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新型副干酪乳杆菌ATG-E1菌株或包含所述菌株的呼吸系统疾病预防治疗用组合物

申请号 CN202280051090.X 申请日 2022-06-14 公开(公告)号 CN117813372A 公开(公告)日 2024-04-02
申请人 株式会社爱托健; 姜智姬; 发明人 姜智姬; 李永实; 李大英; 任成薰; 池一容; 朴建锡; 高昇显; 朴珠丽; 李有卿;
摘要 本 发明 涉及一种新型副干 酪乳 杆菌ATG‑E1菌株(Lactobacillus paracasei ATG‑E1 strain,保藏编号为KCTC 14245BP)、包含所述菌株的 呼吸系统 疾病 预防 或 治疗 用组合物,其特征在于:所述呼吸系统疾病,是因为微细粉尘而诱发。所述副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株可以减少支气管 肺 泡以及肺组织的免疫细胞数量,并对 炎症 性细胞因子即白细胞介素‑17A(IL‑17A,Interleukin‑17A)、 肿瘤 坏死 因子(TNF‑α,tumor necrosis factor‑α)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2,Macrophage inflammatory protein2)、CXC趋化因子配体‑1(CXCL‑1,C‑X‑C Motif Chemokine Ligand1)、巨噬细胞炎症蛋白‑1α(MIP‑1α,MIP2,Macrophage inflammatory protein‑α)、或白细胞介素‑6(IL‑6,Interleukin‑6)的表达进行抑制,从而可以作为如急慢性支气管炎、卡他性支气管炎、闭塞性支气管炎、炎症性支气管炎、支气管哮喘、特应性哮喘、非特应性哮喘、特应性免疫球蛋白E(IgE)介导哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、慢性支气管收缩、急性支气管收缩、慢性阻塞性肺病、支气管腺瘤、肺结核、肺气肿、肺脓肿、肺 纤维 化症、肺癌、气道癌、支气管肺泡癌以及支气管癌等多种呼吸系统疾病的治疗剂或健康功能食品使用。
权利要求

1.一种副干酪乳杆菌ATG‑E 1菌株(Lactobacillus paracasei ATG‑E 1s train),其保藏编号为KCTC 14245BP。
2.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ATG‑E 1菌株(Lactobacillus paracasei ATG‑E 1s train),其保藏编号为KCTC 14245BP,其特征在于:
所述菌株含有其活菌体、死菌体、培养物、包含菌体的培养液、移除菌体的培养液、培养液的浓缩物以及从菌体或培养液分离的代谢物
3.根据权利要求1或权利要求2所述的副干酪乳杆菌ATG‑E 1菌株,其特征在于:
所述菌株具有呼吸系统疾病预防治疗功效。
4.根据权利要求1或权利要求2所述的副干酪乳杆菌ATG‑E 1菌株,其特征在于:
所述呼吸系统疾病是从由急慢性支气管炎、卡他性支气管炎、闭塞性支气管炎、炎症性支气管炎、支气管哮喘、特应性哮喘、非特应性哮喘、特应性IgE介导哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、慢性支气管收缩、急性支气管收缩、慢性阻塞性病、支气管腺瘤、肺结核、肺气肿、肺脓肿、肺纤维化症、肺癌、气道癌、支气管肺泡癌以及支气管癌构成的组中选择的疾病。
5.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ATG‑E 1菌株,其特征在于:
所述菌株具有在支气管肺泡或肺组织中减少炎症细胞以及免疫调节细胞的数量的功效。
6.根据权利要求1所述的副干酪乳杆菌ATG‑E 1菌株,其特征在于:
所述菌株具有减少作为炎症性细胞因子的白细胞介素‑17A即IL‑17A、肿瘤坏死因子‑α即TNF‑α、巨噬细胞炎症蛋白2即MIP2、CXC趋化因子配体‑1即CXCL‑1、巨噬细胞炎症蛋白‑1α即MIP‑1α、或白细胞介素‑6即IL‑6的表达的功效。
7.一种呼吸系统疾病的预防或治疗用药物组合物,包含根据权利要求1或权利要求2所述的菌株。
8.根据权利要求7所述的呼吸系统疾病的预防或治疗用药物组合物,其特征在于:
所述呼吸系统疾病是从由急慢性支气管炎、卡他性支气管炎、闭塞性支气管炎、炎症性支气管炎、支气管哮喘、特应性哮喘、非特应性哮喘、特应性IgE介导哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、慢性支气管收缩、急性支气管收缩、慢性阻塞性肺病、支气管腺瘤、肺结核、肺气肿、肺脓肿、肺纤维化症、肺癌、气道癌、支气管肺泡癌以及支气管癌构成的组中选择的疾病。
9.一种呼吸系统疾病的预防或改善用健康功能食品,包含根据权利要求1或权利要求2中的任一项所述的菌株。
10.根据权利要求9所述的呼吸系统疾病的预防或改善用健康功能食品,其特征在于:
所述呼吸系统疾病是从由急慢性支气管炎、卡他性支气管炎、闭塞性支气管炎、炎症性支气管炎、支气管哮喘、特应性哮喘、非特应性哮喘、特应性IgE介导哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、慢性支气管收缩、急性支气管收缩、慢性阻塞性肺病、支气管腺瘤、肺结核、肺气肿、肺脓肿、肺纤维化症、肺癌、气道癌、支气管肺泡癌以及支气管癌构成的组中选择的疾病。
