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凝胶分子印迹反结构光子晶体微球及其制备方法和应用

申请号 CN202310626104.2 申请日 2023-05-30 公开(公告)号 CN116808962A 公开(公告)日 2023-09-29
申请人 南京师范大学; 江西新瑞丰生化股份有限公司; 发明人 黄和; 李想; 杨巧依; 王月桐; 施天穹; 叶超; 聂志奎; 赵丹杉;
摘要 本 发明 涉及 生物 材料 技术,公开了一种 水 凝胶分子印迹反结构 光子 晶体微球及其制备方法和应用。该反结构光子晶体微球的制备方法包括以下步骤:通过微流控方法制备正结构光子晶体微球;将赤霉素作为印迹分子与含有水凝胶和光引发剂的混合溶液进行混合形成预凝胶混合物,将所述正结构光子晶体微球浸泡于所述预凝胶混合物中得到预凝胶体系;在紫外辐照下将所述预凝胶体系进行 固化 I后,经剥离得到固化微球;将所述固化微球与蚀刻剂混合进行反应、清洗。该光子晶体微球能够特异高效地识别 吸附 赤霉素,通过反射峰的偏移值完成定量测定,对赤霉素的检测灵敏度高、检测条件要求低。
权利要求

1.一种凝胶分子印迹反结构光子晶体微球的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)通过微流控方法制备正结构光子晶体微球;
(2)将赤霉素作为印迹分子与含有水凝胶和光引发剂的混合溶液进行混合形成预凝胶混合物,将所述正结构光子晶体微球浸泡于所述预凝胶混合物中得到预凝胶体系;
(3)在紫外辐照下将所述预凝胶体系进行固化I后,经剥离得到固化微球;
(4)将所述固化微球与蚀刻剂混合进行反应、清洗。
2.根据权利要求1所述的制备方法,其特征在于,步骤(1)中所述正结构光子晶体微球的制备过程包括:将含有纳米粒子的水分散液作为内相、硅油作为外相形成微流体液滴,将所述微流体液滴经固化II形成初步微球,将所述初步微球进行煅烧
优选地,所述微流体液滴采用微流控装置形成,所述微流体装置中内相的流速为0.4‑
0.6mL/h,外相的流速为4‑6mL/h。
3.根据权利要求2所述的制备方法,其特征在于,所述二氧化硅纳米粒子的平均粒径大于150nm且小于290nm;
优选地,所述水分散液采用的溶剂为超纯水,所述水分散液中二氧化硅纳米粒子的浓度为5‑20mg/mL。
4.根据权利要求3所述的制备方法,其特征在于,所述固化II的过程包括:将所述微流体液滴分散在硅油中进行加热除去水分子;
优选地,所述加热的温度为55‑80℃;
优选地,所述煅烧的过程包括:将所述初步微球经正己烷洗涤、干燥后,在温度为600‑
800℃的条件下煅烧8‑12h。
5.根据权利要求1至4中任意一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述正结构光子晶体微球、所述赤霉素与所述混合溶液的重量比为0.1‑0.2:0.01‑0.05:1;
优选地,所述混合溶液的溶剂为水;所述水凝胶选自甲基丙烯酸化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和透明质酸甲基丙烯酸酯中的至少一种;所述光引发剂为2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基丙
优选地,相对于1mL水,所述水凝胶的用量为50‑500mg,所述光引发剂的用量为10‑15μL。
6.根据权利要求1至4中任意一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(2)中所述浸泡的条件至少包括:时间为5‑10h;
优选地,步骤(3)中所述固化I的条件至少包括:UV波长为380‑405nm,照射强度为20‑
2
50mW/cm,时间为1‑2min。
7.根据权利要求1至4中任意一项所述的制备方法,其特征在于,步骤(4)中所述蚀刻剂采用浓度为3‑6重量%的氢氟酸溶液;
优选地,所述正结构光子晶体微球与所述蚀刻剂的重量比为1:20‑100;
优选地,所述反应的条件至少包括:温度为20‑30℃,时间为5‑8h;
优选地,所述清洗的清洗液采用PBS缓冲液。
8.根据权利要求1至7中任意一项所述的制备方法制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球。
9.权利要求8所述的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球在检测赤霉素中的应用。
10.一种检测赤霉素的方法,其特征在于,该方法包括以下步骤:
