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表面上的单分子接种和扩增

申请号 CN202280048224.2 申请日 2022-05-09 公开(公告)号 CN117813392A 公开(公告)日 2024-04-02
申请人 加利福尼亚太平洋生物科学股份有限公司; 发明人 旻叡·理查德·沈; 库尔特·帕特森; 盖瑞·R·雅伯; 哈梅德·霍希尼贝;
摘要 提供的内容包括用于在流通池上的单分子接种和扩增的方法、组合物和系统。在一些实施方案中,核酸在包括多于一个结合区域(例如,垫)的流通池上等温地接种和扩增,得到在每个结合区域上的大体上相同的扩增的分子的集合。
权利要求

1.一种核酸扩增的方法,包括:
(a)提供包含第一序列、第二序列和第三序列的第一环状DNA模板;
(b)提供包含多于一个结合区域的表面,其中所述多于一个结合区域中的每一个附接有多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B,其中所述寡核苷酸A包含与所述第一序列互补的第一捕获序列和与所述第二序列互补的第二捕获序列,并且其中所述寡核苷酸B包含所述第三序列;以及
(c)使所述第一环状DNA模板与附接至所述多于一个结合区域的第一结合区域的所述多于一个寡核苷酸A在存在DNA聚合酶的情况下接触以经由滚环扩增(RCA)产生所述第一DNA模板的扩增的单链多联体,并且使单链、寡核苷酸A引发的多联体与所述多于一个寡核苷酸B接触以产生所述第一DNA模板的互补多联体。
2.根据权利要求1所述的方法,还包括提供包含所述第一序列、所述第二序列和所述第三序列的第二环状DNA模板;以及使所述第二环状DNA模板与附接至所述多于一个结合区域的第二结合区域的所述多于一个寡核苷酸A在存在所述DNA聚合酶的情况下接触以经由RCA产生所述第二DNA模板的扩增的单链多联体,并且使所述第二DNA模板的单链、寡核苷酸A引发的多联体与所述多于一个寡核苷酸B接触以产生所述第二DNA模板的互补多联体。
3.根据权利要求1或2所述的方法,其中使所述第一环状DNA模板与附接至所述多于一个结合区域的第一结合区域的所述多于一个寡核苷酸A在存在DNA聚合酶的情况下接触以及使所述第二环状DNA模板与附接至所述多于一个结合区域的第二结合区域的所述多于一个寡核苷酸A在存在所述DNA聚合酶的情况下接触同时发生。
4.根据权利要求1‑3中任一项所述的方法,其中使所述第一环状DNA模板与附接至所述多于一个结合区域的所述第一结合区域的所述多于一个寡核苷酸A在存在所述DNA聚合酶的情况下接触以经由RCA产生所述第一DNA模板的扩增的单链多联体包括:
将所述第一环状DNA模板与附接至所述多于一个结合区域的所述第一结合区域的寡核苷酸A杂交;以及
通过所述DNA聚合酶沿着所述第一环状DNA模板延伸与所述第一环状DNA模板结合的所述寡核苷酸A,由此产生所述第一DNA模板的扩增的单链多联体。
5.根据权利要求1‑4中任一项所述的方法,其中使所述单链、寡核苷酸A引发的多联体与所述多于一个寡核苷酸B接触以产生所述第一DNA模板的互补多联体包括:
将单链、寡核苷酸A引发的多联体与附接至所述多于一个结合区域的所述第一结合区域的寡核苷酸B杂交;以及
通过所述DNA聚合酶延伸与所述单链、寡核苷酸A引发的多联体结合的所述寡核苷酸B,由此产生所述第一DNA模板的互补多联体。
6.根据权利要求5或6所述的方法,其中通过所述DNA聚合酶沿着所述第一环状DNA模板延伸与所述第一环状DNA模板结合的寡核苷酸A以及延伸与所述单链、寡核苷酸A引发的多联体结合的所述寡核苷酸B同时发生。
7.根据权利要求1‑6中任一项所述的方法,包括使所述第一DNA模板的互补多联体与附接至所述第一结合区域的所述多于一个寡核苷酸A中的一个或更多个寡核苷酸A接触以产生所述第一DNA模板的另外的多联体。
8.根据权利要求2‑7中任一项所述的方法,包括使所述第二DNA模板的互补多联体与附接至所述第二结合区域的所述多于一个寡核苷酸A中的一个或更多个寡核苷酸A接触以产生所述第二DNA模板的另外的多联体。
9.根据权利要求1‑8中任一项所述的方法,其中所述第一DNA模板的所述互补多联体与所述第一DNA模板的所述单链多联体反向互补。
10.根据权利要求1‑9中任一项所述的方法,其中所述第一环状DNA模板和所述第二环状DNA模板在同一样品中提供。
11.根据权利要求1‑10中任一项所述的方法,其中所述第一环状DNA模板、所述第二环状DNA模板或两者是单链DNA。
12.根据权利要求1‑11中任一项所述的方法,其中所述第一环状DNA模板、所述第二环状DNA模板或两者是由线性核酸模板环化的。
13.根据权利要求1‑12中任一项所述的方法,其中所述表面是流通池表面。
14.根据权利要求13所述的方法,其中所述RCA反应在流通池内进行。
15.根据权利要求1‑14中任一项所述的方法,包括通过耗尽寡核苷酸A、寡核苷酸B或两者以终止所述RCA反应。
16.根据权利要求1‑15中任一项所述的方法,其中所述方法不包括通过使所述DNA聚合酶变性以终止所述RCA反应。
17.根据权利要求1‑15中任一项所述的方法,其中所述方法不包括通过去除所述DNA聚合酶以终止所述RCA反应。
18.根据权利要求1‑17中任一项所述的方法,其中所述RCA在约37℃进行。
19.根据权利要求1‑18中任一项所述的方法,其中所述DNA聚合酶是Phi29 DNA聚合酶。
20.根据权利要求1‑19中任一项所述的方法,其中在所述寡核苷酸A上,所述第一捕获序列在所述第二捕获序列的5’。
21.根据权利要求1‑19中任一项所述的方法,其中在所述寡核苷酸A上,所述第二捕获序列在所述第一捕获序列的5’。
22.根据权利要求1‑21中任一项所述的方法,其中所述多于一个寡核苷酸A、所述多于一个寡核苷酸B或两者共价缀合至所述第一结合区域、所述第二结合区域或两者。
23.根据权利要求1‑21中任一项所述的方法,其中所述多于一个寡核苷酸A、所述多于一个寡核苷酸B或两者非共价附接至所述第一结合区域、所述第二结合区域或两者。
24.根据权利要求1‑23中任一项所述的方法,其中所述多于一个寡核苷酸A和所述多于一个寡核苷酸B各自附接在所述寡核苷酸A或寡核苷酸B的5’末端处或靠近5’末端处。
25.根据权利要求1‑24中任一项所述的方法,其中所述多于一个寡核苷酸A和所述多于一个寡核苷酸B彼此不反向互补。
26.根据权利要求1‑25中任一项所述的方法,其中所述多于一个结合区域中的结合区域附接有单个寡核苷酸A、单个寡核苷酸B或两者。
27.根据权利要求1‑25中任一项所述的方法,其中所述多于一个结合区域中的结合区域附接有至少10,000个寡核苷酸A、至少10,000个寡核苷酸B或两者。
28.根据权利要求1‑27中任一项所述的方法,其中附接至所述多于一个结合区域的结合区域的所述多于一个寡核苷酸A和所述多于一个寡核苷酸B的比例是约100:1至约1:100。
29.根据权利要求1‑28中任一项所述的方法,其中所述第一结合区域包含所述第一DNA模板的克隆群体。
30.根据权利要求1‑29中任一项所述的方法,其中所述第一结合区域不包含所述第二DNA模板。
31.根据权利要求2‑30中任一项所述的方法,其中所述第二结合区域包含所述第二DNA模板的克隆群体。
32.根据权利要求2‑31中任一项所述的方法,其中所述第二结合区域不包含所述第一DNA模板。
33.根据权利要求1‑32中任一项所述的方法,其中至少90%的所述结合区域包含不多于一种核酸模板的克隆群体。
34.根据权利要求1‑33中任一项所述的方法,其中至少90%的所述结合区域包含彼此不同的模板核酸。
35.根据权利要求1‑34中任一项所述的方法,其中所述第一序列和所述第二序列彼此相邻。
36.根据权利要求1‑35中任一项所述的方法,其中所述第三序列与所述第一序列或所述第二序列相邻。
37.根据权利要求1‑36中任一项所述的方法,其中所述第一DNA模板的所述多联体和所述第一DNA模板的所述互补多联体经由附接至所述第一结合区域的所述多于一个寡核苷酸A和所述多于一个寡核苷酸B附接至所述多于一个结合区域的所述第一结合区域。
38.根据权利要求1‑37中任一项所述的方法,其中所述第二DNA模板的所述多联体和所述第二DNA模板的所述互补多联体经由附接至所述第二结合区域的所述多于一个寡核苷酸A和所述多于一个寡核苷酸B附接至所述多于一个结合区域的所述第二结合区域。
4
39.根据权利要求1‑36中任一项所述的方法,其中所述表面包含约10个结合区域至约
8
10个结合区域。
40.根据权利要求1‑37中任一项所述的方法,其中所述表面包含由非预定和/或随机分布的间断部分隔开的至少10,000个有序的结合区域。
41.根据权利要求1‑40中任一项所述的方法,其中所述多于一个结合区域中的一个、一个或更多个或者每一个具有环状的形状。
42.根据权利要求1‑41中任一项所述的方法,其中所述多于一个结合区域中的一个、一‑9 ‑4
个或更多个或者每一个的尺寸是约10 m至约10 m。
43.根据权利要求42所述的方法,其中所述多于一个结合区域中的一个、一个或更多个或者每一个的尺寸是所述结合区域的宽度或半径。
44.根据权利要求1‑43中任一项所述的方法,其中所述表面是平面表面。

说明书全文

表面上的单分子接种和扩增

[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请要求2021年5月10日提交的美国临时专利申请第63/186,649号和2021年11月29日提交的美国临时专利申请第63/283,877号的优先权的权益。这些相关申请中的每一
个的内容通过引用以其整体并入本文。
[0003] 背景
[0004] 领域
[0005] 本申请总体上涉及分子生物学,并且更具体地涉及核酸的扩增和测序。
[0006] 相关技术的描述
[0007] 滚环扩增(RCA)是扩增环状模板核酸以产生包含模板核酸序列的串联拷贝(concatenated copies)的长单链线性核酸分子的高效方法。RCA已经被用于许多应用,诸
如核酸测序。
[0008] 概述
[0009] 本文公开的内容包括核酸扩增的方法、系统和组合物。在一些实施方案中,该方法包括:(a)提供包含第一序列、第二序列和第三序列的第一环状DNA模板;(b)提供包含多于一个结合区域的表面,其中多于一个结合区域中的每一个附接有多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B,其中寡核苷酸A包含与第一序列互补的第一捕获序列和与第二序列互补
的第二捕获序列,并且其中寡核苷酸B包含第三序列;以及(c)使第一环状DNA模板与附接至多于一个结合区域的第一结合区域的多于一个寡核苷酸A在存在DNA聚合酶的情况下接触
