会员体验
专利管家(专利管理)
工作空间(专利管理)
风险监控(情报监控)
数据分析(专利分析)
侵权分析(诉讼无效)
联系我们
交流群
官方交流:
QQ群: 891211   
微信请扫码    >>>
现在联系顾问~

螺环聚合物及其制备方法和应用

申请号 CN202211039301.6 申请日 2022-08-29 公开(公告)号 CN115260215A 公开(公告)日 2022-11-01
申请人 北京理工大学; 发明人 董宇平; 任悦; 张亚会; 赵晔鋆; 谢海燕; 蔡政旭;
摘要 本 发明 涉及 荧光 化学技术领域,尤其是涉及一种螺环 聚合物 及其制备方法和应用。螺环聚合物,其结构式如下:其中,n为≥1的整数。本发明的螺环聚合物具有聚集诱导发光性质,对M1型巨噬细胞具有快速、特异且无损的识别能 力 ;可以进一步联合M1型巨噬细胞,制备靶向成像体系;并且本发明的荧光探针的制备简单,操作方便,效果显著。
权利要求

1.螺环聚合物,其特征在于,结构式如下:
其中,n为≥1的整数。
2.根据权利要求1所述的螺环聚合物,其特征在于,n为3~11之间的整数;
优选的,n为6。
3.权利要求1或2所述的螺环聚合物的制备方法,其特征在于,包括如下步骤:
二异腈环己烷、苯甲酰基异硫氰酸酯、乙炔二羧酸二乙酯、封端剂和溶剂的混合物,在空气氛围下,于50~60℃反应12~18h,冷却至室温后,加入沉淀剂中,收集沉淀;
其中,所述封端剂的结构为
4.根据权利要求3所述的螺环聚合物的制备方法,其特征在于,所述封端剂与所述二异腈环己烷的摩尔比为(0.1~0.5)﹕1;
和/或,
所述二异腈环己烷、苯甲酰基异硫氰酸酯和乙炔二羧酸二乙酯的摩尔比为1﹕1﹕1。
5.根据权利要求3所述的螺环聚合物的制备方法,其特征在于,所述溶剂为二氯甲烷;
和/或,
所述沉淀剂为石油醚;
优选的,所述溶剂与所述封端剂的用量比为(5~10)mL﹕1mmol;
优选的,所述沉淀剂与所述溶剂的体积比为(30~50)﹕1。
6.根据权利要求3所述的螺环聚合物的制备方法,其特征在于,所述封端剂的制备方法包括:
(a)2‑溴蒽醌和4‑(二苯基基)苯酸于溶剂中,在催化剂的作用下进行Suzuki反应,得到化合物PAD;
(b)化合物PAD与DMF在POCl3的作用下反应得到所述封端剂;
其中,所述化合物PAD的结构式为:
7.权利要求1或2所述的螺环聚合物在制备用于识别M1型巨噬细胞的探针中的应用。
8.用于识别M1型巨噬细胞的探针,其特征在于,包括权利要求1或2所述的螺环聚合物中的任一种、有机溶剂和不良溶剂;
所述有机溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、乙腈和N,N‑二甲基甲酰胺中的任一种或多种;
所述不良溶剂为、PBS缓冲液和DMEM培养基中的任一种或多种。
9.根据权利要求8所述的用于识别M1型巨噬细胞的探针,其特征在于,所述探针中,所‑4 ‑6
述螺环聚合物的浓度为1×10 ~1×10 mol/L;
优选的,所述有机溶剂和所述不良溶剂的体积比为1﹕(9~999)。
10.权利要求1或2所述的螺环聚合物在制备靶向成像试剂中的应用;
优选的,将所述螺环聚合物与M1型巨噬细胞进行共孵育。

说明书全文

螺环聚合物及其制备方法和应用

技术领域

[0001] 本发明涉及荧光化学技术领域,尤其是涉及一种螺环聚合物及其制备方法和应用。

背景技术

