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用于抑制CIDEB基因表达的siRNA、药物及其应用
申请号 CN202380012566.3 申请日 2023-11-21 公开(公告)号 CN117813383A 公开(公告)日 2024-04-02
申请人 广州必贝特医药股份有限公司; 发明人 范福顺; 刘新建; 林莹莹; 钱长庚;
摘要 本 发明 涉及用于抑制人 体细胞 中CIDEB表达的siRNA，并公开了对所述siRNA进行了合适的修饰，用以提高靶标的沉默能 力 并降低非靶点活性。本发明还提供了含有上述siRNA的用于抑制CIDEB表达的 生物 制剂或者药物制剂。本发明通过一系列体外和体内试验中，获得了具有很好的抑制CIDEB表达生物活性的siRNA序列，有望应用于临床上进行与CIDEB相关的 疾病 具有很好的应用。
权利要求

1.一种用于抑制细胞中诱导细胞死亡的DFFA样效应因子B(Cell death‑inducing 
DFFA‑like effector b，CIDEB)表达的siRNA，其包括正义链及反义链，所述正义链和所述反义链能够互补，其序列选自表1所示中的任意一组双链体或与其组成相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸序列，包括BBD‑4102，BBD‑4101和BBD‑4005所示序列。
2.根据权利要求1所述的siRNA，其中，所述siRNA选自如下至少一对或其修饰序列:
a)BBD‑4101,其正义链如SEQ ID NO.201所示，反义链如SEQ ID NO.202所示；
b)BBD‑4102,其正义链如SEQ ID NO.203所示，反义链如SEQ ID NO.204所示；
c)BBD‑4005，其正义链如SEQ ID NO.9所示，反义链如SEQ ID NO.10所示；
d)BBD‑4012，其正义链如SEQ ID NO.23所示，反义链如SEQ ID NO.24所示。
3.根据权利要求2所述的siRNA，其中，所述siRNA选自BBD‑4101、BBD‑4102或其经修饰序列。
4.根据权利要求1‑3所述的siRNA，其中，所述正义链包括不多于3、2、1或0个未修饰的核苷酸，所述正义链中的修饰核苷酸包含分别选自2'‑O‑甲基修饰的核苷酸、2'‑脱氧核苷酸、2'‑氟修饰的核苷酸、末端反向无碱基残基、锁核酸，所述正义链在5'‑末端含有1，或2，或3个硫代磷酸酯键；
以及所述反义链包括不多于3、2、1或0个未修饰的核苷酸，所述反义链中的修饰的核苷酸包括分别选自2'‑O‑甲基修饰的核苷酸、2'‑脱氧核苷酸、2'‑氟修饰的核苷酸、末端5’‑(E)‑乙烯基膦酸酯核苷酸及其类似物、开环核酸核苷酸或异甘油核苷酸，所述反义链在5'‑末端和3'‑末端各含有1‑3个硫代磷酸酯键。
5.根据权利要求4所述的siRNA，其中，所述5’‑(E)‑乙烯基膦酸酯核苷酸及其类似物是尿苷‑5’‑(E)‑乙烯基膦酸酯及其类似物，其选自如下结构的一种：
其中：R为X‑G,
8 9
X选自：‑C(R)(R)‑，‑S‑；
8 9
R和R 分别独立选自：H，C1‑C6烷基，卤素；G选自：H，卤素，氰基，C1‑C10烷基，C2‑C10烯基，C2‑C10炔基，C3‑C8环烷基，C3‑C8环烷基甲基，C1‑C10烷氧基，卤素取代的C1‑C10烷基，羟基取代的C1‑C10烷基，C1‑C6烷氧基取代的C1‑C10烷基，氨基取代的C1‑C10烷基，C1‑C6烷基胺基取代的C1‑C10烷基，氰基取代的C1‑C10烷基；
优选的，R选自：甲硫基，乙硫基，乙基，丙基，烯丙基，甲氧基甲基，甲氧基乙基，氰基甲基，氟甲基。
6.权利要求3所述的siRNA，其中，所述尿苷‑5’‑(E)‑乙烯基膦酸酯及其类似物为2’‑S‑甲基尿苷‑5’‑(E)‑乙烯基磷酸‑3’‑磷酸酯或2’‑O‑甲基尿苷‑5’‑(E)‑乙烯基磷酸‑3’‑磷酸酯。
7.权利要求4所述的siRNA，其中，所述异甘油核苷酸修饰如式(I)所示：
其中，M为O或S；
Base选自嘌呤，腺嘌呤，鸟嘌呤，异鸟嘌呤，次黄嘌呤，黄嘌呤，C2修饰的嘌呤，N8修饰的嘌呤，2，6‑二氨基嘌呤，6‑二甲基氨基嘌呤，2‑氨基嘌呤，N6‑烷基腺嘌呤，O6‑烷基鸟嘌呤，
7‑脱氮嘌呤，胞嘧啶，5‑甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假胞嘧啶，尿嘧啶，假尿嘧啶，2‑硫代尿苷，
4‑硫代尿苷，C5修饰的嘧啶，胸腺嘧啶，吲哚，5‑硝基吲哚和3‑硝基吡咯中的任一种。
8.权利要求7所述的siRNA，其中，式(I)的修饰核苷酸为如下中的至少一种：
9.根据权利要求1‑8任一所述的siRNA，其中，siRNA正义链为21个核苷酸，反义链为23个核苷酸时，
正义链由3’至5’的修饰如下所示：
u mA m m m m m m m y m d v f m y m m m m m m u，
反义链的5'‑3'的碱基修饰如下所示：
vpU f m m m m x y m m m d m f m f m y m m m m m；
或siRNA的正义链为21个核苷酸，反义链为21个核苷酸时，
正义链的由3’至5’的修饰如下所示：
u mAm m m m m m m y m d v f m y m m m m m m u，
反义链的5'‑3'的碱基修饰如下所示：
vpU f m m m m x y m m m d m f m f m y m m m；
或siRNA的正义链为19个核苷酸，反义链为21个核苷酸时，
正义链的由3’至5’的修饰如下所示：
u mAm m m m m m m y m d v f m y m m m m u，
反义链的5'‑3'的碱基修饰如下所示：
vpU f m m m m x y m m m d m f m f m y m m m；
其中，vpU为尿苷‑5’端‑(E)‑乙烯基膦酸酯及其类似物，mA为2’‑O‑甲基腺苷‑3’‑磷酸酯，m为任意2'‑O‑甲基修饰的核苷酸，f为任意2'‑氟修饰的核苷酸，x为任意2'‑O‑甲基修饰的核苷酸或开环核酸核苷酸或异甘油核苷酸(isoGNA)，y为任意2'‑O‑甲基修饰的核苷酸或任意2'‑氟修饰的核苷酸，d为任意2'‑脱氧核苷酸或2'‑氟修饰的核苷酸，v为任意2'‑氟修饰的核苷酸或任意2'‑O‑甲基修饰的核苷酸或任意2'‑脱氧核苷酸，u为0‑1个反向无碱基残基；优选地，所述siRNA为如所述BBD‑4101、BBD‑4102、BBD‑4005及BBD‑4012所示序列经由上述方式进行修饰获得。
10.根据权利要求9所述的siRNA，其中，所述siRNA是表12中的经修饰的双链体，优选地，所述siRNA是表12中裸序列为所述BBD‑4101或BBD‑4102的经过修饰的双链体。
11.根据权利要求9所述的siRNA，其中，所述siRNA是BBD‑4101.11、BBD‑4102.11、BBD‑
4101.21、BBD‑4101.24、BBD‑4101.31、BBD‑4101.41、BBD‑4101.33、BBD‑4101.43、BBD‑
4101.34、BBD‑4101.44、BBD‑4101.45、BBD‑4101.46、BBD‑4101.48、BBD‑4101.49、BBD‑
4101.410、BBD‑4102.21、BBD‑4102.24、BBD‑4102.25、BBD‑4102.26、BBD‑4102.41、BBD‑
4102.42、BBD‑4102.43、BBD‑4102.44、BBD‑4102.45、BBD‑4102.46、BBD‑4102.47、BBD‑
4102.48。
更优选为BBD‑4102.41、BBD‑4102.44、BBD‑4102.42、BBD‑4102.47、BBD‑4102.43、BBD‑
4102.48、BBD‑4101.41、BBD‑4101.48、BBD‑4101.45、BBD‑4101.49、BBD‑4101.46、BBD‑
4101.410。
12.根据权利要求1‑11任一项所述的siRNA在制备用于抑制CIDEB表达的生物制剂或者药物制剂中的应用。
13.一种用于抑制CIDEB表达的生物制剂或者药物制剂，其中，包括权利要求1‑11任一项所述的siRNA，以及与所述siRNA连接或包裹的靶向性递送配体或递送载体。
14.根据权利要求13所述的生物制剂或者药物制剂，其中，所述配体为N‑乙酰基半乳糖胺衍生物；或任意特异性递送到肝脏细胞的脂质体或其他递送载体。
15.根据权利要求14所述的生物制剂或者药物制剂，其中，所述N‑乙酰基半乳糖胺衍生物的结构如下：
16.根据权利要求13‑15述的生物制剂或者药物制剂，其中，所述N‑乙酰基半乳糖胺衍生物与siRNA的正义链的3’端连接方式如下：
17.根据权利要求13‑16任一项所述的生物制剂或者药物制剂在制备预防或治疗与
CIDEB相关疾病的产品中的应用。
18.根据权利要求17所述应用，其中，所述与CIDEB相关的疾病为肝炎、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎、非酒精性脂肪性肝病、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎、酒精性脂肪肝病、HCV‑相关的硬化、药物引起的肝损伤及肝细胞坏死；或所述与CIDEB相关的疾病为肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、高血糖症、以及糖尿病引起的多种感染、肥胖症、代谢综合征、血脂异常。
19.一种抑制CIDEB表达的方法，其中，包括给予有效剂量的权利要求1‑11任一项所述的siRNA或权利要求13‑16任一项所述的用于抑制CIDEB表达的生物制剂或者药物制剂。
说明书全文

用于抑制CIDEB基因表达的siRNA、药物及其应用

技术领域

[0001] 本发明属于生物医药领域，具体是涉及用于抑制CIDEB基因表达的siRNA、药物及其应用。

背景技术

[0002] 当前全球健康问题的相当一部分来自于脂肪肝导致的疾病，例如肝硬化。脂质稳态的失调是导致肝硬化和代谢综合征(包括肥胖、糖尿病、心血管疾病和癌症)的发生和发展的重要因素。肝脏脂质平衡，包括脂质储存和极低密度脂蛋白的组装和分泌。游离脂肪酸通过脂肪生成作用被重塑和酯化为中性脂类，并储存在脂滴中。脂滴的储脂能力受其生长控制，可通过局部脂质合成或脂滴融合控制。脂滴是一种动态的亚细胞细胞器，由磷脂单层包膜、中性脂核和一系列特定的脂滴相关蛋白组成，通过协调脂合成、脂储存、脂分泌和脂解来维持脂类的动态平衡。细胞摄取的脂肪、胆固醇和神经酰胺通过内质网上的脂肪合成途径被重塑和酯化为中性脂质，并被隔离到脂滴核心。这些中性脂质包括三酰甘油、甾醇酯和酰化神经酰胺以及其他酯化脂质。研究表明，中性脂在细胞内的功能失调或过度储存与代谢疾病的发展密切相关，如肥胖、2型糖尿病、非酒精性脂肪性肝病和动脉粥样硬化。