以经由滚环扩增(RCA)产生第一DNA模板的扩增的单链多联体(concatemers),并且使单链、寡核苷酸A引发的多联体与多于一个寡核苷酸B接触,以产生第一DNA模板的互补多联体。
[0010] 该方法可以,例如,还包括提供包含第一序列、第二序列和第三序列的第二环状DNA模板;以及使第二环状DNA模板与附接至多于一个结合区域的第二结合区域的多于一个
寡核苷酸A在存在DNA聚合酶的情况下接触以经由RCA产生第二DNA模板的扩增的单链多联
体,并且使第二DNA模板的单链、寡核苷酸A引发的多联体与多于一个寡核苷酸B接触,以产生第二DNA模板的互补多联体。
[0011] 在一些实施方案中,使第一环状DNA模板与附接至多于一个结合区域的第一结合区域的多于一个寡核苷酸A在存在DNA聚合酶的情况下接触以及使第二环状DNA模板与附接
至多于一个结合区域的第二结合区域的多于一个寡核苷酸A在存在DNA聚合酶的情况下接
触同时发生。在一些实施方案中,使第一环状DNA模板与附接至多于一个结合区域的第一结合区域的多于一个寡核苷酸A在存在DNA聚合酶的情况下接触以经由RCA产生第一DNA模板
的扩增的单链多联体包括:将第一环状DNA模板与附接至多于一个结合区域的第一结合区
域的寡核苷酸A杂交;以及通过DNA聚合酶,沿着第一环状DNA模板,延伸与第一环状DNA模板结合的寡核苷酸A,由此产生第一DNA模板的扩增的单链多联体。
[0012] 在一些实施方案中,使单链、寡核苷酸A引发的多联体与多于一个寡核苷酸B接触以产生第一DNA模板的互补多联体包括:将单链、寡核苷酸A引发的多联体与附接至多于一
个结合区域的第一结合区域的寡核苷酸B杂交;以及通过DNA聚合酶,延伸与单链、寡核苷酸A引发的多联体结合的寡核苷酸B,由此产生第一DNA模板的互补多联体。
[0013] 在一些实施方案中,通过DNA聚合酶沿着第一环状DNA模板延伸与第一环状DNA模板结合的寡核苷酸A以及延伸与单链、寡核苷酸A引发的多联体结合的寡核苷酸B同时发生。
[0014] 在一些实施方案中,该方法可以包括:使第一DNA模板的互补多联体与附接至第一结合区域的多于一个寡核苷酸A中的一个或更多个寡核苷酸A接触以产生第一DNA模板的另
外的多联体。在一些实施方案中,该方法包括:使第二DNA模板的互补多联体与附接至第二结合区域的多于一个寡核苷酸A中的一个或更多个寡核苷酸A接触以产生第二DNA模板的另
外的多联体。
[0015] 第一DNA模板的互补多联体可以与第一DNA模板的单链多联体反向互补。第一环状DNA模板和第二环状DNA模板可以在同一样品中提供。在一些实施方案中,第一环状DNA模
板、第二环状DNA模板或两者是单链DNA。在一些实施方案中,第一环状DNA模板、第二环状DNA模板或两者是由线性核酸模板环化的。表面可以是流通池表面。在一些实施方案中,RCA反应在流通池内进行。
[0016] 在一些实施方案中,该方法可以包括:通过耗尽寡核苷酸A、寡核苷酸B或两者以终止RCA反应。在一些实施方案中,该方法不包括通过使DNA聚合酶变性以终止RCA反应。在一些实施方案中,该方法不包括通过去除DNA聚合酶以终止RCA反应。在一些实施方案中,RCA在约37℃进行。DNA聚合酶可以是,例如,Phi29 DNA聚合酶。在一些实施方案中,在寡核苷酸A上,第一捕获序列在第二捕获序列的5’。在一些实施方案中,在寡核苷酸A上,第二捕获序列在第一捕获序列的5’。多于一个寡核苷酸A、多于一个寡核苷酸B或两者可以与第一结合区域、第二结合区域或两者共价缀合。多于一个寡核苷酸A、多于一个寡核苷酸B或两者可以非共价附接至第一结合区域、第二结合区域或两者。在一些实施方案中,多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B各自附接在寡核苷酸A或寡核苷酸B的5’末端处或靠近5’末端处。在一些实施方案中,多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B彼此不是反向互补的。在一些实施方案中,多于一个结合区域中的结合区域附接有单个寡核苷酸A、单个寡核苷酸B或两
者。在一些实施方案中,多于一个结合区域的结合区域附接有至少10,000个寡核苷酸A、至少10,000个寡核苷酸B或两者。
[0017] 附接至多于一个结合区域的结合区域的多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B的比例可以是约100:1至约1:100。在一些实施方案中,第一结合区域包含第一DNA模板的
克隆群体。在一些实施方案中,第一结合区域不包含第二DNA模板。在一些实施方案中,第二结合区域包含第二DNA模板的克隆群体。在一些实施方案中,第二结合区域不包含第一DNA
模板。在一些实施方案中,至少90%的结合区域包含不多于一种核酸模板的克隆群体。在一些实施方案中,至少90%的结合区域包含彼此不同的模板核酸。第一序列和第二序列可以
彼此相邻。第三序列可以与第一序列或第二序列相邻。
[0018] 第一DNA模板的多联体和第一DNA模板的互补多联体可以经由附接至第一结合区域的多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B附接至多于一个结合区域的第一结合区域。
第二DNA模板的多联体和第二DNA模板的互补多联体可以经由附接至第二结合区域的多于
一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B附接至多于一个结合区域的第二结合区域。
[0019] 表面可以包含,例如,约104个结合区域至约108个结合区域。在一些实施方案中,表面包含由非预定和/或随机分布的间断部(disjunctions)分隔开的至少10,000个有序的结合区域。在一些实施方案中,多于一个结合区域中的一个、一个或更多个或者每一个具有环状的形状。多于一个结合区域中的一个、一个或更多个或者每一个的尺寸可以变化,例如约‑9 ‑4
10 m至约10 m。在一些实施方案中,多于一个结合区域中的一个、一个或更多个或者每一
个的尺寸是结合区域的宽度或半径。在一些实施方案中,表面是平面表面。
[0020] 提供的内容包括用于扩增核酸的方法、组合物和试剂盒。该方法可以包括:(a)提供包含第一序列、第二序列和第三序列的第一环状DNA模板;(b)提供包含多于一个结合区
域的表面,其中多于一个结合区域中的每一个附接有多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核
苷酸B,其中寡核苷酸A包含与第一序列互补的第一捕获序列和与第二序列互补的第二捕获
序列,并且其中寡核苷酸B包含第三序列;以及(c)使第一环状DNA模板与附接至多于一个结合区域的第一结合区域的多于一个寡核苷酸A在存在DNA聚合酶的情况下接触以经由滚环
扩增产生第一DNA模板的扩增的单链多联体,并且使单链、寡核苷酸A引发的多联体与多于
一个寡核苷酸B接触以产生第一DNA模板的互补多联体。
[0021] 附图简述
[0022] 图1是示出了单链DNA环(ssDNA模板)的产生的非限制性示意图。ssDNA模板包含具有序列101和序列103的衔接子A以及具有序列102的衔接子B。
[0023] 图2是示出了具有多于一个结合区域(例如,垫)的示例性流通池表面,以及具有与其缀合的引物A和引物B的单独的垫的组成的非限制性示意图。引物A具有与图1中示出的单
链DNA环(ssDNA模板)的序列101互补(或大体上互补)的序列区域,以及与图1中示出的单链
DNA环(ssDNA模板)的序列102互补(或大体上互补)的另一个序列区域。引物B具有与图1中
示出的单链DNA环(ssDNA模板)的序列103具有相同(或大体上相同)序列的序列区域。
[0024] 图3是示出了在存在聚合酶的情况下,通过附接至垫的引物A来捕获单链DNA模板的非限制性示意图。
[0025] 图4是示出了经由滚环扩增产生DNA多联体的非限制性示意图。
[0026] 图5是示出了引物B退火到DNA多联体的非限制性示意图。
[0027] 图6A‑图6B是示出以下的非限制性示意图:(1)经由滚环扩增,从使用引物B的引发开始生长的互补DNA多联体的产生(图6A示出了从表面引物B生长的互补多联体);以及(2)伴随着第一链的产生,第二链引发的开始(图6B示出,随着更多的第一链产生,更多的第二链引发从表面开始)。
[0028] 图7是示出了经由滚环扩增形成DNA多联体的簇的非限制性示意图。第一链引物可以退火到第二链鳞状物(scales),用于另外的延伸和表面引物消耗。在一些实施方案中,引物消耗可以阻止另外的文库环在同一垫中退火。
[0029] 图8是示出了在表面上的多于一个垫上产生的第一链多联体DNA和第二链多联体DNA的扩增产物的非限制性示意图。每个垫可以具有第一链多联体DNA和第二链多联体DNA。
[0030] 图9A示出了产生与固定引物杂交的环状模板核酸的非限制性示意图。
[0031] 图9B示出了经由滚环扩增,沿着环状模板核酸延伸固定引物,以产生扩增的多联体的非限制性示意图。
[0032] 详述
[0033] 在以下详述中,参考了构成本文的一部分的附图。在附图中,相似的符号通常标识相似的组成部分,除非上下文另外规定。详述、附图和权利要求书中描述的说明性实施方案不意图是限制性的。在不偏离本文提出的主题的精神或范围的情况下,可以利用其他实施方案,并且可以做出其他改变。将容易地理解的是,如本文一般描述的和附图中图示的,本公开内容的方面可以以各种不同的配置被布置、替代、组合、分离和设计,其全部在本文中被明确地预期并且构成本文的公开内容的一部分。
[0034] 所有专利、公布的专利申请、其他出版物以及来自GenBank和本文提及的其他数据库的序列关于相关技术通过引用以其整体并入。
[0035] 本文公开的内容包括用于使用滚环扩增(RCA)在包含多于一个结合区域(例如,垫)的表面(例如,结构化表面)上等温接种和扩增核酸的方法、组合物和系统。这样的接种和扩增可以产生多于一个结合区域(例如,垫),每个结合区域包含基本上相同的扩增的分
子的集合,并且结合区域(例如,垫)上的扩增的分子的集合在结合区域(例如,垫)之间是不同的(即,给定的结合区域上的扩增的分子的集合不同于多于一个结合区域的任何其他垫
上的扩增的分子的集合)。表面可以是流通池表面。表面可以是平面的或弯曲的。本文公开内容的实践允许在表面上同时捕获环形文库组分,并且在结构化表面的特定区域扩增该文
库组分。通常,捕获和扩增以比二次捕获更快的速率发生,使得特定区域被不多于一个文库成分接种。因此,接种在该位置的核酸群体通常是单个原始文库成分的同质扩增
(homogeneous amplification),以便促进文库成分的测序。