[0002] 螺环聚合物是指一类具有独特螺环单元的特殊聚合物。在聚合物主链中引入螺环单元不仅可以提高聚合物的热稳定性和化学稳定性,还可以赋予聚合物特殊的性能,如螺环共轭、螺环超共轭或异头效应。螺环聚合物的传统合成策略主要是使用预合成的螺环单体通过金属催化缩合,直接连接到聚合物主链上。但是,这种合成方法通常有一些缺点,如反应过程繁琐,聚合条件苛刻,难以引入多种取代基,以及缺乏合适的单体等。通过多组分螺化聚合的概念,使用简单的单体一步聚合即可得到螺环聚合物。因此一种单体适用度广、合成简单、条件温和的一步聚合螺环化合物的合成制备是目前螺环聚合物的研究热点和难点。目前,含有硫、氮等杂原子的螺环化合物常用于医药领域,然而,含有硫、氮等杂原子的螺环聚合物在生物医学上的研究还较少。
[0003] 巨噬细胞主要分为抗肿瘤的M1型巨噬细胞和促肿瘤的M2型巨噬细胞。M1型巨噬细胞广泛分布在人体内,用于抵御外部病原体的入侵。M1细胞不仅可以作为相关疾病的诊断参数,也可以引发自身免疫。近年来,因为M1型巨噬细胞及其外泌体、细胞膜对肿瘤细胞具有靶向性,逐渐成为探针和药物的载体。在多种巨噬细胞中特异无损识别M1型巨噬细胞具有重要的意义。然而现有的商业M1型巨噬细胞染料往往价格昂贵、识别过程繁琐并对M1型细胞具有损伤性(大多数商业染料染色过程需要在4℃下与M1型巨噬细胞共孵育30min,较为苛刻的孵育条件对M1细胞具有损伤),所以亟需一种可以在正常生理条件下对M1细胞实现快速、灵敏且简便快速的特异性识别探针。
[0004] 有鉴于此,特提出本发明。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的在于提供螺环聚合物,可用于M1型巨噬细胞的特异性识别等。
[0006] 本发明的另一目的在于提供螺环聚合物的制备方法,操作简单,条件温和。
[0007] 本发明的又一目的在于提供螺环聚合物在制备用于识别M1型巨噬细胞的探针中的应用。
[0008] 本发明的再一目的在于提供螺环聚合物在制备用于靶向成像试剂中的应用。
[0009] 为了实现本发明的上述目的,特采用以下技术方案:
[0010] 螺环聚合物,其结构式如下:
[0011]
[0012] 其中,n为≥1的整数。
[0013] 在本发明的具体实施方式中,n为3~11之间的整数。
[0014] 本发明还提供了螺环聚合物的制备方法,包括如下步骤:
[0015] 二异腈环己烷、苯甲酰基异硫氰酸酯、乙炔二羧酸二乙酯、封端剂和溶剂的混合物,在空气氛围下,于50~60℃反应12~18h,冷却至室温后,加入沉淀剂中,收集沉淀;
[0016] 其中,所述封端剂的结构为
[0017] 在本发明的具体实施方式中,所述封端剂与所述二异腈环己烷的摩尔比为(0.1~0.5)﹕1。
[0018] 在本发明的具体实施方式中,所述二异腈环己烷、苯甲酰基异硫氰酸酯和乙炔二羧酸二乙酯的摩尔比为1﹕1﹕1。
[0019] 在本发明的具体实施方式中,所述溶剂为二氯甲烷。
[0020] 在本发明的具体实施方式中,所述沉淀剂为石油醚。
[0021] 在本发明的具体实施方式中,还包括:采用正己烷洗涤所述沉淀,干燥。
[0022] 本发明还提供了螺环聚合物在制备用于识别M1型巨噬细胞的探针中的应用。
[0023] 本发明还提供了一种用于识别M1型巨噬细胞的探针,包括所述螺环聚合物、有机溶剂和不良溶剂;
[0024] 所述有机溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、乙腈和N,N‑二甲基甲酰胺中的任一种或多种;