[0003] 到目前为止，已经报道了一些与脂滴相关的蛋白质。其中CIDEB基因在人类肝脏中表达最高，是一种肝脏特异性蛋白，定位于内质网和脂滴，是脂肪细胞中脂质储存和脂质代谢的重要调节因子。CIDEB在脂滴‑脂滴接触部位富含，介导从小脂滴到大脂滴的定向脂转移，控制非典型脂滴的融合和生长。LD的生长增强了脂肪的储存能力和细胞内的脂肪积累。然而，由于过度摄取脂肪，脂肪组织或肝脏中不受控制的脂滴生长(肥大)可能导致代谢性疾病的发展，如肥胖和脂肪肝疾病。在数十万人中进行外显子组测序显示，CIDEB中罕见的预测功能丧失变体和错义变体的负担(组合载频，0.7％)与丙氨酸氨基转移酶水平降低(每等位基因β降低1.24U/L)和全因肝病风险降低33％(每个等位基因的风险比为0.67)显著相关。
[0004] 有研究表明CIDEB的突变可以防止脂肪在肝细胞中聚集，并且产生的脂滴更小，与肝病风险下降33％有关。针对保护性的遗传变异开发相关药物是一个较为常见的思路，此前，已有针对PCSK9的siRNA药物inclisiran获FDA批准上市。Inclisiran作为长效降脂药，仅需每年皮下注射给药两次即可有效地降低血液循环中低密度脂蛋白的水平，达到降低血脂的效果。开发靶向CIDEB相关siRNA药物的优势在于其保护效果的广泛性，不局限于某一种类型的肝病。

发明内容

[0005] 基于此，本发明的目的是提供一种用于抑制CIDEB表达的siRNA及其应用，其具有体外、体内试验效果好、非靶点活性弱的优势。
[0006] 本发明的第一个方面，提供了一种用于降低人体细胞中诱导细胞死亡的DFFA样效应因子B(Cell death‑inducing DFFA‑like effector b，CIDEB)表达的siRNA，其包括正义链及反义链，所述正义链和所述反义链能够互补，其序列选自表1所示中的任意一组双链体或与其组成相差不超过3个核苷酸的至少15个连续核苷酸序列，包括BBD‑4102，BBD‑4101和BBD‑4005所示序列，其中BBD‑4102，BBD‑4101所示序列由BBD‑4005经碱基优化而得。
[0007] 在其中的一些实施例中，所述用于抑制CIDEB表达的siRNA，包括正义链及反义链，其序列选自序列如下至少一对或其修饰序列:
[0008] a)BBD‑4101,其正义链如SEQ ID NO.201所示，反义链如SEQ ID NO.202所示；
[0009] b)BBD‑4102,其正义链如SEQ ID NO.203所示，反义链如SEQ ID NO.204所示；
[0010] c)BBD‑4005，其正义链如SEQ ID NO.9所示，反义链如SEQ ID NO.10所示；
[0011] d)BBD‑4012，其正义链如SEQ ID NO.23所示，反义链如SEQ ID NO.24所示；
[0012] e)BBD‑4013，其正义链如SEQ ID NO.25所示，反义链如SEQ ID NO.26所示；
[0013] f)BBD‑4015，其正义链如SEQ ID NO.29所示，反义链如SEQ ID NO.30所示；
[0014] g)BBD‑4016，其正义链如SEQ ID NO.31所示，反义链如SEQ ID NO.32所示；
[0015] h)BBD‑4018，其正义链如SEQ ID NO.35所示，反义链如SEQ ID NO.36所示；
[0016] i)BBD‑4020，其正义链如SEQ ID NO.39所示，反义链如SEQ ID NO.40所示；
[0017] j)BBD‑4021，其正义链如SEQ ID NO.41所示，反义链如SEQ ID NO.42所示；
[0018] k)BBD‑4022，其正义链如SEQ ID NO.43所示，反义链如SEQ ID NO.44所示；
[0019] l)BBD‑4023，其正义链如SEQ ID NO.45所示，反义链如SEQ ID NO.46所示；
[0020] m)BBD‑4026，其正义链如SEQ ID NO.51所示，反义链如SEQ ID NO.52所示；
[0021] n)BBD‑4027，其正义链如SEQ ID NO.53所示，反义链如SEQ ID NO.54所示；
[0022] o)BBD‑4039，其正义链如SEQ ID NO.77所示，反义链如SEQ ID NO.78所示；
[0023] p)BBD‑4040，其正义链如SEQ ID NO.79所示，反义链如SEQ ID NO.80所示；
[0024] q)BBD‑4045，其正义链如SEQ ID NO.89所示，反义链如SEQ ID NO.90所示；
[0025] r)BBD‑4052，其正义链如SEQ ID NO.103所示，反义链如SEQ ID NO.104所示；
[0026] s)BBD‑4057，其正义链如SEQ ID NO.113所示，反义链如SEQ ID NO.114所示；
[0027] t)BBD‑4061，其正义链如SEQ ID NO.121所示，反义链如SEQ ID NO.122所示；
[0028] u)BBD‑4064，其正义链如SEQ ID NO.127所示，反义链如SEQ ID NO.128所示；
[0029] v)BBD‑4066，其正义链如SEQ ID NO.131所示，反义链如SEQ ID NO.132所示；
[0030] w)BBD‑4074，其正义链如SEQ ID NO.147所示，反义链如SEQ ID NO.148所示；
[0031] x)BBD‑4078，其正义链如SEQ ID NO.155所示，反义链如SEQ ID NO.156所示；
[0032] y)BBD‑4097，其正义链如SEQ ID NO.193所示，反义链如SEQ ID NO.194所示；
[0033] z)BBD‑4100，其正义链如SEQ ID NO.199所示，反义链如SEQ ID NO.200所示。
[0034] 在其中一些实施例中，所述siRNA选自BBD‑4101、BBD‑4102、BBD‑4005及BBD‑4012所示序列或其经修饰序列。
[0035] 在其中一些实施例中，其中，所述正义链包括不多于3、2、1或0个未修饰的核苷酸，所述正义链中的修饰核苷酸包含分别选自2'‑O‑甲基修饰的核苷酸、2'‑脱氧核苷酸、2'‑氟修饰的核苷酸、末端反向无碱基残基、锁核酸LNA，所述正义链在5'‑末端含有1，或2，或3个硫代磷酸酯键；以及所述反义链包括不多于3、2、1或0个未修饰的核苷酸，所述反义链中的修饰的核苷酸包括分别选自2'‑O‑甲基修饰的核苷酸、2'‑脱氧核苷酸、2'‑氟修饰的核苷酸、末端5’‑(E)‑乙烯基膦酸酯核苷酸及其类似物、开环核酸核苷酸(UNA)或异甘油核苷酸(isoGNA)，所述反义链在5'‑末端和3'‑末端各含有1‑3个硫代磷酸酯键。
[0036] 其中，尿苷‑5’端‑(E)‑乙烯基膦酸基团及其类似物选自如下结构的一种：
[0037]
[0038] 其中：R为X‑G,
[0039] X选自：‑C(R8)(R9)‑，‑S‑；
[0040] R8和R9分别独立选自：H，C1‑C6烷基，卤素；G选自：H，卤素，氰基，C1‑C10烷基，C2‑C10烯基，C2‑C10炔基，C3‑C8环烷基，C3‑C8环烷基甲基，C1‑C10烷氧基，卤素取代的C1‑C10烷基，羟基取代的C1‑C10烷基，C1‑C6烷氧基取代的C1‑C10烷基，氨基取代的C1‑C10烷基，C1‑C6烷基胺基取代的C1‑C10烷基，氰基取代的C1‑C10烷基。
[0041] 优选的，R选自：甲硫基，乙硫基，乙基，丙基，烯丙基，甲氧基甲基，甲氧基乙基，氰基甲基，氟甲基。
[0042] 5′(E)‑乙烯基膦酸酯，简称vp‑，末端5′(E)‑乙烯基膦酸酯核苷酸是RNA核苷酸，特别是VP‑U。更优选尿苷‑5’端‑(E)‑乙烯基膦酸基团在类似物为2’‑S‑甲基尿苷‑5’‑[0043] (E)‑乙烯基磷酸‑3’‑磷酸酯，或2’‑O‑甲基尿苷‑5’‑(E)‑乙烯基磷酸‑3’‑磷酸酯。
[0044] 其中，所述异甘油核苷酸修饰如式(I)所示：
[0045]
[0046] 其中，M为O或S；
[0047] Base选自嘌呤，腺嘌呤，鸟嘌呤，异鸟嘌呤，次黄嘌呤，黄嘌呤，C2修饰的嘌呤，N8修饰的嘌呤，2，6‑二氨基嘌呤，6‑二甲基氨基嘌呤，2‑氨基嘌呤，N6‑烷基腺嘌呤，O6‑烷基鸟嘌呤，7‑脱氮嘌呤，胞嘧啶，5‑甲基胞嘧啶，异胞嘧啶，假胞嘧啶，尿嘧啶，假尿嘧啶，2‑硫代尿苷，4‑硫代尿苷，C5修饰的嘧啶，胸腺嘧啶，吲哚，5‑硝基吲哚和3‑硝基吡咯中的任一种。优选的，其中，式(I)的修饰核苷酸为如下中的至少一种：
[0048]
[0049] 任一所述的siRNA，其中，siRNA正义链为21个含碱基核苷酸，反义链为23个含碱基核苷酸时，
[0050] 正义链由3’至5’的修饰如下所示：
[0051] u mA m m m m m m m y m d v f m y m m m m m m u，反义链的5'‑3'的碱基修饰如下所示：
[0052] vpU f m m m m x y m m m d m f m f m y m m m m m；
[0053] 或siRNA的正义链为21个含碱基核苷酸，反义链为21个含碱基核苷酸时，
[0054] 正义链的由3’至5’的修饰如下所示：
[0055] u mA m m m m m m m y m d v f m y m m m m m m u，
[0056] 反义链的5'‑3'的修饰如下所示：
[0057] vpU f m m m m x y m m m d m f m f m y m m m；
[0058] 或siRNA的正义链为19个含碱基核苷酸，反义链为21个含碱基核苷酸时，
[0059] 正义链的由3’至5’的修饰如下所示：
[0060] u mA m m m m m m m y m d v f m y m m m m u，
[0061] 反义链的5'‑3'的修饰如下所示：
[0062] vpU f m m m m x y m m m d m f m f m y m m m；
[0063] 其中，vpU为尿苷‑5’端‑(E)‑乙烯基膦酸酯及其类似物，mA为2’‑O‑甲基腺苷‑3’‑磷酸酯，m为任意2'‑O‑甲基修饰的核苷酸，f为任意2'‑氟修饰的核苷酸，x为任意2'‑O‑甲基修饰的核苷酸或开环核酸核苷酸(UNA)或异甘油核苷酸(isoGNA)，y为任意2'‑O‑甲基修饰的核苷酸或任意2'‑氟修饰的核苷酸，d为任意2'‑脱氧核苷酸或2'‑氟修饰的核苷酸，v为任意2'‑氟修饰的核苷酸或任意2'‑O‑甲基修饰的核苷酸或任意2'‑脱氧核苷酸，u为0‑1个反向无碱基残基。
