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检测猴痘病毒的核酸组合物和其检测方法
申请号 CN202311863518.3 申请日 2023-12-29 公开(公告)号 CN117802271A 公开(公告)日 2024-04-02
申请人 珠海碳华检测科技有限公司; 发明人 白慕群; 王亮; 韦玉倩;
摘要 本 发明 公开了检测猴痘病毒的核酸组合物和其检测方法，涉及 生物 检测领域。本发明提供的核酸组合物包括引物对1～3中的至少一对，引物对1的序列如SEQ ID NO:2～3所示，引物对2的序列如SEQ ID NO:5～6所示，引物对3的序列如SEQ ID NO:11～12所示。该核酸组合物的靶标区域具有高度保守性和特异性，应用于猴痘病毒的检测具有高特异性和灵敏度，为猴痘病毒的快速有效检测提供了新的途径。
权利要求

1.一种核酸组合物，其特征在于，其包括：第一核酸组合、第二核酸组合和第三核酸组合中的至少一组；
所述第一核酸组合包括引物对1，所述引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示；
所述第二核酸组合包括引物对2，所述引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；
所述第三核酸组合包括引物对3，所述引物对3的核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示。
2.根据权利要求1所述的核酸组合物，其特征在于，所述第一核酸组合1还包括探针1，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示；
可选地，所述第一核酸组合2还包括探针2，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示；
可选地，所述第一核酸组合3还包括探针3，所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
3.根据权利要求2所述的核酸组合物，其特征在于，所述探针1、所述探针2和所述探针3中的任意一种或多种的序列5’端连接有荧光基团且序列3’端连接有淬灭基团；
可选地，所述荧光基团选自：VIC、FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5和LC RED705中的任意一种；
可选地，所述淬灭基团选自：BHQ1、BHQ2、Dabcyl和QYS‑7中的任意一种。
4.如权利要求1～3任一项所述的核酸组合物在制备用于检测猴痘或猴痘病毒的产品中的应用；
可选地，所述产品选自试剂、芯片和试剂盒。
5.一种试剂或芯片，其特征在于，其包括：权利要求1～3任一项所述的核酸组合物。
6.一种试剂盒，其特征在于，其包括：权利要求1～3任一项所述的核酸组合物或权利要求5所述的试剂或芯片。
7.一种猴痘病毒的检测方法，其特征在于，其包括：采用权利要求1～3任一项所述的核酸组合物对样本进行检测；所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
8.根据权利要求7所述的检测方法，其特征在于，所述检测的方法包括：荧光定量PCR或数字PCR。
9.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述荧光定量PCR的反应程序包括：94～96℃预变性28～32s；94～96℃变性4～6s，56～62℃退火或延伸28～32s，共40个循环。
10.根据权利要求8所述的检测方法，其特征在于，引物对1中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.1～0.4μM，探针1的反应浓度为0.1～0.4μM；
可选地，引物对1中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.1～0.2μM，探针1的反应浓度为0.3～0.4μM；
可选地，引物对2中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.1～0.4μM，探针2的反应浓度为0.1～0.4μM；
可选地，引物对2中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.3～0.4μM，探针2的反应浓度为0.3～0.4μM；
可选地，引物对3中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.1～0.4μM，探针3的反应浓度为0.1～0.4μM；