11.一种呼吸系统疾病的预防或改善用食品组合物,包含根据权利要求1或权利要求2中的任一项所述的菌株。
12.根据权利要求11所述的呼吸系统疾病的预防或改善用食品组合物,其特征在于:
所述呼吸系统疾病是从由急慢性支气管炎、卡他性支气管炎、闭塞性支气管炎、炎症性支气管炎、支气管哮喘、特应性哮喘、非特应性哮喘、特应性IgE介导哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、慢性支气管收缩、急性支气管收缩、慢性阻塞性肺病、支气管腺瘤、肺结核、肺气肿、肺脓肿、肺纤维化症、肺癌、气道癌、支气管肺泡癌以及支气管癌构成的组中选择的疾病。

说明书全文

新型副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株或包含所述菌株的呼吸系统疾

预防治疗用组合物

技术领域

[0001] 本发明涉及一种新型副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株(Lactobacillus paracasei ATG‑E1strain,保藏编号为KCTC 14245BP)或包含所述菌株的呼吸系统疾病预防或治疗用组合物。

背景技术

[0002] 微细粉尘是指在大气中漂浮或飞散的颗粒状物质,会在如炭和石油等化石燃料燃烧或工厂的燃烧工程以及汽车燃料的燃烧过程中大量发生。
[0003] 微细粉尘可以根据离子直径进行区分,其中PM10是指小于10μm的粒子,而PM2.5是指小于2.5μm的粒子。据了解,微细粉尘的粒子非常微小,无法被鼻毛或支气管粘膜过滤,因此在吸入时可能会直接浸润到泡或者大脑。一旦微细粉尘进入到人体,负责免疫的细胞就会通过清除粉尘而保护人体,此时就会出现副作用炎症反应。已经有报告指出,当在如呼吸道、肺、心血管以及大脑等人体的各个器官出现如上所述的炎症反应时,会导致哮喘、呼吸系统以及肺部疾病的患病率以及早期死亡率的增加。微细粉尘与现有的因为细菌、暂时中毒或其他物质流入呼吸道而导致的呼吸系统以及肺损伤不同,无法通过人体的免疫予以消除,而且在微细粉尘通过呼吸系统流入时,也无法将其强制排出。此外,因为并不能准确掌握这些损伤会导致什么样的问题发生,因此急需一种可以对因为微细粉尘而诱发的呼吸道以及肺部的损伤进行预防、缓解、治疗或改善,而且可以对因此而诱发的呼吸系统疾病进行治疗的新型的治疗剂。
[0004] 乳酸菌作为益生菌的一种,可以在人体的消化系统中共生并起到将纤维以及复合蛋白分解转化成重要的营养成分的作用。乳酸菌是一种可以对化合物进行分解并借此生成乳酸的细菌,属于可以在气较少的环境下高效繁殖的厌氧菌。近年来,乳酸菌对多种疾病的预防以及治疗效果已经得到了证实,因此也在尝试开发出利用乳酸菌的健康功能食品以及治疗剂。
[0005] 因此,本发明人在对利用乳酸菌的呼吸系统疾病改善方法进行各种研究的过程中,发现新型副干酪乳杆菌ATG‑E 1菌株可以对因为微细粉尘毒性而导致的呼吸系统免疫进行调节并对验证反应进行抑制,从而完成了本发明。
[0006] 先行技术文献
[0007] 专利文献
[0008] 韩国注册专利第10‑2165930号(发明名称:含有乳酸菌的微细粉尘刺激诱发的呼吸系统疾病或炎症疾病治疗用组合物,申请人:(株)绿十字福利,注册日期:2020年10月07日)
[0009] 韩国注册专利第10‑2049700号(发明名称:包含罗伊氏乳杆菌ATG‑F4的肌肉疾病预防或治疗用组合物,申请人:(株)AtoGen,注册日期:2019年11月21日)
[0010] 韩国注册专利第10‑2163551号(发明名称:含有植物乳杆菌ATG‑K2或ATG‑K6的脂质相关代谢性疾病的预防以及治疗用组合物,申请人:(株)AtoGen,注册日期:2020年09月29日)
[0011] 韩国注册专利第10‑1500974号(发明名称:具有抗炎症以及代谢性疾病改善功效的植物乳杆菌HAC01菌株及其用途,申请人:(株)AtoGen,注册日期:2015年03月04日)[0012] 韩国注册专利第10‑1951919号(发明名称:具有多巴胺分泌增强功能的新型罗伊氏乳杆菌ATG‑F4菌株、含有所述菌株的精神疾病预防或治疗用组合物,申请人:(株)AtoGen,注册日期:2019年02月19日)

发明内容

[0013] 本发明的目的在于提供一种新型副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株(Lactobacillus paracasei ATG‑E1strain,保藏编号为KCTC 14245BP)、包含所述菌株的呼吸系统疾病预防或治疗用组合物。
[0014] 本发明涉及一种副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株(Lactobacillus paracasei ATG‑E1strain,保藏编号为KCTC 14245BP)。
[0015] 所述菌株,可以包含其活菌体、死菌体、培养物、包含菌体的培养液、移除菌体的培养液、培养液的浓缩物以及从菌体或培养液分离的代谢物
[0016] 本发明的特征在于:所述菌株,具有因为微细粉尘而诱发的呼吸系统疾病的预防或治疗功效。
