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一种动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束的制备方法及应用
申请号	CN201810595580.1	申请日	2018-06-11	公开(公告)号	CN108904446B	公开(公告)日	2021-05-11
申请人	中山大学;			发明人	陶军; 帅心涛; 王勇; 夏文豪;
摘要	本发明公开了一种动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束的制备方法及应用。纳米胶束由两嵌段聚合物包含亲水段聚乙二醇和疏水段聚硫化丙烯自组装形成。由于PEG‑PPS胶束能响应斑块的活性氧（ROS）发生解体，可自身消耗病灶部位ROS实现其有效抑制，同时，胶束又作为刺激响应的药物载体，快速释放负载的药物Andro降低病灶部位炎症反应，起到显著增强治疗斑块的效果。这种借助载体本身的氧化响应性实现药物释放产生抗炎作用并同时缓解氧化应激的方法，为动脉粥样硬化提供了一种有前途的创新性治疗策略，应用前景广阔。
权利要求	1.一种动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用，其特征在于，所述动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束由两嵌段聚合物包含亲水段聚乙二醇和疏水段聚硫化丙烯自组装形成纳米胶束，所述聚乙二醇的分子量为1kDa～5kDa，聚硫化丙烯的分子量为2kDa～10kDa，所述纳米胶束直径在150nm以内。 2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述聚乙二醇的分子量为2kDa，聚硫化丙烯的分子量为6kDa。 3.根据权利要求1所述的应用，所述动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束的制备方法包括如下步骤： S1.以PEG‑OH为原料合成磺酸化的PEG； S2.以磺酸化的PEG为原料，在甲醇中与硫代乙酸钾反应合成硫代乙酸化的PEG； S3.以硫代乙酸化的PEG作引发剂，甲醇钠作催化剂，引发硫化丙烯的开环聚合得到 PEG‑PPS。 4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，S1以PEG‑OH为原料合成磺酸化的PEG的具体步骤为将PEG‑OH用无水氯仿溶解后，在0‑5℃条件下，加入DMAP、三乙胺及对甲苯磺酰氯，室温搅拌8‑24h，沉淀在大量乙醚中过滤干燥。 5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述治疗动脉粥样硬化药物由所述动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束负载穿心莲内酯制备而成。 6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述纳米药物直径在150nm以内，可实现血管损伤部位的富集并穿过损伤内皮到达斑块病理区。 7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述纳米药物直径为117.9±23.7nm。 8.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，控制穿心莲内酯与聚合物的投料比1:10以获得最大的载药量及最佳的纳米药物尺寸。
说明书全文	一种动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束的制备方法及应用技术领域 [0001] 本发明涉及纳米医学领域，具体地，涉及一种动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束的制备方法及应用，尤其涉及一种能负载穿心莲内酯的动脉斑块微环境响应的纳米胶束的制备方法及应用。背景技术 [0002] 动脉粥样硬化是一种慢性炎症性疾病，在世界范围内受到广泛的影响，并引起各种严重的并发症，包括高血压、心绞痛和肢体缺血等等。目前可用的治疗策略主要集中在脂质代谢物的调节上而非炎症控制，此外，作为目前常见动脉粥样硬化治疗的他汀类药物，可能会引起如肌病和糖尿病的副反应。因此，动脉粥样硬化的治疗急需寻求新的策略。 [0003] 众所周知，氧化应激参与动脉粥样硬化的发展。一方面，保留在内膜中的低密度脂蛋白（LDL）易于被被活性氧（ROS）氧化成氧化低密度脂蛋白（oxLDL），是动脉粥样硬化斑块形成的关键步骤。所产生的oxLDL可诱导并促进多种趋化因子的表达，并促进单核细胞的募集且最终导致其分化为巨噬细胞。另一方面，ROS可直接导致的内膜受损，推动动脉粥样硬化的进展与恶化。