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一种鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法

申请号 CN202311870141.4 申请日 2023-12-29 公开(公告)号 CN117802266A 公开(公告)日 2024-04-02
申请人 浙江千济方医药科技有限公司; 中国农业科学院农业资源与农业区划研究所; 发明人 陈晓华; 邹亚杰; 胡清秀; 郑仲桂; 张德智;
摘要 本 发明 公开了一种鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,包括通过检测所述鲍氏桑黄菌株的特异性基因 片段 进行分子鉴定,所述鲍氏桑黄菌株为鲍氏桑黄QJF‑1菌株;所述检测包括采用聚合酶链式反应进行检测。本发明通过检测鲍氏桑黄QJF‑1菌株346bp的的特异性基因片段对鲍氏桑黄QJF‑1菌株进行分子鉴定。本发明分子鉴定方法的检测特异性强,能够实现快速、准确检测。
权利要求

1.一种鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:包括通过检测所述鲍氏桑黄(Sanghuangporus baumii)菌株的特异性基因片段进行分子鉴定,所述鲍氏桑黄菌株为鲍氏桑黄QJF‑1菌株;所述检测包括采用聚合酶链式反应进行检测;所述聚合酶链式反应的引物序列分别为:
上游引物:5′‑GCCAGTGTTGACTAGGCGT‑3′;
下游引物:5′‑CGCAAATCTAGACGGCTACCTT‑3′;
所述特异性基因片段大小为346bp。
2.根据权利要求1所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:所述鲍氏桑黄QJF‑1菌株的保藏编号为:CGMCC No.20226。
3.根据权利要求2所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:包括提取所述鲍氏桑黄QJF‑1菌株的菌丝体或子实体的基因组DNA,使用所述引物序列进行聚合酶链式反应。
4.根据权利要求3所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:所述聚合酶链式反应的退火温度为60℃。
5.根据权利要求4所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:所述聚合酶链式反应的循环数为30个循环。
6.根据权利要求1~5中任一项所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:所述聚合酶链式反应的程序设定为:95℃ 3min,95℃ 30s,60℃ 30s,72℃ 30s,30个循环,72℃ 10min。
7.根据权利要求3所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:所述菌丝体包括气生菌丝。
8.根据权利要求7所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:所述气生菌丝的获得方法包括,将所述鲍氏桑黄QJF‑1菌种接种到铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行避光培养,得到所述气生菌丝。
9.根据权利要求1所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其特征在于:所述特异性基因片段的基因序列如SEQ ID NO:1所示。

说明书全文

一种鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法

技术领域

[0001] 本发明属于分子标记鉴定技术领域,具体涉及一种鲍氏桑黄菌株的分子标记引物对及其鉴定方法。

背景技术

[0002] 目前在市场上生产和销售的桑黄菌株很多,种类混杂,不典型的野生桑黄子实体的肉眼鉴定存在着相当大的难度。一般的传统分子标记lSSR,RAPD或者分子鉴定技术如扩增菌株ITS等在桑黄物种间的区分效率较低,更无法用于菌株的区分。
[0003] 随着基因组测序技术的发展,越来越多的个体基因组得到了测序,而基于全基因组序列的比对获得某一菌株/个体的特异片段,并基于此设计引物进行聚合酶链式反应扩增,是一种有效且准确鉴定相似菌株的方法,能够简便、快速、稳定的进行菌种鉴定。