[0036] 滚环扩增产生线性多联体核酸分子,其呈随机线圈的形式,通常被称为“微微球(picosphere)”。微微球可以被固定至适合用于测序的表面(例如,经由与测序基底表面上的通用捕获寡核苷酸杂交)。通用捕获寡核苷酸具有与任何感兴趣的特定靶序列无关的序
列,并且因此可以用于捕获任何靶序列。通用捕获寡核苷酸可以与微微球中的通用引发序
列杂交。在一些实施方案中,通用捕获寡核苷酸是条形码测序引物。在一些实施方案中,微微球通过离子相互作用、经由共价连接或通过附接的配体(例如,生物素和链霉亲和素)的
结合介导而附接至表面。在一些实施方案中,一个或若干个测序引物在附接至用于测序的
表面之前或之后与微微球杂交。
[0037] 在本文公开的方法、组合物和系统中,可以提供具有多于一个结合区域(例如,垫)的表面(例如,结构化表面),其中寡核苷酸A和寡核苷酸B被固定在多于一个结合区域中的每一个上。寡核苷酸A包含互补的并且能够捕获文库元件的结合区域,并且寡核苷酸B包含
与文库元件的序列相同(或大体上相同)的结合区域。例如,如图1中示出的,衔接子A和衔接子B位于线性文库的成员核酸的每个末端,成员核酸可以与夹板(splint)杂交,并且通过连接形成ssDNA环。衔接子A包含序列101和序列103,并且衔接子B包含序列102。当衔接子A连接到衔接子B时,线性文库成分转化为具有衔接子A/衔接子B连接的区域的环状分子,该衔
接子A/衔接子B连接的区域与结合位点上的一组寡核苷酸反向互补,并且在序列上与结合
位点上的第二引物局部相同。因此,捕获寡核苷酸可以用于引发环化文库成分的滚环扩增,这进而产生与原始文库成分反向互补并且具有与表面上的第二寡核苷酸反向互补的区段
的线性多联体。图2中示出,流通池表面包含多于一个结合区域(例如,垫),并且结合区域中的每一个具有附接(例如,固定)在其上的引物A和引物B。引物A和引物B各自包含跨越原始
文库成分的衔接子A和衔接子B之间的连接事件的序列。引物A和引物B能够在随后的反应中
作为引物发挥作用。引物A包含与衔接子B的序列102互补(或大体上互补)的序列102’以及
与衔接子A的序列101互补(或大体上互补)并位于序列102’的5’的序列101’。引物B包含序列103(或与序列103大体上相同的序列)。对于引物A,序列101’可以与序列102’相邻,中间没有间隔序列,或者序列101’的3’末端可以距离序列102’的5’末端一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸或更多个核苷酸。由于序列互补性,引物A可以与ssDNA环模板结合以在存在DNA聚合酶的情况下产生DNA多联体。然后引物B可以结合至由结合至环状模板的引物A延伸
产生的多联体,产生反向互补多联体。然而,引物A和引物B彼此不是反向互补的,使得它们不在表面上形成二聚体。
[0038] 可以形成包含呈ssDNA环(也被称为模板ssDNA)的形式的文库成员核酸和DNA聚合酶的延伸混合物,并且提供该延伸混合物以接触固定寡核苷酸A和寡核苷酸B在其上的垫以
进行核酸延伸和扩增(图3)。由于寡核苷酸A和寡核苷酸B分别与文库的成员核酸上的衔接
子A和衔接子B具有的序列互补性,寡核苷酸A和寡核苷酸B可以用作捕获寡核苷酸和扩增寡
核苷酸。在一些实施方案中,可以进行允许同时捕获和扩增的生化方法(例如,在存在例如phi29聚合酶、盐、核苷酸、缓冲液或更多的情况下的滚环扩增(RCA))。例如,使用寡核苷酸A作为引物,可以进行RCA并且产生模板ssDNA的多联体拷贝(图4)。寡核苷酸B之后可以与多
联体DNA结合,并且作为引物发挥作用,以允许RCA产生互补的多联体(图5和图6)。然而,由于引物A和引物B彼此不是反向互补的,它们不在表面上形成引物二聚体。随着产生更多的
第一链,在结合区域(例如,垫)上启动了更多的第二链引发以继续RCA(图6A‑图6B)。如图7中示出的,第一链引物可以退火到第二链鳞状物,用于另外的延伸和表面引物消耗。在一些实施方案中,阻止另外的文库环在同一垫中退火对于引物消耗可以是有利的。作为第一链
引发RCA和第二链引发RCA的结果,结合区域(例如,垫)将与第一链多联体DNA和第二链多联体DNA相关。流通池表面可以具有多于一个结合区域(例如,垫)。结合区域(例如,垫)可以在流通池表面上处于结构化配置,或者在一些实施方案中,垫处于未被结构化和/或预定的配置。
[0039] 该方法可以包括:(a)提供包含第一序列、第二序列和第三序列的第一环状DNA模板;(b)提供包含多于一个结合区域的表面,其中多于一个结合区域中的每一个附接有多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B,其中寡核苷酸A包含与第一序列互补的第一捕获序
列和与第二序列互补的第二捕获序列,并且其中寡核苷酸B包含第三序列;以及(c)使第一
环状DNA模板与附接至多于一个结合区域的第一结合区域的多于一个寡核苷酸A和多于一
个寡核苷酸B在存在DNA聚合酶的情况下接触以产生第一DNA模板的扩增的多联体和第一
DNA模板的互补多联体。在一些实施方案中,一些方法从末端具有衔接子A和衔接子B的线性文库成分开始,使得与引物A的接触导致将线性文库成分定位为在与连接酶接触后环化。第一DNA模板的扩增的多联体和第一DNA模板的互补多联体的产生可以经由滚环扩增(RCA)反
应来进行,例如在约25℃至65℃的范围内的温度,或在25℃至65℃的范围内的温度,例如在
37℃在等温条件下进行的RCA反应。由此产生的互补多联体包含与引物B互补的区域,使得
引物B可以引发反向互补多联体或者与引物A引物多联体链的反向互补链的合成。
[0040] 在一些实施方案中,该方法包括:(a)提供多于一个环状DNA模板,每个环状DNA模板包含第一序列、第二序列和第三序列;(b)提供包含多于一个结合区域的表面,其中多于一个结合区域中的每一个附接有多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B,其中寡核苷酸
A包含与第一序列互补的第一捕获序列和与第二序列互补的第二捕获序列,并且其中寡核
苷酸B包含第三序列;以及(c)将多于一个环状DNA模板中的每一个分别与附接至多于一个
结合区域的结合区域的多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B在存在DNA聚合酶的情况
下杂交,以经由滚环扩增(RCA)产生DNA模板的扩增的多联体和DNA模板的互补多联体。这样的接种和扩增方法可以产生多于一个结合区域,每个结合区域包含基本上相同的扩增的分
子的集合,并且结合区域上的扩增的分子的集合在结合区域之间是不同的(即,给定的结合区域上的扩增的分子的集合不同于多于一个结合区域的任何其他垫上的扩增的分子的集
合)。
[0041] 定义
[0042] 除非另外定义,否则本文使用的技术术语和科学术语具有与本公开内容所属领域的普通技术人员通常所理解的相同含义。参见,例如,Singleton等人,Dictionary of 
Microbiology and Molecular Biology,第2版,J.Wiley&Sons(New York,NY 1994);
Sambrook等人,Molecular Cloning,A Laboratory Manual,Cold Spring Harbor Press
(Cold Spring Harbor,NY 1989)。出于本公开内容的目的,以下术语在下文定义。
[0043] 如本文使用的,术语“固定的”在提及分子使用时,指的是分子直接或间接、共价或非共价附接至表面,诸如固体支持物的表面。在一些配置中,共价附接是优选的,但是通常所有需要的仅是分子(例如,核酸)在期望表面保留的条件下保持固定或附接至表面。
[0044] 如本文使用的,术语“核苷酸”可以用于指天然核苷酸或其类似物。实例包括但不限于核苷酸三磷酸(NTP)诸如核糖核苷酸三磷酸(rNTP)、脱核糖核苷酸三磷酸(dNTP)、或其非天然类似物诸如二脱氧核糖核苷酸三磷酸(ddNTP)或可逆终止的核苷酸三磷酸(rtNTP)。
[0045] 如本文使用的,术语“互补性”或“互补的”意指基于传统的Watson‑Crick配对规则,一个核酸可以与另一个核酸形成氢键。互补性可以是完全的或部分的。完全互补性指示一条链的每一个核酸碱基都能够根据Watson‑Crick经典碱基配对与另一个反向平行核酸序列中的对应碱基形成氢键。部分互补性指示,一个核酸序列中只有一定百分比的连续
残基可以与另一个反向平行核酸序列中相同数目的连续残基形成Watson‑Crick碱基配对。
“大体上互补的”指的是约、至少或至少约70%、80%、90%、100%或这些值中的任何两个之间的数字或范围的互补百分比。
[0046] 如本文使用的,术语“聚合酶”可以用于指合成核酸的酶,包括但不限于DNA聚合酶、RNA聚合酶、逆转录酶、引物酶和转移酶。通常,聚合酶具有一个或更多个活性位点,在该一个或更多个活性位点处可以发生核苷酸结合和/或核苷酸聚合的催化。聚合酶可以催化
核苷酸聚合到双链核酸分子的第一链的3’末端。例如,聚合酶催化下一个正确的核苷酸经由磷酸二酯键添加至双链核酸分子的第一链的3’氧部分,从而将核苷酸共价掺入双链核酸分子的第一链。在一些实施方案中,聚合酶不需要能够在本文阐述的方法中使用的一种或
更多种条件下进行核苷酸掺入。例如,突变聚合酶可以能够形成三元复合物,但不能催化核苷酸掺入。
[0047] 如本文使用的,术语“引物”指的是具有在模板序列处或靠近模板序列处与核酸结合的序列的核酸。通常,引物以允许例如经由引物的聚合酶延伸复制模板的配置结合。引物可以是核酸分子的第一部分,该第一部分与核酸分子的第二部分结合,第一部分是引物序列并且第二部分是引物结合序列(例如,发夹引物)。在一些实施方案中,引物是与具有模板序列的第二核酸分子结合的第一核酸分子。引物可以由DNA、RNA或其类似物组成。引物可以具有可延伸的3’末端或被封闭引物延伸的3’末端。
[0048] 如本文使用的,“容器”是用于将一种化学过程(例如,结合事件;掺入反应;等)与另一种化学过程分离的器皿,或者用于提供化学过程可以发生在其中的空间的器皿。结合所公开的技术有用的容器的实例包括但不限于流通池、多孔板的孔;显微镜载玻片;管(例如,毛细管);液滴、囊泡、试管、托盘、离心管、阵列中的特征、管道(tubing)、基底中的通道等。
[0049] 如本文使用的,术语“环状”,当用于提及核酸链时,意指该链不具有末端(即,该链缺少3’末端和5’末端)。因此,环状链中每个核苷酸单体的3’氧和5’磷酸部分共价附接到链中相邻的核苷酸单体。环状DNA链可以用作经由滚环扩增(RCA)产生多联体扩增子的模板,其中多联体扩增子的每个序列单元是环状核酸链的反向互补物。环状核酸可以是双链的。
