疫组织化学)。
[0462] 示例性结果将包括:
[0463] a)未经处理的小鼠:
[0464] ‑进行性EAE疾病与该模型中的预期一致。
[0465] ‑免疫学检查后,检测对MOG抗原反应的炎症免疫细胞。
[0466] ‑经组织学检查,轴突损伤和炎症损伤的迹象与模型一致。
[0467] b)用呈递MOG抗原的健康phDC处理:
[0468] ‑进行性EAE疾病,由于健康phDC的额外免疫作用,可能比该模型中预期的更严重。
[0469] ‑免疫学检查后,增加对MOG抗原反应的炎症免疫细胞的检测。
[0470] ‑组织学检查后,有更严重的轴突损伤和炎症损伤的迹象。
[0471] c)用呈递MOG抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC处理:
[0472] ‑进行性EAE疾病,可能没有该模型中预期的那么严重,由于8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的一些耐受作用被注射小鼠中的健康DC吸收。
[0473] ‑免疫学检查后,对MOG抗原反应的炎症免疫细胞的检测有所减少。
[0474] ‑组织学检查后,有较轻的轴突损伤和炎症损伤的迹象。
[0475] d)用具有已内化的含有MOG抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC处理:
[0476] ‑显著减少的EAE疾病,由于吸收了携带MOG抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC的耐受作用,从而能够控制和减少EAE疾病。
[0477] ‑免疫学检查后,检测出耐受性免疫细胞,例如Treg,以及显著减少的对MOG抗原反应的炎症免疫细胞。
[0478] ‑组织学检查后,轴突损伤和炎症损伤显著减少。
[0479] 实验9:使用耐受性phDC改善其他自身免疫性疾病
[0480] 在此实施例中,使用合适的动物模型(例如,上表A中描述的动物模型)来评估耐受性phDC是否改善自身免疫性疾病。
[0481] 例如,非肥胖糖尿病(NOD)小鼠是本领域公认的胰岛素依赖性糖尿病(IDDM)模型。在此实施例中,使用与实验7和8中描述的类似方法评估NOD小鼠。
[0482] 根据NOD小鼠的相关临床标准对动物进行检查和评分。在一些实施例中,将动物分为四个处理组,如下:
[0483] a)未经处理的动物
[0484] b)用呈递自身抗原(例如胰腺β细胞抗原)的健康phDC处理
[0485] c)用呈递自身抗原(例如胰腺β细胞抗原)的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC处理
[0486] d)用具有已内化的含有自身抗原(例如胰腺β细胞抗原)的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC处理
[0487] 上述处理组的phDC可以按如下方式生成:
[0488] b)呈递自身抗原(例如胰腺β细胞抗原)的健康phDC:
[0489] 单核细胞取自健康的同系动物,如所述(Ventura et al.J Vis Exp.2019May17;147)通过TI板,并与自身抗原一起孵育过夜以确保抗原吸收。
[0490] c)呈递自身抗原(例如,胰腺β细胞抗原)的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC:
[0491] 单核细胞取自健康的同系动物,并如上所述通过TI板,然后暴露于足以诱导细胞损伤的剂量的8‑MOP和UVA,并与自身抗原(例如胰腺β细胞抗原)一起孵育过夜。
[0492] d)具有已内化的含有自身抗原(例如胰腺β细胞抗原)的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC:
[0493] 来自c)组的细胞与等量的新鲜单核细胞结合,如上所述通过TI板,并共孵育过夜以确保健康phDC吸收含有自身抗原(例如胰腺β细胞抗原)的8‑MOP/UVA损伤的phDC。
[0494] 将如上所述生成的phDC以适当的剂量(例如,至少1x 106个细胞/动物)、在适当时间间隔下静脉内施用于适当组中的小鼠,通常至少三次,用于动物模型。
[0495] 监测动物的糖尿病表型。此外,动物可能在实验过程中的不同时间点被处死:
[0496] (i)疾病诱导前,即健康动物;
[0497] (ii)疾病诱导后,但未经处理,即免疫动物;
[0498] (iii)第二次和第三次疫苗接种之间,即中间时间点;
[0499] (iv)实验结束时,即终点
[0500] 安乐死后,获取动物样品(例如脾脏和腹股沟和腋窝淋巴结),分离成单细胞悬浮液,用于评估对免疫和处理的免疫应答。标准免疫应答测定包括通过细胞表面或细胞内流