S1、将不同浓度的赤霉素标准溶液分别与权利要求8所述的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球混合进行吸附,检测所述光子晶体微球在吸附前后的反射峰位移量;
S2、以所述反射峰位移量为纵坐标,赤霉素标准溶液的浓度为横坐标,建立反射峰位移曲线的方程;
S3、将待测溶液与所述光子晶体微球混合进行吸附,检测所述光子晶体微球在吸附前后的反射峰位移量,然后根据所述方程计算待测溶液中赤霉素的含量;
优选地,所述吸附的条件包括:温度为0‑40℃,时间为25‑35min;
优选地,所述方程为y=64.71‑6.20*x,其中,y为反射峰位移量,x为赤霉素标准溶液的浓度。

说明书全文

凝胶分子印迹反结构光子晶体微球及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物材料技术,具体地,涉及一种水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球及其制备方法和应用以及检测赤霉素的方法。

背景技术

[0002] 赤霉素(GA)是一种四环、二萜植物激素,通过复杂的途径生物合成,广泛分布在被子植物、裸子植物、细菌及多种真菌中。赤霉素的种类丰富,不同的赤霉素生物活性不同,其中赤霉素A3(GA3)的活性最高。赤霉素是最重要的植物生长调节剂之一,对植物的许多发育过程都至关重要,包括种子萌发、茎伸长、叶扩张、毛状体发育、花粉成熟和诱导开花。赤霉素多应用于农业生产,将赤霉素调节到一定浓度可以提高农作物的产量和品质。但是,如果在培育农作物时过量使用赤霉素,可能导致农作物的赤霉素含量残留超标,易在人体中富集积累,引起慢性中毒,危害人体健康,如导致人体内分泌系统紊乱,引起慢性器官中毒甚至癌症等。因此,针对植物生长环境和食品中赤霉素含量进行检测和控制,对农作物相关的食品安全具有重要的意义。
[0003] 传统的赤霉素检测方法主要有高效液相色谱法、免疫分析法、电化学法等,以上方法虽灵敏度较高,但存在反应条件苛刻、检测效率低、检测设备昂贵、操作过程繁琐等问题,需要寻找一种快速、高效且结果准确的高通量赤霉素检测平台和方法。

发明内容

[0004] 本发明的目的是为了克服现有技术存在的问题,提供一种水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球及其制备方法和应用,以及一种检测赤霉素的方法。
[0005] 本发明的发明人在研究过程中,利用分子印迹技术与光子晶体,意外地获得一种新型的赤霉素检测平台,构建出可特异性结合捕获赤霉素分子并进行赤霉素含量测定的分子印迹光子晶体,该光子晶体微球能够特异高效地识别赤霉素,通过反射峰的偏移值完成定量测定,对赤霉素的检测灵敏度高、检测条件要求低。
[0006] 为了实现上述目的,本发明第一方面提供一种水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球的制备方法,包括以下步骤:
[0007] (1)通过微流控方法制备正结构光子晶体微球;
[0008] (2)将赤霉素作为印迹分子与含有水凝胶和光引发剂的混合溶液进行混合形成预凝胶混合物,将所述正结构光子晶体微球浸泡于所述预凝胶混合物中得到预凝胶体系;
[0009] (3)在紫外辐照下将所述预凝胶体系进行固化I后,经剥离得到固化微球;
[0010] (4)将所述固化微球与蚀刻剂混合进行反应、清洗。
[0011] 优选地,步骤(1)中所述正结构光子晶体微球的制备过程包括:将含有纳米粒子的水分散液作为内相、硅油作为外相形成微流体液滴,将所述微流体液滴经固化II形成初步微球,将所述初步微球进行煅烧
[0012] 优选地,所述微流体液滴采用微流控装置形成,所述微流体装置中内相的流速为0.4‑0.6mL/h,外相的流速为4‑6mL/h。
[0013] 优选地,所述二氧化硅纳米粒子的平均粒径大于150nm且小于290nm。
[0014] 优选地,所述水分散液采用的溶剂为超纯水,所述水分散液中二氧化硅纳米粒子的浓度为5‑20mg/mL。
[0015] 优选地,所述固化II的过程包括:将所述微流体液滴分散在硅油中进行加热除去水分子。
[0016] 优选地,所述加热的温度为55‑80℃。
[0017] 优选地,所述煅烧的过程包括:将所述初步微球经正己烷洗涤、干燥后,在温度为600‑800℃的条件下煅烧8‑12h。
[0018] 优选地,步骤(2)中所述正结构光子晶体微球、所述赤霉素与所述混合溶液的重量比为0.1‑0.2:0.01‑0.05:1。