[0064] 在其中一些优选的实施例中，所述siRNA由所述BBD‑4101、BBD‑4102、BBD‑4005及[0065] BBD‑4012经由上述方式进行修饰获得。
[0066] 在其中一些优选的实施例中，所述siRNA是表12中的经修饰的双链体，
[0067] 进一步优选地，所述siRNA是表12中裸序列为所述BBD‑4101或BBD‑4102的经过修饰的双链体。
[0068] 更进一步优选地，所述siRNA是BBD‑4101.11、BBD‑4102.11、BBD‑4101.21、BBD‑4101.24、BBD‑4101.31、BBD‑4101.41、BBD‑4101.33、BBD‑4101.43、BBD‑4101.34、BBD‑
4101.44、BBD‑4101.45、BBD‑4101.46、BBD‑4101.48、BBD‑4101.49、BBD‑4101.410、BBD‑
4102.21、BBD‑4102.24、BBD‑4102.25、BBD‑4102.26、BBD‑4102.41、BBD‑4102.43、BBD‑
4102.44、BBD‑4102.45、BBD‑4102.46、BBD‑4102.47、BBD‑4102.48。更优选为BBD‑4102.41、BBD‑4102.44、BBD‑4102.42、BBD‑4102.47、BBD‑4102.43、BBD‑4102.48、BBD‑4101.41、BBD‑
4101.48、BBD‑4101.45、BBD‑4101.49、BBD‑4101.46、BBD‑4101.410。
[0069] 本发明的第二个方面，提供了用于抑制CIDEB表达的药物制剂，包括上述任一所述siRNA，以及与所述siRNA连接或包裹的靶向性递送配体或递送载体。
[0070] 在其中一些实施例中，所述配体为N‑乙酰基半乳糖胺(Galnac)衍生物。
[0071] 在其中一些实施例中，所述配体的结构如下：
[0072]
[0073]
[0074] 在其中的一些实施例中，所述N‑乙酰基半乳糖胺衍生物与siRNA的正义链的3’端连接，所述结构如下：
[0075]
[0076]
[0077] 上述 代笔双链RNA，例如本发明的siRNA。
[0078] 本发明的第三个方面，提供了上述siRNA在制备抑制CIDEB表达的生物制剂或者药物制剂中的应用。
[0079] 本发明的第四个方面，是提供所述生物制剂或者药物制剂在制备预防和治疗与CIDEB相关的疾病中的应用。
[0080] 在其中一些实施例中，所述与CIDEB表达相关的疾病为肝炎、肝纤维化、非酒精性脂肪性肝炎(NASH)、非酒精性脂肪性肝病(NAFLD)、肝硬化、酒精性脂肪性肝炎(ASH)、酒精性脂肪肝病(ALD)、HCV‑相关的硬化、药物引起的肝损伤及肝细胞坏死。
[0081] 在其中一些实施例中，所述与CIDEB表达相关的疾病为肥胖、糖尿病、胰岛素抵抗、高血糖症、以及糖尿病引起的多种感染、肥胖症、代谢综合征、血脂异常。
[0082] 本发明的第五个方面，是提供一种抑制CIDEB表达的方法，包括给予有效剂量的上述的siRNA或上述的用于抑制CIDEB表达的生物制剂或者药物制剂。
[0083] 本发明经过对siRNA序列研究，并通过大量的实验，筛选到多条能够用于抑制CIDEB表达的siRNA序列，在前期对BBD‑4005的研究上，继续进行从序列碱基优化、正义链反义链的多重修饰优化等方面的改进，以更好地提高靶标的沉默能力并降低非靶点活性。其中，通过一系列体外和体内试验中，获得了具有更地的抑制CIDEB表达生物活性的siRNA序列，有望应用于临床上进行与CIDEB相关的疾病的治疗。特别是发现，这些优化的生物活性很好的siRNA序列中的BBD‑4101.41与BBD‑4102.41在高脂饮食诱导的小鼠NASH模型中恢复纤维化标志基因的表达，可显著改善肝纤维化水平，有望于在应用于临床治疗上。附图说明
[0084] 图1为BBD‑4101与BBD‑4102在高脂饮食诱导的小鼠NASH模型中的CIDEB基因及炎症纤维化基因的表达结果示意图。
[0085] 图2为BBD‑4101与BBD‑4102在高脂饮食诱导的小鼠NASH模型中的肝HE染色结果示意图。

具体实施方式

[0086] 为了便于理解本发明，下面将对本发明进行更全面的描述。本发明可以以许多不同的形式来实现，并不限于本文所描述的实施例。相反地，提供这些实施例的目的是使对本发明公开内容的理解更加透彻全面。
[0087] 下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，例如Green和Sambrook主编的第四版《分子克隆实验指南》(Molecular Cloning:A Laboratory Manual)已于2013年出版，或按照制造厂商所建议的条件。实施例中所用到的各种常用化学试剂，均为市售产品。
[0088] 除非另有定义，本发明所使用的所有的技术和科学术语与属于本发明的技术领域的技术人员通常理解的含义相同。本发明的说明书中所使用的术语只是为了描述具体的实施例的目的，不用于限制本发明。本发明所使用的术语“和/或”包括一个或多个相关的所列项目的任意的和所有的组合。
[0089] 本发明所述靶向性递送配体或其他类型递送载体，所述配体优选为N‑乙酰基半乳糖胺衍生物(Galnac载体)，其他类型递送载体如特异性递送到肝脏细胞的脂质体只要能实现siRNA的递送都可用于本发明。
[0090] 近年来，Galnac载体目前已经有比较深入研究，GalNAc‑核酸是糖类化合物与核酸形成的单缀合物，将N‑乙酰化的半乳糖胺以三价态的方式共价缀合到不同序列的RNA的正义链3′和/或5′末端，形成GalNAc‑siRNA药物，从而实现向肝细胞的特异性递送，并通过细胞内吞作用使药物进入细胞和发挥功能。相关已知的Galnac载体都适用于本发明所述siRNA。
[0091] 以下实施例中，作为举例，Galnac载体及连接siRNA后的结构如下：
[0092]
[0093] 需要指出的，任何其他有类似作用的Galnac载体或靶向肝脏的脂质体，都可与本文件中的序列相缀合，用于降低CIDBE的表达。
[0094] 核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写及结构如下：
[0095] 需要指出的，任何其他有类似作用的Galnac载体或靶向肝脏的脂质体，都可与本文件中的序列相缀合，用于降低CIDBE的表达。
[0096] 核酸序列表示中使用的核苷酸单体的缩写及结构如下：
[0097]A 腺苷‑3’‑磷酸酯
T 5’‑甲基尿苷‑3’‑磷酸酯
C 胞苷‑3’‑磷酸酯
G 鸟苷‑3’‑磷酸酯
U 尿苷‑3’‑磷酸酯
dA 2’‑脱氧腺苷‑3’‑磷酸酯
dT 2’‑脱氧胸苷‑3’‑磷酸酯
dC 2’‑脱氧胞苷‑3’‑磷酸酯
dG 2’‑脱氧鸟苷‑3’‑磷酸酯
dU 2’‑脱氧尿苷‑3’‑磷酸酯
mA 2’‑O‑甲基腺苷‑3’‑磷酸酯
mC 2’‑O‑甲基胞苷‑3’‑磷酸酯
mG 2’‑O‑甲基鸟苷‑3’‑磷酸酯
mU 2’‑O‑甲基尿苷‑3’‑磷酸酯
fA 2’‑氟代腺苷‑3’‑磷酸酯
fC 2’‑氟代胞苷‑3’‑磷酸酯
fG 2’‑氟代鸟苷‑3’‑磷酸酯
fU 2’‑氟代尿苷‑3’‑磷酸酯
VPU 2’‑O‑甲基尿苷‑5’‑(E)‑乙烯基磷酸‑3’‑磷酸酯
VPU‑S 2’‑S‑甲基尿苷‑5’‑(E)‑乙烯基磷酸‑3’‑磷酸酯
VPU‑8 2’‑甲氧甲基‑5’‑(E)‑乙烯基磷酸‑3’‑磷酸酯
VPU‑12 2’‑S‑乙基‑5’‑(E)‑乙烯基磷酸‑3’‑磷酸酯
isoGNA‑A 腺苷‑异甘油核苷酸
isoGNA‑T 胸苷‑异甘油核苷酸
isoGNA‑C 胞苷‑异甘油核苷酸
isoGNA‑G 鸟苷‑异甘油核苷酸
isoGNA‑U 尿苷‑异甘油核苷酸
Invab 反向无碱基残基
UNA 开环核酸核苷酸
* 硫代磷酸酯键联
[0098]
[0099]
[0100] 本领域技术人员根据已有的技术，所述siRNA的药学上可接受的盐可为钠盐或钾盐，例如，在纯化的时候，产生siRNA的钠盐。
[0101] 以下结合具体实施例对本发明作进一步详细的说明。
[0102] 实施例1siRNA的合成
[0103] 在北京擎科生物科技有限公司12通道核酸合成仪上，使用固相寡核苷酸合成方案进行0.2‑1μmol的寡核苷酸合成，含Galnac的siRNA序列需要在偶联Galnac的CPG预填充柱上进行合成。在合成的寡核苷酸中加入氨解试剂，并在45‑80℃下孵育，将寡核苷酸与固相载体分离使寡核苷酸游离下来。然后用乙醇沉淀粗制寡核苷酸，高速离心弃去上清液，重复两遍获得粗制寡核苷酸，并将沉淀重悬于DEPC水中。通过离子配对HPLC方法对粗制寡核苷酸进行纯化，将收集到的产物在真空离心干燥器中干燥至粉末状。用DEPC水溶解纯化后得到的产物，并通过TOF LC‑MS进行分析。测定寡核苷酸浓度，计算等摩尔量的正义链、反义链所需体积，将等摩尔量的正义链、反义链混合均匀，通过95℃加热5分钟，然后自然冷却至室温的退火方法制备双链。其中，异甘油核苷酸来源，参见实施例2的制备方法，其他的修饰的核苷都为常规方法制备的得到或常规购买获得。
[0104] 表1：未修饰siRNA的正义链和反义链序列。
[0105]
[0106]
[0107]
[0108]
[0109]
[0110]
[0111] 实施例2异甘油核苷酸及VPU‑S的制备
[0112] 2.1异甘油核苷酸的制备
[0113] 2.1.1合成化合物1‑1
[0114]
[0115] 原料5‑methylpyrimidine‑2,4(1H,3H)‑dione(10g,79.4mmol)溶于无水吡啶和无水甲苯中，加入苯甲酰氯。反应体系室温搅拌过夜，然后反应混合物减压浓缩至干，加入320mL 1,4‑二氧六环，加入K2CO3水溶液(180mL)，体系室温搅拌过夜。反应液用DCM萃取，分出有机液。有机液用Na2SO4干燥，减压浓缩至干。浓缩物用DCM打浆，滤出固体，抽干，得到产物1。
[0116] 1H NMR(500MHz,DMSO‑d6),δ11.33(s,1H),7.95(d,J＝9.5Hz,2H),7.77(t,J＝+7.5Hz,1H),7.64–7.58(m,2H),7.52(s,1H),1.82(s,3H).LCMS:Found 231[M+H] .