可选地，引物对3中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.2～0.4μM，探针3的反应浓度为0.2～0.4μM。
说明书全文

检测猴痘病毒的核酸组合物和其检测方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物检测领域，具体而言，涉及检测猴痘病毒的核酸组合物和其检测方法。

背景技术

[0002] 猴痘病毒(Mpox virus，MPXV)是一种基因组长达200kb左右的DNA病毒，属于痘病毒科正痘病毒属，外形为回角砖形或卵圆形，大小为200～400nm，外被脂蛋白膜或封套，中间具有两个含蛋白质的侧体，有1个厚膜核心，核心内含很大的双链DNA基因组。猴痘病毒的基因组为双链DNA，长约197kb，基因组末端包含一个相同但方向相反的末端反向重复序列。该病毒包含190个开放阅读框，其中4个位于末端反向重复序列中；同一属的病毒还包括天花病毒、牛痘病毒等。
[0003] 猴痘是一种由猴痘病毒(Mpox virus，MPXV)感染所致的病毒性人畜共患病(从动物传播给人的病毒)，病人症状与过去在天花病人身上所观察到的相似，但临床严重程度较轻。随着在1980年消灭了天花和随后停止接种天花疫苗，猴痘成为最严重的正痘病毒。
[0004] 猴痘由实验室确诊。目前，国际上尚无一种通用的、安全快速的对天花和猴痘病毒感染的血清学诊断方法，而生物学鉴别诊断(病毒分离培养、电镜观察等)通常需3‑6天，且存在生物安全危害隐患。由于血清学诊断与临床诊断的灵敏度不高，不易鉴别诊断天花、猴痘及其他出皮疹的疾病，所以采用分子诊断(PCR)技术来进行病毒感染的检测。而现有的分子诊断试剂大多也存在灵敏度不高、特异性不强等缺陷。
[0005] 鉴于此，特提出本发明。

发明内容

[0006] 本发明的目的在于提供检测猴痘病毒的核酸组合物和其检测方法。
[0007] 本发明是这样实现的：
[0008] 第一方面，本发明实施例提供了一种核酸组合物，其包括：第一核酸组合、第二核酸组合和第三核酸组合中的至少一组；所述第一核酸组合包括引物对1，所述引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示；所述第二核酸组合包括引物对2，所述引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；所述第三核酸组合包括引物对3，所述引物对3的核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示。
[0009] 第二方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的核酸组合物在制备用于检测猴痘或猴痘病毒的产品中的应用。
[0010] 第三方面，本发明实施例提供了一种试剂或芯片，其包括：前述实施例所述的核酸组合物。
[0011] 第四方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括：前述实施例所述的核酸组合物或前述实施例所述的试剂或芯片。
[0012] 第五方面，本发明实施例提供了一种猴痘病毒的检测方法，其包括：采用前述实施例所述的核酸组合物对样本进行检测；所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
[0013] 本发明具有以下有益效果：
[0014] 本发明提供了用于检测猴痘病毒的引物探针组合，该引物探针组合的靶标区域具有高度保守性和特异性，采用该引物探针组合应用于猴痘病毒的检测具有高特异性和灵敏度，为猴痘病毒的快速有效检测提供了新的途径。附图说明
[0015] 为了更清楚地说明本发明实施例的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，应当理解，以下附图仅示出了本发明的某些实施例，因此不应被看作是对范围的限定，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他相关的附图。
[0016] 图1为本发明实施例3中第四组引物/探针(F4/R4/P4)的浓度配比试验反应结果；
[0017] 图2为本发明实施例3中第五组引物/探针(F5/R5/P5)的浓度配比试验反应结果；
[0018] 图3为本发明实施例4中第一组引物探针(F1/R1/P1)灵敏度试验结果图；其中，1的7 6
模板浓度为0.5×10copies/μL，2的模板浓度为0.5×10copies/μL，3的模板浓度为0.5×
5 4 3
10copies/μL，4的模板浓度为0.5×10copies/μL，5的模板浓度为0.5×10copies/μL，6的
2 1
模板浓度为0.5×10copies/μL，7的模板浓度为0.5×10copies/μL，8的模板浓度为0.5×