发明内容

[0004] 本部分的目的在于概述本发明的实施例的一些方面以及简要介绍一些较佳实施例。
[0005] 鲍氏桑黄(Sanghuangporus baumii)QJF‑1菌株,保藏编号为CGMCC No.20226,于2020年07月23日保藏于中国生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC),保藏地址为:北京市朝阳区北辰西路1号院3号,中国科学院微生物研究所。
[0006] 本发明提供一种鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法,其包括通过检测所述鲍氏桑黄(Sanghuangporus baumii)菌株的特异性基因片段进行分子鉴定,所述鲍氏桑黄菌株为鲍氏桑黄QJF‑1菌株;所述检测包括采用聚合酶链式反应进行检测;所述聚合酶链式反应的引物序列分别为:
[0007] 上游引物:
[0008] 下游引物:
[0009] 所述特异性基因片段大小为346bp。
[0010] 作为本发明所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法的一种优选方案:包括提取所述鲍氏桑黄QJF‑1菌株的菌丝体或子实体的基因组DNA,使用所述引物序列进行聚合酶链式反应。
[0011] 作为本发明所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法的一种优选方案:所述聚合酶链式反应的退火温度为60℃。
[0012] 作为本发明所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法的一种优选方案:所述聚合酶链式反应的循环数为3O个循环。
[0013] 作为本发明所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法的一种优选方案:所述聚合酶链式反应的程序设定为:95℃3min,95℃30s,60℃30s,72℃30s,30个循环,72℃10min。
[0014] 作为本发明所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法的一种优选方案:所述菌丝体包括气生菌丝。
[0015] 作为本发明所述的鲍氏桑黄菌株的分子鉴定方法的一种优选方案:所述气生菌丝的获得方法包括,将所述鲍氏桑黄QJF‑1菌种接种到铃薯葡萄糖琼脂培养基上进行避光培养,得到所述气生菌丝。
[0016] 本发明的有益效果:本发明通过检测鲍氏桑黄QJF‑1菌株346bp的的特异性基因片段对鲍氏桑黄QJF‑1菌株进行分子鉴定。本发明分子鉴定方法的检测特异性强,能够实现快速、准确检测。本发明分子鉴定在应用于已有的鲍氏桑黄和杨树桑黄、粗毛纤孔菌、桑树桑黄的检测中发现,其具有鲍氏桑黄QJF‑1菌株的专一性。附图说明
[0017] 为了更清楚地说明本发明的实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。显而易见地,下面描述中的附图仅仅是示例性的,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据提供的附图引伸获得其它的实施附图。
[0018] 本说明书所绘示的结构、比例、大小等,均仅用以配合说明书所揭示的内容,以供熟悉此技术的人士了解与阅读,并非用以限定本发明可实施的限定条件,故不具技术上的实质意义,任何结构的修饰、比例关系的改变或大小的调整,在不影响本发明所能产生的功效及所能达成的目的下,均应仍落在本发明所揭示的技术内容得能涵盖的范围内。
[0019] 图1为针对鲍氏桑黄(Sanghuangporus baumii)QJF‑1菌株的特异性基因片段,采用特异性引物对多种桑黄属菌株及粗毛纤孔菌进行聚合酶链式反应的扩增产物电泳图谱。
[0020] 图1中,泳道″1″菌株是鲍氏桑黄QJF‑1;
[0021] 泳道″2″菌株是鲍氏桑黄(来自延边朝鲜族自治州农业科学院);
[0022] 泳道″3″菌株是鲍氏桑黄(来自陕西省微生物研究所);
[0023] 泳道″4″菌株是杨树桑黄(来自上海市农业科学院食用菌研究所);
[0024] 泳道″5″菌株是杨树桑黄QJF‑3;
[0025] 泳道″6″菌株是杨树桑黄浙黄1号;
[0026] 泳道″7″菌株是杨树桑黄(来自浙江千岛湖生产基地);
[0027] 泳道″8″菌株是粗毛纤孔菌(来自山东省农业科学院);
[0028] 泳道″9″菌株是粗毛纤孔菌(来自陕西省微生物研究所);
[0029] 泳道″10″菌株是粗毛纤孔菌(来自山东省生产基地);
[0030] 泳道″11″菌株是桑树桑黄(从吉林采集);
[0031] 泳道″12″菌株是桑树桑黄(从浙江采集);
[0032] 泳道″13″菌株是桑树桑黄QJF‑2;
[0033] M为10kbp DNA ladder。