双链核酸中的一条链或两条链可以缺少3’末端和5’末端。双链核酸中的一条链可以具有缺口(相对于另一条链不存在至少一个核苷酸单体)或切口(两个核苷酸单体之间不存在磷酸
二酯键),只要另一条链是环状的。
[0050] 如本文使用的,术语“多联体”,当用于提及核酸分子时,意指包含串联连接的共同序列的多于一个拷贝的连续核酸分子。类似地,术语“多联体”,当用于提及核苷酸序列时,意指包含串联的共同序列的多于一个拷贝的连续核苷酸序列。序列的每个拷贝可以被称为多联体的“序列单元”。序列单元可以具有至少10个碱基、50个碱基、100个碱基、250个碱基、
500个碱基或更多碱基的长度。多联体可以包含至少2个、5个、10个、50个、100个或更多个序列单元。序列单元可以包含具有多种功能中的任一种的子区域,诸如引物结合区、靶序列
区、标签区、独特分子标识符(UMI)等。
[0051] 如本文使用的,“流通池”是包括一个或更多个通道的反应室,该一个或更多个通道以预定方式引导流体以进行期望的反应。流通池可以耦接至检测器,使得可以观察到发生在反应室中的反应。例如,流通池可以包含例如拴系至固体支持物的引发的模板核酸分
子,向其迭代地施加核苷酸和辅助试剂并且洗掉。流通池可以包括透明材料,该透明材料允许在期望的反应发生之后对样品成像。例如,流通池可以包括包含小流体通道的载玻片,聚合酶、dNTP和缓冲液可以送通过该小流体通道。通道内部的玻璃用一个或更多个待测序
的引发的模板核酸分子装饰。可以放置外部成像系统以检测玻璃的表面上的分子。流通池
中的试剂交换通过泵送、抽取或以其他方式使不同的液体试剂“流动”通过流通池来完成。
示例性流通池、它们的制造方法和它们的使用方法在以下中描述:美国专利申请公布
US2010/0111768或US2012/0270305;或WO 05/065814,其中每一篇通过引用并入本文。
[0052] 如本文使用的,术语“簇”,当用于提及核酸时,指的是附接至固体支持物的核酸群体,例如,在固体支持物上的结合区域的阵列中的结合区域处。
[0053] 如本文使用的,术语“克隆群体”指的是关于特定核酸序列是同质的核酸群体。同质序列通常至少10个核苷酸长,但可以甚至更长,包括例如至少50个、100个、500个、1000个或2500个核苷酸长。克隆群体可以源自单个模板核酸。克隆群体可以包含特定核酸序列的至少2个、10个、100个、500个或1000个拷贝。拷贝可以存在于单个核酸分子中,例如,作为多联体,或者拷贝可以存在于不同的核酸分子上(例如,不同的多联体)。通常,簇中的所有核酸将具有相同的核苷酸序列。应当理解,在不偏离明显克隆性的情况下,簇中可以出现数目可忽略不计的污染核酸或突变(例如,由于扩增伪影(amplification artifact))。簇可以
是至少80%、85%、90%、95%或99%克隆的。在一些实施方案中,簇可以是100%克隆的。
[0054] 滚环扩增
[0055] 本文提供的内容包括用于使用滚环扩增在表面上接种和扩增核酸的方法、系统和组合物。通常,RCA反应涉及聚合酶延伸退火到环状模板的引物,使得聚合酶绕环状模板多于一圈产生包含多于一个串联重复的多联体单链DNA,每个重复与环状模板互补。
[0056] 图9A‑图9B提供了进行核酸的滚环扩增的非限制性示意图。如图9A中示出的,核酸引物(通过空心矩形和划线矩形指示)(例如,图2中的寡核苷酸A或引物A)经由接头(通过灰线指示)附接至固体支持物(通过有斑点的矩形指示)上。引物可以用于经由模板核酸中与
引物互补的引物结合位点捕获模板核酸的靶核酸。例如,引物可以具有与模板核酸的第一
引物结合区(例如,通过空心矩形指示)互补的第一捕获序列(例如,通过空心矩形指示)和
与模板核酸的第二引物结合区(例如,通过划线矩形指示)互补的第二捕获序列(例如,通过划线矩形指示)。
[0057] 在图9A中示出的示例性配置中,固定的引物可以与存在于靶序列相对末端的引物结合位点的部分杂交(分别地,靶序列通过虚线指示,并且侧翼引物结合位点区域通过空心矩形和划线矩形指示)。因此,固定的引物起到将模板核酸的两个末端聚集在一起的夹板的作用。两个末端可以例如被连接酶连接,同时与夹板核酸杂交以形成模板核酸的环状形式。
在图9A中示出的另一种配置中,模板核酸在与固体支持物上的固定的引物杂交之前被环
化。因此,模板序列可以是线性核酸或环状核酸。
[0058] 图9B提供了经由与固定的引物杂交的引发的环状模板的滚环扩增产生的单链多联体的非限制性示意图。引物以3’末端可用于聚合酶延伸的方式固定(例如,引物可以在其
5’末端处或靠近其5’末端处附接)。第一子步骤的产物示出为已经进展到产生了环状模板的两个拷贝(两个序列单元),并且环状模板与正在复制的第三拷贝(第三序列单元)的一部
分杂交的程度。每个序列单元包含与靶序列互补的区域(通过黑色实线指示)和与引物互补
的区域(通过空心矩形的和划线矩形指示)。第二子步骤的产物已经进展到产生了环状模板
的近六个拷贝的程度。图9B示出了在第三子步骤中环状模板不存在(例如,已经被去除)之
后RCA反应的产物。为了说明目的,示出了最终产物的两个区域:描绘了序列单元的区域(指示扩增的链的多联体一级结构),和没有指定序列单元的数目和构象的区域(指示整个簇的
动态和可变二级结构)。
[0059] RCA反应可以通过使聚合酶变性来终止,例如通过在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃或更高温度加热样品。RCA反应也可以通过去除RCA的一种或更多种组分来终止,所述组分诸如聚合酶和/或dNTP。在一些实施方案中,RCA反应可以通过耗尽引物来终止。RCA的组分可以通过例如用洗涤试剂洗涤来去除。
[0060] 核酸在表面上的接种和扩增
[0061] 本文公开的内容包括一种核酸扩增的方法,并且特别是一种在包含多于一个结合区域的表面上接种和扩增核酸的方法。在一些实施方案中,该方法可以包括提供包含一个
或更多个引物结合区(例如,第一序列、第二序列和第三序列)的核酸模板。核酸模板可以是环状核酸或环化以形成环状核酸的线性核酸。一个或更多个引物结合区可以彼此相邻诸如
在环状模板核酸中)。一个或更多个引物结合区可以位于线性模板核酸的相对末端。在一些实施方案中,引物结合区是最初用于环化线性核酸文库成分的区域(参见例如图1)。核酸模板还包含含有作为扩增对象的靶核酸的靶区域。如本文使用的术语“提供”指的是将一种或更多种组分(例如,核酸模板)制备并递送至发生RCA反应的容器,诸如包含多于一个结合区域的流通池的表面。
[0062] 该方法还包括使核酸模板与附接至(例如,共价或非共价)多于一个结合区域的结合区域的多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B在存在聚合酶(例如,DNA聚合酶)的情
况下接触以经由滚环扩增产生核酸模板的多于一个扩增的单链多联体。从本文描述的RCA
产生的多于一个扩增的单链多联体各自包含核酸模板的多于一个拷贝或其反向互补物。
[0063] 在一些实施方案中,使核酸模板与附接至结合区域的多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B接触包括:(i)使核酸模板与多于一个寡核苷酸A接触,以经由滚环扩增产生核酸模板的单链、寡核苷酸A引发的多联体(或第一链多联体),以及(ii)使单链、寡核苷酸A引发的多联体与多于一个寡核苷酸B接触,以经由滚环扩增产生单链、寡核苷酸B引发的多
联体(或第二链多联体),寡核苷酸B引发的多联体与寡核苷酸A引发的多联体反向互补。如
本文使用的,“寡核苷酸A引发的多联体”或“第一链多联体”指的是通过沿着例如模板核酸延伸寡核苷酸A而产生的多联体。类似地,“寡核苷酸B引发的多联体”或“第二链多联体”指的是通过沿着例如第一链多联体延伸寡核苷酸B而产生的多联体。
[0064] 在一些实施方案中,使用多于一个寡核苷酸A产生第一链多联体的步骤和使用多于一个寡核苷酸B产生第二链多联体的步骤可以顺序地或同时地发生。例如,在一些情况
下,寡核苷酸B可以引发并沿着第一链多联体延伸,同时第一链多联体仍正在经由RCA反应
延伸。在一些其他情况下,寡核苷酸B可以在第一链多联体的延伸终止之后引发并沿着第一链多联体延伸。随着更多的第一链多联体产生,更多的第二链引发从表面开始。
[0065] 产生的第一链多联体和第二链多联体随后可以通过退火到表面上新鲜的固定的寡核苷酸A和寡核苷酸B(或未使用的引物)来启动另外的几轮复制,以便形成一系列固定的
多联体链,每个多联体链包含多于一个序列单元,每个序列单元与模板核酸大体上互补或
大体上相同。例如,第二链多联体可以与一个或更多个新鲜寡核苷酸A接触并杂交,从而促进新的轮次的扩增以形成另外的第一链多联体。另外的第一链多联体可以与一个或更多个
新鲜寡核苷酸B接触并杂交,从而促进新的轮次的扩增以形成另外的第二链多联体。另外轮次的引发和扩增允许在短时间段内消耗引物并且合成大量多联体链。引物消耗可以阻止另
外的模板核酸在相同的结合区域退火。在一些实施方案中,模板序列可以经由滚环扩增经
受约、至少、至少约、至多或至多约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、
20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、40、50、60、70、80、90、100轮或这些值中的任何两个之间的数字或范围的轮次的复制。
[0066] 其中描述的接种和扩增产生拴系有多于一个多联体核酸分子的结合区域,其中多联体链可以与多于一个互补的多联体链部分地杂交。多联体链和互补多联体链可以经受下
一代测序。当多联体链和互补多联体链彼此部分地杂交时,可以对它们进行测序。可选择地或另外地,多联体链和互补多联体链可以通过例如热变性,使得链不会部分地杂交来分离。
[0067] 本文描述的多轮扩增可以产生核酸簇,该核酸簇包含附接至表面的核酸群体(例如,多联体链),例如在表面的结合区域(非限制性实例参见图8)。在一些实施方案中,表面的结合区域的簇关于特定核酸序列是同质的,使得簇中约、至少或至少约80%、90%、95%或99%的扩增的核酸含有相同的靶序列。因此,本文描述的接种和扩增方法可以在每个结
合区域上产生大体上相同的扩增的分子的集合。
[0068] 在本文描述的一些实施方案中,模板核酸和/或多联体与固定的寡核苷酸接触的容器是流通池。因此,在一些实施方案中,可以通过使用流通池来促进接触步骤。使液体试剂(例如,延伸混合物)流动通过流通池可以允许试剂混合和交换。例如,使核酸模板与多于一个固定的寡核苷酸接触可以包括使包含聚合酶、dNTP混合物、模板核酸的延伸混合物流