0
10copies/μL；
[0019] 图4为本发明实施例4中第一组引物探针(F1/R1/P1)实时荧光PCR方法的标准曲线图；
[0020] 图5为本发明实施例4中第二组引物探针(F2/R2/P2)灵敏度试验结果图；其中，1的7 6
模板浓度为0.5×10copies/μL，2的模板浓度为0.5×10copies/μL，3的模板浓度为0.5×
5 4 3
10copies/μL，4的模板浓度为0.5×10copies/μL，5的模板浓度为0.5×10copies/μL，6的
2 1
模板浓度为0.5×10copies/μL，7的模板浓度为0.5×10copies/μL，8的模板浓度为0.5×
0
10copies/μL；
[0021] 图6为本发明实施例4中第二组引物探针(F2/R2/P2)实时荧光PCR方法的标准曲线图；
[0022] 图7是本发明实施例4中第三组引物探针(F3/R3/P3)灵敏度试验结果图；其中，1的7 6
模板浓度为0.5×10copies/μL，2的模板浓度为0.5×10copies/μL，3的模板浓度为0.5×
5 4 3
10copies/μL，4的模板浓度为0.5×10copies/μL，5的模板浓度为0.5×10copies/μL，6‑8
2 1 0
的模板浓度分别为0.5×10copies/μL、0.5×10copies/μL和0.5×10copies/μL；
[0023] 图8为本发明实施例4中第三组引物/探针(F3/R3/P3)实时荧光PCR方法的标准曲线图；
[0024] 图9为本发明实施例4中第四组引物探针(F4/R4/P4)灵敏度试验结果图；其中，1的7 6
模板浓度为0.5×10copies/μL，2的模板浓度为0.5×10copies/μL，3的模板浓度为0.5×
5 4 3
10copies/μL，4的模板浓度为0.5×10copies/μL，5的模板浓度为0.5×10copies/μL，6的
2 1
模板浓度为0.5×10copies/μL，7的模板浓度为0.5×10copies/μL，8的模板浓度为0.5×
0
10copies/μL；
[0025] 图10为本发明实施例4中第四组引物探针(F4/R4/P4)实时荧光PCR方法的标准曲线图；
[0026] 图11为本发明实施例5中第一组引物探针(F1/R1/P1)的特异性试验反应结果，其中，1：MPXV；2：VACV；35分别为：CAMV、ECTV、TATV；6：CPV；7‑8：VARV、阴性对照；
[0027] 图12为本发明实施例5中第二组引物探针(F2/R2/P2)的特异性试验反应结果，其中，1：MPXV；28分别为：CPV、VACV、VARV、CAMV、ECTV、TATV、阴性对照；
[0028] 图13为本发明实施例5中第四组引物探针(F4/R4/P4)的特异性试验反应结果，其中，1：MPXV；25分别为：CPV、VACV、CAMV、TATV；6：VARV；7：ECTV；8：阴性对照。

具体实施方式

[0029] 为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。实施例中未注明具体条件者，按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可以通过市售购买获得的常规产品。
[0030] 一方面，本发明实施例提供了一种核酸组合物，其包括：第一核酸组合、第二核酸组合和第三核酸组合中的至少一组(任意一组或任意两组以上的组合)；
[0031] 所述第一核酸组合包括引物对1，所述引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示；
[0032] 所述第二核酸组合包括引物对2，所述引物对2的核苷酸序列如SEQ ID NO:5～6所示；
[0033] 所述第三核酸组合包括引物对3，所述引物对3的核苷酸序列如SEQ ID NO:11～12所示。
[0034] 本发明提供的引物对1～3对于猴痘病毒的检测灵敏度均可达到0.5×101copies/μL，相对于现有用于猴痘病毒的检测引物对而言，灵敏度具有显著提高。
[0035] 需要说明的是，每组引物对的均包括上游引物和下游引物，可以理解的是，本文记载的“引物对1的核苷酸序列如SEQ ID NO:2～3所示”具体是指引物对1中的上游引物和下游引物的核苷酸序列依次如SEQ ID NO:2～3所示。引物对2～3同此理解。
[0036] 在一些实施例中，所述第一核酸组合1还包括探针1，所述探针1的核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0037] 在一些实施例中，所述第一核酸组合2还包括探针2，所述探针2的核苷酸序列如SEQ ID NO:4所示。