具体实施方式

[0034] 以下由特定的具体实施例说明本发明的实施方式,熟悉此技术的人士可由本说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点及功效,显然,所描述的实施例是本发明一部分实施例,而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例,本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例,都属于本发明保护的范围。
[0035] 实施例1:
[0036] 本发明鲍氏桑黄菌株的分子鉴定研究方法如下:
[0037] 培养鲍氏桑黄QJF‑1菌株的气生菌丝:
[0038] 将各菌株(鲍氏桑黄QJF‑1菌株和其他对照菌株)分别接种到马铃薯葡萄糖琼脂培养基中,避光培养14d,培养温度为:28℃,获得各菌株的气生菌丝,‑20℃冻存备用。
[0039] 提取鲍氏桑黄QJF‑1菌株和其他对照菌株的基因组DNA:按照DNA提取试剂盒的说明书提取提取各菌株的基因组DNA(DP305,自于天根生化科技(北京)有限公司)。
[0040] 提取所述基因组DNA后,于‑20℃保存备用。
[0041] 进行基因组重测序及分析:将各菌株的基因组DNA随机剪切成350bp大小的DNA片段。经过末端修复、磷酸化和添加poly‑A尾构建DNA文库,DNA文库在Illumina Hi Seq PE150平台进行重测序。重测序获得的原始数据使用软件fastq 0.23进行质量过滤。过滤条件为:1)删除包含接头(adapter)的reads;2)删除N含量超过5%的reads;3)删除低质量reads(Qphred≤20)的基数占整个reads长度的50%以上的reads;
[0042] 获得QJF‑1菌株的基因组草图,输出BAM文件。获得每个菌株与QJF‑1序列变异的的VCF文件,
[0043] 根据BAM文件计算每个菌株序列比对至QJF‑1基因组草图的测序深度,根据VCF文件计算每个菌株在QJF‑1基因组草图中的变异密度。筛选所有菌株比对结果的测序深度极低或无测序reads比对,或者变异密度高于10个变异/100bp的区段,作为潜在的QJF‑1基因组特异性区段。对于无测序数据比对区域,判定为QJF‑1基因组独有片段;对于高变异区段判定为QJF‑1特异性强片段。
[0044] 本发明对重测序结果进行比对研究,发现鲍氏桑黄QJF‑1菌株有一条它自己特有的基因片段序列。
[0045] 进行聚合酶链式反应:
[0046] 聚合酶链式反应所用的特异性引物序列为:
[0047] 上游引物:
[0048] 下游引物:
[0049] 用特异聚合酶链式反应扩增引物对泳道″1″菌株是鲍氏桑黄QJF‑1、泳道″2″菌株是鲍氏桑黄(来自延边朝鲜族自治州农业科学院)、泳道″3″菌株是鲍氏桑黄(来自陕西省微生物研究所)、泳道″4″菌株是杨树桑黄(来自上海市农业科学院食用菌研究所)、泳道″5″菌株是杨树桑黄QJ F‑3、泳道″6″菌株是杨树桑黄浙黄1号、泳道″7″菌株是杨树桑黄(来自浙江千岛湖生产基地)、泳道″8″菌株是粗毛纤孔菌(来自山东省农业科学院)、泳道″9″菌株是粗毛纤孔菌(来自陕西省微生物研究所)、泳道″1O″菌株是粗毛纤孔菌(来自山东省生产基地),泳道″11″菌株是桑树桑黄(从吉林采集),泳道″12″菌株是桑树桑黄(从浙江采集),泳道″13″菌株是桑树桑黄QJF‑2等菌株的基因组进行聚合酶链式反应扩增。
[0050] 扩增体系:
[0051] 25μL体系:以以上各个菌株的基因组DNA为模板:20‑30ng/μL 1.0μL DNA,引物0.5pmol/pL各1μL,2×Rapid Taq Master Mix 12.5μL(购自北京Vazyme),加至25μL;
[0052] 聚合酶链式反应反应条件:预变性95℃3min:95℃30s 60℃30s,72℃45s,30个循环:72℃延伸10min。
[0053] 电泳检测:
[0054] 取上述各菌株基因组DNA的聚合酶链式反应的扩增产物5μL,与1μL上样缓冲液混匀,点样于2%的琼脂糖凝胶上,于0.5 X TBE缓冲液中,5V/cm电压下电泳,电泳结束后,进行琼脂糖凝胶电泳。然后在凝胶成像仪上照相,其结果请参阅图1电泳图谱。
[0055] 从图1可知,只有以鲍氏桑黄QJF‑1菌株的基因组DNA为模板的聚合酶链式反应产物有单一并专一的条带,这个特异性DNA片段大小为346bp。而其它12个菌株在同一位置并没有出现条带。
[0056] 所述鲍氏桑黄(Sanghuangporus baumii)QJF‑1菌株的346bp特异性基因片段的序列如下:
[0057] SEQ ID NO:1
[0058]
[0059] 本发明实施例中,如图1所示:
[0060] 泳道″1″菌株是鲍氏桑黄QJF‑1;
[0061] 泳道″2″菌株是鲍氏桑黄(来自延边朝鲜族自治州农业科学院);
[0062] 泳道″3″菌株是鲍氏桑黄(来自陕西省微生物研究所);
[0063] 泳道″4″菌株是杨树桑黄(来自上海市农业科学院食用菌研究所);
[0064] 泳道″5″菌株是杨树桑黄QJF‑3;
[0065] 泳道″6″菌株是杨树桑黄浙黄1号;
[0066] 泳道″7″菌株是杨树桑黄(来自浙江千岛湖生产基地);
[0067] 泳道″8″菌株是粗毛纤孔菌(来自山东省农业科学院);
[0068] 泳道″9″菌株是粗毛纤孔菌(来自陕西省微生物研究所);
[0069] 泳道″10″菌株是粗毛纤孔菌(来自山东省生产基地);
[0070] 泳道″11″菌株是桑树桑黄(从吉林采集);
[0071] 泳道″12″菌株是桑树桑黄(从浙江采集);
[0072] 泳道″13″菌株是桑树桑黄QJF‑2;
[0073] M为10kbp DNA ladder。
[0074] 应说明的是,以上实施例仅用以说明本发明的技术方案而非限制,尽管参照较佳实施例对本发明进行了详细说明,本领域的普通技术人员应当理解,可以对本发明的技术方案进行修改或者等同替换,而不脱离本发明技术方案的精神和范围,其均应涵盖在本发明的权利要求范围当中。