[0117]
[0118] 称取化合物(s)‑soketal(5.0g,38mmol)与DMAP(370mg,3.0mmol)加入三口烧瓶，加入DCM及TEA，氮气保护，室温下逐滴滴加TBDPSCl，室温过夜搅拌。TLC与LC‑MS监测反应完全后，将反应混合物转移至分液漏斗，依次用NaHCO3溶液和水洗涤，有机层用无水Na2SO4干燥后，过滤旋干。过柱纯化得到化合物2。
[0119]
[0120] 称取化合物2(12g,32mmol)，加入MeOH及DCM溶解，小心滴加用MeOH稀释的浓盐酸，室温下搅拌。TLC与LC‑MS监测反应完全后，减压旋蒸除去反应溶剂。过柱纯化得到化合物3。
[0121] 1H NMR(500MHz,DMSO‑d6),δ7.70‑7.62(m,4H),7.50‑7.39(m,6H),4.61(d,J＝4.5Hz,1H),4.43(t,J＝5.6Hz,1H),3.66‑3.54(m,3H),3.49(dt,J＝10.2,4.8Hz,1H),3.39(dt,J＝10.6,4.9Hz,1H),1.00(s,9H).
[0122]
[0123] 原料3(3.0g,9.1mmol)，DMAP(77mg,0.63mmol)溶于无水吡啶(40mL)中，加入DMTrCl(3.7g,10.9mmol)。体系室温搅拌3h后，加入10mL MeOH，搅拌0.5h。反应液减压浓缩至干，柱层析分离，分得产物4。
[0124] 1H NMR(500MHz,DMSO‑d6),δ7.65–7.49(m,4H),7.49–7.34(m,8H),7.31–7.24(m,6H),7.21(dd,J＝5.8,3.8Hz,1H),6.88–6.81(m,4H),3.81(d,J＝5.4Hz,1H),3.72(s,7H),
3.63(d,J＝5.6Hz,2H),3.13(dd,J＝9.1,4.8Hz,1H),3.00(dd,J＝9.1,5.7Hz,1H),0.88(s,
9H).
[0125]
[0126] N2下，化合物1(800mg,3.47mmol)，化合物4(1.98g,3.13mmol)，三苯基膦(911mg,3.47mmol)溶于无水THF中。体系降温至0～5℃，加入DIAD，体系室温搅拌过夜。反应液减压浓缩至干，柱层析分离，分得产物5。
[0127] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d),δ7.94–7.83(m,3H),7.62(dt,J＝8.0,1.5Hz,6H),7.53(s,2H),7.49–7.39(m,11H),7.38–7.32(m,3H),7.29(dd,J＝8.5,2.7Hz,4H),7.18(d,J＝2.1Hz,5H),6.85–6.82(m,5H),4.98(h,J＝5.4,4.6Hz,2H),3.89(d,J＝4.8Hz,1H),
3.80(s,7H),3.78–3.71(m,1H),3.55–3.44(m,1H),1.97–1.93(m,3H),1.09(s,9H)[0128]
[0129] 化合物5(1.4g,1.63mmol)溶于THF(14mL)中，加入TBAF。体系室温搅拌0.5h。反应液加入到200mL水中，DCM萃取。有机液用Na2SO4干燥，减压浓缩，柱层析分离得到白色泡沫状固体产物6。
[0130] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d),δ7.93–7.87(m,2H),7.62(t,J＝7.5Hz,1H),7.43(t,J＝7.7Hz,2H),7.37(d,J＝7.3Hz,2H),7.34(s,1H),7.32–7.27(m,4H),7.26(s,4H),6.84(d,J＝8.4Hz,4H),4.73–4.65(m,1H),4.04–3.87(m,2H),3.80(s,6H),3.53(ddd,J＝
36.4,10.4,5.6Hz,2H),1.92(s,3H).
[0131] LCMS:Found 605[M‑H]‑.
[0132]
[0133] N2下，化合物6(0.55g,0.91mmol)，DIPEA(585mg,4.54mmol)溶于THF(中，加入2‑氰乙基N,N‑二异丙基氯代亚磷酰胺。体系室温搅拌1h。然后反应液减压浓缩，柱层析分离，得产物1‑1。
[0134] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d),δ7.94–7.86(m,2H),7.62(t,J＝7.4Hz,1H),7.48–7.41(m,2H),7.38(dd,J＝7.5,3.5Hz,2H),7.34–7.27(m,4H),7.23(d,J＝7.1Hz,1H),
7.16(d,J＝5.7Hz,1H),6.83(dt,J＝8.8,2.0Hz,4H),5.00–4.87(m,1H),3.98–3.82(m,2H),
3.79(s,6H),3.77–3.65(m,2H),3.58–3.44(m,4H),2.54(dt,J＝10.0,6.2Hz,2H),1.89(d,J＝5.1Hz,3H),1.20–1.13(m,6H),1.09(d,J＝6.8Hz,6H).
[0135] LCMS：Found 669[M‑137]‑,722[M‑84]‑.
[0136] 2.1.2合成化合物1‑2
[0137]
[0138] 化合物1(2.08g,1.0eq)，1‑1‑4(5.5g,1.0eq)，PPh3(4.6g,2.0eq)溶于dioxane中，在空气环境下加入DEAD，体系超声30min。反应液减压浓缩，得到的粗产物柱层析分离，得到产物2。
[0139] LMCS:853.37，found 855[M+H]+。
[0140]
[0141] 化合物2(2.6g,1.0eq)溶于THF(210mL)中，加TBAF(12mL,4.0eq,1mol/Lin THF)，体系于室温下搅拌1h。然后反应液减压浓缩，加入到饱和NaHCO3水溶液中，DCM萃取。有机液用饱和NaHCO3水溶液洗至无TBAF残留，分离出有机液，干燥，浓缩，得到的粗产物柱层析分离，得类白色泡沫状固体3。
[0142] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ，9.12(s,1H),8.68(s,1H),8.13(s,1H),8.07–8.00(m,2H),7.62(t,J＝7.4Hz,1H),7.53(t,J＝7.6Hz,2H),7.23–7.07(m,9H),6.72(dd,J＝11.5,8.6Hz,4H),4.72–4.57(m,2H),4.22–4.07(m,2H),3.81–3.65(m,8H).
[0143] LCMS:616.25，found 616[M+H]+。
[0144]
[0145] N2下，化合物3(1.3g,1.0eq)，DIPEA(1.36g,5.0eq)溶于THF(13mL)中，加入2‑氰乙基N,N‑二异丙基氯代亚磷酰胺，体系于室温搅拌1h。反应液减压浓缩，得到的粗产物柱层析分离，得到类白色固体化合物1‑2。
[0146] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ，9.06(s,1H),8.75(d,J＝4.0Hz,1H),8.09(dt,J＝43.0,5.5Hz,3H),7.76–7.49(m,3H),7.26(s,3H),7.23–7.13(m,6H),6.76(dd,J＝8.3,4.2Hz,4H),5.17–4.96(m,1H),4.25(ddt,J＝23.2,12.2,6.1Hz,1H),4.08(ddd,J＝38.7,
10.9,5.6Hz,1H),3.77(d,J＝4.6Hz,6H),3.74–3.70(m,1H),3.65–3.56(m,2H),3.46(dq,J＝11.7,6.0Hz,2H),2.61(d,J＝17.1Hz,1H),2.50(dq,J＝17.4,5.9Hz,2H),1.26(d,J＝
4.5Hz,5H),1.16–1.07(m,7H).