[0025] 所述不良溶剂为、PBS缓冲液和DMEM培养基中的任一种或多种。
[0026] 在本发明的具体实施方式中,所述探针中,所述螺环聚合物的浓度为1×10‑4~1×‑610 mol/L。
[0027] 在本发明的具体实施方式中,所述有机溶剂和所述不良溶剂的体积比为1﹕(9~999)。
[0028] 本发明还提供了螺环聚合物在制备靶向成像试剂中的应用。
[0029] 与现有技术相比,本发明的有益效果为:
[0030] (1)本发明的螺环聚合物具有聚集诱导发光性质,对M1型巨噬细胞具有快速、特异且无损的识别能;并且,本发明的螺环聚合物的制备操作简单,条件温和;
[0031] (2)本发明的荧光探针可以进一步联合M1型巨噬细胞,制备靶向成像体系;并且本发明的荧光探针的制备简单,操作方便,效果显著。附图说明
[0032] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0033] 图1为本发明实施例1提供的封端剂及螺环聚合物的核磁氢谱图;其中,A为封端剂的核磁氢谱图,B为螺环聚合物的核磁氢谱图;
[0034] 图2为本发明实施例1提供的封端剂及螺环聚合物的核磁谱图;其中,A为封端剂的核磁碳谱图,B为螺环聚合物的核磁碳谱图;
[0035] 图3为本发明实施例1提供的封端剂及螺环聚合物的红外光谱图;其中,A为封端剂的红外光谱图,B为螺环聚合物的红外光谱图;
[0036] 图4为本发明的螺环聚合物在不同混合比例的DMSO/PBS体系中的荧光光谱图;
[0037] 图5为本发明的螺环聚合物在不同含量的PBS体系中的聚集诱导发射特性图;
[0038] 图6为本发明的封端剂在不同混合比例的DMSO/PBS体系中的荧光光谱图;
[0039] 图7为本发明的封端剂在不同含量的PBS体系中的聚集诱导发射特性图;
[0040] 图8为本发明的螺环聚合物对M0、M1和M2型巨噬细胞染色的细胞流式仪数据图;
[0041] 图9为本发明的螺环聚合物对M0细胞的染色图;其中,蓝色为细胞核商业染料染色,红色为溶酶体商业染料染色;
[0042] 图10为本发明的螺环聚合物对M1细胞的染色图;其中,蓝色为细胞核商业染料染色,红色为溶酶体商业染料染色,绿色为螺环聚合物对细胞染色;
[0043] 图11为本发明的螺环聚合物对M2细胞的染色图;其中,蓝色为细胞核商业染料染色,红色为溶酶体商业染料染色;
[0044] 图12为加入CD80抗体后,本发明的螺环聚合物对M1细胞的染色图;其中,蓝色为细胞核商业染料染色;
[0045] 图13为本发明的螺环聚合物和CD80对接计算图;
[0046] 图14为本发明的螺环聚合物和CD80对接表面电能图;
[0047] 图15为本发明的螺环聚合物和CD80对接计算中氢键图;
[0048] 图16为本发明的螺环聚合物和M1型巨噬细胞的靶向成像体系的构建图;
[0049] 图17为靶向成像体系的小鼠器官图;
[0050] 图18为靶向成像体系的小鼠器官荧光强度图;
[0051] 图19为M1细胞和螺环聚合物@M1细胞的TEM图。

具体实施方式

[0052] 下面将结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述,但是本领域技术人员将会理解,下列所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例,仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0053] 本发明的具体实施方式中的部分试剂的信息可以如下:
