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一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白-槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法
申请号	CN202311364985.1	申请日	2023-10-20	公开(公告)号	CN117426378A	公开(公告)日	2024-01-23
申请人	东北农业大学;			发明人	王辉; 殷凌宇; 孔保华; 刘骞; 陈倩; 孙方达;
摘要	本发明提供了一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法，采用碱接枝法制备了玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合物；然后将牛至精油溶解在玉米醇溶蛋白‑槲皮素的乙醇水溶液中，充分搅拌，将溶液离心去除不溶物，逐滴滴加到去离子水中，得到了负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒。本发明制备的负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒与负载牛至精油的单一玉米醇溶蛋白纳米颗粒相比，粒径分布更均匀，具有更高的包封和负载效率，更好的环境稳定性，更强的抗氧化性和抑菌性。
权利要求	1.一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：包括以下步骤： (1)称取1g玉米醇溶蛋白和0.2g槲皮素分别溶解于乙醇水溶液中，充分搅拌使其完全溶解。 (2)使用NaOH溶液将玉米醇溶蛋白溶液和槲皮素溶液的pH值调至9.0。 (3)将pH 9.0的玉米醇溶蛋白溶液和槲皮素溶液混合，在室温下，敞口搅拌24h，使其充分反应。 (4)反应结束后，将反应液倒入透析袋内，放置于4℃透析，每6h更换一次透析液，去除游离槲皮素。 (5)将不同质量的牛至精油滴加到步骤(4)得到的混合溶液中，充分搅拌，使其完全溶解。 (6)使用分液漏斗将步骤(5)得到的牛至精油/玉米醇溶蛋白‑槲皮素溶液逐滴滴加到去离子水中，在转速500rpm下，持续磁力搅拌30min，旋转蒸发除去乙醇，最后，冷冻干燥即得到负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒。 2.根据权利要求1所述的一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中所用的乙醇水溶液，其浓度为70％v/v。 3.根据权利要求1所述的一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(1)中的充分搅拌时间为2h。 4.根据权利要求1所述的一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(2)的NaOH浓度为0.1M。 5.根据权利要求1所述的一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(4)中的透析袋的截留分子量为7000Da，透析液为 70％v/v乙醇水溶液，透析时间为48h。 6.根据权利要求1所述的一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法，其特征在于：所述步骤(5)中的牛至精油的质量分别为100mg、200mg、400mg、 600mg。
说明书全文	一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法技术领域 [0001] 本发明涉及可用于负载精油的功能性复合纳米颗粒制备技术领域，具体涉及一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒及其制备方法。背景技术 [0002] 牛至精油(OEO)是从牛至全草中提取出来的一种淡黄色液体，含有30多种挥发性成分，具有很强的抗氧化和抗菌活性。由于牛至精油的挥发性强，稳定性差，易损失、易氧化而难以储存，同时牛至精油具有刺激性气味，也因此严重限制了其在药物、食品等领域的应用。