[0147] LCMS:815.36，found 733[M‑82]‑。
[0148] 2.1.3合成化合物1‑3
[0149]
[0150] 化合物1(2.0g,1.0eq)与吡啶(100mL)混合，加入异丁酸酐(6.0mL,2.0eq)，体系于115℃反应2h。反应液降至室温后，浓缩。浓缩物加入50mL MeOH，于室温打浆15min，滤出固体，抽干，得到类白色固体产物2。
[0151] 1H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ，11.45(s,1H),10.69(s,1H),7.79(d,J＝7.0Hz,1H),7.13(d,J＝7.1Hz,1H),2.71(hept,J＝6.8Hz,1H),1.06(d,J＝6.9Hz,6H).LCMS:181.09，+
found 182[M+H]。
[0152]
[0153] N2下，化合物2(2.0g,1.0eq))，1‑1‑4(6.9g,1.0eq))，PPh3(3.74g,1.3eq)溶于dioxane中，于冰浴下加入DIAD，体系于室温搅拌过夜。反应液减压浓缩，得到的粗产物柱层析分离，得到白色泡沫状固体产物3。
[0154] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.34(d,J＝5.5Hz,1H),7.81–7.71(m,2H),7.65–7.57(m,4H),7.45–7.36(m,4H),7.31–7.29(m,5H),7.25–7.14(m,5H),6.86–6.81(m,2H),
6.80–6.72(m,4H),5.43(t,J＝5.2Hz,1H),3.99(qd,J＝10.6,5.4Hz,2H),3.76(d,J＝
2.4Hz,6H),3.53–3.41(m,2H),2.55(dq,J＝13.9,6.9Hz,1H),1.27–1.24(m,6H),0.94(s,
9H).
[0155] LCMS:795.37，found 754[M‑H]‑。
[0156]
[0157] 化合物3(3.6g,1.0eq)溶于THF(215mL)中，加入TBAF。体系于室温搅拌1h。然后反应混合物减压浓缩，加入DCM，饱和NaHCO3水溶液，分出有机液。有机液继续用饱和NaHCO3洗至无TBAF残留。有机液干燥，浓缩，得到的粗产物柱层析分离,得到化合物4。
[0158] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.42–8.31(m,1H),8.14(s,1H),7.92–7.80(m,1H),7.47–7.38(m,1H),7.32–7.25(m,6H),7.17(d,J＝8.8Hz,3H),6.91–6.71(m,4H),5.31–
5.13(m,1H),4.01–3.87(m,3H),3.79(d,J＝11.4Hz,6H),3.41(ddd,J＝30.1,9.8,5.3Hz,
1H),2.59–2.54(m,1H),1.25(d,J＝7.0Hz,6H).
[0159] LCMS:557.25，found 556[M‑H]‑。
[0160]
[0161] N2下，化合物4(1.6g,1.0eq)和DIPEA(1.82g,5.0eq)溶于THF中，加入2‑氰乙基N,N‑二异丙基氯代亚磷酰胺。体系于室温搅拌1h。然后反应混合物减压浓缩，浓缩物柱层析分离得到白色泡沫状固体1‑3。
[0162] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.36(d,J＝5.8Hz,1H),7.95(d,J＝5.6Hz,1H),7.78(d,J＝5.8Hz,1H),7.40(dd,J＝8.1,3.9Hz,2H),7.29(dt,J＝9.1,2.9Hz,4H),7.22(d,J＝5.1Hz,3H),7.17(dt,J＝8.1,4.2Hz,1H),6.78(dt,J＝9.0,4.6Hz,4H),5.49(h,J＝
5.5Hz,1H),4.08–3.97(m,1H),3.88(dq,J＝13.0,6.9Hz,1H),3.76(d,J＝6.7Hz,6H),3.71(p,J＝6.3Hz,2H),3.52(dq,J＝10.7,6.8Hz,2H),3.40(dq,J＝11.3,6.2,5.4Hz,2H),2.54(tq,J＝13.1,6.8Hz,3H),1.25(d,J＝6.9Hz,6H),1.16–1.07(m,12H).
[0163] LCMS:757.36，found 620[M‑137]‑。
[0164] 2.1.4合成化合物1‑4
[0165]
[0166] 化合物1(2.0g,1.0eq)与DMF(10mL)混合，加入醋酸酐(2.22mL,2.6eq)。体系于100℃搅拌2h。反应液冷却至室温后，滤出固体，用少量乙醇洗涤，真空干燥后得到类白色固体化合物2。
[0167] 1H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ，12.26(s,1H),11.66(s,1H),8.44(s,1H),2.83(s,4H),1.14(d,J＝6.8Hz,6H).
[0168]
[0169] 化合物2(1.0g,1.0eq)，DIPEA(0.98g,2.0eq)与吡啶混合，加入二苯基胺基甲酰氯(1.2eq)，体系于室温搅拌过夜。于反应液中加入乙醇(10mL)，室温搅拌10min后，减压浓缩除去溶剂，粗品加入到乙醇和水中。体系于100℃搅拌2h。然后反应液冷却到室温后，滤出固体，真空干燥后得到类白色固体化合物3。
[0170] 1H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ13.51(s,1H),10.53(s,1H),8.40(s,1H),7.46(dt,J＝15.3,7.7Hz,8H),7.32(t,J＝7.3Hz,2H),2.80(p,J＝6.9Hz,1H),1.09(d,J＝6.8Hz,6H).[0171] LCMS:415.16,found 417[M+H]+。
[0172]
[0173] N2下，化合物3(1.45g,1.1eq)，1‑1‑4(2.0g,1.0eq)，PPh3(1.66g,2.0eq)溶于dioxane中，加入DIAD。反应体系于65℃搅拌过夜。反应液滤去固体，滤液减压浓缩，得到的粗产物柱层析分离，得到类白色泡沫状固体化合物4。
[0174] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ7.95(s,1H),7.76(s,1H),7.72–7.63(m,2H),7.55(td,J＝7.3,1.5Hz,1H),7.51–7.40(m,9H),7.39–7.32(m,6H),7.22(d,J＝2.8Hz,2H),
7.20–7.14(m,3H),7.10(dd,J＝10.3,8.7Hz,4H),6.76–6.66(m,4H),4.78(q,J＝5.6Hz,
1H),4.13–4.03(m,2H),3.73(d,J＝4.0Hz,6H),3.71–3.67(m,1H),3.56(dd,J＝9.9,4.5Hz,
1H),3.07(s,1H),1.19(dd,J＝6.8,1.8Hz,6H),0.91(s,9H).
[0175]
[0176] 化合物4(2.36g,1.0eq)溶于THF中，加入TBAF，体系于室温搅拌20min。反应混合物加入到饱和NaHCO3水溶液中，DCM萃取干净后，有机液再用饱和NaHCO3水溶液洗至无TBAF残留。有机液干燥，浓缩，得到的粗产物柱层析分离，得到类白色泡沫状固体化合物5。
[0177] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.01(d,J＝7.0Hz,2H),7.45(d,J＝7.8Hz,4H),7.37(d,J＝7.7Hz,4H),7.26–7.19(m,4H),7.13(dt,J＝23.9,8.2Hz,5H),7.05(d,J＝
8.5Hz,2H),6.67(dd,J＝16.7,8.5Hz,4H),5.78(s,1H),4.38(dd,J＝9.0,4.4Hz,1H),4.17–
4.10(m,2H),3.82–3.72(m,2H),3.70(d,J＝8.6Hz,6H),2.56(p,J＝6.9Hz,1H),1.28–1.23(m,6H).
[0178] LCMS:791.33,found 793[M+H]+。
[0179]
[0180] N2下化合物5(1.42g,1.0eq)，DIPEA(1.16g,5.0eq)溶于THF中，加入2‑氰乙基N,N‑二异丙基氯代亚磷酰胺，体系于室温搅拌1h。反应液减压浓缩，得到的粗产物柱层析分离，得到类白色泡沫状固体1‑4。
[0181] 1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.06(d,J＝8.6Hz,1H),7.87(d,J＝7.5Hz,1H),7.44(d,J＝7.9Hz,4H),7.35(t,J＝7.7Hz,4H),7.27(s,2H),7.25–7.19(m,4H),7.13(td,J＝8.9,6.3Hz,5H),6.73(ddd,J＝8.4,5.4,2.4Hz,4H),4.91(t,J＝5.9Hz,1H),4.26–4.15(m,1H),4.05–3.85(m,1H),3.74(d,J＝2.6Hz,6H),3.61(s,2H),3.60–3.51(m,2H),3.49–
3.38(m,2H),3.07(s,1H),2.51(t,J＝6.3Hz,1H),2.45(td,J＝6.2,3.4Hz,1H),1.26–1.23(m,6H),1.10(dd,J＝6.8,4.6Hz,6H),1.03(d,J＝6.8Hz,3H),0.98(d,J＝6.8Hz,3H).LCMS:
‑
991.44,found 661[M‑300]。
[0182] 2.2VPU‑S的制备
[0183] 化合物1：(2R,3R,4R,5R)‑5‑(3‑苯甲酰基‑2,4‑二氧代‑3,4‑二氢嘧啶‑1(2H)‑[0184] 基)‑2‑((E)‑2‑(二甲氧基磷酰基)乙烯基)‑4‑(甲硫基)四氢呋喃‑3‑基(2‑氰乙基)二异丙基亚磷酰胺
[0185] (2R,3R,4R,5R)‑5‑(3‑benzoyl‑2,4‑dioxo‑3,4‑dihydropyrimidin‑1(2H)‑yl)‑2‑((E)‑2‑(di methoxyphosphoryl)vinyl)‑4‑(methylthio)tetrahydrofuran‑3‑yl(2‑cyanoethyl)diisopropylphosphoramidite)(化合物1)的制备
[0186]
[0187] 2.2.1
[0188] (2R,3R,9aR)‑3‑羟基‑2‑(羟甲基)‑2,3,3a,9a‑四氢‑6H‑呋喃并[2'，3':4,5]噁唑并[3,2‑a]嘧啶‑6‑酮(化合物1‑2)的制备：化合物1‑1(30g,122.9mmol)，碳酸二苯酯(31.6g,147.5mmol),碳酸氢钠(825mg,9.8mmol)与DMF(150mL)混合，于100℃下搅拌4h。冷却至室温后，反应液滴加入到MTBE(1.5L)中,反应混合物室温搅拌15min。滤除固体，固体用MeOH(150mL)于室温打浆15min。滤出固体，干燥，得类白色固体产物23.0g(产率83.0％)。+
LCMS(ESI):m/z 227[M+H] .