式细胞术进行的免疫细胞表型分析、炎症或抗炎细胞因子分泌测定(例如,ELISA、Luminex、ELISpot)以及响应自身抗原再刺激的T细胞增殖(例如羧基荧光素琥珀酰亚胺酯(CFSE)稀
释)。
[0501] 示例性结果将包括:
[0502] a)未经处理的动物:
[0503] ‑与NOD模型中预期一致的进行性疾病。
[0504] b)用呈递自身抗原的健康phDC处理:
[0505] ‑进行性疾病,可能比NOD模型中预期的更严重,由于健康phDC的额外免疫作用。
[0506] c)用呈递自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC处理:
[0507] ‑进行性疾病,可能没有NOD模型中预期的那么严重,由于8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的一些耐受作用被注射动物中的健康DC吸收。
[0508] d)用具有已内化的含有自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC处理:
[0509] ‑显著减少的疾病,由于吸收了携带自身抗原的8‑MOP/UVA损伤的凋亡phDC的健康phDC的耐受作用,因此能够控制和减少疾病。
[0510] 其他自身免疫性疾病可以使用如上所述的类似方法进行评估。
[0511] 实验10:使用耐受性phDC治疗自身免疫性疾病
[0512] 使用如本文所述产生的耐受性phDC来治疗患有自身免疫性疾病的人类患者。
[0513] 例如,树突状细胞样品是从患有自身免疫性疾病(例如,MS)的患者中获得的。将树突状细胞暴露于凋亡剂(例如,补骨脂素和UVA的组合(PUVA),特别是8‑MOP和UVA的组合)。在一些实例中,自身抗原也被添加到暴露于凋亡剂的树突状细胞中。例如,对于MS,可以添加表A中描述的任何合适的自身抗原,例如MBP和/或MOG。在细胞发生凋亡的条件下,将细胞暴露于凋亡剂一段时间。
[0514] 然后将所得的凋亡树突状细胞与如本文所述产生的生理树突状细胞组合,并且可以在施用于受试者之前共孵育,例如至少0.5h、1h、2h、3h、4h、5h或6h。或者,可以将组合直接施用于受试者而无需共孵育。phDC治疗有望改善自身免疫性疾病。
[0515] 实验11:与PUVA损伤的PBMC一起孵育的人phDC中PD‑L1表达增加
[0516] 使用TI板从健康志愿者的血液中生成人phDC,并与等量的8‑MOP/UVA处理的同系PBMC(PUVA syn PBMC)或同种异体PBMC(PUVA allo PBMC)孵育过夜。在18小时时通过流式
细胞术测量PD‑L1表达(报告为活CD14+phDC分数的平均荧光强度,MFI),发现与同种异体或同系PUVA处理的PBMC共孵育后,在健康phDC中的表达水平明显高于前体单核细胞(图18)。N=分析的血液供体的数量;p值=经过Welch校正的未配对t检验。
[0517] 实验12:MLR测定中应答T细胞的PD1表达降低
[0518] 使用来自健康志愿者供体的血液进行MLR(混合淋巴细胞反应)测定。简而言之,将5
来自一名供体的2*10个纯化、CFSE标记的应答T细胞(T细胞)与来自同一供体(同系培养
5
物)或来自无关供体(MLR)的4*10个γ辐射(3000rad)刺激剂PBMC共培养。为了抑制MLR反
5 5
应,一些培养物另外补充了1*10个同系8‑MOP/UVA处理的PBMC和1*10 个同系通过TI板的
phDC(MLR+PUVAsyn.PBMC+phDC)。培养5天后,通过流式细胞术(FACS)测量CFSE稀释度来测
定应答CD8 T细胞和CD4 T细胞的增殖(A、B)。另外通过FACS评估应答CD8 T细胞和CD4 T细
胞的激活状态,使用CD44和PD1表达来检测激活的T细胞(C、D)。对于CD8 T细胞和CD4 T细
胞,添加健康phDC和PUVA处理的PBMC显著抑制了增殖和活化(图19)。N=分析的血液供体的数量;p值=经过Welch校正的未配对t检验。
[0519] 另外,本发明涉及以下的实施方案。
[0520] 1.选择性产生耐受性树突状细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
[0521] a)提供来自供体的树突状细胞;
[0522] b)将步骤a)所述的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0523] c)提供来自受体的生理树突状细胞;和
[0524] d)将步骤b)所述的凋亡供体树突状细胞与来自步骤c)的生理受体树突状细胞组合。
[0525] 2.根据1的方法,其中在步骤d)之后,进行将步骤b)所述的凋亡供体树突状细胞与步骤c)所述的生理受体树突状细胞共孵育的步骤。