[0054] 苯甲酰基异硫氰酸酯,安耐吉化学;
[0055] 反式‑1,4‑二基环己烷,天津希恩斯;
[0056] 乙炔二羧酸二乙酯,安耐吉化学;
[0057] 二氯甲烷,阿拉丁;
[0058] 石油醚,天津市福晨化学试剂厂;
[0059] 正己烷,天津市福晨化学试剂厂;
[0060] 二溴蒽醌,天津市福晨化学试剂厂;
[0061] 4‑(二苯氨基)苯酸,天津市福晨化学试剂厂;
[0062] (四三苯基膦)钯,天津市福晨化学试剂厂;
[0063] 三氯磷,天津市福晨化学试剂厂;
[0064] RPMI‑1640培养基,Gibico;
[0065] DMEM培养基,Gibico;
[0066] 青链双抗霉素,Hyclone;
[0067] 胎血清,Hyclone;
[0068] PBS缓冲液,Hyclone;
[0069] 胰酶,Life Technologies;
[0070] Hoechest33342,Life Technologies;
[0071] 脂多糖(LPS),Thermo Fisher Scientific;
[0072] CCK‑8试剂盒,Dojindo;
[0073] 白细胞介素‑4,PeproTech;
[0074] APC anti‑mouse CD80,Biolegend。
[0075] 本发明的具体实施方式中的部分仪器与设备的信息可以如下:
[0076] 核磁共振波谱仪,美国Varian公司;
[0077] 凝胶渗透色谱仪,美国Waters公司;
[0078] 红外光谱仪,德国Bruker公司;
[0079] 荧光分光光度仪,日本日立公司;
[0080] 二氧化碳培养箱,SANYO;
[0081] 多功能酶标仪,BioTek;
[0082] 流式细胞仪,Beckman;
[0083] 激光共聚焦显微镜,Nikon;
[0084] 透射电子显微镜,Tecnai Spirit;
[0085] 小动物活体成像仪,PerkinElmer。
[0086] 螺环聚合物,其结构式如下:
[0087]
[0088] 其中,n为≥1的整数。
[0089] 在本发明的具体实施方式中,n为3~11之间的整数。
[0090] 如在不同实施方式中,n可以为6、8或11等等。
[0091] 在本发明的具体实施方式中,n为6。
[0092] 本发明还提供了螺环聚合物的制备方法,包括如下步骤:
[0093] 二异腈环己烷、苯甲酰基异硫氰酸酯、乙炔二羧酸二乙酯、封端剂和溶剂的混合物,在空气氛围下,于50~60℃反应12~18h,冷却至室温后,加入沉淀剂中,收集沉淀;
[0094] 其中,所述封端剂的结构为
[0095] 在本发明的具体实施方式中,所述封端剂与所述二异腈环己烷的摩尔比为(0.1~0.5)﹕1。
[0096] 如在不同实施方式中,所述封端剂与所述二异腈环己烷的摩尔比可以为0.1﹕1、0.2﹕1、0.5﹕1等等。
[0097] 在本发明的具体实施方式中,所述封端剂与所述二异腈环己烷的摩尔比为0.5﹕1。
[0098] 在本发明的具体实施方式中,所述二异腈环己烷、苯甲酰基异硫氰酸酯和乙炔二羧酸二乙酯的摩尔比为1﹕1﹕1。
[0099] 在本发明的具体实施方式中,所述溶剂为二氯甲烷。进一步的,所述溶剂与所述封端剂的用量比为(5~10)mL﹕1mmol。