[0017] 所述呼吸系统疾病,可以是从由急慢性支气管炎、卡他性支气管炎、闭塞性支气管炎、炎症性支气管炎、支气管哮喘、特应性哮喘、非特应性哮喘、特应性免疫球蛋白E(IgE)介导哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、慢性支气管收缩、急性支气管收缩、慢性阻塞性肺病、支气管腺瘤、肺结核、肺气肿、肺脓肿、肺纤维化症、肺癌、气道癌、支气管肺泡癌以及支气管癌构成的组中选择的疾病。
[0018] 本发明的特征在于:所述菌株,具有在支气管肺泡或肺组织中减少炎症细胞以及免疫调节细胞的数量的功效,因此,所述副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株,具有减少炎症性细胞因子即白细胞介素‑17A(IL‑17A,Interleukin‑17A)、肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α,tumor necrosis factor‑α)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2,Macrophage inflammatory protein 2)、CXC趋化因子配体‑1(CXCL‑1,C‑X‑C Motif Chemokine Ligand 1)、巨噬细胞炎症蛋白‑1α(MIP‑1α,MIP2,Macrophage inflammatory protein‑α)、或白细胞介素‑6(IL‑6,Interleukin‑6)的表达的功效。
[0019] 本发明涉及一种包含所述副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株的呼吸系统疾病的治疗或改善用药物组合物。
[0020] 本发明提供一种包含副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株的呼吸系统疾病的预防或改善用健康功能食品或一般食品组合物。
[0021] 接下来,将对本发明进行详细的说明。
[0022] 本发明的特征在于:所述副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株,不会生成组胺(histamine)、酪胺(tyramine)、腐胺(putrecine)以及尸胺(cadaverine)等生物胺(biogenic amine)。
[0023] 所述副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株具有耐酸性或耐胆汁性。
[0024] 本发明的特征在于:所述副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株,不具有对从由苄西林(ampicillin)、万古霉素(vancomycin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、克林霉素(clindamycin)、红霉素(erythromycin)、四环素(tetracycline)以及氯霉素(chloramphenicol)构成的组中选择的一种以上的抗生素的耐性。
[0025] 本发明的包含ATG‑E1菌株的组合物,可以包含从由其活菌体、死菌体、培养物、包含菌体的培养液、移除菌体的培养液、培养液的浓缩物以及从菌体或培养液分离的代谢物构成的组中选择的某一个以上。
[0026] 本发明的菌株可以在德曼‑罗戈萨‑夏普(MRS)液体或固体培养基(肉汤(broth)或10
琼脂(agar))中进行培养,而且可以培养至大约1×10 CFU/mL的浓度。
[0027] 所述菌株在35~40℃下培养8~20小时为宜,可培养的最佳温度为37℃,最低温度为15℃,最高温度为45℃,最佳pH为6.0,可培养的最低pH为4.0,最大pH为7.8。最佳培养时间为16小时,最小培养时间为8小时,最大培养时间为24小时。
[0028] 此外,本发明提供一种含有新型副干酪乳酸菌ATG‑E1的呼吸系统疾病的预防或治疗用药物组合物。所述新型副干酪乳杆菌ATG‑E1可以以0.001~100重量%添加到本发明的药物组合物中。
[0029] 所述药物组合物可以分别按照一般的方法制剂化成如散剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、混悬剂、乳剂、糖浆剂以及气雾剂等口服剂型或外用剂以及栓剂的形态使用。作为可包含于所述药物组合物中的载体、赋形剂以及稀释剂,可以以如乳糖、葡萄糖蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓糖醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷、水、羟基苯甲酸甲酯、羟基苯甲酸丙酯、滑石、硬脂酸镁以及矿物油为例。在进行制剂化时可以使用通常所使用的如填充剂、增量剂、湿润剂、崩解剂以及表面活性剂等稀释剂或赋形剂进行制备。用于经口给药的固态制剂包括如片剂、烷基、散剂、颗粒剂以及胶囊剂等,而如上所述的固态制剂可以通过向本发明的菌株添加如淀粉、碳酸钙、蔗糖、乳糖以及明胶等至少一种以上的赋形剂的方式进行制备。此外,除了单纯的赋形剂之外还可以使用如硬脂酸镁以及滑石等润滑剂。用于经口给药的液态制剂包括如悬浮剂、内服液剂、乳剂以及糖浆等,除了通常所使用的单纯稀释剂即水以及液态石蜡之外,还可以包含如湿润剂、甜味剂、芳香剂以及保存剂等各种赋形剂。用于非经口给药的制剂包括灭菌水溶液、非水性溶剂、悬浮剂、乳剂、冻结干燥制剂、栓剂以及阴道栓剂。作为非水性溶剂以及悬浮剂可以使用如丙二醇、聚乙二醇、如橄榄油植物油以及如油酸乙酯等注射用酯类等。作为栓剂的基剂可以使用如Witepsol、Macrogol、Tween 61、可可脂、月桂酸甘油酯以及甘油明胶等。