[0189] 2.2.2
[0190] 1‑((2R,3R,4R,5R)‑4‑羟基‑5‑(羟甲基)‑3‑(甲硫基)四氢呋喃‑2‑基)嘧啶‑2,4(1H，3H)‑二酮(化合物1‑3)的制备：化合物1‑2(10g,44.2mmol)溶于DMF(100mL)中，加入甲硫醇钠(14.8g,212.4mmol)，反应体系于室温下搅拌1h。反应液用6N HCl调pH至6～7，滤去不溶物。滤液浓缩，柱层析分离(DCMDCM/MeOH＝20:1)得产物12g(y:99.0％)，为淡黄色固+体。LCMS(ESI):m/z 275[M+H] .
[0191] 2.2.3
[0192] 1‑((2R,3R,4R,5R)‑5‑((双(4‑甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)‑4‑羟基‑3‑(甲硫基)四氢呋喃‑2‑基)嘧啶‑2,4(1H，3H)‑二酮(化合物1‑4)的制备：化合物1‑3(12g,43.8mmol)溶于无水吡啶(120mL)中，加入DMTrCl(17.8g,52.6mmol)，体系于室温下搅拌1h。
反应液浓缩，浓缩物溶于DCM中，水洗，硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(PE/DCM/EA＝1:1:
1DCM/MeOH＝20:1)，得产物13.4g(产率53.1％)，为黄色泡沫状固体。LCMS:576,found 575‑
[M‑H] .1H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ11.35(s,1H),7.55(d,J＝8.1Hz,1H),7.42(d,J＝7.7Hz,
2H),7.28(tt,J＝20.0,7.4Hz,7H),6.96–6.87(m,4H),5.97(d,J＝5.2Hz,1H),5.71(d,J＝
4.2Hz,1H),5.37(d,J＝8.1Hz,1H),4.54(td,J＝6.3,3.2Hz,1H),4.19(q,J＝4.8Hz,1H),
3.74(s,6H),3.40–3.35(m,1H),3.30–3.24(m,2H).
[0193] 2.2.4
[0194] 1‑((2R,3R,4R,5R)‑5‑((双(4‑甲氧基苯基)(苯基)甲氧基)甲基)‑4‑((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)‑3‑(甲硫基)四氢呋喃‑2‑基)嘧啶‑2,4(1H，3H)‑二酮(化合物1‑5)的制备：化合物1‑4(13.4g,23.3mmol)，DBU(7.3mL,48.8mmol)溶于无水DCM(270mL)中，加入TBSCl(7.0g,46.5mmol)，反应混合物于室温下搅拌过夜。反应液水洗，硫酸钠干燥，浓缩，柱层析分离(PE/EA＝10:1DCM/MeOH＝20:1)，得产物10.2g(产率63.3％)，为类白色泡沫状固‑体。LCMS:690,found 689[M‑H] .1H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.62(d,J＝11.6Hz,1H),
7.50(d,J＝8.2Hz,1H),7.41–7.31(m,2H),7.23(t,J＝8.8Hz,3H),7.19–7.15(m,2H),7.11(dd,J＝13.0,5.8Hz,1H),7.04(d,J＝8.7Hz,1H),6.77–6.66(m,4H),5.63(t,J＝2.9Hz,
1H),5.28(dd,J＝8.1,2.2Hz,1H),4.57–4.39(m,1H),4.28–4.19(m,1H),3.67(s,6H),3.44(dd,J＝10.7,5.7Hz,1H),3.28(dd,J＝10.6,3.1Hz,1H),3.00(ddd,J＝78.1,6.6,4.5Hz,
1H),1.92(d,J＝12.7Hz,3H),0.77(d,J＝9.6Hz,9H),0.06–‑0.10(m,6H).
[0195] 2.2.5
[0196] 1‑((2R，3R，4R，5R)‑4‑((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)‑5‑(羟甲基)‑3‑(甲硫基)四氢呋喃‑2‑基)嘧啶‑2,4(1H，3H)‑二酮(化合物1‑6)的制备：化合物1‑5(9.18g,13.3mmol)溶于DCM(92mL)中，加入二氯乙酸(4.4mL,53.2mmol)，反应混合物于室温下搅拌1h。然后反应液用饱和NaHCO3调pH至7～8，饱和氯化钠洗，硫酸钠干燥，浓缩。浓缩液柱层析分离+(DCMDCM/MeOH＝30:1)得黄色固体产物4.47g(产率86.6％)。LCMS:388,found 389[M+H].1H NMR(500MHz,DMSO‑d6)δ11.26(s,1H),7.85(d,J＝8.2Hz,1H),5.61(dd,J＝8.4,3.3Hz,
2H),5.01(t,J＝4.4Hz,1H),4.27–4.16(m,2H),3.59(tdd,J＝11.9,10.1,8.1,4.4Hz,2H),
2.05(s,3H),0.75(s,9H),‑0.00(s,3H),‑0.12(s,3H).
[0197] 2.2.6
[0198] 二甲基((E)‑2‑((2R，3R，4R，5R)‑3‑((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)‑5‑(2,4‑二氧代‑3,4‑二氢嘧啶‑1(2H)‑基)‑4‑(甲硫基)四氢呋喃‑2‑基)乙烯基)膦酸酯(化合物1‑7)的制备：化合物1‑6(4.4g,11.3mmol)溶于无水THF(120mL)中，于0～5℃下加入DMAP(7.21g,17.0mmol)，体系于室温下搅拌3h。反应液用饱和Na2S2O3淬灭，用饱和NaHCO3调pH至7～8，DCM萃取。萃取液用硫酸钠干燥，浓缩，得到1‑6A。四甲基亚甲基二磷酸酯(6.54g,22.7mmol)溶于无水THF(100mL)中，于0～5℃下加入叔丁醇钾(2.54g,22.7mmol)，体系于室温下搅拌
15min。加入1‑6A(溶于20mL无水THF中)，反应液于室温搅拌1h。反应液加入到饱和氯化钠中，DCM萃取，分离DCM层，干燥，减压浓缩。柱层析分离(DCM/Aceton＝5:1)，得产物2.6g(产+
率46.7％)，为类白色泡沫状固体。LCMS(ESI)：m/z 493[M+H] .
[0199] 2.2.7
[0200] 二甲基((E)‑2‑((2R，3R，4R，5R)‑5‑(3‑苯甲酰基‑2,4‑二氧代‑3,4‑二氢嘧啶‑1(2H)‑基)‑3‑((叔丁基二甲基甲硅烷基)氧基)‑4‑(甲硫基)四氢呋喃‑2‑基)乙烯基)膦酸酯(化合物1‑8)的制备：化合物1‑7(1.6g,3.25mmol)，DIPEA(545mg,4.23mmol)溶于无水DCM(32mL)中，加入BzCl(453ul,3.90mmol)。反应混合物于室温搅拌过夜。反应液用饱和NaCl洗涤，干燥，浓缩，柱层析分离(PE/DCM/MeOH＝50:50:1DCM/MeOH＝50:1)，得产物1.91g(产率+98.9％)，为类白色泡沫状固体。LCMS(ESI)：m/z 597[M+H] .
[0201] 2.2.8
[0202] 二甲基((E)‑2‑((2R，3R，4R，5R)‑5‑(3‑苯甲酰基‑2,4‑二氧代‑3,4‑二氢嘧啶‑1(2H)‑基)‑3‑羟基‑4‑(甲硫基)四氢呋喃‑2‑基)乙烯基)膦酸酯(化合物1‑9)的制备：化合物1‑8(1.9g,3.19mmol),TEA(1.2mL,4.97mmol)溶于THF(40mL)中，加入TEA·3HF(2.67mL,
15.9mmol)，反应混合物于室温搅拌过夜。反应液减压浓缩，柱层析分离(PE/DCM/MeOH＝50:
50:1DCM/MeOH＝50:1)，得产物1.2g(产率76.1％)，为类白色泡沫状固体。LCMS:482,found + 1
483[M+H] .H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ8.01–7.90(m,2H),7.76(d,J＝8.2Hz,1H),7.67(t,J＝7.4Hz,1H),7.52(t,J＝7.8Hz,2H),6.83(ddd,J＝22.1,17.2,4.7Hz,1H),6.10–5.99(m,1H),5.87(d,J＝8.3Hz,1H),5.72(d,J＝2.1Hz,1H),5.14(dd,J＝5.2,2.9Hz,1H),4.38(d,J＝2.1Hz,1H),3.93–3.56(m,7H),3.32(dd,J＝5.4,2.1Hz,1H),2.16(s,3H).2.2.9[0203] (2R,3R,4R,5R)‑5‑(3‑苯甲酰基‑2,4‑二氧代‑3,4‑二氢嘧啶‑1(2H)‑基)‑2‑((E)‑
2‑(二甲氧基磷酰基)乙烯基)‑4‑(甲硫基)四氢呋喃‑3‑基(2‑氰乙基)二异丙基亚磷酰胺(化合物1)的制备：化合物1‑9(1.25g,2.59mmol)，DIPEA(1.34g,10.4mmol)溶于无水THF(20mL)中，加入氰乙基N,N‑二异丙基氯代亚磷酰胺(600ul,2.70mmol)，体系于室温搅拌1h。
反应混合物于30℃下浓缩，柱层析分离(PE/Acetone＝3:1,2％TEAPE/DCM/Acetone＝3:1:
+
1,2％TEA)，得产物1.60g(产率90％)，为类白色泡沫状固体。LCMS(ESI)：m/z600[M‑83+H] ，+ 1
m/z 547[M‑135+H] 。H NMR(500MHz,Chloroform‑d)δ7.94(dd,J＝11.0,7.9Hz,2H),7.84(d,J＝8.3Hz,1H),7.66(q,J＝7.1Hz,1H),7.51(q,J＝7.4Hz,2H),6.87(dddd,J＝21.9,
17.1,9.3,4.2Hz,1H),6.15–5.99(m,2H),5.88(t,J＝8.8Hz,1H),5.11(dd,J＝17.9,4.4Hz,
1H),4.54(dd,J＝16.4,9.6Hz,1H),3.94–3.81(m,1H),3.79(d,J＝2.0Hz,6H),3.75–3.69(m,1H),3.60(ddt,J＝23.5,10.4,6.7Hz,2H),3.41(dd,J＝56.0,5.1Hz,1H),2.55(dt,J＝
27.8,5.7Hz,2H),2.21(d,J＝14.2Hz,3H),1.23–1.11(m,12H).
