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一种牛源无乳链球菌的PCR特异性引物和可视化检测方法
申请号	CN202311799262.4	申请日	2023-12-26	公开(公告)号	CN117802256A	公开(公告)日	2024-04-02
申请人	新疆天澳牧业有限公司;			发明人	刘让; 胡刚; 王军; 孙凤霞; 魏勇; 彭夏雨; 剡文亮; 邵伟; 苏玉; 李智星;
摘要	本发明属于食品安全检测领域，具体公开了一种牛源无乳链球菌的PCR特异性引物和可视化检测方法，针对无乳链球菌的靶基因ef‑tu设计特异性引物，分别对上下游引物进行修饰，赋予其特异性识别和信号输出双重功能；PCR扩增产物利用抗原抗体反应偶联金标抗体探针，进一步借助生物素‑链霉亲和素的特异性识别作用实现可视化检测，同时利用生物素‑链霉亲和素信号放大系统显著提高常规试纸条检测方法的灵敏度，实现对无乳链球菌的高灵敏检测；与PCR‑凝胶电泳法相比，本发明方法同时还具有简单、快速、结果容易判读等特点。
权利要求	1.一种牛源无乳链球菌的PCR特异性引物，其特征在于：所述特异性引物为无乳链球菌ef‑tu基因的特异性修饰引物，其序列为：上游引物序列为：5’‑ACCACGAAGAAGAACACC‑3’；下游引物序列为：5’‑GACCAATGCCACAAACTC‑3’。 2.根据权利要求1所述的牛源无乳链球菌的PCR特异性引物，其特征在于：所述上游引物的5’端修饰地高辛，下游引物的5’端修饰生物素。 3.一种牛源无乳链球菌的可视化快速检测方法，其特征在于，包括以步骤： S1、将25mL 0.01％的HAuCl4在磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入0.75mL的1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色变化，待溶液颜色稳定后继续加热5min，得到金纳米粒子溶液，避光保存于4℃备用； S2、取步骤S1获得的1mL金粒子溶液加入适量的0.1mol/L K2CO3溶液调节pH为8，再加入 3.5uL的1mg/mL抗地高辛抗体混合均匀，在室温下孵育15min，混匀后加入封闭液室温封闭 2h后，100×g离心20min，弃沉淀，9900×g4℃离心15min，弃上清，沉淀用0.01mol/L 100μL的缓冲液1重悬，得到10倍浓缩的金标抗体探针； S3、金标抗体结合垫用缓冲液2浸润，37℃干燥2h，用三维平面点膜喷金仪将步骤S2制备好的金标抗体探针均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷液量为0.7uL/cm，置于37℃烘干后封装备用； S4、用三维平面点膜喷金仪将链霉亲和素溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到检测线即T线；将山羊抗小鼠IgG溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到质控线即C线； S5、将样品膜、金标结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴组合到PVC 底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，用切割机切成3mm宽的试纸条，得到金标层析试纸条； S6、取过夜培养的无乳链球菌菌液1mL，利用加热煮沸法提取基因组DNA做为PCR扩增模板，利用权利要求2所述的牛源无乳链球菌的PCR特异性引物对无乳链球菌ef‑tu基因进行PCR扩增，将PCR扩增产物与浓度为0.4％的NaCl溶液按体积比为1:70混合后，滴加到步骤S5制备的金标层析试纸条上，通过检测线是否显色可判断滴加的样品中是否含有目标菌的DNA。 4.根据权利要求3所述的牛源无乳链球菌的可视化快速检测方法，其特征在于：所述金纳米粒子的平均粒径为20nm。 5.根据权利要求3所述的牛源无乳链球菌的可视化快速检测方法，其特征在于，所述封闭液配方为：10％BSA，0.25％PEG2000，0.05％吐温‑20，0.05％TritionX‑100。 6.根据权利要求3所述的牛源无乳链球菌的可视化快速检测方法，其特征在于，所述缓冲液1配方为：100mM Tris‑base、4％海藻糖、0.2％BSA；pH＝9。 7.根据权利要求3所述的牛源无乳链球菌的可视化快速检测方法，其特征在于，所述缓冲液2为：5g蔗糖，1g海藻糖，0.25g PEG2000，300μL吐温‑20，0.2mol/L PBS；pH＝7.4。 8.根据权利要求3所述的牛源无乳链球菌的可视化快速检测方法，其特征在于，所述链霉亲和素溶液的浓度为0.8mg/mL；所述山羊抗小鼠IgG溶液的浓度为1mg/mL。 9.根据权利要求3所述的牛源无乳链球菌的可视化快速检测方法，其特征在于，PCR扩增体系为：采用20μL扩增体系，包括2×Taq PCRMix预混液10μL，浓度均为10μM的上、下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 8μL； PCR扩增程序为：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火58.5℃30s；延伸72℃30s；终延伸 72℃10min；共30个循环。