[0100] 在本发明的具体实施方式中,所述沉淀剂为石油醚。进一步的,所述沉淀剂与所述溶剂的体积比为(30~50)﹕1,如(35~45)﹕1,40﹕1等等。
[0101] 在本发明的具体实施方式中,还包括:采用正己烷洗涤所述沉淀,干燥。在实际操作中,在室温~60℃下真空干燥至恒重,即得到目标螺环聚合物。
[0102] 在实际操作中,所述反应可以在配有磁力搅拌棒的Schlenk管中进行。
[0103] 在本发明的具体实施方式中,所述封端剂的制备方法包括:
[0104] (a)2‑溴蒽醌和4‑(二苯基氨基)苯硼酸于溶剂中,在催化剂的作用下进行Suzuki反应,得到化合物PAD;
[0105] (b)化合物PAD与DMF在POCl3的作用下反应得到所述封端剂;
[0106] 其中,所述化合物PAD的结构式为:
[0107] 在本发明的具体实施方式中,所述溶剂包括甲苯和甲醇。进一步的,所述甲苯和所述甲醇的体积比为(6~8)﹕(2~4),如7﹕3。所述溶剂的用量与所述2‑溴蒽醌的比例为(5~7)mL﹕1mmol,如6mL﹕1mmol。
[0108] 在本发明的具体实施方式中,所述催化剂为Pd(PPh3)4。进一步的,所述催化剂的摩尔量为所述2‑溴蒽醌的摩尔量4%~6%,如5%。
[0109] 在本发明的具体实施方式中,所述Suzuki反应的温度可以为75℃。所述反应在N2保护氛围下进行。
[0110] 在本发明的具体实施方式中,步骤(b)包括:POCl3和DMF在0℃下冷却得到混合溶液,然后加入PAD,于75℃反应过夜。
[0111] 在本发明的具体实施方式中,步骤(b)中,POCl3与PAD的用量比为(1.5~2.5)mL﹕1mmol;DMF与PAD的用量比为(18~22)mL﹕1mmol。
[0112] 本发明还提供了螺环聚合物在制备用于识别M1型巨噬细胞的探针中的应用。
[0113] 本发明还提供了一种用于识别M1型巨噬细胞的探针,包括所述螺环聚合物、有机溶剂和不良溶剂;
[0114] 所述有机溶剂为四氢呋喃、二甲基亚砜、乙腈和N,N‑二甲基甲酰胺中的任一种或多种;
[0115] 所述不良溶剂为水、PBS缓冲液和DMEM培养基中的任一种或多种。
[0116] 在实际操作中,所述探针的制备方法包括:将螺环聚合物溶解于有机溶剂和不良溶剂的混合溶剂中,混合均匀,得到所述探针。
[0117] 在本发明的具体实施方式中,所述探针中,所述螺环聚合物的浓度为1×10‑4~1×‑610 mol/L。
[0118] 如在不同实施方式中,所述探针中,所述螺环聚合物的浓度可以为1×10‑4mol/L、1‑5 ‑5 ‑6 ‑6×10 mol/L、5×10 mol/L、1×10 mol/L、5×10 mol/L等等。
[0119] 在本发明的具体实施方式中,所述有机溶剂和所述不良溶剂的体积比为1﹕(9~999)。
[0120] 如在不同实施方式中,所述有机溶剂和所述不良溶剂的体积比可以为1﹕9、1﹕99、1﹕999等等。
[0121] 本发明还提供了螺环聚合物在制备靶向成像试剂中的应用。
[0122] 在本发明的具体实施方式中,将所述螺环聚合物与M1型巨噬细胞进行共孵育。
[0123] 在本发明的具体实施方式中,将所述螺环聚合物制备成探针,再与所述M1型巨噬细胞进行共孵育。所述共孵育包括:于37℃条件下共孵育0.5~6h。
[0124] 实施例1