[0030] 本发明的药物组合物的给药量可以根据需要接受治疗的对象的年龄和性别以及体重、需要治疗的特定疾病或病理状态、疾病或病理状态的严重程度、给药途径以及开处方者的判断发生变化。相关从业人员可以根据自己的水平以如上所述的因素为基础决定给药量,一般的给药量是在0.01㎎/㎏/天至大约2000㎎/㎏/天的范围之内。作为更较佳的给药量,可以是1㎎/㎏/天至500㎎/㎏/天。给药可以是一天一次,也可以是一天多次。所述给药量在任何方面都不是为了对本发明的范围做出限定。
[0031] 本发明的药物组合物可以通过多种途径向如老鼠、家畜以及人类等哺乳动物进行给药。因为本发明的菌株几乎没有任何毒性以及副作用,因此是一种即使以预防为目的长期服用的情况下也可以放心使用的药剂。
[0032] 此外,本发明提供一种含有新型副干酪乳酸菌ATG‑E1的呼吸系统疾病的预防或改善用健康功能食品。所述副干酪乳杆菌ATG‑E1可以以0.001~100重量%添加到本发明的健康功能食品中。本发明的健康功能食品包括如散剂、片剂、胶囊剂、烷基或液剂等形态,可以添加本发明的菌株的食品包括如各种饮料、肉类、香肠、面包、糖果、零食、面类、淇淋、乳制品、汤类、离子饮料、饮用水酒精饮料、口香糖、茶以及维生素复合剂等。
[0033] 本发明涉及一种新型副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株(Lactobacillus paracasei ATG‑E1strain,保藏编号为KCTC 14245BP)、包含所述菌株的呼吸系统疾病预防或治疗用组合物,其特征在于:所述呼吸系统疾病,是因为微细粉尘而诱发。所述副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株可以对支气管肺泡和肺组织的炎症细胞以及多种免疫细胞的活性进行抑制,并对炎症性细胞因子即白细胞介素‑17A(IL‑17A,Interleukin‑17A)、肿瘤坏死因子(TNF‑α,tumor necrosis factor‑α)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2,Macrophageinflammatory protein2)、CXC趋化因子配体‑1(CXCL‑1,C‑X‑C Motif Chemokine Ligand1)、巨噬细胞炎症蛋白‑1α(MIP‑1α,MIP2,Macrophage inflammatory protein‑α)、或白细胞介素‑6(IL‑6,Interleukin‑6)等的表达进行抑制,从而可以作为如急慢性支气管炎、卡他性支气管炎、闭塞性支气管炎、炎症性支气管炎、支气管哮喘、特应性哮喘、非特应性哮喘、特应性免疫球蛋白E(IgE)介导哮喘、过敏性哮喘、非过敏性哮喘、慢性支气管收缩、急性支气管收缩、慢性阻塞性肺病、支气管腺瘤、肺结核、肺气肿、肺脓肿、肺纤维化症、肺癌、气道癌、支气管肺泡癌以及支气管癌等多种呼吸系统疾病的治疗剂或健康功能食品使用。附图说明
[0034] 图1对利用本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株以及利用微细粉尘进行处理的动物模型中的支气管肺泡灌洗液的总细胞数和中性粒细胞(neutrophils)细胞数及其照片进行了图示。
[0035] 图2对利用本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株以及利用微细粉尘进行处理的动物模型中的支气管肺泡灌洗液的细胞内炎症性细胞因子的蛋白表达程度的确认结果进行了图示。
[0036] 图3对利用本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株以及利用微细粉尘进行处理的动物模型中的肺组织细胞内炎症性细胞因子的信使核糖核酸(mRNA)表达程度的确认结果进行了图示。
[0037] 图4对利用本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株以及利用微细粉尘进行处理的动物模型中的肺组织染色照片进行了图示。
[0038] 图5是对本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株的16S核糖体核糖核酸(rRNA)基序列进行图示的示意图。

具体实施方式

[0039] 接下来,将对本发明的较佳实施例进行详细的说明。但是,本发明并不限定于在此进行说明的实施例,而是还可以通过其他形态实现。所述实施例只是为了更加彻底且完整地介绍本发明的内容,并向相关从业人员充分传递本发明的思想。
[0040] <实施例1.副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ATG‑E1新型乳酸菌的分离以及鉴定>