内膜受损直接导致了胞趋化蛋白‑1（MCP‑1）和白细胞介素（IL‑6）等趋化炎性因子的过高表达，进而引起单核细胞和白细胞向损伤部位的迁移，会导致更多的炎性细胞因子的分泌并促进动脉粥样硬化斑块的进展，形成恶性循环。因此，炎症和氧化应激是动脉粥样硬化发病机制的两个重要因素，两者的调节或可为斑块治疗提供新的策略。 [0004] 基于炎症反应在动脉粥样硬化中的关键影响作用，近期已有多种有效抗炎药物被应用研究。穿心莲内酯（Andro）是一种二萜类内酯化合物，可阻断核因子（NF）‑κB通路而具有很强的抗炎活性。然而，受限于水溶性太差，Andro难以在临床上实现应用推广。目前，胶束等纳米给药系统在提高疏水药物的利用率、降低毒副作用并提升治疗效果等方面显示出巨大的潜力。另一方面，纳米药物具有被动靶向的优点，可附着在受损的血管上，跨越功能不全的血管内皮，并保留在动脉粥样硬化斑块上。因此，纳米胶束可作为穿心莲内酯的载体实现动脉斑块的有效治疗。 [0005] 然而，现有技术中针对动脉粥样硬化微环境的纳米胶束比较少见，仅有的几种针对动脉粥样硬化微环境的纳米胶束也存在下述缺陷：第一、无法很好地解决在血液循环中避免药物泄漏及到靶点位置后又能迅速释放药物的问题，第二、纳米胶束仅仅起到载药工具的作用。发明内容 [0006] 本发明为了克服现有技术的上述不足，提供一种动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束，该载药纳米胶束能够响应斑块病理部位特殊刺激而释放药物（如穿心莲内酯），另外，该载药纳米胶束还可以有效诱导动脉粥样硬化斑块的消退，起到辅助治疗的作用。 [0007] 本发明的另一个目的是提供上述动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束的制备方法。 [0008] 本发明的再一个目的是提供上述动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。 [0009] 为了实现上述目的，本发明是通过以下方案予以实现的： [0010] 一种动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束，是由两嵌段聚合物包含亲水段聚乙二醇（PEG）和疏水段聚硫化丙烯（PPS）自组装形成纳米胶束，所述聚乙二醇的分子量为1 kDa ～5 kDa，聚硫化丙烯的分子量为2 kDa～10 kDa。 [0011] 聚硫化丙烯作为胶束的疏水链段，其能在ROS存在时被氧化成亲水的聚砜结构，实现胶束的崩解及药物的释放；同时，引入亲水链段聚乙二醇增加纳米胶束的稳定性及生物相容性。 [0012] 为获得能更好穿过损伤内皮细胞间隙的纳米尺寸（小于150 nm，特别是117.9 ± 23.7 nm），同时又可以高效负载药物（尤其是穿心莲内酯）的纳米胶束，所述嵌段聚合物选用的聚乙二醇的分子量优选为2000 Da，聚硫化丙烯的分子量优选为6000 Da。 [0013] 一种动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束的制备方法，包括以下步骤： [0014] S1.以PEG‑OH为原料合成磺酸化的PEG； [0015] S2.以磺酸化的PEG为原料，在甲醇中与硫代乙酸钾反应合成硫代乙酸化的PEG； [0016] S3.以硫代乙酸化的PEG作引发剂，甲醇钠作催化剂，引发硫化丙烯的开环聚合得到PEG‑PPS嵌段聚合物。 [0017] 作为优选实施方式，S1以PEG‑OH为原料合成磺酸化的PEG的具体步骤为将PEG‑OH用无水氯仿溶解后，在0 ℃条件下，加入DMAP、三乙胺及对甲苯磺酰氯，室温搅拌12 h沉淀在大量乙醚中，过滤干燥。 [0018] 由聚乙二醇‑聚硫化丙烯（PEG‑PPS）自组装负载疏水性抗炎小分子药物穿心莲内酯（Andro）制备而成。 [0019] 本发明要求保护上述动脉斑块微环境响应的载药纳米胶束在制备治疗动脉粥样硬化药物中的应用。 [0020] 一种治疗动脉粥样硬化的药物，由上述载药纳米胶束负载穿心莲内酯制备得到。该药物能够借助纳米胶束载体释药时消耗动脉斑块的ROS，联合穿心莲内酯的抗炎作用，产生增强性动脉粥样硬化治疗效果。 [0021] 作为优选实施方式，所述纳米药物直径在150 nm以内，可实现血管损伤部位的富集并穿过损伤内皮到达斑块病理区。 [0022] 作为优选实施方式，所述纳米药物直径为117.9 ± 23.7 nm。 [0023] 作为优选实施方式，获得嵌段聚合物后，通过超声诱导聚合物的组装并药物，控制穿心莲内酯与聚合物的投料比1:10以获得最大的载药量及最佳的纳米药物尺寸。 [0024] 与现有技术相比，所述纳米药物具备以下有益效果： [0025] 本发明提供了一种动脉斑块微环境响应的纳米胶束，该纳米胶束可有效地避免输送过程中药物的泄露，同时到靶点部位后可响应病灶部位微环境快速释放药物。尤其重要的是，在动脉斑块释药时能引起病灶部位ROS的消耗，联合抗炎药物的治疗起到增强疗效的作用。