[0125] 本实施例提供了螺环聚合物的制备方法,包括如下步骤:
[0126] (1)将2‑溴蒽醌(5mmol)、4‑(二苯基氨基)苯硼酸(7.5mmol)、Pd(PPh3)4(0.25mmol)和甲苯/甲醇(V﹕V=7﹕3,30mL)的混合物加入100mL圆底烧瓶中。反应混合物在N2搅拌下加热到80℃,得到红色固体PAD。接下来,加入POCl3(2mL)和20mL的DMF在0℃下冷却。然后,在该溶液中加入PAD(1mmol)。然后溶液在80℃下回流过夜。通过胶柱色谱法纯化粗品,用乙酸乙酯/石油醚(体积比1/1)洗脱。得到红色固体PAD‑CHO,即封端剂。
[0127] (2)在装有磁力搅拌棒的15毫升Schlenk管中,加入异氰环己烷(0.5mmol)、乙炔二羧酸二乙酯(0.5mmol)、苯甲酰基异硫氰酸酯(0.5mmol)、PAD‑CHO(0.25mmol)和二氯甲烷(5mL)。反应混合物在50℃下加热18h,冷却到室温后,在剧烈搅拌下将混合物倒入200mL石油醚中。过滤沉淀物,用正己烷洗涤,并在60℃真空下干燥至恒重,得到螺环聚合物SP0.5。
[0128] 其中,化合物PAD、PAD‑CHO和SP0.5的结构式分别如下:
[0129]
[0130] 实施例2
[0131] 本实施例提供了荧光探针的制备方法,包括如下步骤:
[0132] 配制体积比为1﹕9的DMSO和DMEM培养基的混合溶剂;
[0133] 然后取一定量的螺环聚合物SP0.5溶解于混合溶剂中,并使混合物中的螺环聚合‑5物SP0.5的浓度为1×10 mol/L,得到荧光探针。
[0134] 实施例3
[0135] 本实施例提供了靶向成像试剂的制备方法,包括如下步骤:
[0136] 将实施例1的螺环聚合物SP0.5与M1巨噬细胞共孵育0.5~6h,得到装载有螺环聚合物的M1型巨噬细胞(SP0.5@M1)。
[0137] 其中,共孵育的条件包括:细胞使用DMEM培养基在37℃中进行培养,在细胞生长状态良好的情况下,将3mL配置好的荧光探针(如实施例2)加入培养皿,置于37℃细胞培养箱中共孵育0.5~6h后,去除培养皿内的DMEM培养基,用PBS清洗三次,随后用胰酶消化细胞,收集装载有螺环聚合物的M1型巨噬细胞(SP0.5@M1)。
[0138] 实验例1
[0139] 通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征可知所述红色固体为封端剂PAD‑CHO,其核磁1
氢谱和质谱数据如下:H NMR(400MHz,DMSO,δ):9.82(S,1H),8.40(S,1H),8.31‑8.17(m,
4H),8.00‑7.72(m,6H),7.53‑7.40(m,2H),7.36‑7.19(m,5H),7.11‑7,089(d,J=8.4Hz,
13
2H). C NMR(101MHz,DMSO)δ191.19,182.75,182.35,152.68,147.00,145.87,145.15,
135.02,134.88,134.19,133.49,133.44,132.25,131.88,131.76,130.64,129.92,128.97,‑1
127.20,127.12,127.09,126.24,126.01,124.31,120.23.IR 2728,1670cm .MS(MALDI‑+
TOF,m/z):计算值:C33H21NO3,479.15;测试值479.86[M+H] .