[0526] 3.根据2的方法,其中所述共孵育步骤进行至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
[0527] 4.根据1的方法,其中将所述凋亡供体树突状细胞与来自所述受体的所述生理树突状细胞组合的步骤d)在所述受体内进行。
[0528] 5.根据1的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞衍生自所述供体的体外血液样品。
[0529] 6.根据1的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞已通过来自所述供体的PBMC的板传递获得。
[0530] 7.根据1的方法,其中步骤b)所述的凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA、和/或5‑氨基乙酰丙酸和光。
[0531] 8.根据7的方法,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
[0532] 9.根据8的方法,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
[0533] 10.根据1的方法,其中步骤c)所述的生理树突状细胞已通过来自所述受体的PBMC的板传递获得。
[0534] 11.根据1、2、3、4、5、6、7、8、9或10的方法,其中所述供体和/或受体是哺乳动物,优选人。
[0535] 12.选择性产生耐受性树突状细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
[0536] a)提供来自受体的互补单倍体供体的树突状细胞;
[0537] b)将步骤a)所述的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0538] c)提供来自所述受体单倍体供体的生理树突状细胞;和
[0539] d)将步骤b)所述的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与步骤c)所述的生理单倍体供体树突状细胞组合。
[0540] 13.根据12的方法,其中在步骤d)之后,进行将步骤b)所述的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与步骤c)所述的生理单倍体供体树突状细胞共孵育的步骤。
[0541] 14.根据13的方法,其中所述共孵育步骤进行至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
[0542] 15.根据12的方法,其中将步骤b)所述的凋亡互补单倍体供体树突状细胞与步骤c)所述的生理单倍体供体树突状细胞组合的步骤d)在所述单倍体供体内进行。
[0543] 16.根据12的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞衍生自所述受体的互补单倍体供体的体外血液样品。
[0544] 17.根据12的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞已通过来自所述受体的互补单倍体供体的PBMC的板传递获得。
[0545] 18.根据12的方法,其中步骤b)所述的凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或5‑氨基乙酰丙酸和光。
[0546] 19.根据18的方法,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
[0547] 20.根据19的方法,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
[0548] 21.根据12的方法,其中步骤c)所述的生理树突状细胞已通过来自所述受体的互补单倍体供体的PBMC的板传递获得。
[0549] 22.根据12、13、14、15、16、17、18、19、20或21中任一项的方法,其中所述互补单倍体供体、所述单倍体供体和/或所述受体是哺乳动物,优选人。
[0550] 23.选择性产生耐受性树突状细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
[0551] a)提供来自受体的树突状细胞;
[0552] b)将步骤a)所述的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0553] c)提供来自所述受体的生理树突状细胞;和
[0554] d)将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞组合。
