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一株用于制备生物杏香料的蜡样芽孢杆菌及其应用

申请号 CN202410031592.7 申请日 2024-01-09 公开(公告)号 CN117701471A 公开(公告)日 2024-03-15
申请人 河南中烟工业有限责任公司; 发明人 李蕾; 陈芝飞; 王清福; 赵嘉鸣; 王泽宁; 赵志伟; 芦昶彤; 赵永振; 席高磊; 宁一博; 陈浩洋;
摘要 本 发明 公开了一株用于制备 生物 杏香料的蜡样芽孢杆菌及其应用,该蜡样芽孢杆菌分类命名为(Bacillus cereus),菌株名为LY37,保藏于中国 微生物 菌种保藏管理委员会普通生物中心,保藏号为CGMCC No.28451。该菌可作为 发酵 菌株在生物杏香料的发酵中发挥作用。本 申请 的蜡样芽孢杆菌用于发酵杏果香料可以增加香料中的γ‑丁内酯、β‑二氢紫罗兰 酮 和植酮等 香味 物质含量,并能生成异戊醇、苯 乙醇 、丁香酚、异戊酸甲酯等新的香味物质,能明显提高杏果香料中的果香、甜香和花香。
权利要求

1.一种蜡样芽孢杆菌,其特征在于,所述蜡样芽孢杆菌分类命名为(Bacillus cereus),菌株名为LY37,保藏于中国生物菌种保藏管理委员会普通生物中心,保藏号为CGMCC No.28451。
2.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌,其特征在于,所述蜡样芽孢杆菌LY37在LB固体培养基平板上表现为菌落呈不透明灰白色,表明呈白色毛玻璃状,边缘不光滑,菌落比较干燥。
3.根据权利要求1所述的蜡样芽孢杆菌,其特征在于,所述蜡样芽孢杆菌的培养方法为:将蜡样芽孢杆菌液按1%的接种量,接种至LB液体培养基中,培养条件:温度30℃,转速
150rpm,培养时间12h。
4.根据权利要求3所述的蜡样芽孢杆菌,其特征在于,所述LB液体培养基配方为:按每升计,蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L,酵母粉5g/L,LB固体培养基配方为:蛋白胨10g/L,氯化钠
10g/L,酵母粉5g/L,琼脂20g/L。
5.根据权利要求1‑4任一所述的蜡样芽孢杆菌在制备生物杏香料中的应用。
6.一种微生物菌制剂,其特征在于,包含权利要求1‑4任一所述的蜡样芽孢杆菌。
7.根据权利要求6所述的微生物菌制剂的制备方法,其特征在于,包括以下步骤:
(1)将蜡样芽孢杆菌活化培养,得到蜡样芽孢杆菌活化液;菌株活化条件为:30℃、
150r/min条件下震荡培养12h;
(2)将步骤(1)中所得的活化液稀释涂布到LB固体培养基,于30℃恒温培养箱中培养2‑
3d,得到菌株单菌落;
(3)挑取步骤(2)所得的单菌落,接种到LB液体培养基,于30℃、150r/min条件下震荡培养至OD600nm值为0.8~1.0,得到种子液;
(4)将步骤(3)中所得的种子液在4℃、10000r/min条件下进行高速离心8min,弃上清液,等量无菌复溶,重复离心,等量无菌水复溶后得到微生物菌制剂。
8.根据权利要求7所述的微生物菌制剂在制备生物杏香料中的应用。
9.根据权利要求8所述的应用,其特征在于,所述应用为:
8 8
S1、将微生物菌制剂按处理菌量为1.85×10 ‑2.83×10 cfu/g将悬浮液接种到灭菌后的树上干杏杏汁中,在30℃、150rpm的条件下的摇床中发酵36h;
S2、将步骤S1中发酵好的杏汁加入75%的乙醇,加热回流提取2h,真空抽滤,滤渣中继续加入75%乙醇,重复上述操作2次,合并3次滤液,静置24h,取上层清液减压浓缩得到生物杏香料浸膏。
10.根据权利要求9所述的生物杏香料浸膏在提升杏果香料的果香、甜香和花香中的应用,其特征在于,所述生物杏香料浸膏能增加香料中现有的香味物质含量,并能生成新的香味物质。