这种载体本身响应环境刺激而起到增强疗效的作用或为动脉粥样硬化的治疗提供一个新的思路。附图说明 [0026] 图1为嵌段聚合物合成线路图及活性氧（ROS）处理后结构变化。 [0027] 图2A为纳米药物的TEM图；B为经双氧水（0.3%）处理24 h后的纳米药物TEM图；C为纳米药物的粒径分布图；D为负载FDA的纳米胶束经双氧水（0.3%）处理后不同时间的荧光曲线。 [0028] 图3为RAW 264.7细胞对负载FDA纳米胶束不同时间的摄取情况。 [0029] 图4为纳米药物对抑制炎性因子IL‑6和MCP‑1表达的效果评价；表示有显著性差异（P﹤0.05，P﹤0.01，*P﹤0.001）。 [0030] 图5为纳米药物处理RAW 264.7细胞后胞内的氧化水平；上排：Control，LPS和LPS+MC；下排：LPS+Adro和LPS+A‑MC。具体实施方式 [0031] 下面结合说明书附图和具体实施例，进一步阐述本发明。这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下例实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域常规条件或按照制造厂商建议的条件。本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。 [0032] 实施例1 嵌段聚合物的合成 [0033] 聚合物的合成如图1所示。首先，以PEG‑OH为原料合成磺酸化的PEG。具体地，将7.0 g PEG‑OH先用50 mL无水氯仿溶解，然后在0 ℃条件下，加入43 mg DMAP、0.73 mL三乙胺及 1.0 g对甲苯磺酰氯，室温搅拌反应12 h后将反应液沉淀在大量的无水乙醚中，过滤得到固体，真空干燥后得到磺酸化的PEG； [0034] 然后以磺酸化的PEG为原料，在甲醇中与硫代乙酸钾反应合成硫代乙酸化PEG。4.0 g磺酸化的PEG溶解在5 mL的甲醇中，加入12 mL的三乙胺和2.28 g的硫代乙酸钾反应12 h，旋蒸除去甲醇后将固体用氯仿复溶，然后依次用饱和的碳酸氢钠溶液和氯化钠溶液洗涤，分离的有机层经无水硫酸镁干燥后沉淀在无水乙醚中，过滤并干燥得到产物。 [0035] 最后，以硫代乙酸化的PEG作引发剂，甲醇钠作催化剂，引发硫化丙烯的开环聚合得到PEG‑PPS。1.0 g硫代乙酸化的PEG溶解在10 mL四氢呋喃中，加入30 mg的乙醇钠室温搅拌1 h。然后将反应液冷至0 ℃，加入1.95 mL的硫化丙烯， 30 min后移走冷却装置并常温搅拌12 h。随后，在超声的作用下将反应液滴加到100 mL的去离子水中，在水中透析2天除去四氢呋喃后冻干得到终产物。 [0036] 为获得最理想的聚合物嵌段比，分别合成PPS分子量为4000，6000和8000 Da的嵌段聚合物。筛选出6000的嵌段。 [0037] 实施例2 纳米药物的制备及表征 [0038] 取实施例1制备得到的嵌段的聚合物20 mg和2 mg的穿心莲内酯溶于1.5 mL DMSO和0.5 mL氯仿的混合溶剂中，在超声作用下滴加到20 mL水中。旋蒸除去混合溶液的氯仿，然后用14 kDa透析袋在水中透析24 h，超滤浓缩，用水洗涤三次。粒径检测结果显示，胶束的水合直径为117.9 ± 23.7 nm（图2C），电位结果显示，纳米药物为均匀的球形结构，直径为100 nm左右（图2A）。为证明纳米药物具有氧化响应性，我们用0.3%的双氧水处理纳米药物48 h，将处理后的样品制样做TEM检测，发现纳米药物变成了无规的聚集结构（图2B），可归因于胶束结构发生了解体。 [0039] 实施例3 纳米药物氧化敏感释放定性研究 [0040] 为了确认纳米药物中的Andro可响应氧化环境而释放，我们将荧光素二乙酸（FDA）替代Andro负载在纳米胶束中进行了体外模拟释放的荧光检测。如图2D所示，加入0.3%的双氧水后，FDA的荧光随时间的变化而逐渐增强，这是因为FDA从胶束中释放出来而发生的荧光解淬灭。 [0041] 实施例4 纳米药物的细胞摄取 [0042] 我们采用共聚焦实验来评价纳米药物进入细胞的能力。将负载FDA的纳米药物（FDA‑MC）分别与正常的RAW 264.7细胞和LPS诱导的RAW 264.7细胞共培养（LPS诱导后产生类似于动脉斑块的氧化环境），如图3所示，胞内荧光随孵育时间的延长而增强，且LPS诱导组的FDA荧光明显高于未处理组，也显示了氧化微环境触发胶束解体的能力。 [0043] 实施例5 纳米药物对炎性因子的抑制及对ROS的调控 [0044] 我们采用PCR实验评价了经纳米药物治疗后RAW 264.7细胞内IL‑6和MCP‑1在转录水平的表达，如图4所示，LPS组证明，斑块部位的RAW 264.7细胞内IL‑6和MCP‑1表达都会明显的上调，经纳米胶束处理后，该上调会得到明显的抑制，特别是负载Andro的纳米药物（A‑ MC）表现出最好的治疗效果。同样地，该纳米药物也表现出了很好的抑制动脉斑块氧化应激的能力（图5）。