说明书全文	一种牛源无乳链球菌的PCR特异性引物和可视化检测方法技术领域 [0001] 本发明涉及食品安全检测领域，特别是一种牛源无乳链球菌的PCR特异性引物和可视化检测方法。背景技术 [0002] 无乳链球菌是一种兼性厌氧的革兰氏阳性B群链球菌，专性寄生于乳腺，在自然环境中普遍存在，是当前中国奶牛场流行最广泛的乳房炎病原菌之一。大量的调查结果显示，30％‑70％的奶牛乳房炎由无乳链球菌导致，在分离的奶牛乳房炎病原菌中，无乳链球菌约占分离病原菌的11.04％。无乳链球菌具有很高的传染性，能够在牛群中快速传播，感染了无乳链球菌的奶牛多数表现为隐性感染，无明显的临床症状，常常容易被忽视，导致感染率升高。无乳链球菌会引起奶牛乳房红肿、硬块、血乳以及乳汁水样变性，导致奶牛产奶量急剧降低，且随着体细胞数的上升，牛奶干物质比例降低，导致牛乳品质下降。许多牧业集团内部牧场间调牛前没有进行无乳链球菌的检测，造成很多阴性牧场遭受感染，导致巨大经济损失。 [0003] 无乳链球菌还是一种会引发人类疾病的病原菌，孕妇、婴幼儿、老年人等免疫功能不全者极易被感染，可引起妇女子宫内膜炎和婴幼儿脑膜炎、败血症、菌血症、心内膜炎及肺炎等疾病，死亡率较高，可见无乳链球菌污染已经威胁到人类健康和公共食品卫生安全。在实际生产中，生鲜乳极易腐败变质，为了维持牛乳及其制品的新鲜口味和营养物质，原料乳检测时间要求特别严格。传统的病原菌分离鉴定方法虽然结果准确，稳定性好，但是操作繁琐费时，无法适应大批量样品的检测，因此，寻求一种高效快速的检测手段对原料乳中无乳链球菌进行检测具有非常重要的意义。 [0004] PCR法是病原微生物最常见的检测方法，特异性强，灵敏度高，但其结果需要凝胶电泳呈现，不便于实现即时检测。金标侧流层析试纸(LFD)是实现现场检测的重要手段，不需要专用仪器，只需要插入、比对即可，具有快速、低成本，操作简单易行。将PCR技术与金标侧流层析试纸相结合，对目标DNA进行简单快速的检测，实现食源性致病菌的可视化检测，对实现食源性致病菌的现场检测有重要意义，也更适合向企业及民众推广。发明内容 [0005] 为了解决上述技术问题，本发明提供了一种牛源无乳链球菌的PCR特异性引物和可视化检测方法。 [0006] 为达到上述目的，本发明是按照以下技术方案实施的： [0007] 本发明的第一目的是要提供一种牛源无乳链球菌的PCR特异性引物，所述特异性引物为无乳链球菌ef‑tu基因的特异性修饰引物，其序列为： [0008] 上游引物序列为：5’‑ACCACGAAGAAGAACACC‑3’； [0009] 下游引物序列为：5’‑GACCAATGCCACAAACTC‑3’。 [0010] 进一步地，所述上游引物的5’端修饰地高辛，下游引物的5’端修饰生物素。 [0011] 本发明的第二目的是要提供一种牛源无乳链球菌的可视化快速检测方法，包括以步骤： [0012] S1、将25mL 0.01％的HAuCl4在磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入0.75mL的1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色变化，待溶液颜色稳定后继续加热5min，得到金纳米粒子溶液，避光保存于4℃备用； [0013] S2、取步骤S1获得的1mL金粒子溶液加入适量的0.1mol/L K2CO3溶液调节pH为8，再加入3.5uL的1mg/mL抗地高辛抗体混合均匀，在室温下孵育15min，混匀后加入封闭液室温封闭2h后，100×g离心20min，弃沉淀，9900×g4℃离心15min，弃上清，沉淀用0.01mol/L 100μL的缓冲液1重悬，得到10倍浓缩的金标抗体探针； [0014] S3、金标抗体结合垫用缓冲液2浸润，37℃干燥2h，用三维平面点膜喷金仪将步骤S2制备好的金标抗体探针均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷液量为0.7uL/cm，置于37℃烘干后封装备用； [0015] S4、用三维平面点膜喷金仪将链霉亲和素溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到检测线即T线；将山羊抗小鼠IgG溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到质控线即C线； [0016] S5、将样品膜、金标结合垫、具有检测线和质控线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴组合到PVC 