说明书全文

一株用于制备生物杏香料的蜡样芽孢杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及微生物技术领域,特别涉及一株用于制备生物杏香料的蜡样芽孢杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 目前世界上香精、香料的生产主要是人工合成和天然动植物中提取。但人工合成香料是以化学合成为前提,产物的安全性很难为大众所接受;而天然香料由于提取工艺的落后,初步提取的香料难以达到应用标准,提取效率较低,对环境资源造成浪费。
[0003] 近年来,包括微生物在内的生物技术逐渐被应用于香精香料的研发,当微生物添加到天然植物提取物中,一方面会增加天然香料本身的香气成分,另一方面微生物发酵过程中还会产生一些新的香味物质,从而丰富天然香料的香气类型,提高香气浓度。

发明内容

[0004] 本发明所要解决的技术问题是提供一株用于制备生物杏香料的蜡样芽孢杆菌及其应用,该蜡样芽孢杆菌可作为发酵菌株在杏果香料发酵中发挥作用,提高杏果香料的果香、甜香和花香。
[0005] 本发明所要解决的技术问题是通过以下技术方案来实现的:
[0006] 本申请的第一目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌,所述蜡样芽孢杆菌分类命名为(Bacillus cereus),菌株名为LY37,保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心,保藏号为CGMCC No.28451。
[0007] 优选地,所述蜡样芽孢杆菌LY37在LB固体培养基平板上表现为菌落呈不透明灰白色,表明呈白色毛玻璃状,边缘不光滑,菌落比较干燥。
[0008] 优选地,所述蜡样芽孢杆菌的培养方法为:将蜡样芽孢杆菌液按1%的接种量,接种至LB液体培养基中,培养条件:温度30℃,转速150rpm,培养时间12h。
[0009] 优选地,所述LB液体培养基配方为:按每升计,蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L,酵母粉5g/L,LB固体培养基配方为:蛋白胨10g/L,氯化钠10g/L,酵母粉5g/L,琼脂20g/L。
[0010] 本申请的第二目的在于提供一种蜡样芽孢杆菌在制备生物杏香料中的应用。
[0011] 本申请的第三目的在于提供一种微生物菌制剂,包含上述的蜡样芽孢杆菌。
[0012] 本申请的第四目的在于提供一种微生物菌制剂的制备方法,包括以下步骤:
[0013] (1)将蜡样芽孢杆菌活化培养,得到蜡样芽孢杆菌活化液;菌株活化条件为:30℃、150r/min条件下震荡培养12h;
[0014] (2)将步骤(1)中所得的活化液稀释涂布到LB固体培养基,于30℃恒温培养箱中培养2‑3d,得到菌株单菌落;
[0015] (3)挑取步骤(2)所得的单菌落,接种到LB液体培养基,于30℃、150r/min条件下震荡培养至OD600nm值为0.8~1.0,得到种子液;
[0016] (4)将步骤(3)中所得的种子液在4℃、10000r/min条件下进行高速离心8min,弃上清液,等量无菌复溶,重复离心,等量无菌水复溶后得到微生物菌制剂。
[0017] 本申请的第五目的在于提供一种微生物菌制剂在制备生物杏香料中的应用。
[0018] 优选地,所述应用为:
[0019] S1、将微生物菌制剂按处理菌量为1.85×108‑2.83×108cfu/g将悬浮液接种到灭菌后的树上干杏杏汁中,在30℃、150rpm的条件下的摇床中发酵36h;
[0020] S2、将步骤S1中发酵好的杏汁加入75%的乙醇,加热回流提取2h,真空抽滤,滤渣中继续加入75%乙醇,重复上述操作2次,合并3次滤液,静置24h,取上层清液减压浓缩得到生物杏香料浸膏。
[0021] 本申请的第六目的在于提供一种生物杏香料浸膏在提升杏果香料的果香、甜香和花香中的应用。
[0022] 优选地,所述生物杏香料浸膏能增加香料中现有的香味物质含量,并能生成新的香味物质。
[0023] 本发明上述技术方案,具有如下有益效果:
[0024] 本申请利用杏果源微生物发酵杏果香料,通过微生物代谢作用,提高杏果香料的香气,感官评价及GC‑MS分析结果都显示较好,通过感官评价后发现,甜香和果香增加;GC‑MS分析香味成分后发现γ‑丁内酯、β‑二氢紫罗兰和植酮等香味物质含量提高,并生成了异戊醇、苯乙醇、丁香酚、异戊酸甲酯等新的香味物质。
[0025] 该蜡样芽孢杆菌可作为发酵菌株在杏果香料发酵中发挥作用,提高杏果香料的果香、甜香和花香。附图说明
[0026] 图1为本申请的蜡样芽孢杆菌的平板图。
[0027] 图2为本申请的蜡样芽孢杆菌的电镜图。
[0028] 图3为本申请的蜡样芽孢杆菌的系统进化树分析图。
[0029] 图4为本申请的蜡样芽孢杆菌处理前后杏汁感官评价雷达图。