[0041] 为了获得菌株,在采集婴儿(新生儿)的粪便之后向经过高压灭菌的袋子投入90ml的生理食盐水(0.85%NaCl/L),并在投入10g的原材料样本之后均匀搅拌,然后分株1ml并在9ml的生理食盐水中以10倍进行阶段性稀释,最后重复三次涂抹在德曼‑罗戈萨‑夏普(MRS)固体培养基中。接下来,在37℃的培养器中培养48小时以上,然后通过利用0.3%过氧化氢的过氧化氢酶(catalase)以及革兰氏染色法对所生长出来的细菌进行分析。接下来,在筛选出过氧化氢酶阴性、革兰氏阳性且杆菌呈杆状(rod)形状的细菌之后对菌株的16S核糖体核糖核酸(rDNA)基因碱基序列进行了分析,然后将通过16S核糖体核糖核酸测序(rRNA sequencing)获得的碱基序列与美国国家生物技术信息中心基本局部比对搜索工具数据库(NCBI  BLAST database)进行了对比,其结果显示副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)与16S核糖体核糖核酸(rRNA)序列99.9%一致,可以确认其分类学位置属于副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)。
[0042] 此外,利用津纳米孔技术(Oxford Nanopore Technologies)公司的MinION测序平台(seqeuencing platform)获得了3,124,497bp的完整的全长基因组碱基序列,而且为了与标准菌株的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei,ATCC 25302)的全长基因组进行比较而进行了平均遗传相似度(Average Nucleotide Identity,ANI)分析,其结果呈现出了98.37%的类似性,因为在全长基因组上呈现出1.63%的差异,因此将其判定为新型菌株(表1)。因此,将本申请原料命名为副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ATG‑E1,并在韩国生命工学研究院的生物资源中心以KCTC 14245BP的保藏编号对菌株进行了保藏。
[0043] 【表1】
[0044] 项目 数值平均遗传相似度值(ANI value) 98.37%
ATG‑E1基因组大小(genome size) 3,124,497bp
标准菌株基因组大小(Type strain genome size) 2,939,640bp
[0045] <实施例2.副干酪乳杆菌ATG‑E1巡行乳酸菌的特性确认>
[0046] 实施例2‑1.糖利用特性
[0047] 使用API 50CH试纸条(API 50CH test,Biomerieux)按照相应手册中的方法执行,从而对通过本发明分离的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ATG‑E1菌株的糖利用特性进行了分析。其结果,在本发明的副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)ATG‑E1菌株中观察到了如下述表2所示的糖利用特性。
[0048] 【表2】
[0049]
[0050]
[0051] 实施例2‑2.耐酸性以及耐胆汁性测试
[0052] 按照以与人体(胃以及十二指肠)环境类似的条件设定的模拟胃十二指肠道(SSDP,simulated stomach duodenum passage)法对菌株执行了耐酸性以及耐胆汁性试验。在将所分离的副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株在德曼‑罗戈萨‑夏普(MRS)液体培养基中培养18小时之后,将1ml的菌株液投入到试管中执行离心分离(3000xg,5分钟,4℃),接下来丢弃上清液并重复执行两次利用生理食盐水对细胞板进行洗涤的过程。接下来,移除生理食盐水并将发生沉淀的细菌混合到10ml的将pH调节为3的德曼‑罗戈萨‑夏普(MRS)液体培养基中。取悬浮液中的1ml并以10倍进行阶段性稀释,接下来在涂抹到德曼‑罗戈萨‑夏普(MRS)固体培养基中并在37℃下培养24~48小时之后对所生成的细菌数进行记数,从而计算出最终细菌的CFU/ml,而剩余的9ml在37℃下培养1小时之后,连续混合胆汁酸(在向10g的牛胆汁(oxgall)投入100ml的蒸馏水并进行高压灭菌之后使用)以及17ml的十二指肠液
(duodenum juice;6.4g/L NaHC03,再将0.239g/L KCl以及1.28g/L NaCl均匀混合到蒸馏水之后将pH调节至7.4并在进行高压灭菌之后使用)并进行记数。此外,将所记数的最初细菌的CFU/ml以及存活3小时的细菌的CFU/ml进行比较,并将其记作存活率。
[0053] 【表3】
[0054]
[0055] 通过表3可以确认,副干酪乳杆菌ATG‑E1在经过胃酸条件以及胆汁之后直至小肠为止的存活率非常高。
[0056] 实施例2‑3.抗生素耐性测试
[0057] 利用E‑测试条(E‑test strip,BuoMerieux,法国)对氨苄西林(ampicillin)、万古霉素(vanacomycin)、庆大霉素(gentamicin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、克林霉素(clindamycin)、红霉素(erythromycin)、四环素