动通过具有包含多于一个结合区域的表面的流通池。延伸混合物还可以包含进行RCA反应
所必需的辅助试剂,诸如盐、缓冲液、小分子、辅因子、金属和离子,如对于技术人员来说将是明显的。
[0069] 延伸混合物可以在任何有利于聚合酶活性的温度与固定的引物一起孵育。在一些实施方案中,本文描述的RCA反应不需要热循环,并且可以在大体上等温的反应温度进行,例如,变化不超过给定温度以上或以下约2‑3℃的温度。反应温度可以在20℃和70℃之间,例如20℃、25℃、30℃、35℃、37℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃、65℃、70℃,或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,反应温度在20℃和60℃之间。在一些实施方案中,反应温度在20℃和50℃之间。在一些实施方案中,反应温度是约30℃(例如,约37℃)。
[0070] 寡核苷酸A和寡核苷酸B引发的延伸反应可以通过结合区域上寡核苷酸A和寡核苷酸B的耗尽来终止。在一些实施方案中,延伸反应可以被终止,例如,通过引入3’封闭核苷酸,该3’封闭核苷酸可以抑制或阻止核苷酸的3’氧在核酸聚合反应期间与下一个核苷酸形成共价连接。在一些实施方案中,延伸反应不是通过使聚合酶(例如,DNA聚合酶)变性、通过去除聚合酶或通过聚合酶的任何化学失活来终止的。
[0071] 第一链多联体的产生
[0072] 在一些实施方案中,使核酸模板与多于一个寡核苷酸A接触以产生核酸模板的单链、寡核苷酸A引发的多联体的步骤(i)可以包括将核酸模板与多于一个寡核苷酸A杂交(例
如,通过寡核苷酸A的捕获序列和核酸模板的第一序列及第二序列之间的互补碱基配对)
(例如,在图3中)。然后寡核苷酸A经受延伸反应,以便经由滚环扩增在它的3’末端添加核酸模板的多于一个单体单元。结果是如在图4中所见的经由寡核苷酸A拴系至表面的原始核酸
模板的多聚体的多联体。因此,该方法包括延伸与核酸模板结合的多于一个寡核苷酸A,以产生核酸模板的寡核苷酸A引发的多联体(或第一链多联体)。
[0073] 在图3‑图4中阐述的非限制性示例性实施方案中,可以产生一个或更多个寡核苷酸A引发的多联体(或第一链多联体)。多于一个寡核苷酸A(通过虚线箭头指示)和寡核苷酸
B(通过灰色实线箭头指示)经由接头(通过黑线和灰线指示)固定在结合区域(通过蓝色椭
圆形指示)上。如图3中示出的,核酸模板经由核酸模板的引物结合序列(例如,指示为绿色和红色实线的第一序列和第二序列)和寡核苷酸A中对应的捕获序列(通过绿色和红色虚线
箭头指示)之间的互补碱基配对被寡核苷酸A捕获。结合的寡核苷酸A然后在RCA反应中通过
聚合酶,诸如具有链置换活性的聚合酶,沿着模板核酸延伸,以产生第一链多联体(在图4中示出为部分退火到模板核酸的黑色虚线)。产生的第一链多联体经由引物A保持附接至表
面。引物A可以用作捕获引物和扩增引物。可以同时捕获和扩增一个或更多个核酸模板,产生核酸模板的多于一个第一链多联体。在一些实施方案中,在多于一个结合区域的结合区
域处捕获和扩增一个或至多一个模板核酸,在结合区域处产生一个或至多一个第一链多联
体。图中示出的固定在结合区域上的寡核苷酸A和寡核苷酸B的数目以及产生的链的数目仅
用于说明,并且不意图限制。
[0074] 在一些实施方案中,模板核酸不与寡核苷酸B杂交,因为寡核苷酸B中的捕获序列与核酸模板的第三序列大体上相同,并且不与核酸模板的第一序列和第二序列反向互补。
[0075] 第一链多联体中的每个序列单元包含与靶序列互补的区域和与引物结合序列(例如,第一序列、第二序列和第三序列)互补的区域。因此,第一链多联体中的每个序列单元包含与寡核苷酸B或其一部分反向互补的区段。
[0076] 第二链多联体的产生
[0077] 在产生核酸模板的第一链多联体后,第一链多联体然后被用作用于产生核酸模板的第二链多联体的模板,由寡核苷酸B引发,寡核苷酸B可以退火到第一链多联体的引物结
合区的一部分,例如,与寡核苷酸B的序列互补的引物结合区的部分。
[0078] 类似地,使单链、寡核苷酸A引发的多联体与多于一个寡核苷酸B接触以产生单链、寡核苷酸B引发的多联体的步骤(ii)可以包括将寡核苷酸A引发的多联体(或第一链多联体)与多于一个寡核苷酸B杂交,并且延伸与寡核苷酸A引发的多联体结合的多于一个寡核
苷酸B以产生核酸模板的寡核苷酸B引发的多联体(或第二链多联体)。
[0079] 一个或更多个寡核苷酸B引发的多联体(或第二链多联体)可以在图5‑图6中阐述的非限制性示例性实施方案中,使用附接至结合区域的多于一个寡核苷酸B来产生。如图5
中示出的,寡核苷酸B(通过灰色箭头指示)可以通过与第一链多联体的一部分杂交并且经
由RCA通过聚合酶沿着第一链多联体被延伸以产生第二链多联体来引发第一链多联体(通
过黑色虚线指示)。产生的第二链多联体(在图中通过黑色实线指示)经由寡核苷酸B保持附
接至表面。多于一个第一链多联体中的每一个都可以同时被一个或更多个寡核苷酸B引发,产生固定至表面的核酸模板的多于一个第二链多联体。
[0080] 在一些实施方案中,一个或更多个第二链多联体可以由单个第一链多联体产生。例如,一个或更多个寡核苷酸B可以退火到第一链多联体(例如,第一链多联体的不同的序
列单元)以产生具有与一个或更多个延伸寡核苷酸B杂交的第一链多联体的核酸簇,从而产
生与第一链多联体的至少一部分互补的一个或更多个第二链多联体。从相同的第一链多联
体产生的一个或更多个第二链多联体可以具有多种长度(例如,多种数目的序列单元)和退
火模式。在图6A中示出的一个实例中,两个寡核苷酸B与第一链多联体的两个不同序列单元杂交,并且在RCA反应中延伸以产生两个第二链多联体(示出为至少部分地退火到第一链的
黑色实线)。图中示出的固定在结合区域上的寡核苷酸A和寡核苷酸B的数目以及产生的第
一链和第二链的数目仅用于说明,并且不意图限制。
[0081] 多重接种和扩增
[0082] 本文描述的方法可以以多重形式进行,使得可以使用本文阐述的步骤在离散的结合区域上平行接种和扩增多于一个不同的模板核酸(参见例如图8)。多于一个结合区域中
的每个结合区域可以产生多于一个多联体链,每个多联体链包含特定靶序列或其反向互补
物的多于一个拷贝(参见例如图8)。例如,包含不同靶序列的多于一个核酸模板(例如,测序文库)可以分布在表面的多于一个结合区域上,使得不同的文库成分经由滚环扩增在离散
的结合区域中被捕获和扩增。每个结合区域可以包含具有经由寡核苷酸A和寡核苷酸B拴系
至结合区域的特定靶核酸的第一链多联体和第二链多联体的集落。在一些实施方案中,本
文公开的方法可以被配置成平行接种和扩增约、至少、至少约、至多或至多约2、10、100、1×
3 4 5 6 9
10、1×10、1×10、1×10、1×10个或更多不同的核酸,从而提供成本节约、时间节约和条
件的均匀性。因此,表面上的结合区域的数目可以在这里针对不同核酸举例说明的范围内。
[0083] 例如,在一些实施方案中,将第二核酸模板提供给第二结合区域,该第二结合区域不同于捕获和扩增第一核酸模板的第一结合区域。第二核酸模板可以包含与第一核酸模板中的靶核酸具有不同的序列的靶核酸。
[0084] 因此,在一些实施方案中,该方法可以包括提供包含第一序列、第二序列和第三序列的第二核酸模板(例如,第二环状DNA模板),并且在聚合酶存在的情况下,使第二核酸模板与附接至多于一个结合区域的第二结合区域的多于一个寡核苷酸A和寡核苷酸B接触,以经由滚环扩增产生第二核酸模板的扩增的单链多联体。从本文描述的RCA产生的多于一个
扩增的单链多联体中的每一个包含第二核酸模板或其反向互补物的多于一个拷贝。
[0085] 在一些实施方案中,使第二核酸模板与附接至第二结合区域的多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B接触包括:(i)使第二核酸模板与多于一个寡核苷酸A接触,以经由
滚环扩增产生第二核酸模板的单链、寡核苷酸A引发的多联体(或第一链多联体),以及(ii)使单链、寡核苷酸A引发的多联体与多于一个寡核苷酸B接触,以经由滚环扩增产生第二核
酸模板的单链、寡核苷酸B引发的多联体(或第二链多联体),寡核苷酸B引发的多联体与寡
核苷酸A引发的多联体反向互补。
[0086] 与第一结合区域上第一核酸模板的扩增相似,使用多于一个寡核苷酸A产生第二核酸模板的第一链多联体的步骤和使用多于一个寡核苷酸B产生第二核酸模板的第二链多
联体的步骤可以顺序地或同时地发生。例如,在一些情况下,寡核苷酸B可以引发第二核酸模板的第一链多联体,同时第一链多联体仍正在经由RCA反应延伸。在一些其他情况下,寡核苷酸B可以在第一链多联体的延伸终止之后引发第一链多联体。
[0087] 在一些实施方案中,第一结合区域可以包含第一核酸模板的克隆群体,并且第二结合区域可以包含第二核酸模板的克隆群体。例如,在一些实施方案中,第一结合区域不包含第二核酸模板,并且第二结合区域不包含第一核酸模板。
[0088] 在一些实施方案中,可以将多于一个核酸模板提供给包含多于一个结合区域的表面。因此,在一些实施方案中,该方法可以包括:(a)提供多于一个核酸模板(例如,环状DNA模板),每个核酸模板包含第一序列、第二序列和第三序列;(b)提供包含多于一个结合区域的表面,其中多于一个结合区域中的每一个附接有多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷
酸B接,其中寡核苷酸A包含与第一序列互补的第一捕获序列和与第二序列互补的第二捕获
序列,并且其中寡核苷酸B包含第三序列;以及(c)将多于一个环状DNA模板中的每一个分别与附接至多于一个结合区域的结合区域的多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B在存
在DNA聚合酶的情况下杂交以经由滚环扩增(RCA)产生DNA模板的扩增的多联体和DNA模板
的互补多联体。扩增的多联体可以在扩增不同模板核酸的每个结合区域独立地产生。
[0089] 多重接种和扩增可以产生各自包含附接至结合区域的核酸簇的多于一个结合区域。在结合区域处或结合区域上产生的核酸簇可以包含不多于一种核酸模板。例如,各自包含不多于一种核酸模板的多于一个结合区域的百分比可以是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下、或者至多约以下:30%、31%、32%、33%、34%、35%、36%、37%、38%、
39%、40%、41%、42%、43%、44%、45%、46%、47%、48%、49%、50%、51%、52%、53%、
54%、55%、56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、