纳米级载体系统封装和递送生物活性物质能够改善化合物水分散性差、稳定性低、挥发性强等缺点，并且纳米级载体具有制备工艺简单、生物相容性好、载药率高等特点，因此纳米封装技术被认为是解决以上问题的有效方法。 [0003] 基于蛋白质的纳米颗粒不仅具有资源丰富易得、价格合理、良好的生物相容性和生物降解性等优点，而且蛋白质基纳米颗粒制备和装载化合物的过程相对温和，此外蛋白质的两亲性质使它们具有结构多样性，易与小分子化合物、碳水化合物和脂质等发生相互作用。玉米醇溶蛋白不仅具有良好的生物降解性和生物相容性，并且具有独特的自组装特性，这种特性使玉米醇溶蛋白成为开发胶体递送系统的合适材料，可用于封装和递送疏水性生物活性物质。尽管玉米醇溶蛋白纳米颗粒具有作为纳米载体的潜力，但单一的玉米醇溶蛋白纳米颗粒作为疏水性生物活性物质递送载体仍存在一些局限：在其等电点(6.2)附近容易发生聚集；环境稳定性差；具有较强的表面疏水性，导致其在储存过程易发生疏水聚集，从而失去纳米结构。因此，如何提高玉米醇溶蛋白纳米颗粒的稳定性并降低其表面疏水性是将其实际应用于封装和递送载体领域的关键。 [0004] 实验表明槲皮素和玉米醇溶蛋白之间可以发生强烈的共价反应，槲皮素分子结构中具有多个亲水性羟基和疏水性的环结构，羟基是与食物基质中的蛋白质相互作用的主要结构。槲皮素和玉米醇溶蛋白之间的共价作用不仅可以降低玉米醇溶蛋白纳米颗粒的表面疏水性，而且可以提高其稳定性和对牛至精油的包封及负载效率。因此，开发并探究玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒，进一步降低其表面疏水性并提高其在包封和运载精油期间的稳定性，在扩大其递送疏水性生物活性物质方面具有重要的意义。发明内容 [0005] 本发明的目的是提供一种负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒的制备方法，采用碱接枝的方法制备共价复合物，利用反溶剂沉淀法制备纳米颗粒。制备的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒粒径分布均匀，对牛至精油的包封和负载效率高，环境稳定性好，并具有更强的抗氧化性和抑菌性。 [0006] 为实现上述目的，包括以下步骤： [0007] (1)称取1g玉米醇溶蛋白和0.2g槲皮素分别溶解于50mL乙醇水溶液，充分搅拌使其完全溶解。 [0008] (2)将步骤(1)中得到的溶液的pH均调至9.0。 [0009] (3)将步骤(2)所得的溶液混合，暴露在空气中搅拌，使二者充分反应。 [0010] (4)将步骤(3)得到混合溶液置于透析袋中，置于4℃透析，每6h更换一次透析液，去除游离的槲皮素。 [0011] (5)将不同质量的牛至精油滴加到步骤(4)所得到的溶液中，持续搅拌，使其充分溶解。 [0012] (6)使用分液漏斗将步骤(5)得到的牛至精油/玉米醇溶蛋白‑槲皮素溶液逐滴滴加到去离子水中，在转速500rpm下，持续磁力搅拌30min，旋转蒸发除去乙醇，最后，冷冻干燥即得到负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒。 [0013] 本发明还包括这样一些特征： [0014] 步骤(1)中乙醇水溶体积分数为70％，搅拌时间为2h。 [0015] 步骤(2)中使用的NaOH为0.1M。 [0016] 步骤(3)中的搅拌时间为24h。 [0017] 步骤(4)中的透析袋的截留分子量为7000Da，透析液为70％v/v乙醇水溶液，透析时间为48h。 [0018] 步骤(5)中的牛至精油的质量分别为100mg、200mg、400mg、600mg。 [0019] 本发明的有益效果： [0020] 1.本发明使用的玉米醇溶蛋白属于天然生物聚合物，价格低廉，绿色环保。 [0021] 2.本发明使用的槲皮素属于多羟基黄酮醇类化合物，可以与玉米醇溶蛋白发生强烈的共价反应，改善其稳定性。 [0022] 3.本发明以具有抗菌和抗氧化活性的牛至精油作为疏水性生物活性物质，以玉米醇溶蛋白‑槲皮素作为载体，采用了常见的反溶剂沉淀法制备了负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒，材料低廉环保，方法简单易操作，同时还为负载抑菌活性物质提供了理论基础。 [0023] 4.