(tetracycline)以及氯霉素(chlorampenicol)等9种抗生素的最低抑菌浓度(minimum inhibitory concentration,MIC)值进行了确认。简单来讲,将需要试验的乳酸菌分别悬浮至大约0.8的OD600吸光度之后,利用灭菌棒涂抹到德曼‑罗戈萨‑夏普(MRS)固体培养基中。在对涂抹有乳酸菌的固体培养基进行大约3分钟的干燥之后放置E‑测试条(test strip),接下来在37℃下进行48小时的培养。但是,因为从乳酸菌的特性上来讲,可能会发生对氨基糖苷(aminoglycoside)类的庆大霉素(genetamicin)、卡那霉素(kanamycin)以及链霉素(streptomycin)产生天然固有耐性(intrinsic resistance)的情况,因此作为对所述抗生素的测试培养基(testmedium),使用了平板计数琼脂(plate count agar,PCA,Difco Laboratories,美国)或穆勒‑欣顿琼脂(Mueller‑Hinton agar,MHA,Difco Laboratories,美国)。关于抗生素的类型以及可判定为安全的最低抑菌浓度标准,参阅了由欧洲食品安全局(European food safety authority,EFSA)发布的指南。
[0058] 【表4】
[0059]
[0060] 各个分析结果为副干酪乳杆菌ATG‑E1乳酸菌对如上所述的表4中的主要抗生素的最低抑菌浓度(MIC)测定试验结果,可以确认本发明的菌株具有与欧洲食品安全局(EFSA)指南的限制值相比显著较低的抗生素敏感性,借此可以确认副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株不存在与其他菌株交换抗生素耐性基因的险。而且,在接下来利用全长基因组信息通过PathogenFinder对副干酪乳杆菌ATG‑E1乳酸菌的病原性与否进行预测时,与数据库进行对照的结果没有任何与致病家族(pathogenic family)匹配的项目,而有480项与非致病家族(not pathogenic family)匹配的项目,属于非人类病原体(non‑human pathogen)即没有人体有害性。
[0061] 实施例2‑4.生物胺生成测试
[0062] 制作出添加有0.1%的氨基酸前驱体(L‑酪氨酸二钠盐(tyrosine disodium salt)、L‑组氨酸一盐酸盐一水合物(histidine monohydrochloride monohydrate)、L‑氨酸盐酸盐(ornithine  monohydrochloride)以及L‑赖氨酸盐酸盐(lysine monohydrochloride))的德曼‑罗戈萨‑夏普(MRS)液体培养基,并在将所分离的副干酪乳杆菌ATG‑E1菌株以1%接种到包含氨基酸前驱体的德曼‑罗戈萨‑夏普(MRS)液体培养基中之后进行5~10次继代培养,然后激活脱羧酶(decarboxylase)。在将酶激活的细菌涂抹到脱羧酶培养基(在将0.5%的胰蛋白胨、0.5%的酵母提取物、0.5%的辣椒提取物、0.5%的氯化钠、0.25%的葡萄糖、0.05%的吐温‑80、0.02%的硫酸镁、0.005%的硫酸锰、0.004%的硫酸、0.2%的柠檬酸盐、0.001%的硫胺素、0.2%的K2PO4、0.01%的碳酸钙、0.005%的吡多‑5‑磷酸盐(pyridoxal‑5‑phosphate)、1%的氨基酸、0.006%的溴甲酚红紫(bromocresol purple)以及2%的琼脂混合到蒸馏水中并将pH调节至5.3之后使用)之后在
37℃下进行48小时的培养并确认其是否转换成紫色,从而对生物胺生成能力进行了判定。
[0063] 【表5】
[0064]  酪胺 组胺 腐胺 尸胺
副干酪乳杆菌ATG‑E1 ‑ ‑ ‑ ‑
[0065] 分析结果如表5所示,ATG‑E1菌株在生物胺的生成能力方面,从氨基酸前驱体即酪氨酸、组氨酸、鸟氨酸以及赖氨酸生成生物胺即酪氨、组胺、腐胺以及尸胺的能力都呈现出了阴性,借此可以确认本发明的菌株没有可能诱发过敏性免疫反应的生物胺生成能力。
[0066] <实施例3.对因为如微细粉尘等大气污染物质而导致的呼吸系统损伤的预防以及改善效果确认>
[0067] 实施例3‑1.呼吸系统损伤小鼠模型试验
[0068] 将Balb/c小鼠(雄性,8周龄)分成每组8只,而且对于除正常组之外的所有组,将大气污染物质的构成成分即PM10(Simga)以及柴油废气颗粒(diesel exhaust particle,DEP)以明矾(Alum)的最终浓度为1%的方式进行混合,接下来将所述微细粉尘混合物利用在文献中记载的鼻内气管(Intra‑Nazal‑Trachea,INT)注射(injection)方法在实验开始的第4天、第7天以及第10天直接注入到试验动物的气管以及鼻腔中(Lim et al.,Free Radic Biol Med.25(6),635‑644(1998),Shin et al.,Korean J.Mediclinal Crop Sci 27(3),218‑231(2019))。作为阳性对照组,将3mg/kg BW的地塞米松(dexamethasone,也被标记为Dexa,Sigma,D2915)以及利用0.5%的羧甲基纤维素钠(sodium carboxymethyl 
9