具体实施方式

[0030] 现在将详细描述本发明的各种示例性实施例。应注意到:除非另外具体说明,否则在这些实施例中阐述的部件和步骤的相对布置、数字表达式和数值不限制本发明的范围。
[0031] 本申请的蜡样芽孢杆菌(Bacillus cereus)LY37目前保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通生物中心(CGMCC),地址:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,保藏时间为2023年9月13日,保藏号为CGMCC No.28451。
[0032] 实施例1
[0033] 在无菌条件下,在锥形瓶中加入10g杏果园土壤和90mL无菌水,于30℃、150r/min条件下培养4h取出,然后按体积分数10%接种量接入到100mL LB培养基中富集培养48h。
[0034] 将富集液进行梯度稀释,取梯度稀释中的10‑4、10‑6、10‑8三个浓度的稀释液均匀涂布在固体LB培养基上,在30℃的条件下培养1‑2d至长出单菌落,挑取单菌落采用划线法进行纯化后编号保存。
[0035] 将保存的菌株在LB培养基中富集活化后接种入杏汁中,在30℃、150r/min条件下培养36h,发酵结束后进行初步感官评价,将有明显香气改变的菌株标记并保存编号为LY37。
[0036] 将筛选得到的LY37菌株(于2023年3月在杏果园土壤中筛选获得)涂布到LB固体培养基上,于30℃恒温培养箱中培养24h,观察其菌落形态,结果如图1。如图1所示,LY37菌株在LB固体培养基平板上表现为菌落呈不透明灰白色,表明呈白色毛玻璃状,边缘不光滑,菌落比较干燥;使用冷冻型高分辨率场发射扫描电镜观察菌株形态,结果如图2所示。
[0037] 使用DNA抽提试剂盒提取LY37菌株基因组DNA,PCR扩增体系25μL:模板DNA(20‑50ng/μL)1μL,引物7F和1540R(10μmol/L)各0.5μL,dNTP混合液(2.5mmol/L)1μL,Taq酶0.2μL,10×Buffer2.5μL,超纯水19.8μL。
[0038] PCR扩增程序:94℃4min;94℃45s,55℃45s,72℃1min,30个循环;72℃30min。
[0039] 将PCR产物送至上海生物工程有限公司进行16S rDNA测序。将测序结果在NCBIGeneBank中利用BLAST软件进行序列比对,依据同源序列相似性对目标菌株进行菌种鉴定。使用MEGA 11软件依据16S rDNA测序结果,采Neighbor‑joining算法构建系统进化树。结果如图3所示。LY37菌株的16S rDNA与NR 074540.1Bacillus cereus ATCC 14579的相似度最高,命名为Bacillus cereus。
[0040] 实施例2
[0041] (1)菌制剂的制备:
[0042] 将蜡样芽孢杆菌活化培养,得到活化液,将活化液按照一定的梯度稀释后涂布到LB固体培养基,于30℃恒温培养箱中培养2‑3d,挑取平板上的单菌落,接种到LB液体培养基,于30℃,150r/min恒温摇床培养12h,获得种子液,将种子液按1%接种量接种到LB液体培养基中,于30℃,150r/min恒温摇床培养至OD600nm值为0.8~1.0,将菌液于4℃、10000r/min离心10min,弃上清液,等量无菌水复溶,重复离心,等量无菌水复溶,即得菌制剂。