[0038] 在一些实施例中，所述第一核酸组合3还包括探针3，所述探针3的核苷酸序列如SEQ ID NO:10所示。
[0039] 在一些实施例中，所述探针1、所述探针2和所述探针3中的任意一种或多种的序列5’端连接有荧光基团，序列3’端连接有淬灭基团。
[0040] 在一些实施例中，所述荧光基团选自：VIC、FAM、TET、JOE、HEX、CY3、TAMRA、ROX、Texas Red、LC RED640、CY5和LC RED705中的任意一种。
[0041] 在一些实施例中，所述淬灭基团选自：BHQ1、BHQ2、Dabcyl和QYS‑7中的任意一种。
[0042] 另一方面，本发明实施例提供了如前述实施例所述的核酸组合物在制备用于检测猴痘或猴痘病毒的产品中的应用。
[0043] 在一些实施例中，所述产品选自试剂、芯片和试剂盒。
[0044] 当产品的类型为芯片时，前述核酸组合物固定于芯片的基片上。本发明对于芯片的制备无特殊限制，可基于现有公开的方法进行引物探针的固定。
[0045] 另一方面，本发明实施例提供了一种试剂或芯片，其包括：前述任意实施例所述的核酸组合物。
[0046] 另一方面，本发明实施例提供了一种试剂盒，其包括：前述任意实施例所述的核酸组合物或前述实施例所述的试剂或芯片。
[0047] 在一些实施例中，所述试剂盒还包括：PCR反应试剂。
[0048] 在一些实施例中，所述试剂盒还包括：阳性标准品和阴性标准品中的任意一种或多种。
[0049] 此外，本发明实施例还提供了一种猴痘病毒的检测方法，其包括：采用前述任意实施例所述的核酸组合物对样本进行检测；所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为目的。
[0050] 需要说明的是，所述检测方法不以疾病的诊断或治疗为目的的情况有很多，比如当待测样本为环境样本或人工制备的样本时，所述检测方法则是以非疾病的诊断或治疗为目的的检测。
[0051] 在一些实施例中，所述检测的方法包括：荧光定量PCR或数字PCR。
[0052] 在一些实施例中，所述荧光定量PCR的反应程序包括：94～96℃预变性28～32s；94～96℃变性4～6s，56～62℃退火或延伸28～32s，共40个循环。
[0053] 可选地，预变性的温度可以为94、95、96℃中的任意一种或任意两种之间的范围；预变性的事件可以为28、29、30、31、32s中的任意一种或任意两种之间的范围。变性的温度可以为94、95、96℃中的任意一种或任意两种之间的范围；变性的时间可以为4、5、6s中的任意一种或任意两种之间的范围。退火或延伸的温度可以为56、57、58、59、60、61、62℃中的任意一种或任意两种之间的范围；退火或延伸的时间可以为28、29、30、31、32℃中的任意一种或任意两种之间的范围。
[0054] 在一些实施例中，引物对1中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.1～0.4μM，探针1的反应浓度为0.1～0.4μM。
[0055] 在一些实施例中，引物对2中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.1～0.4μM，探针2的反应浓度为0.1～0.4μM。
[0056] 在一些实施例中，引物对3中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.1～0.4μM，探针3的反应浓度为0.1～0.4μM。
[0057] 具体地，引物对1～3中的上下游引物、探针1～3的反应浓度具体可以独立地为0.1、0.2、0.3和0.4μM中的任意一种或任意两种之间的范围。
[0058] 在一些实施例中，引物对1中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.1～0.2μM，探针1的反应浓度为0.3～0.4μM。
[0059] 在一些实施例中，引物对2中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.3～0.4μM，探针2的反应浓度为0.3～0.4μM。
[0060] 在一些实施例中，引物对3中的上游引物和下游引物的反应浓度为0.2～0.4μM，探针3的反应浓度为0.2～0.4μM。
[0061] 以下结合实施例对本发明的特征和性能作进一步的详细描述。
[0062] 实施例1：一种检测猴痘病毒的引物探针组合及其检测方法。
[0063] 1.1材料
[0064] 1.1.1仪器
[0065] Applied Biosystems 7500实时定量PCR仪、SCILOGEX D1008掌上离心机、Kylin‑Bell vortex‑5漩涡混合器、Eppendorf移液器。