cellulose,CMC,Sigma,419273)溶液稀释至4×10CFU/只的浓度的乳酸菌即副干酪乳杆菌ATG‑E1每天口服给药共计10天。在试验开始之后的第11天,通过尸检回收了支气管肺泡灌洗液(BALF:bronchoalveloar lavage fluid)以及肺组织。
[0069] 实施例3‑2.支气管肺泡灌洗液(BALF:Bronchoalvelar lavage fluid)中的总细胞数以及中性粒细胞(neutrophils)数测定
[0070] 在实施例3‑1的试验结束日期进行麻醉之后获得支气管肺泡灌洗液(BALF:Bronchoalvelar lavage fluid),然后利用0.04%的台盼蓝(trypan blue)进行染色并利用血细胞计数器(hematocytometer)对总细胞数进行计算,从而测定除了支气管肺泡灌洗液的总细胞数,接下来利用细胞离心涂片(cytospin)涂抹标板之后执行迪夫快速(Diff‑Quick)染色,从而通过光学显微镜鉴别计算出了中性粒细胞(neutrophils)数。
[0071] 其结果如图1所示,可以确认微细粉尘混合呼吸系统损伤诱导组(CTL)的支气管细胞灌洗液的总细胞数量以及验证免疫细胞即中性粒细胞(neutrophils)数显著增加,而在微细粉尘混合呼吸系统损伤有道之后利用副干酪乳杆菌ATG‑E1(ATG‑E1)进行给药的组中,呈现出了支气管肺泡灌洗液的总细胞数减少的倾向,而且因为微细粉尘混合物(大气污染物质)而增加的中性粒细胞(neutrophils)细胞数也显著减少。
[0072] 借此可以确认,通过副干酪乳杆菌ATG‑E1的给药,可以呈现出因为微细粉尘而诱发的呼吸系统疾病的抑制效果。
[0073] 实施例3‑3.总支气管肺泡灌洗液(BALF:Brochoalvelar lavage fluid)中的免疫细胞分析
[0074] 通过荧光激活细胞分选(FACS,Fluorescence‑activated cell sorting)分析对从实施例3‑1的试验结束之后的各个个体分离的支气管肺泡灌洗液的免疫细胞特性(如淋巴细胞(Lymphocytes)、中性粒细胞(Neutrophils)、巨噬细胞(Macrophage)、T细胞亚型+ +(Tcell subtypes)以及Gr‑1CD11b等)进行了测定。
[0075] 【表6】
[0076]
[0077] 各个免疫细胞的数量如表6所示,可以确认在微细粉尘混合呼吸系统损伤诱导组(CTL)中,所有免疫细胞的细胞数量显著增加,而与此相反,在微细粉尘混合呼吸系统损伤诱导之后利用副干酪乳杆菌ATG‑E1进行给药的组中,免疫细胞即中性粒细胞+ + +
(Neutrophils)、CD4 、CD4 CD69 以及微细粉尘混合物诱导炎症反应的特异性标志物即+high
CD62L‑CD44 的细胞数量显著减少。
[0078] 实施例3‑4.从肺组织分离的细胞中的免疫细胞分析
[0079] 通过荧光激活细胞分选(FACS,Fluorescence‑activated cell sorting)分析对从实施例3‑1的试验结束之后的个体的肺组织分离的细胞的免疫细胞特性(如淋巴细胞(Lymphocytes)、中性粒细胞(Neutrophils)、巨噬细胞(Macrophage)、T细胞亚型(T cell + +subtypes)以及Gr‑1CD11b等)进行了测定。
[0080] 【表7】
[0081]
[0082] 各个结果如表7所示。其结果在肺组织中,同样可以确认在微细粉尘混合呼吸系统损伤诱导组(CTL)中,所有免疫细胞的细胞数量显著增加,而与此相反,在微细粉尘混合呼吸系统损伤诱导之后利用副干酪乳杆菌ATG‑E1(ATG‑E1)进行给药的组中,免疫细胞即中性+ + +粒细胞(Neutrophils)、CD4、CD4CD69以及微细粉尘混合物诱导炎症反应的特异性标志物‑ +high + + + +
即CD62LCD44 、CD21/35B220以及Gr‑1CD11b的细胞数量显著减少。
[0083] 实施例3‑5.总支气管肺泡灌洗液(BALF:Brochoalvelar lavage)内炎症因子生成测定
[0084] 利用市售的ELISA试剂盒(R&D system,美国)按照制造企业的试验方法对试验例3‑1的试验结束之后的个体的支气管肺泡灌洗液(BALF)内的验证因子即白细胞介素‑17A(IL‑17A,Interleukin‑17A)、肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α,tumor necrosis factor‑α)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2,Macrophage inflammatory protein 2)以及CXC趋化因子配体‑1(CXCL‑1,C‑X‑C Motif Chemokine Ligand 1)的表达进行了测定。
[0085] 其结果如图2所示,炎症因子即白细胞介素IL‑7A(IL‑17A)、肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)、巨噬细胞炎症蛋白2(MIP2)以及CXC趋化因子配体‑1(CXCL‑1)在微细粉尘混合呼吸系统损伤诱导组(CTL)中显著增加,而与此相反,在微细粉尘混合呼吸系统损伤之后利用副干酪乳杆菌ATG‑E1进行给药时,如上所述的炎症因子的生成量显著减少。