[0555] 24.根据23的方法,其中在步骤d)之后,进行将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞共孵育的步骤。
[0556] 25.根据24的方法,其中所述共孵育步骤进行至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
[0557] 26.根据23的方法,其中将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞组合的步骤c)在所述受体内进行。
[0558] 27.根据23的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞衍生自所述受体的体外血液样品。
[0559] 28.根据23的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞已通过来自所述受体的PBMC的板传递获得。
[0560] 29.根据23的方法,其中步骤b)所述的凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或5‑氨基乙酰丙酸和光。
[0561] 30.根据29的方法,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
[0562] 31.根据30的方法,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
[0563] 32.根据23的方法,其中步骤c)所述的生理树突状细胞已通过来自所述受体的PBMC的板传递获得。
[0564] 33.根据23至32中任一项的方法,其中所述供体和受体是哺乳动物,优选人。
[0565] 34.根据1至33中任一项的方法,其中所述移植物是器官或干细胞移植物。
[0566] 35.通过根据1至11中任一项的方法获得的耐受性树突状细胞。
[0567] 36.通过根据12至22中任一项的方法获得的耐受性树突状细胞。
[0568] 37.通过根据23至34中任一项的方法获得的耐受性树突状细胞。
[0569] 38.根据35至37的耐受性树突状细胞,其用于预防或减少移植物抗宿主病的方法中。
[0570] 39.选择性产生耐受性树突状细胞的方法,所述方法包括以下步骤:
[0571] a)提供从受试者获得的树突状细胞的第一样品;
[0572] b)将步骤a)所述的树突状细胞暴露于凋亡剂;
[0573] c)提供从所述受试者获得的生理树突状细胞的第二样品;和
[0574] d)将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞组合。
[0575] 40.根据39的方法,其中在步骤d)之后,进行将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞共孵育的步骤。
[0576] 41.根据40的方法,其中所述共孵育步骤进行至少0.5小时、1小时、2小时、3小时、4小时、5小时或6小时。
[0577] 42.根据39的方法,其中将步骤b)所述的凋亡树突状细胞与步骤c)所述的生理树突状细胞组合的步骤c)在所述受试者体内进行。
[0578] 43.根据39至42中任一项的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞衍生自所述受试者的体外血液样品。
[0579] 44.根据43的方法,其中步骤a)所述的树突状细胞已通过来自所述受试者的PBMC的板传递获得。
[0580] 45.根据39至44中任一项的方法,其中所述方法还包括将所述树突状细胞与抗原分子一起孵育的步骤a1)。
[0581] 46.根据45的方法,其中所述抗原分子是自身抗原。
[0582] 47.根据45或46的方法,其中所述抗原分子衍生自天然来源、化学合成或重组产生。
[0583] 48.根据45或46的方法,其中所述抗原分子衍生自细胞。
[0584] 49.根据46的方法,其中所述自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮钙粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、水通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。
[0585] 50.根据39至49中任一项的方法,其中步骤b)所述的凋亡剂包含补骨脂素和UVA、磷酸核黄素和UVA和/或5‑氨基乙酰丙酸和光。
[0586] 51.根据50的方法,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