69%、70%、71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、
84%、85%、86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、
99%、99.9%或这些值中的任何两个之间的数字或范围。例如,至少90%的结合区域包含不多于一种核酸模板。
[0090] 不多于一种靶核酸的克隆群体可以在结合区域上或结合区域处产生。在不同的实施方案中,包含克隆群体的多于一个结合区域的百分比可以不同。在一些实施方案中,各自包含克隆群体的多于一个结合区域的百分比可以是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下、或者至多约以下:50%、51%、52%、53%、54%、55%、56%、57%、58%、59%、
60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、71%、72%、73%、74%、
75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、86%、87%、88%、89%、
90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或这些值中的任何两个之间的数字或范围。例如,至少90%的结合区域包含不多于一种靶序列的克隆群体。
[0091] 结合区域上扩增的分子的集合在结合区域之间是不同的,使得给定结合区域上的扩增的分子的集合不同于多于一个结合区域中任何其他结合区域上的扩增的分子的集合。
例如,多于一个结合区域中的第一结合区域可以包含各自包含第一核酸模板或其反向互补
物的多于一个拷贝的多联体的集合。多于一个结合区域中的第二结合区域可以包含各自包
含第二核酸模板或其反向互补物的多于一个拷贝的多联体的集合。第一核酸模板不同于第
二核酸模板。
[0092] 具有不同模板核酸的多于一个结合区域的结合区域的数目可以是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下、或者至多约以下:50%、51%、52%、53%、54%、55%、
56%、57%、58%、59%、60%、61%、62%、63%、64%、65%、66%、67%、68%、69%、70%、
71%、72%、73%、74%、75%、76%、77%、78%、79%、80%、81%、82%、83%、84%、85%、
86%、87%、88%、89%、90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%、99.9%或这些值中的任何两个之间的数字或范围。例如,至少90%的结合区域包含彼此不同的模
板核酸。
[0093] 不同核酸模板在多于一个结合区域的离散的结合区域上的接种和扩增可以同时发生。例如,包含多于一个文库成分的DNA文库可以分布在包含多于一个结合区域的表面
上,以允许在不同的结合区域上同时捕获文库成分,并且在表面的特定的结合区域处扩增
文库成分。在一些实施方案中,初始捕获和扩增可以以比二次捕获更快的速率发生(例如,快2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、60倍、70倍、80倍、90倍、100倍或这些值中的任何值之间的数字或范围),使得特定的结合区域被不多于一种文
库成分接种。因此,接种在特定的结合区域处的核酸群体通常是单个原始文库成分的同质
扩增,以便促进文库成分的测序。
[0094] 多联体链
[0095] 第一链多联体,也被称为寡核苷酸A引发的多联体,包含各自与模板核酸互补的多于一个序列单元。第一链多联体可以通过沿着例如核酸模板延伸寡核苷酸A来产生。第二链多联体,也被称为寡核苷酸B引发的多联体,包含与模板核酸大体上相同的多于一个序列单元。第二链多联体可以通过沿着第一链多联体延伸寡核苷酸B来产生。第二链多联体与第一链多联体是反向互补的。在一些实施方案中,第二链多联体也可以退火到寡核苷酸A,产生与第二链多联体反向互补并且因此与第一链多联体大体上相同的多联体链。因此,第一链
多联体也可以通过沿着第二链多联体延伸寡核苷酸A来产生。结合区域中的第一链多联体
的数目可以与同一结合区域中的第二链多联体的数目相同或不同。在一些实施方案中,结
合区域中的第一链多联体的数目超过同一结合区域中的第二链多联体的数目。在一些实施
方案中,结合区域中的第二链多联体的数目超过同一结合区域中的第一链多联体的数目。
[0096] 簇中的多联体链可以包含串联连接的序列单元的多于一个拷贝。例如,多联体链可以包含约、至少、至少约、至多、至多约2、10、25、100个或更多个序列单元。通过RCA产生的多联体中序列单元的数目随聚合酶在复制期间绕环状模板完成一圈的次数而变化。多联体
中每个序列单元的内容与被复制的环状模板的内容大体上相同或反向互补。在一些实施方
案中,多联体具有不完整的序列单元。在同一结合区域产生的核酸簇中的多联体不需要具
有相同的长度(例如,不需要具有相同数目的序列单元)。例如,第一链多联体中的两个多联体和/或第二链多联体中的两个多联体可以是相同长度或不同长度。
[0097] 结合区域上的多联体链的数目可以取决于或类似于附接至结合区域的寡核苷酸A和寡核苷酸B的数目。包含至少一对寡核苷酸A和寡核苷酸B的多于一个结合区域的结合区
域可以包含至少两条多联体链(例如,第一链和第二链),每条多联体链经由寡核苷酸A或寡核苷酸B拴系至结合区域。例如,在一些实施方案中,结合区域可以包含至少一个第一链多联体和至少一个第二链多联体。在一些特定的配置中(例如,附接有单个寡核苷酸A和单个
寡核苷酸B的结合区域),结合区域可以包含单个第一链多联体和单个第二链多联体。
[0098] 在一些实施方案中,结合区域上的多联体链的数目可以是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下或至多约以下:2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、
90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、
8000、9,000、10,000、20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、
100,000、200,000、300,000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,
000,000或这些值中的任何两个之间的数字或范围。
[0099] 在一些实施方案中,特定的结合区域中的多联体链包含相同的靶序列或其反向互补物,从而形成可以经受下一代测序的集落。
[0100] 寡核苷酸引物
[0101] 在公开的方法、系统和组合物中使用的引物是具有与模板核酸的部分互补的序列的寡核苷酸。表面上多于一个结合区域的每个结合区域附接有多于一个第一寡核苷酸(例
如,寡核苷酸A或引物A)和多于一个第二寡核苷酸(例如,寡核苷酸B或引物B)。当相互比较时,结合区域的群体中的结合区域可以具有共同的引物(寡核苷酸A和寡核苷酸B)。例如,结合区域的群体可以附接有通用引物,使得相同的引物序列存在于群体中的多于一个结合区
域上。
[0102] 寡核苷酸A可以包含至少一个捕获序列。例如,寡核苷酸A可以包含与核酸模板的第一序列和第二序列大体上互补的捕获序列。在一些实施方案中,寡核苷酸A可以包含两个捕获序列:第一捕获序列与核酸模板的第一引物结合序列(例如第一序列)大体上互补,并
且第二捕获序列与核酸模板的第二引物结合序列(例如第二序列)大体上互补。第一捕获序
列和第二捕获序列可以彼此相邻,中间没有间隔序列。在一些实施方案中,第一捕获序列和第二捕获序列可以具有一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸或更多个核苷酸的间隔序列。
在寡核苷酸A上,第一捕获序列可以在第二捕获序列的5’。在一些实施方案中,在寡核苷酸A上,第二捕获序列可以在第一捕获序列的5’。例如,对于图2中示出的引物A,序列101’可以与序列102’相邻,中间没有间隔序列,或者序列101’的3’末端可以距离序列102’的5’末端一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸或更多个核苷酸。序列101’与图1的第一序列101互补并且序列102’与图1的第二序列102互补。
[0103] 寡核苷酸B可以包含与核酸模板的第三序列大体上相同的序列。术语“大体上相同”指示相对于另一个序列的序列同一性为约、至少或至少约70%、75%、80%、85%、90%、
95%或者这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,寡核苷酸B可以包含与核酸模板的第三序列具有100%的序列同一性的序列。如本文使用的,在两个核酸序列的上下文中的“序列同一性”或“同一性”指的是当使用任何合适的序列比对算法在特定的比较窗口内比对以获得最大对应性时,这两个序列中的相同的核苷酸碱基。
[0104] 在一些实施方案中,模板核酸是具有两个衔接子区域(例如,5’衔接子和3’衔接子)的文库成分(线性或环状),并且寡核苷酸A和寡核苷酸B的序列可以根据线性文库成分
的5’衔接子和3’衔接子或其一部分的序列来设计,使得寡核苷酸A与5’衔接子和3’衔接子或其一部分互补,并且寡核苷酸B与5’衔接子的一部分或3’衔接子的一部分大体上相同(参见例如图1)。
[0105] 由于序列互补性,寡核苷酸A可以结合至核酸模板的一部分(例如,核酸模板的第一序列和第二序列),以在存在聚合酶的情况下通过延伸与核酸模板结合的寡核苷酸A产生
第一链多联体。寡核苷酸B然后可以结合至产生的第一链多联体的一部分,通过引物延伸产生与第一链多联体反向互补的第二链多联体。因此,寡核苷酸A和寡核苷酸B可以作为捕获
引物和扩增引物而起作用。在一些实施方案中,寡核苷酸A和寡核苷酸B彼此不是反向互补
的,使得即使当它们彼此接触时,它们也不在表面上形成二聚体。
[0106] 在本文描述的实施方案中,多于一个结合区域的结合区域附接有至少一个寡核苷酸A和至少一个寡核苷酸B。例如,结合区域可以附接有单个寡核苷酸A和单个寡核苷酸B。在一些实施方案中,结合区域可以附接有多于一个寡核苷酸A和寡核苷酸B。例如,结合区域可以附接有2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、