[0019] 优选地,所述混合溶液的溶剂为水;所述水凝胶选自甲基丙烯酸化明胶、聚乙二醇二丙烯酸酯、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯和透明质酸甲基丙烯酸酯中的至少一种;所述光引发剂为2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基丙
[0020] 优选地,相对于1mL水,所述水凝胶的用量为50‑500mg,所述光引发剂的用量为10‑15μL。
[0021] 优选地,步骤(2)中所述浸泡的条件至少包括:时间为5‑10h。
[0022] 优选地,步骤(3)中所述固化I的条件至少包括:UV波长为380‑405nm,照射强度为2
20‑50mW/cm,时间为1‑2min。
[0023] 优选地,步骤(4)中所述蚀刻剂采用浓度为3‑6重量%的氢氟酸溶液。
[0024] 优选地,所述正结构光子晶体微球与所述蚀刻剂的重量比为1:20‑100。
[0025] 优选地,所述反应的条件至少包括:温度为20‑30℃,时间为5‑8h。
[0026] 优选地,所述清洗的清洗液采用PBS缓冲液。
[0027] 本发明第二方面提供上述的制备方法制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球。
[0028] 本发明第三方面提供上述的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球在检测赤霉素中的应用。
[0029] 本发明第四方面提供一种检测赤霉素的方法,该方法包括以下步骤:
[0030] S1、将不同浓度的赤霉素标准溶液分别与上述的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球混合进行吸附,检测所述光子晶体微球在吸附前后的反射峰位移量;
[0031] S2、以所述反射峰位移量为纵坐标,赤霉素标准溶液的浓度为横坐标,建立反射峰位移曲线的方程;
[0032] S3、将待测溶液与所述光子晶体微球混合进行吸附,检测所述光子晶体微球在吸附前后的反射峰位移量,然后根据所述方程计算待测溶液中赤霉素的含量。
[0033] 优选地,所述吸附的条件包括:温度为0‑40℃,时间为25‑35min。
[0034] 优选地,所述方程为y=64.71‑6.20*x,其中,y为反射峰位移量,x为赤霉素标准溶液的浓度。
[0035] 通过上述技术方案,本发明的有益效果为:
[0036] 本发明提供的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球基于分子印迹特异性识别的特点,与赤霉素分子精准结合后导致光子晶体微球折射率发生波动,使特征反射峰发生相应的变化,实现赤霉素浓度的检测,提高了赤霉素检测的灵敏度和选择性;本发明提供的制备方法获得的光子晶体微球,将带有印迹分子空穴的水凝胶和光子晶体相结合作为检测赤霉素的载体,相对于其他形式的载体,具有度依赖性小、比表面积大以及物质交换迅速等优点,能够实现对赤霉素的快速实时、专一、无标检测。
[0037] 本发明提供的检测赤霉素的方法,相较于传统的赤霉素检测方法,无需昂贵仪器,制备方法简单易行,反应条件要求低,提高了检测的灵敏度和选择性,是一种新型的快速高效且结果准确的高通量赤霉素检测平台,适于推广与应用。附图说明
[0038] 图1是本发明提供的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球的制备方法流程示意图;
[0039] 图2是实施例1中正结构光子晶体微球和反结构光子晶体微球的电镜图,其中,a为正结构光子晶体微球,b为反结构光子晶体微球;
[0040] 图3是实施例1中正结构光子晶体微球以及反结构光子晶体微球吸附赤霉素分子前后的光镜图,其中,a为正结构光子晶体微球,b为吸附前的反结构光子晶体微球,c为吸附赤霉素分子后的反结构光子晶体微球;
[0041] 图4是实施例1得到的反结构光子晶体微球检测赤霉素浓度的标准曲线图。

具体实施方式

[0042] 在本文中所披露的范围的端点和任何值都不限于该精确的范围或值,这些范围或值应当理解为包含接近这些范围或值的值。对于数值范围来说,各个范围的端点值之间、各个范围的端点值和单独的点值之间,以及单独的点值之间可以彼此组合而得到一个或多个新的数值范围,这些数值范围应被视为在本文中具体公开。
[0043] 本发明第一方面提供一种水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球的制备方法,包括以下步骤:
[0044] (1)通过微流控方法制备正结构光子晶体微球;