[0204] 实施例3在体外采用脂质体转染方法进行siRNA体外筛选
[0205] 细胞培养和96孔板转染：在Hep3B细胞中进行体外实验，采用MEM+10％FBS+1×青霉素链霉素+1×非必需氨基酸培养基，细胞平铺面积达80％时用胰蛋白酶消化，并用Scepter自动细胞计数仪(Millipore，#PHCC00000)测定细胞密度，同时在96孔板中将siRNA、Opti‑MEM和INTERFERin(Polyplus transfection)混合并置于室温孵育10分钟，然后每孔加入含有Hep3B细胞的完全培养基，将96孔板放于37℃，5％CO2的培养箱中孵育24小时。
[0206] 小鼠原代肝细胞提取：通过下腔静脉灌注法，用胶原酶消化提取小鼠肝细胞。经组织细胞滤网(BIOLOGIX，15‑1070)过滤，得到活性良好的小鼠原代肝细胞，重悬于DMEM培养基+10％FBS+1×青霉素链霉素中，用Scepter自动细胞计数仪(Millipore)测定细胞密度，同时在96孔板中将siRNA、Opti‑MEM和INTERFERin(Polyplus transfection)混合并置于室温孵育10分钟，然后每孔加入含有Hep3B细胞的完全培养基，将96孔板放于37℃，5％ CO2的培养箱中孵育24小时。
[0207] 96孔板RNA提取、反转录：使用Dynabeads mRNA DIRECT试剂盒(Ambion)提取96孔板细胞mRNA，将96孔板中培养基吸走，用DPBS清洗一次，每孔加入50‑300μL细胞裂解液，再加入20‑100μL beads,在振荡器上震荡，将96孔板置于磁分离架上，吸走孔内裂解液，每孔加入50‑300μL的清洗缓冲液A，吹打后置于磁分离架上，吸走清洗缓冲液A，然后用清洗缓冲液B将beads吹起，转移到新的96孔板，置于磁分离架，吸走清洗缓冲液B，再用缓冲液B将beads吹起转移到96孔PCR板中，同时配制反转试剂，将96孔PCR板置于磁分离架上，吸走清洗缓冲液B，每孔加入20μL的反转试剂，用封板膜封板后在PCR仪上进行25℃孵育10分钟，然后37℃孵育两小时后85℃，5分钟，降温至4℃，反转录结束。
[0208] 实时荧光定量PCR：反转录结束后将96孔板置于磁分离架上直到beads都吸附在底部，吸走反转试剂，将配好的QPCR体系加入到96孔PCR板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时PCR系统(applied biosystems)上进行PCR。
[0209] 采用ΔΔCt方法分析数据，并采用1nM阴性对照序列转染的细胞进行测试标准化。
[0210] 阴性对照AD‑1955序列为：CUUACGCUGAGUACUUCGAdTdT(SEQ  ID NO.205)UCGAAGUACUCAGCGUAAGdTdT(SEQ ID NO.206)。
[0211] 对表1中siRNA序列进行修饰得到表2‑4。
[0212] 表2描述了多条siRNA修饰正义链序列。
[0213]
[0214]
[0215] 表3描述了多条siRNA修饰反义链序列。
[0216]
[0217] 表4描述了修饰siRNA双链序列。
[0218]
[0219]
[0220]
[0221] 表5为Hep3B细胞中修饰siRNA双链在10nM浓度下筛选实验结果。
[0222]
[0223] 表6为Hep3B细胞中修饰siRNA双链在1nM浓度下筛选实验结果。
[0224]
[0225]
[0226] 表7为小鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链在10nM浓度下筛选实验结果。
[0227]
[0228]
[0229] 表8为大鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链通过Galnac递送在10nM浓度下筛选实验结果。
[0230]
[0231] 表9为小鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链通过Galnac递送在10nM浓度下筛选实验结果。
[0232]
[0233] 接下来我们进一步对序列BBD‑4005、4012、4021、4026的修饰进行优化，并在小鼠原代肝细胞中采用Galnac递送的方法对上述活性比较好的序列进行评估。
[0234] 实施例4小鼠原代肝细胞提取、96孔板RNA提取、反转及实时荧光定量PCR(方法同实施例3)
[0235] 采用ΔΔCt方法分析数据，并采用1nM AD‑1955转染的细胞进行测试标准化。
[0236] 表10描述了多条修饰正义链序列。
[0237] 修饰正义链名称 修饰正义链序列5’‑3’BBD‑4005SM1 mC*mU*mAmGmAmGfGmAfGfGfAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4005SM2 mC*mU*mAmGmAmGfGmAdGfGfAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4005SM3 mC*mU*mAmGmAmGfGmAfGdGfAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4005SM4 mC*mU*mAmGmAmGfGmAfGfGdAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4005SM5 mC*mU*mAmGmAmGmGmAfGfGdAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4005SM6 mC*mU*mAmGmAmGmGmAfGfGfAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4005SM7 mC*mU*mAmGmAmGmGmAfGdGfAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4005SM8 mC*mU*mAmGmAmGmGmAdGfGfAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4012SM1 mG*mC*mAmGmUmGfGmAfCfAfGmUmGmAmGmGmAmCmUmUmA
BBD‑4012SM2 mG*mC*mAmGmUmGfGmAfCfAdGmUmGmAmGmGmAmCmUmUmA
BBD‑4012SM3 mG*mC*mAmGmUmGmGmAfCfAdGmUmGmAmGmGmAmCmUmUmA
BBD‑4012SM4 mG*mC*mAmGmUmGmGmAfCfAfGmUmGmAmGmGmAmCmUmUmA
BBD‑4012SM5 mG*mC*mAmGmUmGfGmAdCfAfGmUmGmAmGmGmAmCmUmUmA
BBD‑4012SM6 mG*mC*mAmGmUmGfGmAfCdAfGmUmGmAmGmGmAmCmUmUmA
BBD‑4012SM7 mG*mC*mAmGmUmGmGmAfCdAfGmUmGmAmGmGmAmCmUmUmA
BBD‑4012SM8 mG*mC*mAmGmUmGmGmAdCfAfGmUmGmAmGmGmAmCmUmUmA
BBD‑4012SM9 mA*mG*mUmGmGmAfCmAfGfUdGmAmGmGmAmCmUmUmCmUmA
BBD‑4021SM9 mA*mG*mUmGmGmAfCmAfGfUdGmAmGmGmAmCmUmUmCmUmA
BBD‑4026SM2 mC*mU*mUmUmCmCfGmUfGfUdCmUmGmUmGmAmUmCmAmCmA
BBD‑4101SM1 Invab*mC*mCmAmGmAmGfGmAfGfGdAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4101SM2 Invab*mC*mCmAmGmAmGfGmAfGfGdAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmAInvab
BBD‑4101SM3 Invab*mC*mCmAmGmAmGmGmAfGfGdAmUfGmGmAmAmCmUmGmCmAInvab
BBD‑4101SM4 Invab*mC*mCmAmGmAmGmGmAfGmGfAmUfGmGmAmAmCmUmGmCmAInvab
BBD‑4102SM1 Invab*mC*mCmAmGmAmGfGmAfGfGdAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
BBD‑4102SM2 Invab*mC*mCmAmGmAmGfGmAfGfGdAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmAInvab
BBD‑4102SM3 Invab*mC*mCmAmGmAmGmGmAfGfGdAmUfGmGmAmAmCmUmGmCmAInvab
BBD‑4102SM4 Invab*mC*mCmAmGmAmGmGmAfGmGfAmUfGmGmAmAmCmUmGmCmAInvab
AD‑1700871‑SM mCmUmAmGmAmGmGmAfGfGfAmUmGmGmAmAmCmUmGmCmA
AD‑1700555‑SM mC*mU*mAmUmGmAmCmAfGfCfAmUmCmAmAmAmUmUmUmCmU
[0238] 表11描述了多条修饰反义链序列。
[0239]
[0240]
[0241]
[0242]
[0243] 表12描述了多条修饰双链序列。
[0244]
[0245]
[0246]
[0247]
[0248]
[0249]
[0250]
[0251]
[0252] 表13为在野生型小鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链通过Galnac递送在10nM浓度下筛选实验结果。
[0253]
[0254] 表14为Hep3B细胞中修饰siRNA双链在0.3nM浓度下筛选实验结果。
[0255]
[0256] 实施例5在AAV8‑hCIDEB小鼠中评估BBD‑4005对肝中CIDEB表达影响(3mg/kg)[0257] 在表达hCIDEB的小鼠中评估不同修饰的BBD‑4005序列、BBD‑4012序列、BBD‑4021序列和BBD‑4026序列对肝中hCIDEB表达的影响。
[0258] 1.腺病毒整合hCIDEB
[0259] 2.通过1.5×1011个纯化重组AAV8病毒颗粒注射至6‑8周龄雌性小鼠(C57BL/6)体内，获得稳定表达hCIDEB的转基因小鼠。
[0260] 2.给药
[0261] 小鼠注射病毒14天后，将小鼠平均分组，每组4只。siRNA用生理盐水溶解，皮下注射，给药剂量为3mg/kg。
[0262] 3.取肝检测
[0263] siRNA注射后不同时间点取肝，通过TRI REAGENT(MRC，货号：TR118)提取肝组织中的RNA，用PrimeScript RT regent Kit(Takara,货号：RR047A)将提取的RNA反转录为cDNA。配好的QPCR体系加入到96孔PCR板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时PCR系统(applied biosystems)上进行QPCR，检测hCIDEB的表达量。
