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鉴定兴国灰鹅品种的引物组合和方法
申请号	CN202410229504.4	申请日	2024-02-29	公开(公告)号	CN117802248A	公开(公告)日	2024-04-02
申请人	江西科技师范大学;			发明人	晏学明; 陈浩; 欧阳婧; 黄宇轩; 汤鸿波; 缪俊杰;
摘要	本发明涉及生物技术领域，具体涉及鉴定兴国灰鹅品种的引物组合和方法。在本发明中，XG1P位点到XG8P位点为影响兴国灰鹅表型的8个SNP位点，兴国灰鹅中8个SNP位点XG1P‑XG8P的基因型依次为CC、AA、CC、GG、AA、TT、TT和AA。因此，所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合可以用于鉴定鹅的品种是否为兴国灰鹅。
权利要求	1.一种鉴定兴国灰鹅品种的引物组合，其特征在于，所述引物组合扩增XG1P位点到XG8P位点中的任意5‑8种： XG1P位于XG1_CHR 1上第21561740位，该位点为C或T多态； XG2P位于XG1_CHR 1上第202470502位，该位点为A或T多态； XG3P位于XG1_CHR 7上第36978122位，该位点为C或T多态； XG4P位于XG1_CHR 14上第17426588位，该位点为G或A多态； XG5P位于XG1_CHR 23上第592968位，该位点为A或G多态； XG6P位于XG1_CHR 39上第14520891位，该位点为T或C多态； XG7P位于XG1_CHR 39上第50301363位，该位点为T或A多态； XG8P位于XG1_CHR 39上第79390292位，该位点为A或G多态。 2.根据权利要求1所述的鉴定兴国灰鹅品种的引物组合，其特征在于，所述引物组合扩增XG1P位点到XG8P位点中的任意6种。 3.根据权利要求1所述的鉴定兴国灰鹅品种的引物组合，其特征在于，所述引物组合扩增XG1P位点到XG8P位点中的任意7种。 4.根据权利要求1所述的鉴定兴国灰鹅品种的引物组合，其特征在于，所述引物组合扩增XG1P位点到XG8P位点中的8种。 5.根据权利要求1所述的鉴定兴国灰鹅品种的引物组合，其特征在于，所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合包括以下引物对中的任意5‑8种：用于扩增XG1P位点的XG1F和XG1R引物对，其中XG1F的引物序列为 GCTCTTTTCCGCATGGTTGA，XG1R的引物序列为GGGTGCTTCCATATGACCTCC；用于扩增XG2P位点的XG2F和XG2R引物对，其中XG2F的引物序列为 GGACATCTTCTGGCCTGACC，XG2R的引物序列为GTGGGTCCACGATCTCCAAG；用于扩增XG3P位点的XG3F和XG3R引物对，其中XG3F的引物序列为 CTGTGGATCCTCCGTGCTTC，XG3R的引物序列为ACCGGTGGAAATGGGAGTTT；用于扩增XG4P位点的XG4F和XG4R引物对，其中XG4F的引物序列为 TGAACGTGAAGTGGTTCGCT，XG4R的引物序列为CCATTTCTGGACCTCTCCCG；用于扩增XG5P位点的XG5F和XG5R引物对，其中XG5F的引物序列为 TTTGGCCCTTGTCACCCAAA，XG5R的引物序列为AGCAGACAAAAGGGCTGCTT；用于扩增XG6P位点的XG6F和XG6R引物对，其中XG6F的引物序列为 ATTTGTGCATTGGCAGAGGC，XG6R的引物序列为CTCACCCCTGTTCTTTGGCT；用于扩增XG7P位点的XG7F和XG7R引物对，其中XG7F的引物序列为 GTACGATGCAGCCAGAAGGAT，XG7R的引物序列为ACCTTACCACAGACTCTCCCA；用于扩增XG8P位点的XG8F和XG8R引物对，其中XG8F的引物序列为 TGTGCCAACAATTCATCCC，XG8R的引物序列为CGGATGAGGATTTTGCACCCA。 