本发明制备所得到的复合纳米颗粒对牛至精油的包封率高达70.12％，制备的复合纳米颗粒具有很好的环境稳定性，在28天的储藏时间之内，体系稳定无明显的聚集现象。玉米醇溶蛋白‑槲皮素与牛至精油协同增强其抗氧化活性和抑菌活性。附图说明 [0024] 附图1.对比例和实施例3制得的复合纳米颗粒的透射电镜图 [0025] 附图2.对比例和实施例3制得的复合纳米颗粒在不同pH值下的粒径及PDI的变化[0026] 附图3.对比例和实施例3制得的复合纳米颗粒在28天储藏期内的粒径及PDI的变化 [0027] 附图4.对比例和实施例3制得的复合纳米颗粒的自由基清除能力具体实施方式 [0028] 对比例 [0029] 步骤一：称取1g玉米醇溶蛋白溶解于100mL乙醇水溶液(70％v/v)，充分搅拌2h，使其完全溶解。 [0030] 步骤二：将400mg牛至精油溶解于玉米醇溶蛋白溶液中，玉米醇溶蛋白和牛至精油的质量比为5:2。 [0031] 步骤三：使用分液漏斗将牛至精油/玉米醇溶蛋白溶液逐滴滴加到去离子水中，在转速500rpm下，持续磁力搅拌30min，旋转蒸发除去乙醇，最后，冷冻干燥即得到负载牛至精油的玉米醇溶蛋白纳米颗粒。 [0032] 实施例1 [0033] 步骤一：称取1g玉米醇溶蛋白和0.2g槲皮素分别溶解于50mL乙醇水溶液(70％v/v)，充分搅拌2h，使其完全溶解。 [0034] 步骤二：使用0.1M NaOH溶液将玉米醇溶蛋白溶液和槲皮素溶液的pH调至9.0；将调好pH的溶液混合，室温下，暴露在空气中搅拌24h，使二者充分反应。 [0035] 步骤三：将反应后的溶液倒入7000Da的透析袋中，置于4℃透析48h，透析液为70％v/v乙醇水溶液，每6h更换一次透析液，去除游离的槲皮素。 [0036] 步骤四：将100mg牛至精油溶解于透析后得到的溶液中，玉米醇溶蛋白和牛至精油的质量比为10:1。 [0037] 步骤五：使用分液漏斗将牛至精油/玉米醇溶蛋白‑槲皮素溶液逐滴滴加到去离子水中，在转速500rpm下，持续磁力搅拌30min，旋转蒸发除去乙醇，最后，冷冻干燥即得到负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒。 [0038] 实施例2 [0039] 步骤一：称取1g玉米醇溶蛋白和0.2g槲皮素分别溶解于50mL乙醇水溶液(70％v/v)，充分搅拌2h，使其完全溶解。 [0040] 步骤二：使用0.1M NaOH溶液将玉米醇溶蛋白溶液和槲皮素溶液的pH调至9.0；将调好pH的溶液混合，室温下，暴露在空气中搅拌24h，使二者充分反应。 [0041] 步骤三：将反应后的溶液倒入7000Da的透析袋中，置于4℃透析48h，透析液为70％v/v乙醇水溶液，每6h更换一次透析液，去除游离的槲皮素。 [0042] 步骤四：将200mg牛至精油溶解于透析后得到的溶液中，玉米醇溶蛋白和牛至精油的质量比为5:1。 [0043] 步骤五：使用分液漏斗将牛至精油/玉米醇溶蛋白‑槲皮素溶液逐滴滴加到去离子水中，在转速500rpm下，持续磁力搅拌30min，旋转蒸发除去乙醇，最后，冷冻干燥即得到负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒。 [0044] 实施例3 [0045] 步骤一：称取1g玉米醇溶蛋白和0.2g槲皮素分别溶解于50mL乙醇水溶液(70％v/v)，充分搅拌2h，使其完全溶解。 [0046] 步骤二：使用0.1M NaOH溶液将玉米醇溶蛋白溶液和槲皮素溶液的pH调至9.0；将调好pH的溶液混合，室温下，暴露在空气中搅拌24h，使二者充分反应。 [0047] 步骤三：将反应后的溶液倒入7000Da的透析袋中，置于4℃透析48h，透析液为70％v/v乙醇水溶液，每6h更换一次透析液，去除游离的槲皮素。 [0048] 步骤四：将400mg牛至精油溶解于透析后得到的溶液中，玉米醇溶蛋白和牛至精油的质量比为5:2。 [0049] 步骤五：使用分液漏斗将牛至精油/玉米醇溶蛋白‑槲皮素溶液逐滴滴加到去离子水中在转速500rpm下，持续磁力搅拌30min，旋转蒸发除去乙醇，最后，冷冻干燥即得到负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒。 [0050] 实施例4 [0051] 步骤一：称取1g玉米醇溶蛋白和0.2g槲皮素分别溶解于50mL乙醇水溶液(70％v/v)，充分搅拌2h，使其完全溶解。 [0052] 步骤二：使用0.1M NaOH溶液将玉米醇溶蛋白溶液和槲皮素溶液的pH调至9.0；将调好pH的溶液混合，室温下，暴露在空气中搅拌24h，使二者充分反应。 [0053] 步骤三：将反应后的溶液倒入7000Da的透析袋中，置于4℃透析48h，透析液为70％v/v乙醇水溶液，每6h更换一次透析液，去除游离的槲皮素。 [0054] 步骤四：将600mg牛至精油溶解于透析后得到的溶液中，玉米醇溶蛋白和牛至精油的质量比为5:3。 [0055] 步骤五：使用分液漏斗将牛至精油/玉米醇溶蛋白‑槲皮素溶液逐滴滴加到去离子水中，在转速500rpm下，持续磁力搅拌30min，旋转蒸发除去乙醇，最后，冷冻干燥即得到负载牛至精油的玉米醇溶蛋白‑槲皮素共价复合纳米颗粒。 [0056] 对比例和实施例3制得的复合纳米颗粒的透射电镜图见图1，从图中可以看出，实施例3制备的纳米颗粒粒径更小并且分布较为均匀。 [0057] 性能测试： [0058] 1.测试实施例1‑4和对比例制得的复合纳米颗粒的粒径、PDI、Zeta电位以及对牛至精油的包封率 [0059] 复合纳米颗粒的粒径、PDI和Zeta电位测定：用去离子水将复合纳米颗粒稀释至0.01mg/mL，使用马尔文纳米粒度仪测量复合纳米颗粒的平均粒径、PDI和Zeta电位。测试温度25℃，平衡时间120s。复合纳米颗粒对牛至精油的包封率和负载率测定：取样品溶液在4℃下离心20min(4000rpm)，收集滤液使其通过10kDa的滤膜,在276nm处测定吸光度，根据牛至精油的标准曲线计算滤液中游离牛至精油的量。 [0060] 牛至精油包封率(％)＝(牛至精油总量‑牛至精油游离的量)/牛至精油总量ⅹ100[0061] 测试结果见表1 [0062] 表1实施例1和对比例所制备的复合纳米颗粒的表征 [0063] [0064] 由表1可以看出与对比例相比，实施例3具有更小的粒径，分散更均匀，对牛至精油的包封率更高，可以更好的完成牛至精油的包封和运载。 [0065] 2.测试不同pH值对复合纳米颗粒的粒径、PDI的影响。 [0066] 测试方法：固定复合纳米颗粒的浓度为1mg/mL。使用0.1M NaOH和HCl溶液对纳米颗粒分散液的pH进行调整，将分散液的pH调整为5.0、6.0、7.0、8.0、9.0。测量纳米颗粒的平均粒径和PDI。 [0067] 测试结果如图2，从图中可以看出实施例3制备的复合纳米颗粒的粒径和PDI随pH值的变化并不大，尤其在碱性条件时，具有较小的粒径和PDI值，说明其具有优异的碱性pH稳定性。在pH 5～6时对比例的粒径较大，有明显的聚集，可能是pH接近玉米醇溶蛋白的等电点(6.2)，纳米颗粒间的静电斥力低，纳米颗粒容易聚集，而实施例3的粒径较小，PDI在0.2以下，稳定性较好。说明槲皮素的共价复合可以提高纳米颗粒的pH稳定性。 [0068] 3.储藏稳定性测试 [0069] 测试方法：将复合纳米颗粒在4℃下储存28天，每周测量一次纳米颗粒的平均粒径和PDI。 [0070] 测试结果如图3，从图中可以看出与对比例制备的纳米颗粒相比，实施例3制备的复合纳米颗粒在整个28天储藏期间粒径和PDI变化更平缓，PDI一直维持在0.2左右，颗粒分布均匀。说明槲皮素共价复合纳米颗粒展现出了比单一玉米醇溶蛋白纳米颗粒更好的储藏稳定性。 [0071] 4.抗氧化能力测试 [0072] 测试方法：取2.5mL新鲜制备的复合纳米颗粒(0.5mg/mL)与1mL DPPH甲醇溶液[0073] (1.75×10‑4mol/L)混合。在黑暗中反应30min，517nm处测定吸光度。 [0074] [0075] 其中，A0代表DPPH空白对照的吸光度，A1代表样品反应溶液的吸光度，A2代表没有DPPH自由基溶液存在的样品的吸光度。 [0076] 取1mL新鲜制备的复合纳米颗粒(0.5mg/mL)与3mL ABTS溶液(734nm处的吸光度为‑10.70±0.02cm )充分混合，将混合物放置在黑暗处1h，734nm处测定吸光度。 [0077] [0078] 其中，A0代表ABTS空白对照的吸光度，A1代表样品反应溶液的吸光度，A2代表没有ABTS自由基溶液存在的样品的吸光度。 [0079] 测试结果如图4，从图中可以看出实施例3具有较高的自由基清除活性，可能是由于实施例3对牛至精油有较高的包封率，并且OEO和槲皮素之间具有协同抗氧化作用。有研究表明OEO的抗氧化性呈现剂量依赖性，即浓度浓度越高，其抗氧化性越强。