[0264] siRNA注射后14天与31天取肝，检测hCIDEB表达量，结果参见表15，当给药剂量3mg/kg时不同修饰的序列在体内的活性表达不同，多条序列显示出显著的小鼠体内降解靶基因效果。
[0265] 表15为在AAV8‑hCIDEB小鼠中评估BBD‑4005对肝中CIDEB表达的影响。
[0266]
[0267] 上述数据表明不同修饰的BBD‑4005序列的活性比其他序列的高。我们接下来将从序列碱基优化、正义链反义链的修饰优化等方面，进一步筛选最优的靶向CIDEB的siRNA双连体。
[0268] 实施例6在AAV8‑hCIDEB小鼠原代肝细胞中检测优化的BBD‑4005序列的活性[0269] 我们选择了Alnylam公司两条阳性序列(L96‑AD‑1700555、L96‑AD‑1700871，具体序列和修饰参见表12)作为参考对照，对候选的BBD‑4005序列中进行碱基优化，并于反义链中引入了VPU、Invab修饰，在AAV8‑hCIDEB小鼠原代肝细胞进行脂质体转染与自由摄取实验。
[0270] 表16为AAV8‑hCIDEB小鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链在不同浓度下筛选实验结果。
[0271]
[0272] 结果显示经过修改碱基配对、VPU修饰或Invab修饰后，优化序列的BBD‑4005序列——BBD‑4101.11与BBD‑4102.11表现出比阳性参考更好的活性。
[0273] 接下来我们进一步对序列BBD‑4101.11与BBD‑4102.11的修饰进行优化，并在小鼠原代肝细胞中采用脂质体转染与Galnac递送的方法或者在体内对这些序列的活性进行评估。
[0274] 实施例7在AAV8‑hCIDEB小鼠中检测正义链修饰对于BBD‑4101与BBD‑4102序列活性的影响
[0275] 表17为AAV8‑hCIDEB小鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链在不同浓度下筛选实验结果。
[0276]
[0277]
[0278] 基于21/23与21/21配对，我们还对正义链的修饰进行优化，主要包括两种组合：1.第7位、第9位、第10位氟代修饰、第10位甲氧基修饰、第11位DNA修饰(BBD‑4101.21、BBD‑4102.21)；2.第9位、第11位、第13位氟代修饰(BBD‑4101.41、BBD‑4102.41)，结果显示21/23与21/21配对中，第二种正义链修饰的活性较好，后续可考虑选择此类修饰。接下来我们将以hCIDEB表达量作为评估指标，在AAV8‑hCIDEB小鼠体内探索上述修饰的体内活性，结果见表18。
[0279] 表18为在AAV8‑hCIDEB小鼠体内探索反义链正义链的不同修饰对于序列活性的影响。
[0280]
[0281] 结果显示BBD‑4101.41的整体活性持续时间较长，正义链第9位、第11位、第13位氟代修饰可能为4101序列的最优修饰。无论是4101修饰序列还是4102修饰序列，都比阳性参考AD‑1700871及AD‑1700555的活性更高。
[0282] 实施例8在AAV8‑hCIDEB小鼠中检测正义链修饰对于BBD‑4101序列活性的影响[0283] 表19为在AAV8‑hCIDEB小鼠体内探索正义链的不同修饰对于序列活性的影响。
[0284]
[0285] 基于21/23配对探索表18的正义链修饰的序列的体内活性，结果仍显示第9位、第11位、第13位氟代修饰(BBD‑4101.41)的活性持续时间较长。
[0286] 实施例9在AAV8‑hCIDEB小鼠中检测反义链修饰对于BBD‑4101序列活性的影响[0287] 我们接下来基于正义链带有两个invab的版本，综合正义链与反义链的不同修饰，探索这些修饰对于4101与4102序列活性的影响。可分为3组：1.反义链第12位DNA修饰、第14位、15位氟代修饰(BBD‑4101.31、BBD‑4101.41、BBD‑4101.21)；2.反义链第7位氟代修饰、第12位DNA修饰、第14位、15位氟代修饰(BBD‑4101.33、BBD‑4101.43、BBD‑4101.23)；3.反义链第8位氟代修饰、第12位DNA修饰、第14位、15位氟代修饰(BBD‑4101.34、BBD‑4101.44、BBD‑
4101.24)。在AAV8‑hCIDEB小鼠原代肝细胞中通过脂质体转染与自由摄取探索这些修饰对于BBD‑4101序列活性的影响。
[0288] 表20为AAV8‑hCIDEB小鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链在不同浓度下筛选实验结果。
[0289]
[0290] 结果显示，3组不同的反义修饰与表18正义链修饰排列组合，对于BBD‑4101序列活性的影响不大。
[0291] 实施例10在AAV8‑hCIDEB小鼠中探索反义链的不同VP修饰对于序列活性的影响[0292] 我们基于21/21配对的序列BBD‑4102进行不同的VP修饰，包括VPU、VPU‑S、VPU‑12、VPU‑8，在AAV8‑hCIDEB小鼠体内外探索这些修饰对于BBD‑4102活性的影响。
[0293] 表21为AAV8‑hCIDEB小鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链在不同浓度下筛选实验结果。
[0294]
[0295]
[0296] 体外结果显示，对于BBD‑4101与BBD‑4102序列，不管是自由摄取或脂质体转染实验，VPU与VPU‑S修饰整体表现较高的活性。我们接下来针对21/21配对的BBD‑4101序列，探索反义链的不同VP修饰对于该序列体内活性的影响，结果见表22。
[0297] 表22为在AAV8‑hCIDEB小鼠体内探索反义链不同VP修饰对于序列活性的影响。
[0298]
[0299] 体内结果显示VPU、VPU‑S修饰(BBD‑4102.41、BBD‑4102.44)的序列体内活性较高。实施例11评估不同VP修饰的BBD‑4102在肝脏中的体外代谢稳定性
[0300] 1.用DEPC水精确稀释受试的化合物序列，稀释至浓度为10μM的工作液。
[0301] 2.肝匀浆的制备：称量200mg小鼠肝脏，加入1mL磷酸钾缓冲溶液和5颗磁珠，在研磨仪中60HZ,30s/次条件下匀浆3次，得到200mg/mL肝匀浆。
[0302] 3.72h样品的制备：取17μL 10μM受试化合物/阳性化合物工作溶液，加入153μL肝匀浆混合，涡旋30s，取75μL化合物与肝匀浆混合溶液于EP管中，平行样本数为2，置于37℃孵育箱孵育72h，孵育完后取出50μL。
[0303] 4.0h样品的制备：取75μL肝匀浆于EP管中，平行样本数为2，置于37℃孵育箱孵育72h，孵育完后取出45μL肝匀浆，加入5μL 10μM受试化合物/阳性化合物，混匀。
[0304] 5.孵育后的样品每管加入5μL 50μg/mL内标，混匀，每管再加入100μL裂解液，涡旋30s，静置20min。
[0305] 6.所有样品采用合适前处理方法处理后，取上清进行仪器分析。随后计算，相对剩余率(％)＝(72h化合物含量/0h化合物含量)×100％。
[0306] 结果见表23。
[0307] 表23为评估不同VP修饰的BBD‑4102在肝脏中的体外代谢稳定性。
[0308] VP修饰 siRNA双链体 72h后反义链的剩余比例(％) 72h后正义链的剩余比例(％)VPU BBD‑4102.41 89.20 44.58VPU‑S BBD‑4102.44 106.17 24.45
VPU‑12 BBD‑4102.45 94.38 8.33
VPU‑8 BBD‑4102.46 97.03 1.71
[0309] 结果显示，经过72h肝匀浆孵育后，测试序列剩余比例均较高，其中反义链VPU‑S修饰的BBD‑4102序列稳定性最高。
[0310] 实验例12探索反义链带有UNA或isoGNA‑T修饰对序列活性的影响
[0311] 有报道指出UNA修饰或者isoGNA‑T修饰可以提高序列的稳定性以及降低其体内毒性，因此我们进一步基于21/21、21/23配对版本，在反义链第7位引入UNA、isoGNA‑T修饰，结合上述筛选的VPU、VPU‑S修饰，在小鼠体外与体内探索BBD‑4102与BBD‑4101的活性。
[0312] 表24为AAV8‑hCIDEB小鼠原代肝细胞中修饰siRNA双链在不同浓度下筛选实验结果。
[0313]
[0314] 结果显示，UNA、isoGNA‑T修饰对于序列活性提高作用不明显，除了BBD‑4102.42活性较低，其余各序列活性较高且差别不大。接下来我们将选择21/21配对版本，通过体内实验探索包含这些修饰组合的序列活性。
[0315] 表25为在野生型小鼠体内探索不同的反义链修饰对于序列活性的影响。
[0316]
[0317] 加药后第七天的检测结果显示，在序列碱基优化的基础上，添加UNA、isoGNA‑T对于BBD‑4102活性影响不大，综合来看，BBD‑4102.41可作为后续靶向CIDEB的理想序列。
[0318] 实施例13评估BBD‑4101与BBD‑4102在高脂饮食诱导小鼠NASH模型中的预治疗效果
[0319] 1.给药
[0320] C57雌性小鼠20只，体重20‑25g，随机分成5组，每组4只，设置对照组，模型组，给药组。对照组每天以正常饲料饲养，模型组与给药组每天以NASH饲料(A06071302，CDAHFD，Choline‑deficient,l‑amino acid‑defined,high‑fat diet)饲养。给药组siRNA给药剂量为3mg/kg,给药体积为5mL/kg，溶媒为生理盐水，给药方式为皮下注射，对照组和模型组以相同的给药方式给与同等剂量的溶媒。
[0321] 2.取肝检测
[0322] siRNA注射29天后，处死取肝，通过TRI REAGENT(MRC，货号：TR118)提取肝组织中的RNA，用PrimeScript RT regent Kit(Takara,货号：RR047A)将提取的RNA反转录为cDNA。配好的QPCR体系加入到96孔PCR板中，封板膜封板，在StepOnePlus的实时荧光定量PCR系统(applied biosystems)上进行PCR。检测CIDEB基因的表达及与肝病相关基因的表达(结果见图1)。另外剩余的肝组织进行HE染色，各组观察肝纤维化情况(结果见图2)。
[0323] 实时荧光定量PCR结果显示，BBD‑4101.41与BBD‑4102.41在高脂饮食诱导的小鼠NASH模型中恢复纤维化标志基因(mTNFA、mMCP‑1)的表达。HE结果表明BD‑4101.41与BBD‑4102.41可显著改善高脂饮食诱导的肝纤维化水平。可见BBD‑4101与BBD‑4102在高脂饮食诱导的NASH模型中具有良好的预治疗效果。
[0324] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

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