一种可降解高分子材料和自组装纳米复合物及应用专利检索-在高分子主链中由形成含硫的键合有或没有氮氧或碳键合反应得到的高分子化合物专利检索查询-专利查询网

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一种可降解高分子材料和自组装纳米复合物及应用
申请号	CN202110481787.8	申请日	2021-04-30	公开(公告)号	CN113265050A	公开(公告)日	2021-08-17
申请人	浙江大学;			发明人	平渊; 郭家晶; 万涛; 辛虎虎;
摘要	本发明提供了一种可降解高分子材料和自组装纳米复合物及应用，所述高分子材料是一种聚双硫阳离子材料，由聚双硫阳离子材料与核苷酸和蛋白质的生物大分子通过自组装形成一种含胍基的双硫主链的高分子复合物。本发明高分子复合物进入细胞后，在胞浆内GSH的作用下，能迅速将载体主链降解，释放出包裹的生物大分子进入胞浆中，因此，本发明材料对细胞的毒性较小，具有良好的细胞相容性。本发明高分子复合物在胞内递送过程中具有很高的效率，制作成本低，材料毒性小，能够有效的将多种生物大分子递送到细胞中，不需要其进行化学修饰，不影响其生物活性。可载体在细胞内递送质粒、mRNA、蛋白质中的应用。聚双硫阳离子材料的结构如式(1)所示：
权利要求	1.一种可降解高分子材料，其特征在于，所述高分子材料是一种聚双硫阳离子材料，所述聚双硫阳离子材料的结构如式(1)所示：其中： A＝S或者Se； X＝O或N，n1,n2为0到20之间的整数； R1为含巯基的小分子或者巯基聚乙二醇，含巯基的小分子选自：巯基聚乙二醇，其相对分子质量:200、400、600、800、1000、2000、5000、10000，4‑arm‑巯基聚乙二醇或者8‑arm‑巯基聚乙二醇，8‑arm‑巯基聚乙二醇相对分子质量:2000、5000、 10000)； R2为: 式(2)中：B＝O或者N,Y＝N、C或者O,n3＝0～20之间的整数； R4为：H、COOH、 R3为：或者式(3)中：X＝O或者N，n4＝0～20之间的整数， R5为：式(4)中：R6为：氢,甲氧基，氨基或者 n5＝0～5之间的整数。 2.根据权利要求的1所述的一种可降解高分子材料，其特征在于，所述高分子材料如式 (1)到式(4)中所示的结构，其中，X为O或者N，Y为O、C或者N，n1、n2,为0到20的整数，n3，n4为0 到20间的整数，n5为0到5之间的整数，R1为各种带巯基的可作为引发剂的小分子；式(2)中，当Y为氧时，R4为H、当Y为碳元素时，R4为羧基、当Y为氮元素时，R4为H、式(3)中，X为氧元素或氮元素，R5为：式(4)中，R6为：H、甲氧基、氨基、 n5为0到5之间的整数。 3.一种含胍基的双硫主链的高分子复合物，其特征在于，是由权利要求1所述的聚双硫阳离子材料与核苷酸和蛋白质的生物大分子通过自组装形成的纳米粒子，其中核苷酸链包括但不限于质粒、mRNA，蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白，β‑半乳糖苷酶，枣红蛋白，核糖核酸酶A，Cas9蛋白。 4.根据权利要求3所述的一种含胍基的双硫主链的高分子复合物，其特征在于，当聚双硫阳离子材料与核苷酸形成复合物时,核苷酸与聚双硫阳离子材料的用量为：每400ng核苷酸与2μl的聚双硫阳离子材料充分混合，孵育30min后即得。 5.根据权利要求3所述的一种含胍基的双硫主链的高分子复合物，其特征在于，当聚双硫阳离子材料与蛋白质形成复合物时，蛋白质和聚双硫阳离子材料的用量为：每500ng的蛋白质与2μl的聚双硫阳离子材料充分混合，孵育30min后即得。 6.权利要求3所述的含胍基的双硫主链的高分子复合物作为载体在细胞内递送质粒、 mRNA、蛋白质中的应用。
说明书全文	一种可降解高分子材料和自组装纳米复合物及应用技术领域 [0001] 本发明属于有机化学，高分子化学，分子生物学，细胞生物学，生物技术等领域，涉及一种可降解高分子材料和自组装纳米复合物及应用。技术背景 [0002] 基因递送是指将外源的遗传物质传递到细胞内，从而实现细胞生物学功能的调控、疾病的治疗等作用。这里的术语“核酸”包括各种类型的核酸聚合物，例如(但不限于)质粒DNA(pDNA)，信使RNA(mRNA)，小干扰RNA(siRNA)或反义寡核苷酸(ASO)。在过去的几十年中，已经开发了多种纳米颗粒基因递送系统。核酸递送系统可以分为三个不同的类别：(i) 物理方法，(ii)病毒递送系统，和(iii)非病毒递送系统。由于物理方法和病毒递送系统具有很多的缺陷，比如：物理方法只能在细胞水平进行，同时处理过程中会导致大量的细胞死亡并产生毒性；病毒递送系统虽然效率高但毒性也很高，且容易引起机体的免疫排斥反应，包装质粒的容量比较小，只能包载小质粒(<4.8kb)从而限制了其进行广泛的应用。非病毒 DNA递送系统包括脂质或脂质体材料，无机材料以及有机聚合物材料，具有明显优于物理方法和病毒递送系统的优点：1.具有亲疏水端，很容易形成小的纳米囊泡或者胶束；2.可降解，低毒性；3.无免疫原性；4.表面可进行靶向修饰从而提高药物的递送效率；5.非病毒载体的结构多样可以对于特定的药物进行特定的设计；6.性质稳定并且易于大规模制备；7. 能与DNA等生物大分子形成稳定的纳米复合物，易于递送。 [0003] 基因编辑或基因组工程是定向插入、替换或删除宿主细胞基因组中特定的DNA序列的技术。这种策略到目前为止一共有四种不同的核酸酶可供使用：大范围核酸酶、锌指核酸酶(ZFN)、转录激活因子样效应核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas9系统。在CRISPR‑Cas9系统中，DNA载体可以同时编码Cas9蛋白和靶序列特异性指导RNA(gRNA)，在转录gRNA和翻译 Cas9 mRNA后，Cas9将于gRNA组合形成核糖核蛋白(RNP)复合物,这种形成的核糖核蛋白复合物在核定位序列的引导下(Nuclear localization sequence，NLS)，可将RNP带到细胞核中，同时gRNA可以与细胞核基因组中特定的基因序列配对并指导Cas9蛋白将序列特异性切开，产生位点特异性双链断裂并通过同源定向修复(HDR)机制插入donor基因，或者通过非同源末端连接(NHEJ)，该技术可以沉默、删除或者修复目的基因。 [0004] 目前CRISPR/Cas9技术是治疗各种遗传疾病特别是单基因遗传病非常有前景的方法。但由于Cas9蛋白比较大(170kDa)，导致编码其蛋白所需质粒比较大(约10.6kb),而病毒一般只能包载4.7kb的质粒，同时病毒有将DNA插入到宿主细胞基因的危险，并且有较高的免疫原性，且难以大规模制备的等问题，故发展有机非病毒的基因编辑递送系统就变得非常关键。