[0140] 通过核磁共振波谱仪和质谱仪表征可知所述橙红色固体为螺环聚合物,其核磁氢谱数据如下:
[0141] PAD‑CHO、螺环聚合物的1H‑NMR图谱和13C NMR图谱如图1所示。δ3.08ppm的峰可归于异氰环己烷中环己烷上氢的共振,δ4.28ppm和δ8.05ppm、δ7.66ppm、δ7.49ppm的峰归于乙炔二羧酸二乙酯中乙酯氢的共振和苯甲酰基异硫氰酸酯中苯环的共振。在δ9.82ppm的峰可以归结为PAD‑CHO中基氢的共振。异氰环己烷+乙炔二羧酸二乙酯+苯甲酰基异硫氰酸酯三组份聚合的峰仍在螺环聚合物中。在螺环聚合物形成后,PAD‑CHO中醛基对应的没有了,证明PAD‑CHO参与了封端。如图2所示,在δ156.91、77.36、135.09、161.71、191.19ppm处的峰属于异氰环己烷、乙炔二羧酸二乙酯、苯甲酰基异硫氰酸酯和PAD‑CHO中的共振,这些峰都没有。δ182.75ppm的峰属于PAD‑CHO苯醌的共振,仍在螺环聚合物中。此外,在δ84.64ppm处出现了形成螺环共振的新峰,证明形成了螺环聚合物。所有的结果都证实了PAD‑CHO参与了反应并形成了螺环聚合物。
[0142] 图3为本发明实施例1提供的封端剂及螺环聚合物的红外光谱图。封端剂的C‑CHO‑1伸缩振动的峰值出现在2728cm 。然而,螺环聚合物的光谱中没有峰,表明发生了聚合过程。
并且C‑O的峰值也出现在螺环聚合物中,说明形成了螺环。这些结果进一步证明获得了目标聚合物。
[0143] 以上结构表征说明橙红色固体是本发明所述的螺环聚合物SP0.5。
[0144] 表征得到的螺环聚合物SP0.5的重均分子量(Mw)为6800,PDI=1.87,根据计算得到SP0.5中的平均聚合物n=6。
[0145] 实验例2
[0146] 图4和图6分别为本发明的螺环聚合物和封端剂在不同混合比例的DMSO/PBS体系中的荧光光谱图;图5和图7分别为本发明的螺环聚合物和封端剂在不同含量的PBS体系中的聚集诱导发射特性图。从图中可知,螺环聚合物在PBS含量为0%~40%(体积分数)体系中均有微弱的荧光发射,当PBS含量达到50%时,观察到明显的光致发光强度增加,并且随着PBS含量的增加,荧光波长出现了红移。这主要是由于在450nm激发不是螺环的最佳激发,随着PBS含量的增加,封端剂基团的发射占据主导,这与PBS体系中封端剂的发射一致。这进一步证明了封端剂参与了反应并成功地使聚合物的波长发生了红移。
[0147] 实验例3
[0148] 螺环聚合物SP0.5特异性识别M1型巨噬细胞
[0149] 本发明的具有AIE性能的橙色固体螺环聚合物SP0.5可以在M0、M1和M2型巨噬细胞中特异性识别染色M1巨噬细胞。首先我们先将小鼠M0巨噬细胞用LPS(1μg/mL)刺激为M1型巨噬细胞,用IL‑4(100ng/mL)刺激为M2型巨噬细胞。然后在M0、M1和M2细胞中加入浓度为1‑5×10 mol/L的螺环聚合物探针(10%DMSO,90%DMEM培养基)在37℃的培养箱中培养6h,然后收集细胞并用PBS清洗三次,随后用商业染料CD80在4℃染色30min,清洗三次后用流式细胞仪收集。如图8所示,螺环聚合物只有在M1细胞中体现出75%的双阳率,而在M0和M2细胞中,阳性率十分低,只有0%或1%,十分明显的说明了螺环聚合物SP0.5对M1细胞的特异性选择识别。随后共聚焦显微镜的成像说明了同样的结果,如图9、图10和图11所示,只有在M1细胞中,螺环聚合物呈现出荧光成像螺环聚合物与商业溶酶体染料共定位系数高,说明螺环聚合物SP0.5能特异性识别M1细胞,并且进入细胞后定位在溶酶体中。
[0150] 螺环聚合物特异性识别M1型巨噬细胞机理
[0151] 螺环聚合物对M1型巨噬细胞的特异性选择的机理通过理论计算和实验共同验证。CD80是M1表面特异性蛋白,是区分M0、M2巨噬细胞最直接的判断依据。
[0152] 首先,我们先使用CD80的抗体对M1型巨噬细胞表面的CD80进行“封闭”,然后再用螺环聚合物和“封闭”了CD80的M1型巨噬细胞进行共培养6h。从图12中共聚焦显微镜数据中看出,当“封闭”了M1型巨噬细胞表面的CD80后,螺环聚合物并没有进入M1型巨噬细胞中实现对M1细胞的特异性识别成像。