[0045] (2)将赤霉素作为印迹分子与含有水凝胶和光引发剂的混合溶液进行混合形成预凝胶混合物,将所述正结构光子晶体微球浸泡于所述预凝胶混合物中得到预凝胶体系;
[0046] (3)在紫外辐照下将所述预凝胶体系进行固化I后,经剥离得到固化微球;
[0047] (4)将所述固化微球与蚀刻剂混合进行反应、清洗。
[0048] 本发明提供的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球,基于分子印迹特异性识别的特点,与赤霉素分子精准结合后导致光子晶体微球折射率发生波动,使特征反射峰发生相应的变化,实现赤霉素浓度的检测,提高了赤霉素检测的灵敏度和选择性;本发明提供的制备方法获得的光子晶体微球,将带有印迹分子空穴的水凝胶和光子晶体相结合作为检测赤霉素的载体,相对于其他形式的载体,具有角度依赖性小、比表面积大以及物质交换迅速等优点,能够实现对赤霉素的快速实时、专一、无标检测。
[0049] 根据本发明,正结构光子晶体微球采用微流控方法制备,利用微流体乳液液滴中的受限组装获得。优选地,步骤(1)中所述正结构光子晶体微球的制备过程包括:将含有二氧化硅纳米粒子的水分散液作为内相、硅油作为外相形成微流体液滴,将所述微流体液滴经固化II形成初步微球,将所述初步微球进行煅烧。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于提高正结构光子晶体微球的结构稳定性
[0050] 本发明中,二氧化硅纳米粒子可以商购获得,也可以自行制备。示例性地,采用Stober法制备二氧化硅纳米粒子,Stober方法是一种物理化学方法,具体是指通过将硅酸乙酯(TEOS)加入乙醇水中生成纳米二氧化硅颗粒的方法。
[0051] 根据本发明,优选地,所述微流体液滴采用微流控装置形成,所述微流体装置中内相的流速为0.4‑0.6mL/h,外相的流速为4‑6mL/h。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于提高正结构光子晶体微球的制备效率,并进一步提高正结构光子晶体微球的结构稳定性。
[0052] 根据本发明,优选地,所述二氧化硅纳米粒子的平均粒径为大于150nm且小于290nm,更优选为180‑250nm。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于提高液滴对二氧化硅纳米粒子的包裹效果,促进正结构光子晶体微球的形成。
[0053] 根据本发明,优选地,所述水分散液采用的溶剂为超纯水,所述水分散液中二氧化硅纳米粒子的浓度为5‑20mg/mL。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于促进正结构光子晶体微球的形成。
[0054] 根据本发明,优选地,所述固化II的过程包括:将所述微流体液滴分散在硅油中进行加热除去水分子。进一步优选地,所述加热的温度为55‑80℃。发明人发现,在该优选的实施方式下,能够使得二氧化硅纳米粒子在液滴中的水蒸发过程中自组装成有序晶格。
[0055] 根据本发明,优选地,所述煅烧的过程包括:将所述初步微球经正己烷洗涤、干燥后,在温度为600‑800℃的条件下煅烧8‑12h。发明人发现,在该优选的实施方式下,能够得到紧密排列的正结构光子晶体微球,提高正结构光子晶体微球的机械强度。
[0056] 根据本发明,优选地,步骤(2)中所述正结构光子晶体微球、所述赤霉素与所述混合溶液的重量比为0.1‑0.2:0.01‑0.05:1。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于赤霉素印迹分子接枝到正结构光子晶体微球上。
[0057] 根据本发明,优选地,所述混合溶液的溶剂为水;所述水凝胶选自甲基丙烯酸化明胶(GelMA)、聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(ETPTA)和透明质酸甲基丙烯酸酯(HAMA)中的至少一种;所述光引发剂为2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基丙酮(HMPP)。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于促进赤霉素接枝正结构光子晶体微球复合结构在预凝胶混合物中溶胀,使得二氧化硅纳米粒子之间的空隙空间完全填充。
[0058] 根据本发明,优选地,相对于1mL水,所述水凝胶的用量为50‑500mg,所述光引发剂的用量为10‑15μL。示例性地,相对于1mL水,水凝胶为GelMA时,其用量为200‑500mg,水凝胶为PEGDA时,其用量为50‑100μL,水凝胶为HAMA时,其用量为100‑200mg。