[0086] 实施例3‑6.在肺组织中的炎症诱发因子的表达分析
[0087] 从实施例3‑1的试验结束之后的个体摘取的肺组织中利用RNAzol B试剂(RNAzol B reagent,Tel‑Test,奥斯汀,得克萨斯州,美国)提取出了总核糖核酸(total RNA),并将3μg的总核糖核酸(total RNA)利用ReverTraAce‑a‑cDNA合成试剂盒(ReverTraAce‑a‑cDNA Synthesis kit,Toyobo,大阪,日本)合成出了互补脱氧核糖核酸(cDNA)。对所合成的互补脱氧核糖核酸(cDNA)利用Applied Biosystems 7500实时聚合没脸反应系统(Applied Biosystems 7500 Real‑time PCR system,Applied Biosystems,美国)执行实时聚合酶链反应(real‑time PCR),从而对白细胞介素(IL‑6,Interleukin‑6)、肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)、CXC趋化因子配体‑1(CXCL‑1)以及巨噬细胞炎症蛋白‑1α(MIP‑1α)的表达进行了分析。作为实时聚合酶链反应的条件,预变性(pre‑denaturation)是在50℃下执行2分钟、在94℃下执行10分钟、在94℃下执行1分钟40轮以及在60℃下执行1分钟。在基因分析中使用的引物碱基序列如表8所示。作为内标物(internal standard)使用3‑磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)对试料给药组以及对照组的相对定量(RQ,relative quantitative)进行了测定。
[0088] 【表8】
[0089]
[0090] 实时聚合酶链反应(real‑time PCR)结果如图3所示,可以确认在微细粉尘混合呼吸系统损伤诱导组(CTL)的肺组织中,炎症诱发因子即白细胞介素‑6(IL‑6)、肿瘤坏死因子‑α(TNF‑α)、CXC趋化因子配体‑1(CXCL‑1)以及巨噬细胞炎症蛋白‑1α(MIP‑1α)的表达增加,但是在利用副干酪乳杆菌ATG‑E1进行给药时,如上所述的炎症诱发因子的基因表达显著减少。
[0091] 实施例3‑7.组织病理学检查
[0092] 在从实施例3‑1的试验结束之后的个体摘取肺组织之后,通过执行10%中性缓冲福尔林(neutral buffered formalin)固定以及石蜡包埋而制造出体(block),接下来制造出组织切片(厚度为4μm)。接下来,为了对肺组织内的验证进行观察而执行了苏木精&伊红(H&E,Hematoxylin&Eosin)染色,并通过执行胶原蛋白沉积(collagen deposition)染色即马松三色(MT,Masson's trichrome)染色以及用于粘液分泌染色的过碘酸希夫(PAS,periodic acid Schiff)染色而利用光学选未经对肺组织的病理学变化进行了观察。
[0093] 观察结果如图4所示,可以确认在微细粉尘混合呼吸系统损伤诱导组(CTL)中与正常组相比其肺细胞壁变厚且胶原纤维增加,而且观察到了如炎症症状等组织损伤,但是在副干酪乳杆菌ATG‑E1给药组中如上所述的组织损伤得到了缓解。
[0094] <制剂例1.药学制剂>
[0095] 制剂例1‑1.片剂的制造
[0096] 将200g的本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1与175.9g的乳糖、180g的马铃薯淀粉以及32g的胶体硅酸混合。向所述混合物添加10%的明胶溶液之后进行粉碎并使其通过14目网筛。将在对其进行干燥之后添加160g的马铃薯淀粉、50g的滑石以及5g的硬脂酸镁而获得的混合物制作成片剂。
[0097] <制剂例2.食品的制造>
[0098] 制剂例2‑1.烹饪调味料的制造
[0099] 将本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1以1重量%添加到烹饪调味料中而制造出了健康增强用烹饪调味料。
[0100] 制剂例2‑2.乳制品(dairy products)的制造
[0101] 将本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1以0.1重量%添加到牛奶中,并利用所述牛奶制造出了如黄油以及冰淇淋等多种乳制品。
[0102] 制剂例2‑5.蔬菜汁的制造
[0103] 将0.5g的本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1添加到1000ml的番茄汁或胡萝卜汁中而制造出了健康增强用蔬菜汁。
[0104] 制剂例2‑6.果汁的制造
[0105] 将0.1g的本发明的副干酪乳杆菌ATG‑E1添加到1000ml的苹果汁或葡萄汁中而制造出了健康增强用果汁。
[0106] 【保藏机构】
[0107] 保藏机构名称:韩国典型培养物保藏中心
[0108] 保藏编号:KCTC 14245BP
[0109] 保藏日期:20200721
[0110] 专利程序的微生物保藏国际承认的布达佩斯条约
[0111] 国际表格
[0112] 收到原始保藏
[0113] 根据第7条第1款颁发
[0114] 致:姜智姬
[0115] 姜智姬
[0116] 韩国大田儒城区科技1路11‑8
[0117]