[0066] 1.1.2阳性样本制备
[0067] 本发明利用生物信息学方法分析已公开发表的正痘病毒基因组序列，分别人工合成了含特异检测猴痘病毒靶基因的B6R片段、E9L片段及基因组，并插入质粒，作为猴痘病毒检测的模拟阳性模板。引物/探针及质粒均由金斯瑞生物科技股份有限公司合成。引物/探针纯化方式为HPLC。
[0068] 1.2方法
[0069] 1.2.1猴痘病毒引物/探针的合成
[0070] 设计合成表1所示的引物探针组合。
[0071] 表1引物探针组合
[0072]
[0073]
[0074] 备注:前文所述引物对1对应表1中的上游引物‑F1和下游引物‑R1，探针1对应表1中的探针‑P1；前文所述引物对2对应表1中的上游引物‑F2和下游引物‑R2，探针2对应表1中的探针‑P2；前文所述引物对3对应表1中的上游引物‑F4和下游引物‑R4，探针3对应表1中的探针‑P4。
[0075] 其中，129bp的B6R基因扩增片段的核苷酸序列(5’～3’)如下:
[0076] TGTCACGTGTCCTAATGCGGAATGTCAACCTCTTCAATTAGAACACGGATCGTGTCAACCAGTTAAAGAAAAATACTCATTTGGGGAATATATGACTATCAACTGTGATGTTGGATATGAGGTTATTGG(SEQ ID No.16)。
[0077] 89bp的B6R基因扩增片段的核苷酸序列(5’～3’)如下:
[0078] ATATAATCATAATGGCGTTGACAATTATGGGTGTCATATTTCTAATCTCTATTATAGTATTAGTTTGTTCCTGTGACAAAAATAATGAC(SEQ ID No.17)。
[0079] 106bp的E9L基因扩增片段的核苷酸序列(5’～3’)如下:
[0080] TTAGCGAAACAGTTACGTGGATCGTCACAATGATAACATCCATTGTTAATCTTTGTCAAATATTGCTCGTCCAACGAGTAACATCCGTCTGGAGATATCCCGTTAG(SEQ ID No.18)。
[0081] 113bp的基因组扩增片段的核苷酸序列(5’～3’)如下:
[0082] GAGGTGAAGACCATCCCACTAGTAACAGTCTGAACGCATTGTTTGTGATGCTTGGGATGCTCAATTACATGGATTATACCATCATATTCTGGCGTATGAATTGATGAGTTACA(SEQ ID No.19)。
[0083] 138bp的基因组扩增片段的核苷酸序列(5’～3’)如下:
[0084] CGGAGACGGTAGAATAAGTGTAGCAAATAAAATCTATATGACTGATAAGAGACGTGTTATTACATCCTGGTTAAACATTAATCCTGTCAAGGAAGAAGATGCTACAACGTTTACGTGTATGGCGTTTACTATTCCTAG(SEQ ID No.20)。
[0085] 1.2.2荧光PCR反应体系
[0086] 反应体系包括上游引物、下游引物、探针，Probe qPCR Mix(TAKARA，RR391S)、Dye II(TAKARA，RR391S)、ddH2O和反应模板(1μg)，总反应体系为20μL。五组引物探针组合对应的反应体系如表2所示。
[0087] 表2反应体系
[0088]
[0089]
[0090] 1.2.3扩增程序
[0091] 第一、二、三组引物/探针优化后的退火及延伸温度为58℃，第四、五组引物/探针优化后的退火及延伸温度为60℃，荧光定量PCR反应程序如表3所示。
[0092] 表3荧光定量PCR反应程序
[0093]
[0094] 总反应时间为53分钟。
[0095] 实施例2：引物探针的退火、延伸温度测定。
[0096] 以猴痘病毒质粒作为扩增模板，分别以实施例1中的五组引物探针组合按照实施例1中反应体系和扩增程序进行实时荧光PCR检测，每次试验设2个平行，结果如表4所示。
[0097] 表4检测结果
[0098]
[0099] 注：“+”表示结果为阳性。
[0100] 结果显示，第一组引物探针组合(F1/R1/P1)和第三组引物探针组合(F3/R3/P3)在56‑60℃时的Ct值相差不大；第二组引物探针组合(F2/R2/P2)在58℃时Ct值相对较低，说明此条件下荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数最少；第四、五组引物探针组合的最适退火、延伸温度为60℃。
[0101] 实施例3：引物探针的浓度配比测定。