[0059] 根据本发明,优选地,步骤(2)中所述浸泡的条件至少包括:时间为5‑10h。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于促进赤霉素接枝正结构光子晶体微球复合结构在预凝胶混合物中充分溶胀。
[0060] 根据本发明,优选地,步骤(3)中所述固化I的条件至少包括:UV波长为380‑405nm,2
照射强度为20‑50mW/cm ,时间为1‑2min。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于在赤霉素接枝正结构光子晶体微球复合结构完全填充二氧化硅纳米粒子之间的空隙空间后进行有效聚合,形成稳定的固化微球结构。
[0061] 根据本发明,所述蚀刻剂为能够腐蚀二氧化硅的试剂,例如氢氟酸。优选地,步骤(4)中所述蚀刻剂采用浓度为3‑6重量%的氢氟酸溶液,以利用通过氢氟酸蚀刻去除固化微球的赤霉素,形成赤霉素分子印迹,实现对赤霉素的高特异性识别。
[0062] 根据本发明,优选地,所述正结构光子晶体微球与所述蚀刻剂的重量比为1:20‑100。发明人发现,在该优选的实施方式下,有利于提高水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球的赤霉素灵敏度和选择性。
[0063] 根据本发明,优选地,所述反应的条件至少包括:温度为20‑30℃,时间为5‑8h。
[0064] 根据本发明,优选地,所述清洗的清洗液采用PBS缓冲液,以去除印迹分子,纯化水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球。
[0065] 根据本发明一种特别优选的实施方式,参见图1,水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球的制备方法包括:
[0066] (1)将含有平均粒径大于150nm且小于290nm的二氧化硅纳米粒子的水分散液(浓度为5‑20mg/mL)作为内相、硅油作为外相,采用微流控装置以内相的流速为0.4‑0.6mL/h,外相的流速为4‑6mL/h形成微流体液滴,将所述微流体液滴分散在硅油中进行加热至55‑80℃除去水分子,形成初步微球,将所述初步微球经正己烷洗涤、干燥后,在温度为600‑800℃的条件下煅烧8‑12h,得到正结构光子晶体微球;
[0067] (2)将赤霉素作为印迹分子,与含有水凝胶和光引发剂的混合溶液(相对于1mL水,水凝胶的用量为50‑500mg,光引发剂的用量为10‑15μL)进行混合形成预凝胶混合物,将所述正结构光子晶体微球浸泡于所述预凝胶混合物中5‑10h,得到预凝胶体系,其中,正结构光子晶体微球、赤霉素与混合溶液的重量比为0.1‑0.2:0.01‑0.05:1;
[0068] (3)在UV波长为380‑405nm、照射强度为20‑50mW/cm2的紫外辐照下,将所述预凝胶体系进行固化1‑2min后,经剥离得到固化微球;
[0069] (4)将所述固化微球与浓度为3‑6重量%的氢氟酸溶液(蚀刻剂)混合使得正结构光子晶体微球与蚀刻剂的重量比为1:20‑100,在温度为20‑30℃下进行反应5‑8h,用PBS溶液清洗以去除印迹分子。
[0070] 本发明第二方面提供上述的制备方法制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球。
[0071] 基于本发明提供的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球能够特异性识别赤霉素的特性,实现赤霉素浓度的检测,提高了赤霉素检测的灵敏度和选择性。本发明第三方面提供上述的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球在检测赤霉素中的应用。
[0072] 检测赤霉素的应用方法可以直接将待测溶液与水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球混合,对赤霉素进行定量检测;检测原理为,将不同浓度梯度的赤霉素溶液分别加入到水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球中,由于赤霉素与赤霉素印迹的结合,导致该光子晶体微球折射率发生波动,其结构色和特征反射峰发生相应的变化,通过对该光子晶体微球特征反射峰的测定,即可定量待测溶液中赤霉素的初始浓度。
[0073] 本发明第四方面提供一种检测赤霉素的方法,该方法包括以下步骤:
[0074] S1、将不同浓度的赤霉素标准溶液分别与上述的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球混合进行吸附,检测所述光子晶体微球在吸附前后的反射峰位移量;
[0075] S2、以所述反射峰位移量为纵坐标,赤霉素标准溶液的浓度为横坐标,建立反射峰位移曲线的方程;
[0076] S3、将待测溶液与所述光子晶体微球混合进行吸附,检测所述光子晶体微球在吸附前后的反射峰位移量,然后根据所述方程计算待测溶液中赤霉素的含量。
[0077] 根据本发明,优选地,所述吸附的条件包括:温度为0‑40℃,时间为25‑35min。
[0078] 根据本发明,优选地,所述方程为y=64.71‑6.20*x,其中,y为反射峰位移量,x为赤霉素标准溶液的浓度。
[0079] 以下将通过实施例对本发明进行详细描述。
[0080] 以下实施例中,扫描电子显微镜采购自日本电子株式会社(JEOL)、型号为JSM‑5610LV,颗粒的结构色通过光学显微镜(采购自奥林巴斯株式会社、型号为BX53正置显微镜)获得,微流控装置采购自保定兰格公司、型号为LSP02‑1B,光纤光谱仪采购自上海复享光学股份有限公司、型号为PG2000‑Pro‑EX。GA3标准品购自江西新瑞丰生化股份有限公司、产品编号为GA3原药,二氧化硅胶纳米颗粒的水分散液购自南京彩纳生物科技有限公司、产品编号为MS‑06‑101;在无特殊说明的情况下,其余试剂和原料均为常规的市售品。
[0081] 以下实施例中,在无特殊说明的情况下,室温指的是25±5℃。
[0082] 实施例1
[0083] (1)将平均粒径为250nm、浓度为10mg/mL的单分散二氧化硅纳米粒子的水分散液作为内相,50cs硅油作为油相,将两种流体分别注入共流微流体装置,控制内相流速为0.5mL/h、外相流速为5mL/h下生成液滴,将液滴收集在充满过量500cs硅油的容器中;将液滴容器在70℃下加热,使二氧化硅纳米粒子在液滴中的水蒸发过程中自组装成有序晶格,得到初步微球;用过量正己烷洗涤初步微球,重复3‑5次直至洗净残留硅油后,将初步微球自然干,在800℃下进行高温煅烧10h,得到紧密排列的正结构光子晶体微球;该正结构光子晶体微球经扫描电子显微镜观察其微观结构如图2中a所示,经光学显微镜观察其结构色如图3中a所示;
[0084] (2)将50mg模板分子赤霉素、200mg甲基丙烯酸化明胶(GelMA)溶解在900μL蒸馏水中,再加入10μL 2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基丙酮(HMPP),混合制成预凝胶混合物,将200mg步骤(1)得到的正结构光子晶体微球浸泡在过量的预凝胶混合物中5h得到预凝胶体系;
[0085] (3)将步骤(2)得到的预凝胶体系在波长为405nm、照射强度为25mW/cm2的紫外辐照下聚合2min,使体系完全固化,手动剥离得到其中的固化微球;
[0086] (4)将步骤(3)得到的固化微球与过量4%氢氟酸溶液混合,使得正结构光子晶体微球与蚀刻剂的重量比为1:50,在温度为25℃下进行反应6h,蚀刻去除固化微球中的二氧化硅粒子,再用过量PBS缓冲液冲洗去除印迹赤霉素分子,得到水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球,经扫描电子显微镜观察其微观结构如图2中b所示,经光学显微镜观察其结构色如图3中b所示,由于凝胶材料的折射率发生变化,反结构光子晶体微球的结构色和反射峰位置发生蓝移。
[0087] 实施例2
[0088] (1)将平均粒径为200nm、浓度为5mg/mL的单分散二氧化硅纳米粒子的水分散液作为内相,50cs硅油作为油相,将两种流体分别注入共流微流体装置,控制内相流速为0.4mL/h、外相流速为4mL/h下生成液滴,将液滴收集在充满过量500cs硅油的容器中;将液滴容器在55℃下加热,使二氧化硅纳米粒子在液滴中的水蒸发过程中自组装成有序晶格,得到初步微球;用过量正己烷洗涤初步微球,重复3‑5次直至洗净残留硅油后,将初步微球自然风干,在600℃下进行高温煅烧12h,得到紧密排列的正结构光子晶体微球;
[0089] (2)将40mg模板分子赤霉素、100μL聚乙二醇二丙烯酸酯(PEGDA)、10mg乙氧基化三羟甲基丙烷三丙烯酸酯(ETPTA)溶解在900μL蒸馏水中,再加入15μL 2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基丙酮(HMPP),混合制成预凝胶混合物,将150mg步骤(1)得到的正结构光子晶体微球浸泡在过量的预凝胶混合物中8h得到预凝胶体系;