[0587] 52.根据50的方法,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
[0588] 53.根据39至52中任一项的方法,其中步骤c)所述的生理树突状细胞已通过来自所述受试者的PBMC的板传递获得。
[0589] 54.根据39至53中任一项的方法,其中所述受试者是哺乳动物,优选人。
[0590] 55.通过根据39至54中任一项的方法获得的耐受性树突状细胞。
[0591] 56.根据55的耐受性树突状细胞,其用于治疗自身免疫性疾病。
[0592] 57.根据56使用的耐受性树突状细胞,其中所述自身免疫性疾病选自下组:多发性硬化症、类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症、寻常型天疱疮、牛皮癣、重症肌无力、甲状腺炎、硬皮病、Sjogren综合征、血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、自身免疫性溶血性贫血、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、Addison病、腹泻性乳糜泻、慢性疲劳综合征、结肠炎、Crohn病、纤维肌痛、甲状腺功能亢进症、Graves病、甲状腺功能减退症、Hashimoto病、子宫内膜异位症、恶性贫血、Goodpasture综合征、Wegener病和风湿热。
[0593] 58.在有此需要的受试者中治疗自身免疫性疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的55的耐受性树突状细胞。
[0594] 59.治疗有此需要的受试者的自身免疫性疾病的方法,所述方法包括向所述受试者施用有效量的耐受性树突状细胞,其中所述耐受性树突状细胞包含生理树突状细胞,所
述生理树突状细胞包含来自所述受试者、自身抗原、其片段或其组合的凋亡树突状细胞的
材料。
[0595] 60.58或59的方法,其中所述自身免疫性疾病选自下组:多发性硬化症、类风湿性关节炎、幼年类风湿性关节炎、系统性红斑狼疮、肌萎缩侧索硬化症、寻常型天疱疮、牛皮癣、重症肌无力、甲状腺炎、硬皮病、Sjogren综合征、血小板减少性紫癜、冷球蛋白血症、自身免疫性溶血性贫血、胰岛素依赖型糖尿病(IDDM)、Addison病、腹泻性乳糜泻、慢性疲劳综合征、结肠炎、Crohn病、纤维肌痛、甲状腺功能亢进症、Graves病、甲状腺功能减退症、Hashimoto病、子宫内膜异位症、恶性贫血、Goodpasture综合征、Wegener病和风湿热。
[0596] 61.59或60的方法,其中所述自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮钙粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、水通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。
[0597] 62.离体耐受性树突状细胞,其包含来自从受试者获得的凋亡树突状细胞的材料。
[0598] 63.62的离体耐受性树突状细胞,其进一步包含自身抗原或其片段。
[0599] 64.组合物,其包含:
[0600] (a)从受试者获得的树突状细胞样品;
[0601] (b)凋亡剂;和
[0602] (c)自身抗原或其片段。
[0603] 65.64的组合物,其中所述凋亡剂包含补骨脂素、磷酸核黄素或5‑氨基乙酰丙酸。
[0604] 66.65的组合物,其中所述补骨脂素选自8‑MOP和amotosalen。
[0605] 67.66的组合物,其中所述补骨脂素是8‑MOP。
[0606] 68.62或63的离体耐受性树突状细胞,或64‑67中任一项的组合物,其中所述自身抗原选自下组:Rh血型抗原、血小板整合素GpIIb:IIIa、基底膜IV型胶原的非胶原结构域、表皮钙粘蛋白、链球菌细胞壁抗原、类风湿因子IgG复合物(含或不含丙型肝炎抗原)、胰腺β细胞抗原、髓鞘碱性蛋白、蛋白脂质蛋白、髓鞘少突胶质细胞糖蛋白、桥粒芯糖蛋白3、谷氨酸脱羧酶、乙酰胆碱受体、羧肽酶H、嗜铬粒蛋白A、谷氨酸脱羧酶、imogen‑38、胰岛素、胰岛素瘤抗原‑2和2β、胰岛特异性葡萄糖‑6‑磷酸酶催化亚基相关蛋白(IGRP)、胰岛素原、α‑烯醇酶、水通道蛋白‑4、β‑抑制蛋白、S100‑β、瓜氨酸化蛋白、胶原蛋白II、热休克蛋白、人软骨糖蛋白39、La抗原、核小体组蛋白和核糖核蛋白(snRNP)、磷脂‑β‑2糖蛋白I复合物、聚(ADP‑核糖)聚合酶、U‑1小核糖核蛋白复合物Sm抗原、胰岛细胞抗原、细胞质接头蛋白‑170(CLIP‑
170)、Sjogren综合征抗原A(SS‑A/Ro)、Sjogren综合征抗原B(SS‑B/La)、Sjogren狼疮抗原(SL)和硬皮病抗原70(Scl‑70))。