6.根据权利要求1所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合在兴国灰鹅品种鉴定中的应用。 7.一种兴国灰鹅品种的鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤： (1)提取待测鹅基因组总DNA； (2)根据所选SNP位点组合，利用权利要求1所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合分别进行PCR扩增； (3)将PCR扩增产物测序后，判断基因型； (4)根据基因型结果，判断待测鹅是否属于兴国灰鹅品种，如果所选SNP位点组合对应的基因型中有一个不符合兴国灰鹅对应的基因型，则判定待测鹅不属于兴国灰鹅；如果所选SNP位点组合对应的基因型全部符合兴国灰鹅对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定待测鹅属于兴国灰鹅的概率。 8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述步骤(1)中待测鹅的基因组DNA由待测鹅个体翅静脉采血得到。 9.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，用酚‑氯仿法提取待测鹅基因组总DNA。 10.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，所述贝叶斯定理的计算公式如下：其中，P表示待测鹅属于兴国灰鹅的概率；Pi表示SNP位点组合中第i个SNP位点中其它品种对应基因型的频率，i为1‑8的整数。
说明书全文	鉴定兴国灰鹅品种的引物组合和方法技术领域 [0001] 本发明涉及生物技术领域，具体涉及鉴定兴国灰鹅品种的引物组合和方法。背景技术 [0002] 兴国灰鹅全身覆盖灰色羽毛，颈前及腹下部为灰白色，喙为青色，掌为黄色（青），是我国优良灰羽肉用型品种。 [0003] 目前市场上鉴别兴国灰鹅主要依靠主观性极强的形态学方法，而且由于兴国灰鹅自然群体中公鹅性体型大，叫声洪亮，成熟后额前肉瘤突起。母鹅体型不及公鹅，后腹部较为发达，叫声低沉又清亮。使得兴国灰鹅和许多其他地方品种极为相似，鉴定错误率大大增高，尤其是在鉴定兴国灰鹅与其他地方鹅品种的杂种后代时，做出正确的分类与鉴定变得更加困难。 [0004] 单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphism，SNP) 主要是指在基因组水平上由单个核苷酸的变异所引起的DNA序列多态性，是一种二态的标记，具有位点丰富、分布广泛、遗传稳定性高、具有代表性、检测便捷快速等特点。SNP标记，利用个体基因组DNA中特有的品种差异性较大的SNP位点，通过不同位点组合的基因型进行品种鉴定，鉴定结果更加客观、准确。因此，基于SNP开发一种能够准确有效鉴定兴国灰鹅品种的产品及方法变得更为急迫。发明内容 [0005] 基于此，本发明提供鉴定兴国灰鹅品种的引物组合和方法，至少解决现有技术中的一个问题。 [0006] 第一方面，本发明提供一种鉴定兴国灰鹅品种的引物组合，所述引物组合可以扩增XG1P位点到XG8P位点中的任意5‑8种：XG1P位于XG1_CHR 1上第21561740位，该位点为C或T多态； XG2P位于XG1_CHR 1上第202470502位，该位点为A或T多态； XG3P位于XG1_CHR 7上第36978122位，该位点为C或T多态； XG4P位于XG1_CHR 14上第17426588位，该位点为G或A多态； XG5P位于XG1_CHR 23上第592968位，该位点为A或G多态； XG6P位于XG1_CHR 39上第14520891位，该位点为T或C多态； XG7P位于XG1_CHR 39上第50301363位，该位点为T或A多态； XG8P位于XG1_CHR 39上第79390292位，该位点为A或G多态。 [0007] 在本发明中，XG1P位点到XG8P位点为影响兴国灰鹅表型的8个SNP位点，兴国灰鹅中8个SNP位点XG1P‑XG8P的基因型依次为CC、AA、CC、GG、AA、TT、TT和AA。因此，所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合可以用于鉴定鹅的品种是否为兴国灰鹅。 [0008] 在一些优选的实施方式中，所述引物组合可以扩增XG1P位点到XG8P位点中的任意6种。 [0009] 在一些优选的实施方式中，所述引物组合可以扩增XG1P位点到XG8P位点中的任意7种。 [0010] 在一些优选的实施方式中，所述引物组合可以扩增XG1P位点到XG8P位点中的任意8种。 [0011] 在一些优选的实施方式中，所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合包括以下引物对中的任意5‑8种：用于扩增XG1P位点的XG1F和XG1R引物对，其中XG1F的引物序列为 GCTCTTTTCCGCATGGTTGA（SEQ ID No. 1），XG1R的引物序列为GGGTGCTTCCATATGACCTCC（SEQ ID No. 2）；用于扩增XG2P位点的XG2F和XG2R引物对，其中XG2F的引物序列为 GGACATCTTCTGGCCTGACC（SEQ ID No. 3），XG2R的引物序列为GTGGGTCCACGATCTCCAAG（SEQ ID No. 4）；用于扩增XG3P位点的XG3F和XG3R引物对，其中XG3F的引物序列为 CTGTGGATCCTCCGTGCTTC（SEQ ID No. 5），XG3R的引物序列为ACCGGTGGAAATGGGAGTTT（SEQ ID No. 6）；用于扩增XG4P位点的XG4F和XG4R引物对，其中XG4F的引物序列为 TGAACGTGAAGTGGTTCGCT（SEQ ID No. 7），XG4R的引物序列为CCATTTCTGGACCTCTCCCG（SEQ ID No. 8）；用于扩增XG5P位点的XG5F和XG5R引物对，其中XG5F的引物序列为 TTTGGCCCTTGTCACCCAAA（SEQ ID No. 9），XG5R的引物序列为AGCAGACAAAAGGGCTGCTT（SEQ ID No. 10）；用于扩增XG6P位点的XG6F和XG6R引物对，其中XG6F的引物序列为 ATTTGTGCATTGGCAGAGGC（SEQ ID No. 11），XG6R的引物序列为CTCACCCCTGTTCTTTGGCT（SEQ ID No. 12）；用于扩增XG7P位点的XG7F和XG7R引物对，其中XG7F的引物序列为 GTACGATGCAGCCAGAAGGAT（SEQ ID No. 13），XG7R的引物序列为ACCTTACCACAGACTCTCCCA（SEQ ID No. 14）；用于扩增XG8P位点的XG8F和XG8R引物对，其中XG8F的引物序列为 TGTGCCAACAATTCATCCC（SEQ ID No. 15），XG8R的引物序列为CGGATGAGGATTTTGCACCCA（SEQ ID No. 16）。 [0012] 第二方面，本发明提供所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合在兴国灰鹅品种鉴定中的应用。 [0013] 第三方面，本发明提供一种兴国灰鹅品种的鉴定方法，其包括以下步骤：(1)提取待测鹅基因组总DNA； (2)根据所选SNP位点组合，利用所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合分别进行PCR 扩增； (3)将PCR扩增产物测序后，判断基因型； (4)根据基因型结果，判断待测鹅是否属于兴国灰鹅品种，如果所选SNP位点组合对应的基因型中有一个不符合兴国灰鹅对应的基因型，则判定待测鹅不属于兴国灰鹅；如果所选SNP位点组合对应的基因型全部符合兴国灰鹅对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定待测鹅属于兴国灰鹅的概率。 [0014] 在一些优选的实施方式中，所述步骤(1)中待测鹅的基因组DNA由待测鹅个体翅静脉采血得到。 [0015] 在一些优选的实施方式中，用酚‑氯仿法提取待测鹅基因组总DNA。 [0016] 在一些优选的实施方式中，所述贝叶斯定理的计算公式如下：其中，P表示待测鹅属于兴国灰鹅的概率；Pi表示SNP位点组合中第i个SNP位点中其它品种对应基因型的频率，i为1‑8的整数。 [0017] 由于采用了以上技术方案，本发明的实施例至少具有以下有益效果：根据贝叶斯定理，任意1个SNP位点基因型判定为兴国灰鹅的概率最低64.67%，最高71.36%；任意2个SNP位点联合基因型判定为兴国灰鹅的概率达到77.48%以上；任意3个SNP位点联合基因型判定为兴国灰鹅的概率达到87.12%以上；任意4个SNP位点联合基因型判定为兴国灰鹅的概率达到93.63%以上；任意5个SNP位点联合基因型判定为兴国灰鹅的概率达到97.15%以上；任意6个SNP位点的联合基因型判定为兴国灰鹅的概率为达到98.81%以上。当任意6个以上SNP位点的联合基因型判定为兴国灰鹅的概率均大于99%。任意一个SNP位点基因型排除兴国灰鹅的概率即达到100%。因此，只要有一个SNP位点基因型不符合兴国灰鹅相应的基因型，即可完全排除该个体属于兴国灰鹅；任选4个SNP位点组合，准确鉴别兴国灰鹅的概率即可达到93%以上。这种方法操作简便，准确性高。附图说明 [0018] 图1为兴国灰鹅参考基因组的景观图。其中，I、染色体编号；II、100kb滑动窗口中的GC密度；III、重复密度；IV、正链的基因密度（+）；V、负链基因密度（‑）；VI、兴国灰鹅染色体中的同源关系。 [0019] 图2为本发明实施例中XG1P位点的基因型频率柱状图。 [0020] 图3为本发明实施例中XG2P位点的基因型频率柱状图。 [0021] 图4为本发明实施例中XG3P位点的基因型频率柱状图。 [0022] 图5为本发明实施例中XG4P位点的基因型频率柱状图。 [0023] 图6为本发明实施例中XG5P位点的基因型频率柱状图。 [0024] 图7为本发明实施例中XG6P位点的基因型频率柱状图。 [0025] 图8为本发明实施例中XG7P位点的基因型频率柱状图。 [0026] 图9为本发明实施例中XG8P位点的基因型频率柱状图。具体实施方式 [0027] 以下将对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整的描述，以充分地阐述本发明的目的、方案和效果。 [0028] 图1为兴国灰鹅参考基因组（DOI: 10.1038/s42003‑022‑04125‑x）的景观图，可以利用基因组DNA中部分SNP位点，通过不同位点组合的基因型进行品种鉴定。 [0029] 在本发明实施例中，影响兴国灰鹅表型的8个SNP位点分别为表1中的XG1P位点到XG8P位点。 [0030] 表1 影响兴国灰鹅表型的8个SNP位点以上SNP位点的筛选方法为：首先确定兴国灰鹅、朗德鹅、丰城灰鹅、长乐灰鹅和狮头鹅等外观相似并且在市场上流通较广的地方鹅品种，将其分为兴国灰鹅和其他鹅两组；分别计算每个SNP位点的等位基因频率，再将两组结果进行对比，筛选出在兴国灰鹅中频率为0或1并且与其它鹅差异极大的SNP位点。 [0031] 据此设计鉴定兴国灰鹅品种的引物组合，所述引物组合包括表2中引物对中的任意1‑8种：表2 鉴定兴国灰鹅品种的引物组合将所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合用于鉴定兴国灰鹅品种，鉴定方法包括以下步骤： (1)提取待测鹅基因组总DNA； (2)根据所选SNP位点组合，利用所述鉴定兴国灰鹅品种的引物组合分别进行PCR 扩增； (3)将PCR扩增产物测序后，判断基因型； (4)根据基因型结果，判断待测鹅是否属于兴国灰鹅品种，如果所选SNP位点组合对应的基因型中有一个不符合兴国灰鹅对应的基因型，则判定待测鹅不属于兴国灰鹅；如果所选SNP位点组合对应的基因型全部符合兴国灰鹅对应的基因型，则根据贝叶斯定理判定待测鹅属于兴国灰鹅的概率。 [0032] 在本发明实施例的鉴定方法中，优选从待测鹅的翅静脉采血获得基因组DNA，本发明实施例对基因组DNA的提取方法没有特殊限定，采用本领域常规提取方法即可。优选地，在本发明实施例中，用酚‑氯仿法提取基因组DNA。 [0033] 本发明实施例的鉴定方法中，采用XG1P‑XG8P中的一个位点或者几个位点进行兴国灰鹅品种的鉴定，并采用对应的上下游引物进行PCR扩增。本发明实施例对PCR扩增方法没有特殊限定，采用本领域常规PCR扩增方法即可。 [0034] 优选的，所述SNP位点在兴国灰鹅及其它品种中的基因型和基因频率如表3所示。 [0035] 表3 8个SNP位点在兴国灰鹅及其它品种中的基因型和基因频率其中，其他品种的基因型频率是指，以朗德鹅、丰城灰鹅、长乐灰鹅和狮头鹅为一组，检测本组的基因型频率。 [0036] 图2‑图9分别为XG1P‑XG8P位点的基因型频率柱状图，反映了特定基因型属于兴国灰鹅或其他鹅的频率。 [0037] 例如，选择XG1P、XG2P、XG3P、XG4P四个SNP位点，如果联合基因型为CC AA CC GG，则该个体属于兴国灰鹅的概率为P=1/(1+0.432×0.4014×0.4014×0.4097)=0.9723。 [0038] 实施例1在本实施例中，通过商业途径随机选购兴国灰鹅25只、朗德鹅25只、丰城灰鹅25 只、长乐灰鹅26只和狮头鹅25只，翅静脉采血，按照以下步骤鉴定鹅品种：（1）提取总DNA 首先采用酚‑氯仿法提取基因组DNA，具体操作如下： ①于1.5 mL的灭菌离心管上标记好样品编号，吸取20 μL对应编号的家鹅抗凝全血置于相应的离心管中，加入600 μL DNA提取液和10 μL蛋白酶K，用封口膜将离心管口封闭后轻微振荡混匀，置于摇床(60℃，180 转/分)裂解 30 分钟；将充分消化后的离心管从摇床中取出，离心 5 分钟(12000 转/分)，使未消化的血块沉淀； ②用枪头小心吸出上清，加入1/10 体积(约 55 μL)的3 mol/L醋酸钠(pH=5.2)，上下颠倒摇匀至不分层，4℃静置10 min，再加入300 mL苯酚‑氯仿‑异戊醇(25:24:1)，剧烈震荡摇匀至不分层，然后4℃静置10 min，12000 r/min离心10 min； ③吸取上层DNA上清液于新的灭菌1.5 mL离心管，然后向DNA上清液中加入1 mL ‑ 20℃预冷的无水乙醇，轻轻混匀使DNA沉淀，然后用干净的枪头将DNA挑出； ④挑出沉淀的DNA后，向其中加入500 μL ‑20℃预冷的75％乙醇，反复吹打洗涤DNA，倒出乙醇，重复该步骤2‑3次，最后将离心管中多余的75％乙醇用黄枪头吸干； ⑤将DNA置于通风处风干约两个小时，待风干后向离心管内加入200 μL TE 溶液溶解稀释；（2）PCR扩增提取DNA后，根据下表中4个SNP位点的引物进行PCR扩增； PCR体系(20μL)为：DNA模板2μL，正反向引物各1.0μL(10ng/μL)，天根PCR 试剂盒中 2×PCR试剂10μL，其余用超纯水补足； PCR程序为：首先94℃变性5min，然后94℃30s、55℃退火30s、72℃延伸30s，共35个循环，最后72℃后延伸10min，4℃保存；PCR仪器为美国伯乐T100梯度PCR仪；（3）测序与分析扩增产物送至生工生物工程(上海)股份有限公司对序列进行多态性检测和基因型判定。 [0039] 根据测序结果，4个位点联合基因型为CCGGAATT的25个个体判定为兴国灰鹅的概率为99.68％，因此25个个体全部鉴定为兴国灰鹅，鉴定准确率为100％。其余个体均不完全符合CCGGAATT基因型，因此判定为非兴国灰鹅。 [0040] 以上所述，只是本发明的较佳实施例而已，本发明并不局限于上述实施方式，只要其以相同或等同的手段达到本发明的技术效果，都应属于本发明的保护范围。在本发明的保护范围内，其技术方案和/或实施方式可以有各种不同的修改和变化。