700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9,000、10,000、20,000、30,
000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,000、400,
000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000个或这些值中的任何两个之间的数字或范围的寡核苷酸A和/或寡核苷酸B。
[0107] 在不同的实施方案中,结合区域上寡核苷酸A的密度和寡核苷酸B的密度可以不同或相同。在一些实施方案中,结合区域(例如,垫)上的寡核苷酸A的密度和寡核苷酸B的密度中的每一个可以独立地是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下或至多约以下:1
10 10 10 10 10 10 10 10 10 11
×10 、2×10 、3×10 、4×10 、5×10 、6×10 、7×10 、8×10 、9×10 、1×10 、2×
11 11 11 11 11 11 11 11 12 12
10 、3×10 、4×10 、5×10 、6×10 、7×10 、8×10 、9×10 、1×10 、2×10 、3×
12 12 12 12 12 12 12 13 13 13
10 、4×10 、5×10 、6×10 、7×10 、8×10 、9×10 、1×10 、2×10 、3×10 、4×
13 13 13 13 13 13 14 14 14 14
10 、5×10 、6×10 、7×10 、8×10 、9×10 、1×10 、2×10 、3×10 、4×10 、5×
14 14 14 14 14 15 15 15 15 15
10 、6×10 、7×10 、8×10 、9×10 、1×10 、2×10 、3×10 、4×10 、5×10 、6×
15 15 15 15 16 16 16 16 16 16
10 、7×10 、8×10 、9×10 、1×10 、2×10 、3×10 、4×10 、5×10 、6×10 、7×
16 16 16 2
10 、8×10 、9×10 个引物/m,或这些值中的任何两个之间的数字或范围。
[0108] 本文考虑了结合区域上两个相邻引物之间的多种间隔距离(separation distance)或平均间隔距离。结合区域上的两个相邻引物之间的间隔距离或平均间隔距离
可以是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下或至多约以下:10nm、11nm、12nm、
13nm、14nm、15nm、16nm、17nm、18nm、19nm、20nm、21nm、22nm、23nm、24nm、25nm、26nm、27nm、
28nm、29nm、30nm、31nm、32nm、33nm、34nm、35nm、36nm、37nm、38nm、39nm、40nm、41nm、42nm、
43nm、44nm、45nm、46nm、47nm、48nm、49nm、50nm、51nm、52nm、53nm、54nm、55nm、56nm、57nm、
58nm、59nm、60nm、61nm、62nm、63nm、64nm、65nm、66nm、67nm、68nm、69nm、70nm、71nm、72nm、
73nm、74nm、75nm、76nm、77nm、78nm、79nm、80nm、81nm、82nm、83nm、84nm、85nm、86nm、87nm、
88nm、89nm、90nm、91nm、92nm、93nm、94nm、95nm、96nm、97nm、98nm、99nm、100nm、110nm、
120nm、130nm、140nm、150nm、160nm、170nm、180nm、190nm、200nm、210nm、220nm、230nm、
240nm、250nm、260nm、270nm、280nm、290nm、300nm、310nm、320nm、330nm、340nm、350nm、
360nm、370nm、380nm、390nm、400nm、410nm、420nm、430nm、440nm、450nm、460nm、470nm、
480nm、490nm、500nm、510nm、520nm、530nm、540nm、550nm、560nm、570nm、580nm、590nm、
600nm、610nm、620nm、630nm、640nm、650nm、660nm、670nm、680nm、690nm、700nm、710nm、
720nm、730nm、740nm、750nm、760nm、770nm、780nm、790nm、800nm、810nm、820nm、830nm、
840nm、850nm、860nm、870nm、880nm、890nm、900nm、910nm、920nm、930nm、940nm、950nm、
960nm、970nm、980nm、990nm、1000nm或这些值中的任何两个之间的数字或范围。
[0109] 附接至结合区域的寡核苷酸A的数目可以且不需要与附接至(例如,固定至)同一结合区域的寡核苷酸B的数目相同。本文考虑了寡核苷酸A的数目和寡核苷酸B的数目的各
种比例。寡核苷酸A的数目和寡核苷酸B的数目的比例可以是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下或至多约以下:1:100、1:99、1:98、1:97、1:96、1:95、1:94、1:93、1:92、1:
91、1:90、1:89、1:88、1:87、1:86、1:85、1:84、1:83、1:82、1:81、1:80、1:79、1:78、1:77、1:
76、1:75、1:74、1:73、1:72、1:71、1:70、1:69、1:68、1:67、1:66、1:65、1:64、1:63、1:62、1:
61、1:60、1:59、1:58、1:57、1:56、1:55、1:54、1:53、1:52、1:51、1:50、1:49、1:48、1:47、1:
46、1:45、1:44、1:43、1:42、1:41、1:40、1:39、1:38、1:37、1:36、1:35、1:34、1:33、1:32、1:
31、1:30、1:29、1:28、1:27、1:26、1:25、1:24、1:23、1:22、1:21、1:20、1:19、1:18、1:17、1:
16、1:15、1:14、1:13、1:12、1:11、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、
4:1、5:1、6:1、7:1、8:1、9:1、10:1、11:1、12:1、13:1、14:1、15:1、16:1、17:1、18:1、19:1、20:
1、21:1、22:1、23:1、24:1、25:1、26:1、27:1、28:1、29:1、30:1、31:1、32:1、33:1、34:1、35:1、
36:1、37:1、38:1、39:1、40:1、41:1、42:1、43:1、44:1、45:1、46:1、47:1、48:1、49:1、50:1、
51:1、52:1、53:1、54:1、55:1、56:1、57:1、58:1、59:1、60:1、61:1、62:1、63:1、64:1、65:1、
66:1、67:1、68:1、69:1、70:1、71:1、72:1、73:1、74:1、75:1、76:1、77:1、78:1、79:1、80:1、
81:1、82:1、83:1、84:1、85:1、86:1、87:1、88:1、89:1、90:1、91:1、92:1、93:1、94:1、95:1、
96:1、97:1、98:1、99:1、100:1或这些值中的任何两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,寡核苷酸A和寡核苷酸B以多于一个引物集合提供,每个引物集合包含寡核苷酸A和寡核苷酸B。
[0110] 本文使用的寡核苷酸A和寡核苷酸B可以具有相同的长度或不同的长度。寡核苷酸引物(或一种类型或群体中的两个或更多个引物,或一种类型或群体中的每个引物)的长度
可以是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下、至多约以下:10、11、12、13、14、15、
16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、
41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、
66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、
91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、110、120、130、140、150、160、170、180、190、200、300、
400、500、600、700、800、900、1000个核苷酸。
[0111] 本文使用的寡核苷酸A和寡核苷酸B可以具有一个或更多个修饰的核苷酸(核苷酸类似物)。核苷酸类似物是包含如技术人员将理解的对碱基、糖和/或部分的一些类型的修
饰的核苷酸。在一些实施方案中,引入引物的修饰可以改变引物的某些化学性质,诸如增加引物杂交的稳定性和/或增加结合特异性。
[0112] 多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B可以经由共价键或非共价键附接至多于一个结合区域的结合区域。例如,结合区域可以共价或非共价地附接在寡核苷酸A或寡核苷酸B的5’末端处或靠近5’末端处(例如,距离5’末端一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸或更多个核苷酸),使得寡核苷酸A和寡核苷酸B的3’末端可用于聚合酶延伸。核酸(例如,寡核苷酸A或寡核苷酸B)与结合区域的附接可以通过多种表面化学中的任何一种来介导,诸
如结合区域上的羧酸酯部分或琥珀酰亚胺酯部分与胺修饰的核酸的反应,结合区域上的烷
基化试剂(例如碘乙酰胺或来酰亚胺)与硫醇修饰的核酸的反应,环氧烷或异硫氰酸酯
修饰的结合区域与胺修饰的核酸的反应,基苯基或氨基丙基修饰的结合区域与琥珀酰化
核酸的反应,或环氧化物修饰的结合区域与酰肼修饰的核酸的反应,或硫醇修饰的结合
区域与硫醇修饰的核酸的反应。前述反应性对的成员可以关于存在于结合区域上或核酸上
而转换。点击化学可用于将核酸附接至表面区域。用于点击化学的示例性试剂和方法在美