[0090] (3)将步骤(2)得到的预凝胶体系在波长为380nm、照射强度为50mW/cm2的紫外辐照下聚合1min,使体系完全固化,手动剥离得到其中的固化微球;
[0091] (4)将步骤(3)得到的固化微球与过量的浓度为3重量%的氢氟酸溶液混合,使得正结构光子晶体微球与蚀刻剂的重量比为1:100,在温度为20℃下进行反应8h,蚀刻去除固化微球中的二氧化硅粒子,再用过量PBS缓冲液冲洗去除印迹赤霉素分子,得到水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球。
[0092] 实施例3
[0093] (1)将平均粒径为180nm、浓度为20mg/mL的单分散二氧化硅纳米粒子的水分散液作为内相,50cs硅油作为油相,将两种流体分别注入共流微流体装置,控制内相流速为0.6mL/h、外相流速为6mL/h下生成液滴,将液滴收集在充满过量500cs硅油的容器中;将液滴容器在80℃下加热,使二氧化硅纳米粒子在液滴中的水蒸发过程中自组装成有序晶格,得到初步微球;用过量正己烷洗涤初步微球,重复3‑5次直至洗净残留硅油后,将初步微球自然风干,在800℃下进行高温煅烧8h,得到紧密排列的正结构光子晶体微球;
[0094] (2)将15mg模板分子赤霉素、150mg透明质酸甲基丙烯酸酯(HAMA)溶解在900μL蒸馏水中,再加入10μL 2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基丙酮(HMPP),混合制成预凝胶混合物,将110mg步骤(1)得到的正结构光子晶体微球浸泡在过量的预凝胶混合物中10h得到预凝胶体系;
[0095] (3)将步骤(2)得到的预凝胶体系在波长为400nm、照射强度为20mW/cm2的紫外辐照下聚合1.5min,使体系完全固化,手动剥离得到其中的固化微球;
[0096] (4)将步骤(3)得到的固化微球与过量的浓度为6重量%的氢氟酸溶液混合,使得正结构光子晶体微球与蚀刻剂的重量比为1:20,在温度为30℃下进行反应5h,蚀刻去除固化微球中的二氧化硅粒子,再用过量PBS缓冲液冲洗去除印迹赤霉素分子,得到水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球。
[0097] 实施例4
[0098] 按照实施例3的方法制备水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球,不同的是,将步骤(3)替换为:
[0099] (3)将步骤(2)得到的预凝胶体系在波长为300nm、照射强度为20mW/cm2的紫外辐照下聚合2min,使体系完全固化,手动剥离得到其中的固化微球。
[0100] 实施例5
[0101] 按照实施例3的方法制备水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球,不同的是,将步骤(2)替换为:
[0102] (2)将80mg模板分子赤霉素、150mg透明质酸甲基丙烯酸酯(HAMA)溶解在900μL蒸馏水中,再加入10μL 2‑羟基‑2‑甲基‑1‑苯基丙酮(HMPP),混合制成预凝胶混合物,将240mg步骤(1)得到的正结构光子晶体微球浸泡在过量的预凝胶混合物中10h得到预凝胶体系。
[0103] 测试例1
[0104] S1、标准工作液的配制:称取赤霉素标准品(购自深圳市安提生物科技有限公司公司,产品编号为AT01GAAg)0.35mg于100mL容量瓶中,用PBS溶解,定容到刻度线,并且超声10min,得到标准溶液;吸取上述10mL标准溶液至100mL容量瓶中,用PBS稀释至刻度得到混‑5 ‑6 ‑7 ‑8 ‑9
合中间液,以得到浓度梯度为10 、10 、10 、10 、10 mol/L的赤霉素标准工作液;
[0105] S2、采用光纤光谱仪测定实施例1制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球的反射光谱,记录吸附前的反射峰位置为605nm,再将100mg实施例1制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球分别加入到2mL步骤S1得到的不同浓度梯度的赤霉素标准工作液中,在室温下吸附30min使其吸附饱和,取出吸附赤霉素后的反结构光子晶体微球(经光学显微镜观察其结构色如图3中c所示,与吸附前相比,微球的结构色和反射峰位置发生红移),采用光纤光谱仪测定吸附赤霉素后的反结构光子晶体微球的反射光谱,记录反应后的反射峰位置;将检测得到的反射峰偏移值(反应前后特征峰位置的差值)与赤霉素溶液浓度的关系绘制成标准曲线,如图4所示,得到标准曲线的公式为y=64.71‑6.20*x,其中,y为反射峰偏移值,x为赤霉素标准溶液的浓度的负对数值;