[0102] 1、第一组(F1/R1/P1)和第三组(F3/R3/P3)引物探针组合的浓度配比测定[0103] 取2μL猴痘病毒质粒(SEQ ID No.21)作为模板，引物(F/R)浓度以0.1μM、0.2μM、0.3μM、0.4μM，探针(P)浓度以0.3μM按照实施例1中对应的反应体系和扩增程序进行初步实时荧光PCR检测，每次试验设2个平行，第一组引物探针组合(F1/R1/P1)和第三组引物探针组合(F3/R3/P3)的浓度配比检验结果见表5。
[0104] 表5测定结果
[0105]
[0106] 注：“+”表示结果为阳性。
[0107] 结果显示，当引物(F/R)浓度为0.1μM，探针P浓度为0.3μM时，Ct值最小，说明此条件下荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数更少。
[0108] 选取引物浓度为0.1μM，探针(P)浓度为0.1μM～0.4μM进一步测试，检测结果如表6。
[0109] 表6检测结果
[0110]
[0111] 注：“+”表示结果为阳性。
[0112] 数据显示，当引物(F/R)浓度为0.1μM，探针P浓度为0.3μM时，Ct值和荧光增幅较优越，即第一组和第三组引物(F/R)最适浓度为0.1μM，探针(P)最适浓度为0.3μM。
[0113] 含猴痘病毒靶基因(B6R)片段的质粒序列5’‑3’(SEQ ID No.21)：
[0114] atgaaaacgatttccgttgttacgttgttatgcgtactacctgctgttgtttattcaacatgtactgtacccactatgaataacgctaaattaacgtctaccgaaacatcgtttaatgataaacagaaagttacgtttacatgtgattcaggatatcattctttggatccaaatgctgtctgcgaaacagataaatggaaatacgaaaatccatgcaagaaaatgtgcacagtttctgattatgtctctgaactatatgataagccattatacgaagtgaattccaccatgacactaagttgcaacggtgaaacaaaatattttcgttgtgaagaaaaaaatggaaatacttcttggaatgatactgtcacgtgtcctaatgcggaatgtcaacctcttcaattagaacacggatcgtgtcaaccagttaaagaaaaatactcatttggggaatatatgactatcaactgtgatgttggatatgaggttattggtgtttcgtatataagttgtacggctaattcttggaatgttattccatcatgtcaacaaaaatgtgatataccgtctctatctaatggattaatttccggatctacattttctatcggtggcgttatacatcttagttgtaaaagtggttttacactaacggggtctccatcatccacatgtatcgacggtaaatggaatcccatactcccaacatgtgtacgatctaacgaagaatttgatccagtggatgatggtcccgacgatgagacagatctgagcaaactctcgaaagacgttgtacaatatgaacaagaaatagaatcgttagaagcaacttatcatataatcataatggcgttgacaattatgggtgtcatatttctaatctctattatagtattagtttgttcctgtgacaaaaataatgaccaatataagttccataaattgctaccgtaa。
[0115] 2、第二组引物探针组合(F2/R2/P2)的浓度配比测定
[0116] 取2μL猴痘病毒质粒作为模板，引物(F2/R2)浓度以0.1μM‑0.4μM，探针(P2)浓度以0.1μM‑0.4μM按照实施例1中对应的反应组分和扩增程序进行正交试验，每次试验设2个平行，第二组引物/探针(F2/R2/P2)浓度配比检验结果见表7。
[0117] 表7检测结果
[0118]
[0119] 注：“+”表示结果为阳性。
[0120] 数据显示，当引物(F2/R2)浓度为0.4μM，探针P2浓度为0.4μM时，Ct值(25.31)最小，说明此条件下荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数最少。即第二组引物探针(F2/R2/P2)的最适浓度均为0.4μM。
[0121] 3、第四组(F4/R4/P4)和第五组(F5/R5/P5)引物探针组合的浓度配比测定[0122] 取2μL猴痘病毒质粒作为模板，引物(F/R)浓度以0.1μM‑0.4μM，探针(P)浓度以0.1μM‑0.4μM按照实施例1中对应的反应组分和扩增程序进行正交试验，每次试验设2个平行，第四组和第五组引物探针的浓度配比检验结果分别见表8、表9、图1和图2。
[0123] 表8第四组的浓度配比检测结果
[0124]
[0125] 注：“+”表示结果为阳性。