底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，用切割机切成3mm宽的试纸条，得到金标层析试纸条； [0017] S6、取过夜培养的无乳链球菌菌液1mL，利用加热煮沸法提取基因组DNA做为PCR扩增模板，利用权利要求2所述的牛源无乳链球菌的PCR特异性引物对无乳链球菌ef‑tu基因进行PCR扩增，将PCR扩增产物与浓度为0.4％的NaCl溶液按体积比为1:70混合后，滴加到步骤S5制备的金标层析试纸条上，通过检测线是否显色可判断滴加的样品中是否含有目标菌的DNA。 [0018] 优选地，所述金纳米粒子的平均粒径为20nm。 [0019] 优选地，所述封闭液配方为：10％BSA，0.25％PEG2000，0.05％吐温‑20，0.05％TritionX‑100。 [0020] 优选地，所述缓冲液1配方为：100mM Tris‑base、4％海藻糖、0.2％BSA；pH＝9。 [0021] 优选地，所述缓冲液2为：5g蔗糖，1g海藻糖，0.25g PEG2000，300μL吐温‑20，0.2mol/L PBS；pH＝7.4。 [0022] 优选地，所述链霉亲和素溶液的浓度为0.8mg/mL；所述山羊抗小鼠IgG溶液的浓度为1mg/mL。 [0023] 优选地，PCR扩增体系为：采用20μL扩增体系，包括2×Taq PCR Mix预混液10μL，浓度均为10μM的上、下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O8μL；PCR扩增程序为：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火58.5℃30s；延伸72℃30s；终延伸72℃10min；共30个循环。 [0024] 本发明的原理为：针对牛源无乳链球菌的特异性基因ef‑tu设计引物，在上下游引物5’端分别修饰地高辛和生物素，以金纳米粒子作为标记物标记抗地高辛抗体制备金标抗体，试纸条的检测线上固定链霉亲和素，质控线上固定山羊抗小鼠IgG。当待测样本中存在无乳链球菌时，PCR扩增产物为一端标记生物素，另一端标记地高辛的双螺旋DNA，PCR产物先和金标结合垫上的金标抗体通过抗原抗体结合，形成金标‑PCR扩增产物复合物，随着毛细管作用继续层析到硝酸纤维素膜上，到达检测线时通过生物素‑链霉亲和素被固定在检测线上，使得检测线形成红色条带；多余的金标‑PCR扩增产物复合物继续层析到达质控线被山羊抗小鼠IgG结合，此时检测线和质控线均显示出红色条带，即为阳性结果；当待测样本中没有无乳链球菌时，则PCR扩增产物不存在，检测线因无法捕捉胶体金而不显色，质控线通过山羊抗小鼠IgG结合抗地高辛抗体来捕捉金粒子得以显色，即为阴性结果。 [0025] 与现有技术相比，本发明针对无乳链球菌的靶基因ef‑tu设计特异性引物，分别对上下游引物进行修饰，赋予其特异性识别和信号输出双重功能；PCR扩增产物利用抗原抗体反应偶联金标抗体探针，进一步借助生物素‑链霉亲和素的特异性识别作用实现可视化检测，同时利用生物素‑链霉亲和素信号放大系统显著提高常规试纸条检测方法的灵敏度，实现对无乳链球菌的高灵敏检测。与PCR‑凝胶电泳法相比，本发明方法同时还具有简单、快速、结果容易判读等特点。附图说明 [0026] 图1本发明可视化试纸条的组成结构示意图。 [0027] 图2本发明PCR‑LFD检测方法原理示意图。 [0028] 图3本发明可视化检测结果判定图。 [0029] 图4本发明检测方法特异性实验结果。 [0030] 图5本发明检测方法灵敏度测定结果。具体实施方式 [0031] 为使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步的详细说明。此处所描述的具体实施例仅用于解释本发明，并不用于限定发明。 [0032] 实施例1 [0033] 本实施例提供了一种牛源无乳链球菌的PCR特异性引物，根据GenBank中收录的无乳链球菌的基因序列，针对无乳链球菌的ef‑tu基因，设计1对特异性引物，上游引物序列为：5’‑ACCACGAAGAAGAACACC‑3’(参见SEQ ID NO.1)；下游引物序列为：5’‑GACCAATGCCACAAACTC‑3’(参见SEQ ID NO.2)；PCR扩增产物长度为515bp。其中上游引物的5’端修饰地高辛，下游引物的5’端修饰生物素。 [0034] 实施例2 [0035] 如图2、图3所示，结合上述牛源无乳链球菌的PCR特异性引物可以对牛源无乳链球菌进行可视化快速检测，具体步骤如下： [0036] S1、将25mL 0.01％的HAuCl4在磁力搅拌器上加热至沸腾，迅速加入0.75mL的1％柠檬酸三钠溶液，观察溶液颜色变化，待溶液颜色稳定后继续加热5min，得到平均粒径为20nm金纳米粒子溶液，避光保存于4℃备用； [0037] S2、取步骤S1获得的1mL金粒子溶液加入适量的0.1mol/L K2CO3溶液调节pH为8，再加入3.5uL的1mg/mL抗地高辛抗体混合均匀，在室温下孵育15min，混匀后加入封闭液(10％BSA，0.25％PEG2000，0.05％吐温‑20，0.05％TritionX‑100)室温封闭2h后，100×g离心20min，弃沉淀，9900×g 4℃离心15min，弃上清，沉淀用0.01mol/L 100μL的缓冲液1(100mM Tris‑base、4％海藻糖、0.2％BSA；pH＝9)重悬，得到10倍浓缩的金标抗体探针； [0038] S3、金标抗体结合垫用缓冲液2(5g蔗糖，1g海藻糖，0.25g PEG2000，300μL吐温‑20，0.2mol/L PBS；pH＝7.4)浸润，37℃干燥2h，用三维平面点膜喷金仪将步骤S2制备好的金标抗体探针均匀的喷涂到玻璃纤维膜上，喷液量为0.7uL/cm，置于37℃烘干后封装备用； [0039] S4、用三维平面点膜喷金仪将浓度为0.8mg/mL链霉亲和素溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到检测线(T线)；将浓度为1mg/mL山羊抗小鼠IgG溶液均匀的喷涂到硝酸纤维素膜上，得到质控线(C线)； [0040] S5、将样品膜、金标结合垫、具有T线和C线的硝酸纤维素膜和吸水垫依次粘贴组合到PVC底板上，相邻粘贴物之间的重叠部分长度为2mm，切成3mm宽的试纸条，得到金标层析试纸条，其结构如图1所示，在金标试纸条的组装中序号1为PVC底板，其两端分别设有样品垫2和吸水垫5；在PVC底板的中部设置有硝酸纤维素膜检测层4，其上有检测线6和质控线7；在硝酸纤维素膜检测层4和样品垫2之间设置有金标结合垫3。 [0041] 所述金标结合垫3上包被有抗地高辛抗体‑金粒子复合物探针； [0042] 所述检测线6上包被有链霉亲和素。 [0043] 所述质控线7上包被有山羊抗小鼠IgG。 [0044] S6、取过夜培养的无乳链球菌菌液1mL，利用加热煮沸法提取基因组DNA做为PCR扩增模板，利用牛源无乳链球菌的PCR特异性引物对无乳链球菌ef‑tu基因进行PCR扩增，PCR扩增体系为：采用20μL扩增体系，包括2×Taq PCR Mix预混液10μL，浓度均为10μM的上、下游引物各0.5μL，DNA模板1μL，ddH2O 8μL；PCR扩增程序为：预变性94℃5min；变性94℃30s；退火58.5℃30s；延伸72℃30s；终延伸72℃10min；共30个循环；将PCR扩增产物与浓度为 0.4％的NaCl溶液按体积比为1:70混合后，滴加到步骤S5制备的金标层析试纸条上，等待 10min后用肉眼进行观察，通过T线是否显色可判断滴加的样品中是否含有无乳链球菌；如果C线不显色，则试纸条出现质量问题，检测结果无效；如果C线和T线均显色时，说明待测样品中含有无乳链球菌，T线显色越深则检测溶液中无乳链球菌浓度越高，待测样品为阳性；如果T线不显色，只有C线显色时，说明待测样品中不含有无乳链球菌，待测样品为阴性。 [0045] 实施例3无乳链球菌可视化检测方法特异性测定 [0046] 以无乳链球菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌的基因组DNA为模板，将本发明设计的引物加入到实施例2步骤S2所建立的PCR反应体系中进行扩增，对PCR扩增产物进行可视化检测，如图4所示，其中1为无乳链球菌，2为沙门氏菌，3为金黄色葡萄球菌，4为大肠杆菌，5为单增李斯特菌，只有1号试纸条的T线显色，表明本发明方法对无乳链球菌特异性强。 [0047] 实施例4无乳链球菌可视化检测方法灵敏度测定 [0048] 培养无乳链球菌至对数生长期，用0.9％无菌生理盐水稀释菌原液，通过水煮法提取其DNA模板，按照实施例2的步骤S2所述进行PCR扩增，将无乳链球菌PCR扩增产物与0.4％的NaCl溶液以1:70比例混合，滴加在制备好的试纸条上，如图5所示，对无乳链球菌的检测0 2 限达到了1.37×10CFU/mL，而PCR‑凝胶电泳法的检测限为1.37×10CFU/mL，本发明检测方法的灵敏度提升了100倍。 [0049] 本发明的技术方案不限于上述具体实施例的限制，凡是根据本发明的技术方案做出的技术变形，均落入本发明的保护范围之内。