[0043] (2)杏果发酵:
[0044] 按照处理菌量为1.85×108‑2.78×108cfu/g将菌制剂按1%接种量接种在灭菌后的杏汁中,在发酵温度为30℃、转速为150rpm的条件下发酵36h,用等量的无菌水按照上述方法处理等量杏汁,制备对照杏汁样品。
[0045] (3)感官评价:
[0046] 对生物杏香料按照GB/T 14454.2‑2008《香料香气评定法》进行感官评价。从果香、甜香、花香3个方面进行嗅香评价,每个方面最高分5分,最低分0分,嗅其挥发性香气,分辨其香气特色,评定其类型、格及典型性的强弱程度。
[0047] 结果见图4,生物杏香料的花香、果香以及甜香的效果都明显优于对照,尤其是花香,效果明显。
[0048] (4)中性香味成分分析:
[0049] 采取涡旋冷萃法提取杏汁发酵前后的香味成分。按照最优发酵条件处理后,量取15mL发酵液样品加入等量二氯甲烷溶液,涡旋振荡萃取10min后收集二氯甲烷萃取液,重复三次后合并二氯甲烷萃取液并加入无水硫酸钠干燥过夜,加入50μL  2,6‑二氯甲苯(0.6426mg/mL)为内标,常压浓缩至1mL后通过GC‑MS进行化学成分分析。
[0050] 色谱条件:
[0051] 色谱柱:DB‑5MS色谱柱(60m x 250μm x 0.25μm);
[0052] 进样口温度:280℃;
[0053] 分流比:3:1;
[0054] 分流流量:3.0mL/min;
[0055] 载气:He,流速1.0m L/min:
[0056] 升温程序:初始温度50℃(保持3min),然后以2℃/min的速率升温至130℃(保持3min),然后以5℃/min的速率升温至180℃(保持2min),最后以3℃/min的速率升温至280℃(保持5min)。
[0057] 质谱条件:电离方式为电子轰击(EI),电子能量70eV;离子源温度230℃;四极杆温度150℃;溶剂延迟7min;全扫描检测,扫描质量范围35~500amu。
[0058] 结果见表1。表1为该蜡样芽孢杆菌处理前后杏汁香气物质对比结果。
[0059] 表1
[0060]
[0061] 实施例3
[0062] 将蜡样芽孢杆菌涂布到LB固体培养基上,于30℃恒温培养箱中培养24h,观察其菌落形态;使用冷冻型高分辨率场发射扫描电镜观察菌株形态。
[0063] 使用DNA抽提试剂盒提取目标菌株基因组DNA,PCR扩增反应使用的引物(27F1492R)由上海生物工程有限公司合成;对目标菌株进行16S rDNA测序,测序由上海生物工程有限公司完成。将获得的基因序列在NCBIGeneBank中利用BLAST软件进行序列比对,依据同源序列相似性对目标菌株进行菌种鉴定。使用MEGA 11软件依据16S rDNA测序结果,采用Neighbor‑joining算法构建系统进化树。
[0064] 将蜡样芽孢杆菌斜面保存,寄送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心进行保藏。
[0065] 虽然本发明已以实施例公开如上,然其并非用于限定本发明,任何本领域技术人员,在不脱离本发明的精神和范围内,均可作各种不同的选择和修改,因此本发明的保护范围由权利要求书及其等同形式所限定。