[0126] 数据显示，当探针P4浓度为0.4μM时，随着引物浓度的增加，Ct值变化相对较大，不稳定。对比其他浓度的Ct值和荧光增幅，当引物(F4/R4)浓度为0.3μM，探针P4浓度为0.3μM时，Ct值和荧光增幅均较为优越。即第四组引物和探针的最适浓度均为0.3μM。
[0127] 表9第五组的浓度配比检测结果
[0128]
[0129]
[0130] 注：“+”表示结果为阳性。
[0131] 数据显示，当探针P5浓度一定时，随着引物浓度的增加，Ct值变化相对较大，较不稳定，反之亦然。
[0132] 实施例4：引物探针组合的灵敏度试验。
[0133] 将猴痘病毒质粒进行10倍梯度稀释至0.5×100、0.5×101、0.5×102、0.5×103、4 5 6 7
0.5×10、0.5×10 、0.5×10、0.5×10copies/μL 8个梯度，分别取2μL作为模板，按照实施例1中对应的反应体系和扩增程序进行实时荧光PCR检测，每次试验设2个平行，前四组引物/探针灵敏度检测结果如表10、图3～图10所示。
[0134] 表10引物探针的灵敏度检验结果
[0135]
[0136] 注：“+”表示结果为阳性；“‑”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。
[0137] 结果显示，图3中当反应体系中模板浓度为0.5×101copies/μL时，出现典型扩增曲线，Ct值为38.93，表明本发明所设计的第一组引物探针(F1/R1/P1)灵敏度为0.5×1
10copies/μL。以猴痘病毒质粒DNA浓度(copies/μL)为横坐标，以Ct值为纵坐标，建立二者
2
的线性关系，如图4所示，得到的线性回归方程为：y＝‑3.26x+42.91，R＝0.996，扩增效率为1.02。
[0138] 图5中当反应体系中模板浓度为0.5×101copies/μL时，出现典型扩增曲线，Ct值1
为35.01，表明本发明所设计的第二组引物探针(F2/R2/P2)灵敏度为0.5×10 copies/μL。
以猴痘病毒质粒DNA浓度(copies/μL)为横坐标，以Ct值为纵坐标，建立二者的线性关系，如
2
图6所示，得到的线性回归方程为:y＝‑3.44x+38.24，R＝0.996，扩增效率为0.95。
[0139] 图7中当反应体系中模板浓度为0.5×103copies/μL时，出现典型扩增曲线，Ct值3
为36.98，表明本发明所设计的第三组引物探针(F3/R3/P3)灵敏度为0.5×10 copies/μL。
以猴痘病毒质粒DNA浓度(copies/μL)为横坐标，以Ct值为纵坐标，建立二者的线性关系，如
2
图8所示，得到的线性回归方程为:y＝‑4.47x+50.84，R＝0.994，扩增效率为0.67。
[0140] 图9中当反应体系中模板浓度为0.5×101copies/μL时，出现典型扩增曲线，Ct值1
为37.12，表明本发明所设计的第四组引物/探针(F4/R4/P4)灵敏度为0.5×10copies/μL。
以猴痘病毒质粒DNA浓度(copies/μL)为横坐标，以Ct值为纵坐标，建立二者的线性关系，如
2
图10所示，得到的线性回归方程为:y＝‑3.37x+40.18，R＝0.999，扩增效率为0.98。
[0141] 实施例5：引物探针组合的特异性试验。
[0142] 以7种正痘病毒的质粒作为扩增模板，ddH2O为空白对照，按照实施例1中反应体系和扩增程序进行实时荧光PCR检测，每次试验设2个平行，第一、二、四组引物探针的特异性检验结果见表11、图11、图12和图13。
[0143] 表11检测结果
[0144]
[0145] 注：“+”表示结果为阳性；“”表示结果为阴性；“Unde”表示未检测到荧光信号。
[0146] 结果显示，空白对照未出现扩增，说明反应体系未受到污染。用第一组引物探针(F1/R1/P1)和第四组引物探针(F4/R4/P4)进行实时荧光PCR检测时，大多数正痘病毒均有扩增，说明这两组引物探针对猴痘病毒不具有特异性。
[0147] 用第二组引物探针(F2/R2/P2)进行实时荧光PCR检测时，只有猴痘病毒的质粒出现典型的“S”型扩增曲线，而天花病毒、痘苗病毒、牛痘病毒、骆驼痘病毒、鼠痘病毒和沙鼠痘病毒6种正痘病毒及阴性对照均无扩增曲线，第二组引物探针(F2/R2/P2)具有良好的特异性。
[0148] 以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，对于本领域的技术人员来说，本发明可以有各种更改和变化。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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