[0106] S3、将100mg实施例1制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球加入到2mL待测‑4溶液I(采用浓度为5.0×10 mol/L的赤霉素标准工作液作为待测溶液I)中,充分混合,在室温下吸附30min使其吸附饱和,取出吸附赤霉素后的反结构光子晶体微球;采用光纤光谱仪测定吸附后反结构光子晶体微球的反射光谱,记录反射峰位置为649nm,计算出待测溶液的反射峰偏移值,将反射峰偏移值代入步骤S2得到的标准曲线中,最终计算得到待测溶液中‑4
赤霉素的含量为4.57×10 M。
[0107] 实施例1得到的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球对赤霉素的检测限为3.63×‑1110 M。
[0108] 对比例1
[0109] 按照测试例1中的步骤S1配制赤霉素标准工作液,利用HPLC‑MS‑MS检测赤霉素标准品的特征峰面积,绘制特征峰面积与赤霉素浓度的标准曲线;将待测溶液I经HPLC‑MS‑MS检测得到赤霉素的特征峰面积,带入标准曲线中得到待测溶液中赤霉素的含量为6.52×‑410 M。
[0110] 与对比例1相比,实施例1提供的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球具有较好的检测特异性、灵敏度及准确性。
[0111] 对比例2
[0112] 按照实施例3的方法制备水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球,不同的是,二氧化硅纳米粒子的平均粒径为150nm。
[0113] 对比例2制得的反结构光子晶体微球的反射峰理论值小于390nm,到达可见光测量临界值,无法准确测量其反射峰位置,进而无法应用于赤霉素的检测中。
[0114] 对比例3
[0115] 按照实施例3的方法制备水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球,不同的是,将步骤(4)中浓度为6重量%的氢氟酸溶液替换为浓度为6重量%的稀硫酸溶液。
[0116] 对比例3中采用的稀硫酸溶液不能将步骤(3)得到的固化微球上二氧化硅腐蚀掉,进而无法得到反结构的光子晶体微球,无法实现对赤霉素的特异性识别和吸附。
[0117] 测试例2
[0118] (1)按照测试例1中的步骤S1配制赤霉素标准工作液;
[0119] (2)采用光纤光谱仪分别测定实施例2‑实施例5以及对比例2‑对比例3制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球的反射光谱,记录吸附前的反射峰位置,再分别将100mg实施例2‑实施例5以及对比例2‑对比例3制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球分别加入到2mL步骤S1得到的不同浓度梯度的赤霉素标准工作液中,在室温下吸附30min使其吸附饱和,取出吸附赤霉素后的反结构光子晶体微球;采用光纤光谱仪测定吸附赤霉素后的反结构光子晶体微球的反射光谱,记录反应后的反射峰位置;将检测得到的反射峰偏移值(反应前后特征峰位置的差值)与赤霉素溶液浓度的关系绘制成标准曲线,得到标准曲线的公式如表1所示,其中,y为反射峰偏移值,x为赤霉素标准溶液的浓度的负对数值;
[0120] (3)分别将100mg实施例2‑实施例5以及对比例2‑对比例3制得的水凝胶分子印迹‑4反结构光子晶体微球加入到2mL待测溶液I(采用浓度为5.0×10 mol/L的赤霉素标准工作液作为待测溶液I)中,充分混合,在室温下吸附30min使其吸附饱和,取出吸附赤霉素后的反结构光子晶体微球;采用光纤光谱仪测定吸附后反结构光子晶体微球的反射光谱,记录反射峰位置(结果见表1),计算出待测溶液的反射峰偏移值,将反射峰偏移值代入步骤S2得到的标准曲线中,最终计算得到待测溶液I中赤霉素的含量,结果见表1。
[0121] 实施例2‑实施例5以及对比例2‑对比例3制得的水凝胶分子印迹反结构光子晶体微球对赤霉素的检测限,见表1。
[0122] 表1
[0123]
[0124] 以上详细描述了本发明的优选实施方式,但是,本发明并不限于此。在本发明的技术构思范围内,可以对本发明的技术方案进行多种简单变型,包括各个技术特征以任何其它的合适方式进行组合,这些简单变型和组合同样应当视为本发明所公开的内容,均属于本发明的保护范围。