[0153] 随后我们对CD80和螺环聚合物探针进行了分子对接(Molecular docking)。分子对接是通过受体的特征以及受体和药物分子之间的相互作用方式来进行药物设计的方法。主要用来研究分子间(如配体和受体)相互作用,并预测其结合模式和亲合力的一种理论模拟方法。从图13、图14和图15中我们可以得出以下结论:
[0154] (1)CD80与螺环聚合物之间,能够相互结合;
[0155] (2)CD80‑螺环聚合物体系中,能够与螺环聚合物相互作用的CD80蛋白结合界面上的氨基酸,分为极性氨基酸和疏水性氨基酸。其中,极性氨基酸(K72,H73,D74,K75,K84,K86,K92,S112,R114,K142,D144,T147,E199,D225,H227,S229,E230),形成多处的极性氢键相互作用;
[0156] (3)另外,CD80蛋白上的疏水性氨基酸(L85,V87,W88,P89,L111,T147,F171,P172,Y223,A226,V228)与临近的螺环聚合物形成较好疏水性结合作用;
[0157] (4)在蛋白质与小分子结合能量中,当结合能小于‑10.00kcal/mol的时候,说明蛋白质与小分子之间结合能量较好;CD80‑螺环聚合物之间结合的时候,能够与周围氨基酸形成较好的氢键作用和疏水性相互匹配,最低结合能量为‑15.06kcal/mol。
[0158] 根据实验和计算,验证了螺环聚合物对M1型巨噬细胞可以特异性识别染色的机理。
[0159] 实验例4
[0160] 靶向成像体系的构建
[0161] 本发明进一步利用螺环聚合物对M1型巨噬细胞的特异性识别的特性,建立了基于M1细胞和螺环聚合物的靶向成像体系,并应用于小鼠的靶向成像中。如图16所示,首先我们共孵育螺环聚合物和M1巨噬细胞,得到装载有螺环聚合物(成像功能)的M1型巨噬细胞(靶向功能),命名为SP0.5@M1。构建小鼠的荷瘤模型,通过尾静脉分别注入同等SP0.5剂量的单独SP0.5成像剂和SP0.5@M1靶向成像体系成像剂。24h后安乐死小鼠,并解剖肿瘤和相关内脏在小动物成像仪上进行成像,如图17所示,SP0.5@M1组中肿瘤的成像亮度明显强于单独的SP0.5组,图18中显示,靶向成像组肿瘤的荧光强度是单独成像剂强度的2倍左右。充分体现出靶向成像剂的靶向、成像优势,有望今后在手术导航中实现应用。我们还利用电子投射显微镜对M1细胞和SP0.5@M1细胞进行了微观表征,如图19所示,对于负载了SP0.5的M1型巨噬细胞,细胞微观形貌并没有发生改变,证实了我们SP0.5探针的安全无损性能。
[0162] 其中,单独SP0.5成像剂和SP0.5@M1靶向成像体系成像剂分别参考实施例2和实施例3的方法得到,先得到SP0.5@M1,再依据SP0.5@M1中SP0.5的装载量配制同等SP0.5剂量的6
单独SP0.5成像剂。具体的,SP0.5@M1制备中的部分参数为:M1细胞约2×10个,使用的荧光‑4
探针中SP0.5的浓度为1×10 mol/mL,体积是9mL,共孵育后确定得到的SP0.5@M1中SP0.5的‑4 ‑4
装载量约6.75×10 mol;因而,单独SP0.5成像剂中,SP0.5的剂量同为6.75×10 mol。
[0163] 最后应说明的是:以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案,而非对其限制;尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明,本领域的普通技术人员应当理解:其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改,或者对其中部分或者全部技术特征进行等同替换;而这些修改或者替换,并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。