发明内容 [0005] 为了解决现有技术中高分子载体不能很好的解决生物大分子胞内递送的问题，本发明的目的是提供一种可降解高分子材料，是一种聚双硫阳离子材料，具体是含胍基的双硫主链的阳离子高分子材料。 [0006] 所述聚双硫阳离子材料的结构如式(1)所示： [0007] 其中：A＝S或者Se； [0008] X＝O或N，n1、n2为0到20之间的整数； [0009] R1为含巯基可以用来做引发剂(Initiator)的小分子或者巯基聚乙二醇的大分子，举例如下：或者PEGSH(巯基聚乙二醇,MW(相对分子质量):200、400、600、800、1000、2000、 5000、10000)；4‑arm‑PEGSH(4‑臂‑巯基聚乙二醇)或者8‑arm‑PEGSH(8‑臂‑巯基聚乙二醇) (MW:2000、5000、10000)。 [0010] R2为: 式(2)，式(2)中：B＝O或N，Y＝N、C或者O,n3＝0～20之间的整数， [0011] R4为：H、COOH、 [0012] R3为：或者 [0013] 其中式(3)中：X＝O或N，n4＝0～20之间的整数，R5为： [0014] 式(4)中：R6为：氢,甲氧基，氨基或者 n5＝0～5之间的整数。 [0015] 进一步，式(2)中，当Y为氧时，R4为H、当Y为碳元素时，R4为羧基、当Y为氮元素时，R4为H、式(3)中，X 为氧元素或氮元素，R5为： [0016] 本发明的另一个目的是提供一种含胍基的双硫主链的高分子复合物，是由聚双硫阳离子材料与核苷酸或者蛋白质等生物大分子通过自组装形成的纳米粒子，其中核苷酸链包括但不限于质粒、mRNA，蛋白质包括但不限于牛血清白蛋白(BSA)，β‑半乳糖苷酶(β‑ gal)，枣红蛋白(R‑Pe)，核糖核酸酶A(RNase A)，Cas9蛋白等。当聚双硫阳离子材料与核苷酸(质粒、mRNA)形成复合物时,核苷酸与聚双硫阳离子材料的用量为：每400ng核苷酸与2μl (1mg/ml)的聚双硫阳离子材料充分混合，孵育30min后即可形成纳米复合物。当聚双硫阳离子材料与蛋白质形成复合物时，蛋白质和聚双硫阳离子材料的用量为：每500ng的蛋白质与 2μl的聚双硫阳离子材料充分混合，孵育30min后即可形成高分子复合物。 [0017] 本发明的再一个目的是提供所述的含胍基的双硫主链的高分子复合物作为载体在细胞内递送质粒、mRNA、蛋白质中的应用。研究表明，本发明聚双硫阳离子材料作为载体，与核苷酸和蛋白质等生物大分子通过自组装形成纳米粒子，能够有效的将这些生物大分子递送到细胞的胞浆中，不需要对其进行任何化学修饰，从而不改变其结构也不影响其生物活性。 [0018] 本发明通过合成带胍基的二硫为主链的阳离子高分子载体，用于胞内CRISPR/Cas9基因的递送。载体上所携带的正电荷的胍基官能团能与带负电荷的生物大分子通过正负电荷相互作用形成稳定的纳米粒子同时能帮助纳米粒子穿过细胞膜的阻碍进入胞内，氨基部分有助于压缩生物生物大分子形成稳定的纳米粒子并促进复合物在胞内的内涵体逃逸并进入胞浆中，含双硫的主链通过与细胞膜表面膜蛋白携带的巯基通过硫巯交换反应帮助纳米粒子通过细胞膜，纳米粒子进入细胞后能在胞浆中的GSH作用下，与双硫主链发生化学反应使其降解实现生物大分子无痕释放的同时降低了载体的毒性，从而解决了大分子胞内传递载体的难题。本发明通过设计，得到这一类阳离子高分子，进而获得了高效、低毒的生物大分子胞内递送载体。尽管目前很多含胍基阳离子载体用于胞内的传递如细胞穿膜肽 (arginine‑rich cell‑penetrating peptides,CPPs)，但存在的一个主要缺陷就是在胞内不能降解，有较大的毒性，另一方面，这些穿膜肽必须与所传递的功能性生物大分子通过共价连接的方式结合，导致会影响其功能，由于这些缺陷的存在，限制了细胞穿膜肽的研究与应用。本发明设计合成的载体具有全新的化学结构，属于新的递送载体，新应用。 [0019] 利用本发明分别实现了:(1),293T,Hela,A549,HepG2等细胞系中CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase‑Luciferase质粒的胞内递送，并实现了对特定基因位点的编辑；(2),在293T细胞中CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase mRNA的胞内递送，并实现了对特定基因位点的编辑；(3), 在293T细胞中Cas9蛋白的胞内递送，并实现了对特定基因位点的编辑。(4)，在HeLa和MDA‑ MB‑231细胞中实现了牛血清白蛋白，β‑半乳糖苷酶，枣红蛋白，核糖核酸酶A(RNase A)等蛋白的高效胞内递送。结果表明本阳离子材料有以下特点：本发明提出的生物大分子胞内送载体具有很高的胞内递送效率和表达效率，对于质粒的胞内递送，效率显著优于商业化转染式剂PEI 25K(金标准)和Lipofectamine 2000；对于mRNA的胞内递送,效率显著优于商业化转染式剂PEI 25K,明显优于Lipofectamine 3000。对于蛋白质的胞内递送，效率与商业化的递送载体Lipofectamine CRISPR MAX(CMAX)基本持平。通过核苷酸链上标记的报告基因的表达或者Cas9融合的荧光蛋白来表征纳米粒子的传递效率，并通过流式细胞计数仪进行定量比较。通过细胞毒性实验(MTT)表明本发明提供的阳离子双硫高分子聚合物具有较低的毒性，在生物大分子的传递条件下，实验细胞的存活率高于90％，具有较好的生物相容性。本发明提供的阳离子双硫材料在胞内递送过程中具有很高的效率，制作成本低，材料毒性小，能够有效的将多种生物大分子递送到细胞中，不需要其进行化学修饰，不影响其生物活性。附图说明 [0020] 图1为实施例2中含部分双硫阳离子高分子材料向293T细胞递送CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒的EGFP表达定量结果，及其与商业化的式剂PEI 25K,lipo2000作比较。 [0021] 图2为实施例2中含部分双硫阳离子高分子材料向293T细胞递送CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒的绿色荧光蛋白表达定量的结果，及其与商业化的式剂PEI 25K,lipo2000 作比较。 [0022] 图3为实施例3中聚阳离子材料DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase形成的复合物的尺寸和表面电势。 [0023] 图4为实施例4中DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒不同N/P形成复合物在293T细胞系中的胞内递送效率。 [0024] 图5为实施例5中阳离子聚合材料DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒形成复合物在293T,Hela,HepG2,A549四种哺乳动物细胞系中的胞内递送效率。 [0025] 图6为实施例6阳离子聚合物材料DET‑CPD‑12的生物降解能力的评价。 [0026] 图7为实施例7中阳离子聚合材料DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒形成的复合物在293T(A),Hela(B),HepG2(C),A549(D)四种哺乳细胞中毒性评价。 [0027] 图8为实施例8中DET‑CPD‑12与EGFP‑plasmid(4.3kb)形成的纳米复合物在293T细胞中的递送效率。 [0028] 图9为实施例9中DET‑CPD‑12与CRISPR‑Ca9质粒形成的复合物用于293T细胞中CCNE1基因敲除的效率。 [0029] 图10为实施例10中DET‑CPD‑12递送CRISPR‑Ca9质粒于293T‑EGFP细胞中对EGFP基因的敲除。 [0030] 图11为实施例11中DET‑CPD‑12与EGFP‑mRNA形成的复合物在293T细胞中的递送效率。 [0031] 图12为实施例12中DET‑CPD‑12与Cas9‑GFP‑mRNA形成的复合物在293T细胞中的递送效率。 [0032] 图13为实施例13中DET‑CPD‑12与Cas9‑GFP‑mRNA形成的复合物的尺寸和表面电势。 [0033] 图14为实施例14中DET‑CPD‑12在293T细胞中递送Cas9‑mRNA用于CCNE‑1基因位点的敲除。 [0034] 图15为实施例15中DET‑CPD‑12在293T‑EGFP细胞中递送Cas9‑mRNA用于EGFP基因位点的敲除。 [0035] 图16为实施例16中DET‑CPD‑12与罗丹明标记的Cas9蛋白形成的复合物用于293T细胞的胞内递送效率。 [0036] 图17为实施例17中DET‑CPD‑12与基因编辑核糖核酸复合物(CRISPR‑Cas9)形成的复合物的尺寸和表面电势。 [0037] 图18为实施例18中DET‑CPD‑12与基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR‑Cas9)形成的复合物用于293T细胞中CCNE1基因敲除。 [0038] 图19为实施例19中DET‑CPD‑12与基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR‑Cas9)形成的复合物用于293T‑EGFP细胞中EGFP基因敲除。 [0039] 图20为实施例20中DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16，DET‑CPD‑17，DET‑CPD‑18，DET‑CPD‑19，DET‑CPD‑20九种材料与藻红蛋白(R‑PE)形成的复合物用于HeLa细胞中的胞内递送及效率评价。 [0040] 图21为实施例21中DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16，DET‑CPD‑17，DET‑CPD‑18，DET‑CPD‑19，DET‑CPD‑20九种材料与BSA‑FITC形成的复合物用于HeLa细胞中的胞内递送及效率评价。 [0041] 图22为实施例22中DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16五种材料与RNase‑A形成的复合物用于HeLa细胞中的胞内递送及细胞凋亡的评价。 [0042] 图23为实施例23中DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14三类材料与β‑Gal蛋白形成的复合物用于HeLa细胞中的胞内递送及活性评价。具体实施方式 [0043] 结合以下具体实施例和附图，对本发明作进一步的详细说明，本发明的保护内容不局限于以下实施例。在不背离发明构思的精神和范围下，本领域技术人员能够想到的变化和优点都被包括在本发明中，并且以所附的权利要求书为保护范围。实施本发明的过程、条件、式剂、实验方法等，除以下专门提及的内容之外，均为本领域的普遍知识和公共常识，本发明没有特别限制内容。 [0044] 实施例1：单体和聚双硫阳离子高分子材料CPD(Cell‑penetrating poly(disulfide)s)的具体合成方法。 [0045] 1.聚合反应单体的合成，Scheme 1中为本发明中举例合成的单体,为M1,M2,M3,M5,M6,M7。具体结构式如下： [0046] 单体的合成： [0047] 式(5)中，将硫辛酸1(2.06g,10mmol)溶于40ml无水二氯甲烷中(DCM)，加入羰基二咪唑(CDI,2.43g,15mmol)，室温搅拌，将三乙烯二胺2(8.24g,80mmol)溶于10ml无水二氯甲烷中，冰浴搅拌0.5h,然后滴加溶有硫辛酸和CDI的二氯甲烷溶液，完毕后零度反应1h，移入室温反应1h，然后饱和食盐水萃取三次，无水硫酸钠干燥，除去溶剂得到粗品，硅胶柱分离提纯，流动相为甲醇和二氯甲烷体系，即得到单体M1。 [0048] 单体M3合成参考M1： [0049] [0050] 式(6)中，将硫辛酸1(2.06g,10mmol)溶于20ml无水DMF中，加入羰基二咪唑(CDI,2.43g,15mmol)，室温搅拌1h。将精氨酸甲酯盐酸盐3(1.05g,5mmol)和DIEA(0.645g,5mmol) 溶于10ml无水DMF中，然后将精氨酸盐酸盐溶液滴加到硫辛酸溶液中室温搅拌4h,反应完毕后，除去溶剂得到粗品，硅胶柱分离提纯，流动相为甲醇和二氯甲烷体系，即得到单体M2。 [0051] [0052] 式(7)中，化合物5参考单体M1的合成方法，化合物5(1.68g,5mmol)和1H‑吡唑‑1‑甲脒盐酸盐(0.56g,5mmol)溶于无水二氯甲烷中，室温搅拌4h，除去溶剂，硅胶柱分离提纯，流动相为甲醇和二氯甲烷体系，即得到单体M4。 [0053] [0054] 式(8)中，将4‑胍基苯甲酸盐酸盐6(1.08g,5mmol)与三乙胺(0.5g,5mmol)加入20ml二氯甲烷中室温搅拌1h,然后加入(1.24g,5mmol)的M3，EDCI(0.96g,5mmol)和DMAP (0.122g,1mmol)室温反应过夜，反应完毕后除去溶剂，硅胶柱分离提纯，流动相为甲醇和二氯甲烷体系，即得到单体M5。 [0055] [0056] 式(9)中，将硫辛酸1(2.06g,10mmol)溶于20ml DCM中，依次加入加EDCI(2.3g,12mmol)，DMAP(0.244g,2mmol)和4‑氨基苯硼酸(1.6g,12mmol)，室温搅拌过夜，停止反应，饱和食盐水萃取三次，无水硫酸钠干燥，除去溶剂，硅胶柱分离提纯，流动相为甲醇和二氯甲烷体系，即得到单体M6。 [0057] 单体M7参考M6和M4的合成。 [0058] 2.聚双硫阳离子高分子材料CPD的合成。聚双硫阳离子高分子材料CPD的制备方法为：将适量的不同的单体(反应浓度为 0.2M)溶于TEOA(三乙醇胺)缓冲液(PH＝7)中。然后将引发剂溶于TEOA缓冲液中，加入到溶有单体的反应液中(反应浓度为0.2M)，室温反应一段时间后，将反应液滴加到终止剂中，中止剂为碘乙酰胺的水溶液(用量为单体摩尔量的5倍)。然后用去离子水充分透析除去(透析袋，MWCO:3500)，即得到目标材料。 [0059] 具体方法如下： [0060] [0061] 式(10)中，将适量的单体I(M1)(反应浓度为0.2M)溶于TEOA缓冲液(PH＝7)中，将引发剂半胱氨酸甲酯溶于TEOA缓冲液中，单体I的量为引发剂的80倍，室温反应，时间为 0.5h,1h，1.5h,2.0h，2.5h，3.0h，将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5 倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到二乙烯三胺嵌段的聚双硫阳离子高分子材料，分别命名为DET‑1,DET‑2,DET‑3,DET‑4,DET‑5,DET‑6。材料于4摄氏度冰箱保存。 [0062] [0063] 式(11)中，将适量的单体II(M2)(反应浓度为0.2M)溶于TEOA缓冲液(PH＝7)中，将引发剂半胱氨酸甲酯溶于TEOA缓冲液中，单体II的量为引发剂的80倍，室温反应，时间为 30min,1.0h，1.5h,2.0h，2.5h，3.0h，将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到精氨酸甲酯嵌段的聚双硫阳离子材料，分别命名为CPD‑1,CPD‑2,CPD‑3,CPD‑4,CPD‑5,CPD‑6。材料于4摄氏度冰箱保存。 [0064] [0065] 式(12)中，将适量的单体I(M1)和单体II(M2)(反应浓度为0.2M)溶于TEOA缓冲液(PH＝7)中，将引发剂半胱氨酸甲酯溶于TEOA缓冲液中(单体I和单体II摩尔量的和为引发剂的80倍)，加入到溶有单体的反应液中，加入单体I和单体II摩尔比分别为1：1、1：2、2：1，室温反应1.5h，反应完毕后，将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料为DET‑CPD‑1,DET‑CPD‑2, DET‑CPD‑3。于4摄氏度冰箱保存。 [0066] 将适量的单体I(M1)和单体II(M2)(反应浓度为0.2M)溶于TEOA缓冲液(PH＝7)中，单体I和单体II摩尔比为1：2，将引发剂半胱氨酸甲酯溶于TEOA缓冲液中(单体I和单体II摩尔量的和为引发剂的80倍)，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，时间分别为：30min, 1h，2.0h，2.5h，3.0h，将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料，分别命名为DET‑CPD‑4,DET‑CPD‑ 5,DET‑CPD‑6,DET‑CPD‑7,DET‑CPD‑8,于4摄氏度冰箱保存。 [0067] 将适量的单体I(M1)和单体II(M2)(反应浓度为0.2M)溶于TEOA缓冲液(PH＝7)中，单体I和单体II摩尔比为1：2，将引发剂半胱氨酸甲酯溶于TEOA缓冲液中(单体I和单体II摩尔量的和为引发剂的20倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑9。 [0068] 单体I和单体II摩尔比为1：2，将引发剂半胱氨酸甲酯溶于TEOA缓冲液中(单体I和单体II摩尔量的和为引发剂的20倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑9。 [0069] 单体I和单体II摩尔比为1：2，将引发剂半胱氨酸甲酯溶于TEOA缓冲液中(单体I和单体II摩尔量的和为引发剂的40倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑10。 [0070] 单体I和单体II摩尔比为1：2，将引发剂半胱氨酸甲酯溶于TEOA缓冲液中(单体I和单体II摩尔量的和为引发剂的160倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑11。 [0071] [0072] 式(13)中，单体I和单体II摩尔比为1：2，将引发剂PEGSH(MW:2000)溶于TEOA缓冲液中(单体I和单体II摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应， 1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑12。 [0073] [0074] 式(14)中，单体M3和单体M2摩尔比为1：2，将引发剂PEGSH(MW:2000)溶于TEOA缓冲液中(单体M2和单体M3摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑13。 [0075] [0076] 式(15)中，单体M1和单体M5摩尔比为1：1，将引发剂PEGSH(MW:1000)溶于TEOA缓冲液中(单体M1和单体M5摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑14。 [0077] [0078] 式(16)中，单体M4和单体M7摩尔比为1：1，将引发剂PEGSH(MW:5000)溶于TEOA缓冲液中(单体M4和单体M7摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑15。 [0079] [0080] 式(17)中，单体M5和单体M6摩尔比为1：1，将引发剂PEGSH(MW:2000)溶于TEOA缓冲液中(单体M5和单体M6摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑16。 [0081] [0082] 式(18)中，单体M1和单体M2摩尔比为1：2，将引发剂I5溶于TEOA缓冲液中(单体M1和单体M2摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑17。 [0083] [0084] 式(19)中，单体M1和单体M2摩尔比为1：2，将引发剂I4溶于TEOA缓冲液中(单体M1和单体M2摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑18。 [0085] [0086] 式(20)中，单体M4和单体M7摩尔比为1：1，将引发剂I3溶于TEOA缓冲液中(单体M4和单体M7摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑19。 [0087] [0088] 式(21)中，单体M1和单体M5摩尔比为1：1，将引发剂I2溶于TEOA缓冲液中(单体M1和单体M5摩尔量的和为引发剂的80倍，加入到溶有单体的反应液中，室温反应，1.5h,将反应液取出滴加到溶有碘乙酰胺(当量为总单体量的5倍)的去离子水中终止，半个小时后终止完成，充分透析，即得到材料DET‑CPD‑20。 [0089] 实施例2:阳离子聚合材料DETs,CPDs,DET‑CPDs系列载体的质粒胞内递送效率比较以CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒(10.6kb)作为模型质粒，通过拍细胞内表达的绿色荧光蛋白亮度和检测细胞内的荧光，在293T细胞上评估阳离子聚合材料胞内递送质粒的效率，筛选最优材料。 [0090] 具体方法如下：将293T细胞接种到48孔板中过夜，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始细胞转染实验。将400ng CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒溶于50ul ddH2O中，然后加入发明实施例1制备的DETs,CPDs,DET‑CPDs系列阳离子材料，加入的量分分别为1ul、2ul、4ul、8ul、16ul，孵育30min,加入适量的无血清培养基使总体积为250uL，代替原孔中的培养基，细胞培养箱中孵育6h后，用含10％FBS的培养基250uL代替，48h后，通过荧光显微镜观察蛋白的表达或者直接收集细胞进行蛋白表达鉴定，使用PEI和 Lipofectamine 2000作为阳性对照。 [0091] 实验结果：图1为本发明实施例1中所得材料在293T细胞上递送CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒的细胞表达绿色荧光蛋白的流式定量结果。图2为本发明实施例1中所得材料在293T细胞上递送CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒的细胞表达荧光酶素的定量结果。表明阳离子聚合材料在一定的反应时间和一定的单体比例时，才能获得较高的递送效率。其中，DET‑CPD‑12具有最高的质粒递送效率，同时显著优于市售的阳性转染式剂PEI25K和 Lipofectamine 2000，表明本DET‑CPD‑12材料是一种很好的胞内递送质粒的载体。实施例3：阳离子聚合物材料DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒形成复合物，并利用动态光散射(DLS)测量复合物的尺寸和表面电势。 [0092] 具体方法如下：将2ug CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒溶于200ul ddH2O中，然后加入10ul的阳离子材料，孵育30min，将溶液稀释到1ml，使用激光纳米粒度仪检测溶液中纳米颗粒的尺寸分布和表面电势,使用投射电子显微镜测量纳米粒子的大小。 [0093] 实验结果：图3表示本发明制备的DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒形成的复合物DLS表征的尺寸分布、表面电势。结果表明，聚阳离子材料DET‑CPD‑12能与Cas9 质粒形成约80nm尺寸的纳米颗粒，并且颗粒的表面电势为正。 [0094] 实施例4：筛选DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒不同N/P形成复合物在293T细胞系中的胞内递送效率。 [0095] 具体实施方法参考实施例2，材料DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒的N/P分别为3、5、7、9、11，PEI 25K和Lipofectamine 2000作为阳性对照。 [0096] 实验结果：图4表明，当材料和质粒的N/P为5时，通过荧光显微镜拍摄细胞的荧光表达，并通过流式细胞仪定量统计细胞荧光蛋白表达的阳性率转染效率最高，同时明显优于PEI 25K和Lipofectamine 2000。 [0097] 实施例5：DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒形成复合物在多种哺乳动物细胞系中的胞内递送效率，包括293T,Hela,HepG2,A549四种细胞系。 [0098] 具体方法如下：(以Hela细胞为例)细胞培养(以48孔板为例，其他培养皿可以参考48孔板)，在转染前一天(18‑24小时)将细胞(具体的细胞数量应依据细胞的类型、大小和细胞的生长速度而定)接种到孔内进行培养，使第二天的细胞密度能达到约60％‑80％。开始细胞转染实验，将400ng质粒溶于50ul ddH2O中，然后加入2ul的DET‑CPD‑12阳离子材料，孵育30min,加入200ul的无血清培养基，总的体积为250ul,代替原孔中的培养基，细胞培养箱中孵育6h后，用含10％FBS的培养基250ul代替，48h后，通过荧光显微镜观察蛋白的表达或者直接收集细胞进行蛋白表达鉴定。 [0099] 结果表明：图5为通过本发明制备的DET‑CPD‑12阳离子材料与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒形成的复合物递送到多种哺乳细胞系中，通过流式细胞仪定量统计细胞荧光蛋白表达的阳性率。与市售的阳性对照PEI 25K和Lipofectamine 2000相比，DET‑CPD‑12 阳离子的材料效率明显更高。 [0100] 实施例6：阳离子聚合物材料DET‑CPD‑12的生物降解能力的评价。具体方法如下：在DET‑CPD‑12材料中加入10mM的GSH(谷胱甘肽)，室温搅拌过夜，通过GPC测定材料的分子量，与没有加GSH的材料GPC结果进行对比。 [0101] 结果表明：图6表明，没有加GSH的材料通过GPC测出来的分子量约为8640Da，而加入GSH组，材料降解效果十分明显，通过GPC的测式出来的分子量约为655Da。说明DET‑CPD‑ 12具有很好的生物降解能力，从而大大降低了对细胞的毒性。 [0102] 实施例7：阳离子聚合材料DET‑CPD‑12与CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒形成的复合物的细胞毒性评价 [0103] 利用MTT法在正常的细胞转染条件下，聚合阳离子材料DET‑CPD‑12及其与质粒形成的复合物对细胞产生的毒性。以CMV‑Cas9‑GFP‑luciferase质粒作为模型质粒，分别在 293T,Hela,HepG2,A549等动物细胞系上检测细胞存活率。 [0104] 具体操作如下：以293T为例说明，将适量的293T细胞接种到96孔板中，过夜培养。移除培养基，分别加入不同浓度的100ul DET‑CPD‑12/质粒的复合物无血清培养基，孵育4 小时后，除去培养基，加入等量的10％含血清培养基，继续培养20小时。然后按照MTT法的标准步骤检测细胞的存活率。 [0105] 实验结果：图7所示的各种浓度DET‑CPD‑12/质粒复合物与细胞共培养情况下，MTT检测材料与质粒的复合物与处理的293T(A),Hela(B),HepG2(C),A549(D)细胞存活率都高于90％。结果表明本发明制备的聚合物阳离子对细胞的毒性很小，并且在质粒递送过程中也没有对细胞产生明显的毒性，本发明制备的材料DET‑CPD‑12具有较好的生物相容性。 [0106] 实施例8：DET‑CPD‑12阳离子聚合物与EGFP‑质粒(4.3kb)形成复合物进行胞内递送。具体方法如下：将细胞(以293T细胞为例)接种到48孔板中过夜(以48孔板为例，其他培养皿可以参考48孔板)，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始细胞转染实验，将400ng质粒溶于50ul ddH2O中，然后加入2ul的DET‑CPD‑12阳离子材料，孵育30min, 加入200ul的无血清培养基，总的体积为250ul,代替原孔中的培养基，细胞培养箱中孵育6h 后，用含10％FBS的培养基250ul代替，48h后，通过荧光显微镜观察蛋白的表达或者直接收集细胞进行蛋白表达鉴定。 [0107] 结果表明：图8为通过本发明制备的DET‑CPD‑12阳离子材料与EGFP‑质粒(4.3kb)形成的复合物递送到293T细胞中，通过荧光显微镜拍摄细胞的荧光表达，通过流式细胞仪定量计算细胞荧光蛋白表达的阳性率。与市售的阳性对照PEI 25K和Lipofectamine 2000 效率相当。 [0108] 实施例9:DET‑CPD‑12胞内递送CRISPR‑Ca9质粒用于CCNE‑1基因位点的敲除。具体操作方法如下：将293T细胞接种到24孔板中过夜，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始细胞转染实验。将800ng敲除CCNE‑1基因的CRISPR‑Cas9质粒溶于100ul ddH2O中(sgCCNE1:TTTCAGTCCGCTCCAGAAAA)，然后加入发明实施例1制备的DET‑ CPD‑12阳离子材料4ul，孵育30min,加入适量的无血清培养基使总体积为500ul，代替原孔中的培养基，细胞培养箱中孵育6h后，用含10％FBS的培养基500ul代替，继续培养48h。使用商业化式剂盒提取基因组总DNA，PCR扩增带有突变位点的目的片段(CCNE1‑FP: TCCAAGCCCAAGTCCTGAGCCA，CCNE1‑RP：TGGCCTGCAGCTCTGTTTTGGG)，加热变性退火复性处理，最后加入0.3μl的T7E1核酸内切酶，37℃反应30分钟后，跑2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。 [0109] 实验结果：图9为本发明制备的材料DET‑CPD‑12在293T细胞上递送CRISPR‑Cas9质粒编辑CCNE1基因位点后使用T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率，使用商业化的 PEI25K和Lipofectamine 2000作为阳性对照，可见DET‑CPD‑12的效率明显优于PEI 25K和 Lipofectamine 2000。 [0110] 实施例10:阳离子聚合材料DET‑CPD‑12向293T‑EGFP细胞内递送CRISPR‑Cas9质粒用于EGFP基因位点的敲除。具体操作方法如下：实施方法参考实施例9，将293T细胞接种到24孔板中过夜，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始细胞转染实验。将800ng敲除EGFP基因的 CRISPR‑Cas9质粒溶于100ul ddH2O中(sgEGFP:GTGAACCGCATCGAGCTGAA,EGFP‑FP: ATGGTGAGCAAGGGCGAG,EGFP‑FP:TTACTTGTACAGCTCGTCCATGC)。然后加入发明实施例1制备的 DET‑CPD‑12阳离子材料4ul，孵育30min,加入适量的无血清培养基使总体积为500ul，代替原孔中的培养基，细胞培养箱中孵育6h后，用含10％FBS的培养基500ul代替，继续培养48h。 [0111] 实验结果：图10为本发明制备的材料DET‑CPD‑12在293T‑EGFP细胞上递送CRISPR‑Cas9质粒敲除EGFP基因位点后使用荧光显微镜观察细胞内GFP表达情况，使用流式细胞仪对表达GFP的细胞进行定量。使用商业化的PEI 25K和Lipofectamine 2000作为阳性对照，可见DET‑CPD‑12递送CRISPR‑Cas9质粒对于GFP基因位点的敲除效果明显优于PEI 25K和 Lipofectamine 2000。 [0112] 实施例11：DET‑CPD‑12阳离子聚合物与EGFP‑mRNA形成复合物用于293T细胞系的胞内递送。 [0113] 具体实施方法参考实施例2。 [0114] 结果表明：图11为通过本发明制备的DET‑CPD‑12阳离子材料与EGFP‑mRNA形成的复合物递送到293T细胞中，通过荧光显微镜拍摄细胞的荧光表达，并通过流式细胞仪定量统计细胞荧光蛋白表达的阳性率。与阳性对照PEI 25K和Lipofectamine 3000相比，DET‑ CPD‑12阳离子材料效率明显更高。 [0115] 实施例12：DET‑CPD‑12阳离子聚合物与Cas9‑GFP‑mRNA形成复合物用于293T细胞系的胞内递送。 [0116] 具体实施方法参考实施例2。 [0117] 结果表明：图12为通过本发明制备的DET‑CPD‑12阳离子材料与Cas9‑GFP‑mRNA形成的复合物递送到293T细胞中，通过荧光显微镜拍摄细胞的荧光表达，并通过流式细胞仪定量统计细胞荧光蛋白表达的阳性率。与阳性对照PEI 25K和Lipofectamine 3000相比， DET‑CPD‑12阳离子材料效率明显更高。 [0118] 实施例13：阳离子聚合物材料DET‑CPD‑12与Cas9‑GFP‑mRNA形成复合物，并利用DLS测量复合物的尺寸和表面电势,用TEM测量纳米粒子的大小。 [0119] 具体方法如下：将2ug Cas9‑GFP‑mRNA溶于200ul ddH2O中，然后加入10ul的阳离子材料，孵育30min，将溶液稀释到1ml，使用激光纳米粒度仪检测溶液中纳米颗粒的尺寸分布和表面电势。 [0120] 实验结果：图13表示本发明制备的DET‑CPD‑12与Cas9‑GFP‑mRNA形成的复合物DLS表征的尺寸分布、表面电势。结果表明，聚阳离子材料DET‑CPD‑12能与Cas9‑mRNA形成约 120nm大小的纳米颗粒，并且颗粒的表面电势为正。 [0121] 实施例14:DET‑CPD‑12胞内递送Cas9‑mRNA用于CCNE‑1基因位点的敲除。 [0122] 具体实施方法参考实施例9。 [0123] 实验结果：图14为本发明制备的材料DET‑CPD‑12在293T细胞上递送Ca9‑mRNA编辑CCNE1基因位点后使用T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率，使用商业化的PEI 25K和 Lipofectamine 3000作为阳性对照，可见DET‑CPD‑12的敲除效率明显优于PEI25K和 Lipofectamine 3000。 [0124] 实施例15：DET‑CPD‑12阳离子聚合物向293T‑EGFP细胞内递送Cas9‑mRNA用于EGFP基因位点的敲除。 [0125] 具体实施方法参考实施例9。 [0126] 实验结果：图15为本发明制备的材料DET‑CPD‑12在293T‑EGFP细胞上递送Cas9‑mRNA敲除EGFP基因位点后使用荧光显微镜观察细胞内GFP表达情况，使用流式细胞仪对表达GFP的细胞进行定量。使用商业化的PEI 25K和Lipofectamine 3000作为阳性对照，可见 DET‑CPD‑12递送Cas9‑mRNA质粒对于EGFP基因位点的敲除效果明显优于PEI 25K和 Lipofectamine 3000。 [0127] 实施例16:DET‑CPD‑12向胞内递送罗丹明标记的Cas9蛋白。 [0128] 具体方法如下：将293T细胞接种到48孔板中过夜，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始细胞转染实验。将0.5ug罗丹明(Rhodamine)标记的Cas9溶于50ul ddH2O中，然后加入发明实施例1制备的DET‑CPD‑12 4ul，孵育30min,加入适量的无血清培养基使总体积为250ul，代替原孔中的培养基，细胞培养箱中孵育6h后，通过荧光显微镜观察细胞对蛋白摄取的或者直接收集细胞使用流式细胞仪检测细胞内的荧光强度。使用商业化式剂Lipofectamine CRISPRMAX(CMAX)和PEI 25K作为阳性对照。 [0129] 实验结果：图16为本发明制备的DET‑CPD‑12递送Cas9蛋白的荧光照片和流式结果。结果表明，DET‑CPD‑12具有较好的蛋白传递效果。 [0130] 实施例17：制备DET‑CPD‑12与基因编辑核糖核酸复合物(CRISPR‑Cas9)的复合物，并利用DLS表征复合物的尺寸及表面电势，利用TEM表征纳米粒子的大小。 [0131] 具体操作方法如下：将适量的CRISPR‑Cas9蛋白与sgRNA在适量的PBS溶液中混匀，37℃孵育10min使之形成RNP，然后加入适量的DET‑CPD‑12溶液混合均匀形成纳米粒子，室温孵育30分钟，加入1mL去离子水稀释后，使用激光纳米粒度仪检测溶液中纳米颗粒的尺寸分布和表面电势。 [0132] 实验结果：图17表示本发明制备的DET‑CPD‑12与CRISPR‑Cas9蛋白形成的复合物DLS表征的尺寸分布、表面电势。结果表明，聚阳离子材料DET‑CPD‑12能与CRISPR‑Cas9蛋白形成150nm左右尺寸的纳米颗粒，并且颗粒的表面电势为正。 [0133] 实施例18:DET‑CPD‑12向胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR‑Cas9)编辑CCNE1基因。 [0134] 具体操作方法如下：将293T细胞接种到24孔板中过夜，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始细胞转染实验。将1μg的Cas9蛋白溶解于100ul PBS中，加入已经合成好的gRNA(sgCCNE1:TTTCAGTCCGCTCCAGAAAA)，300ng,37℃孵育10min形成RNP，然后加入发明实施例1制备的DET‑CPD‑12阳离子材料4ul，孵育30min,加入适量的无血清培养基使总体积为500ul，代替原孔中的培养基，细胞培养箱中孵育4h后，用含10％FBS的培养基 500ul代替，继续培养48h。提使用商业化式剂盒提取细胞基因组总DNA，PCR扩增带有突变位点的目的片段(CCNE1‑FP:TCCAAGCCCAAGTCCTGAGCCA，CCNE1‑RP： TGGCCTGCAGCTCTGTTTTGGG)，加热变性退火复性处理，最后加入0.3μl的T7E1核酸内切酶，37 ℃反应30分钟后，跑2％的琼脂糖凝胶电泳检测分析酶切结果。 [0135] 实验结果：图18为本发明制备的材料DET‑CPD‑12在293T细胞上递送基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR‑Cas9)编辑CCNE1基因位点后使用T7E1核酸内切酶法检测突变体的突变率，使用商业化的PEI 25K和CMAX作为阳性对照，结果表明，DET‑CPD‑12具有较好的 CCNE1基因敲除效果。 [0136] 实施例19:DET‑CPD‑12向293T‑EGFP细胞内递送基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR‑Cas9)敲除EGFP基因。 [0137] 具体实施方法参考实施例18。 [0138] 实验结果：图19为本发明制备的材料DET‑CPD‑12在293T‑EGFP细胞上递送基因编辑核糖核蛋白复合物(CRISPR‑Cas9)敲除EGFP基因位点后使用荧光显微镜观察细胞内GFP 表达情况，使用流式细胞仪对表达GFP的细胞进行定量。使用商业化的PEI 25K和CMAX作为阳性对照，结果显示，DET‑CPD‑12具有较好的EGFP基因敲除效果。 [0139] 实施例20:DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16，DET‑CPD‑17，DET‑CPD‑18，DET‑CPD‑19，DET‑CPD‑20向HeLa细胞内递送藻红蛋白(R‑PE)。 [0140] 具体操作如下：将HeLa细胞接种到24孔板中过夜，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始蛋白转染实验，现将孔中的培养基除去，用PBS将细胞清洗三遍，然后将1μg的藻红蛋白溶解于100ul dd H2O中，分别各加入4ul的DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑ CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16，混匀后孵育30min,然加入适量的无血清培养基使总体积为500ul，代替原孔中的PBS溶液，细胞培养箱中孵育4h后，除去培养基然后用PBS将细胞清洗三遍，细胞PBS中保存，然后通过荧光显微镜观察细胞对蛋白的摄取或者直接收集细胞进行蛋白摄取定量表征。 [0141] 结果表明：图20为通过本发明制备的DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16阳离子材料与藻红蛋白形成的纳米复合物在HeLa细胞中的摄取情况，通过荧光显微镜拍摄细胞的蛋白摄取，通过流式细胞仪定量计算细胞摄取蛋白后的平均荧光强度。结果显示DET‑CPD‑12具有很好的将藻红蛋白递送到HeLa细胞的能力。 [0142] 实施例21:DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16，DET‑CPD‑17，DET‑CPD‑18，DET‑CPD‑19，DET‑CPD‑20向HeLa细胞内递送牛血清白蛋白(BSA‑ FITC)。 [0143] 具体实施方法参考实施例21。 [0144] 结果表明：图21为通过本发明制备的DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16阳离子材料与BSA‑FITC形成的纳米复合物在HeLa细胞中的摄取情况，通过荧光显微镜拍摄细胞的蛋白摄取，通过流式细胞仪定量计算细胞摄取蛋白后的平均荧光强度。结果显示DET‑CPD‑12具有很好的将牛血清白蛋白递送到HeLa细胞的能力 [0145] 实施例22:DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16向MDA‑MB‑231细胞内递送核糖核酸酶A(RNase A)。 [0146] 具体操作如下：将MDA‑MB‑231细胞接种到48孔板中过夜，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始蛋白转染实验，现将孔中的培养基除去，用PBS将细胞清洗三遍，然后将500ng的RNase A溶解于50ul dd H2O中，分别各加入2ul的DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑ 13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16，混匀后孵育30min,然加入适量的无血清培养基使总体积为250ul，代替原孔中的PBS溶液，细胞培养箱中孵育6h后，用250ul含10％胎牛血清的新鲜DMEM替代每孔的培养基，继续孵育42h。用CCK‑8式剂盒对HeLa细胞的毒性进行评价。 [0147] 结果表明：图22为通过本发明制备的DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14，DET‑CPD‑15，DET‑CPD‑16阳离子材料与RNase A形成的纳米复合物在MDA‑MB‑231细胞中的摄取情况，通过CCK‑8式剂盒测定细胞的存活效率。结果显示，MDA‑MB‑231细胞摄取DET‑CPD‑12/ RNase A纳米复合物后，细胞活性低于20％，具有很明显的细胞毒性，说明DET‑CPD‑12具有很好的将核糖核酸酶A递送到胞内的能力。 [0148] 实施例23:DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14向HeLa细胞内递送β‑半乳糖苷酶(β‑Gal)。 [0149] 具体操作如下：将HeLa细胞接种到24孔板中过夜，使第二天孔中的细胞密度达到约60％～80％时，开始蛋白转染实验，现将孔中的培养基除去，用PBS将细胞清洗二遍，然后将1μg的β‑半乳糖苷酶溶解于100ul dd H2O中，分别各加入4ul的DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13， DET‑CPD‑14，混匀后孵育30min,然加入适量的无血清培养基使总体积为500ul，代替原孔中的PBS溶液，细胞培养箱中孵育4h后，除去培养基然后用PBS将细胞清洗二遍，细胞固定 10min中后，用原位X‑Gal染色式剂盒，将细胞在37℃培养箱中培养2h,然后用光学显微镜观察实验结果。 [0150] 结果表明：图23为通过本发明制备的DET‑CPD‑12，DET‑CPD‑13，DET‑CPD‑14阳离子材料与β‑半乳糖苷酶形成的纳米复合物在HeLa细胞中的摄取情况，说明DET‑CPD‑12能以较高的效率将β‑半乳糖苷酶递送到HeLa细胞中。