国专利第6,737,236号;第7,375,234号;第7,427,678号和第7,763,736号中阐述,其中每一篇都通过引用并入本文。
[0113] 模板核酸
[0114] 待接种和扩增的模板核酸可以包含引物结合序列(例如,第一序列、第二序列、第三序列)以及包含靶序列的靶区域。模板核酸可以是双链的或单链的。
[0115] 在一些实施方案中,模板核酸是环状核酸(例如环状DNA模板),其包含第一引物结合区(例如,由第一序列和第二序列形成)和第二引物结合区(例如,由第三序列形成)。第一序列和第二序列可以彼此相邻,中间没有间隔序列,或者一个序列的3’末端可以距离另一个序列的5’末端一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸或更多个核苷酸。第一引物结合区和第二引物结合区以及靶区域可以处于能够在模板核酸的第一引物结合区和第二引物结合
区与寡核苷酸A和寡核苷酸B之间互补结合的任何配置。
[0116] 例如,核酸模板或其一部分的第一引物结合区和第二引物结合区中的至少一个可以与寡核苷酸A中的捕获序列大体上互补,而核酸模板或其一部分的另一个引物结合区可
以与寡核苷酸B中的序列大体上相同。
[0117] 在一些实施方案中,模板核酸可以是具有靶序列的线性核酸,在靶序列的相对末端(例如靶序列的3’末端和5’末端)侧翼有两个引物结合区(例如,图1中示出的衔接子A和衔接子B)。引物结合区中的每一个包含第一序列、第二序列和第三序列中的至少一个。例
如,第一序列、第二序列和第三序列中的一个可以位于靶序列的一个末端,而另外两个序列位于靶序列的另一个末端。第一序列可以位于靶核酸的3’末端的引物结合区,而第二序列和第三序列位于靶核酸的5’末端的引物结合区。第三序列可以位于第二序列的3’处。类似地,第二序列可以位于靶核酸的3’末端的引物结合区,而第一序列和第三序列位于靶核酸的5’末端的引物结合区。第三序列可以位于第一序列的3’处。在一些实施方案中,第一序列和第三序列位于靶核酸的3’末端的引物结合区,而第二序列位于靶核酸的5’末端的引物结合区。第三序列可以位于第一序列的5’末端处。类似地,第二序列和第三序列位于靶核酸的
3’末端的引物结合区,而第一序列位于靶核酸的5’末端的引物结合区。第三序列可以位于第二序列的5’末端处。
[0118] 然后可以将线性核酸模板环化以形成环状核酸模板(例如,图1)。可以使用多种方法从线性核酸模板制备环状模板核酸用于RCA。在一些实施方案中,线性核酸模板的环化可以通过酶促反应产生,例如通过与连接酶(例如,DNA连接酶)一起孵育。线性核酸模板的末端可以与核酸序列(例如寡核苷酸A)杂交,使得末端接近(参见例如,图1)。然后与连接酶一起孵育可以导致杂交的线性核酸模板的环化,以产生环状核酸模板。线性核酸模板的环化
将第一序列、第二序列和第三序列汇聚在一起,使得在一些实施方案中,第一序列101、第二序列102和第三序列103在环化之后彼此相邻,如图1中示出的。第一序列、第二序列和第三序列可以彼此相邻,中间没有间隔序列,或者一个序列的3’末端可以距离另一个序列的5’末端一个核苷酸、两个核苷酸、三个核苷酸或更多个核苷酸。
[0119] 在一些实施方案中,线性核酸模板分子可以是线性文库成分,其具有位于靶区域侧翼的不同的5’衔接子区域和3’衔接子区域(例如,在图1中)。衔接子区域可以具有多种功能中的任何一种,包括例如提供与捕获引物(例如附接至结合区域的寡核苷酸A)互补的结
合位点,提供用于复制环状模板的引物结合位点,提供用于复制环状模板的互补物的引物
结合位点,提供与靶区域相关的标签(例如,指示靶区域来源的标签诸如条形码,或用于识别在靶区域扩增期间引入的错误的标签等)。衔接子区域或其部分可以是环状模板群体或
多联体群体所共有的。无论衔接子区域是否具有共同序列,环状模板群体中的靶区域或多
联体群体中的靶区域可以具有不同的序列(例如,不同的靶序列)。因此,当对两个或更多个多联体之间或两个或更多个环状模板之间的序列单元进行比较时,序列单元可以具有共同
的序列区域(例如,通用引物结合位点)和/或序列单元可以具有不同序列的区域(例如,不
同的靶序列)。
[0120] 线性文库成分可以退火到表面结合的寡核苷酸A,该寡核苷酸A具有与线性文库成分或其一部分的5’衔接子和3’衔接子互补的区域,并且该线性文库成分被定向以使5’末端和3’末端的定位接近。将线性文库成分的5’末端和3’末端连接,以便形成环状文库成分。在一些实施方案中,核酸模板可以是环状文库成分(例如DNA文库环)。
[0121] 本文描述的方法可以容纳任何长度的文库成分。例如,本文使用的文库成分可以具有小于50、45、40、35、30、25、20或小于20个碱基,或者可选择地至少300、400、500、600、
700、800、900、1000、2000、3000或大于3000个碱基的长度。
[0122] 在本文阐述的方法、组合物和系统中使用的模板核酸可以是DNA诸如基因组DNA、合成DNA、扩增的DNA、互补DNA(cDNA)等。本文使用的模板核酸也可以是RNA诸如mRNA、核糖体RNA、tRNA等。本文使用的模板核酸也可以包括核酸类似物,该核酸类似物包含对核苷酸类似物的磷酸部分、糖部分和/或含氮碱基的修饰。
[0123] 可以选择模板核酸中靶区域的长度,以适合本文描述的方法的特定应用。例如,长4 5
度可以是约、至少、至少约、至多或至多约50、100、250、500、1000、1×10 、1×10个或更多个核苷酸。
[0124] 本文使用的靶核酸可以源自生物来源、合成来源或扩增产物。可以从其衍生核酸的示例性生物体包括例如,哺乳动物诸如啮齿类动物、小鼠、大鼠、兔、豚鼠、类动物、马、绵羊、猪、山羊、、猫、狗、灵长类动物、人类或非人类灵长类动物;植物诸如拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米、高粱、燕麦、小麦、稻、油菜或大豆;藻类诸如莱茵衣藻(Chlamydomonas reinhardtii);线虫诸如秀丽隐杆线虫(Caenorhabditis elegans);昆虫诸如黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)、蚊子、果蝇、蜜蜂或蜘蛛;鱼诸如斑马鱼;爬行动物;两栖动物诸如蛙类动物或非洲爪蟾(Xenopus laevis);盘基网柄菌(dictyostelium discoideum);真菌诸如卡氏孢子虫(pneumocystis carinii)、红鳍东方鲀(Takifugu 
rubripes)、酵母酿酒酵母(Saccharamoyces  cerevisiae)或粟酒裂殖酵母
(Schizosaccharomyces pombe);或恶性疟原虫(plasmodium falciparum)。核酸还可以源
自原核生物诸如细菌、大肠杆菌(Escherichia coli)、葡萄球菌(staphylococci)或肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae);古菌;病毒诸如丙型肝炎病毒、流感病毒、冠状病毒或人类免疫缺陷病毒;或类病毒。核酸可以源自以上生物体的同质培养物或群体,或源自例如一个群落或生态系统中若干种不同生物体的集合。可以使用本领域已知的方法分离核酸,包括
例如Sambrook等人,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第3版,Cold Spring 
Harbor Laboratory,New York(2001)或Ausubel等人,Current Protocols in Molecular 
Biology,John Wiley and Sons,Baltimore,Md.(1998)中描述的那些,这些文献中的每一
篇通过引用并入本文。
[0125] 表面和结合区域
[0126] 在本文描述的方法、组合物和系统中,提供了表面,诸如流通池表面,该表面包含一个或多于一个结合区域。根据本文公开的方法,结合区域可以用于,例如,接种和扩增核酸模板。可以使用多种合适的方法中的任何一种来产生流通池表面。例如,流通池表面可以使用2021年1月13日提交的题为“Surface Structuring With Colloidal Assembly”的美国临时申请第63/137,064号中描述的自上而下的颗粒平板印刷或自下而上的颗粒自组装
来产生,该美国临时申请的内容通过引用以其整体并入本文。
[0127] 本文使用的表面可以使用颗粒的胶体自组装(自下而上)来产生。例如,本文使用的表面可以通过提供包含在液体中的结构,将多于一个颗粒(例如珠)递送至液体的表面来
制备。液体的表面可以是与另一介质诸如空气接触的液体的顶部表面。多于一个颗粒中的
一定的百分比(例如,多于一个颗粒中的5%、10%、20%、25%、30%、35%、40%、45%、
50%、55%、60%、65%、70%、75%、80%、85%、90%、95%或这些值中的任何两个之间的数字或范围,或更多)可以自组装成紧密堆积的、有序的颗粒。该方法可以包括去除颗粒和平面结构之间的液体,使得多于一个颗粒与平面结构接触。在液体的表面上和/或与平面结构接触的多于一个颗粒可以在平面结构上指定多于一个结合区域。
[0128] 本文使用的表面也可以通过例如提供在其上沉积有活性位点层(或物质层或结合位点层)和掩蔽层的平面结构来制备。该方法可以包括将多于一个颗粒(例如珠)沉积到平
面结构的掩蔽层上。该方法可以包括将平面结构暴露于蚀刻剂的行为,以便从未被多于一
个珠屏蔽的区域差异性地去除掩蔽层。该方法可以包括从未被多于一个珠屏蔽蚀刻剂的区
域去除掩蔽层和活性位点层。该方法可以包括从由多于一个珠屏蔽的区域去除剩余的掩蔽
层,在结合区域保留活性位点层。由此,该方法指定包括剩余活性位点层的多于一个结合区域。
[0129] 流通池表面上的结合区域的数目可以是以下、约以下、至少以下、至少约以下、至多以下或至多约以下:1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000、2000、3000、4000、5000、6000、7000、8000、9,000、10,000、
20,000、30,000、40,000、50,000、60,000、70,000、80,000、90,000、100,000、200,000、300,
000、400,000、500,000、600,000、700,000、800,000、900,000、1,000,000或这些值中的任何
4 8
两个之间的数字或范围。在一些实施方案中,表面包含约10个结合区域至约10 个结合区
域。在一些实施方案中,表面包含至少10,000个结合区域的多于一个结合区域。多于一个结合区域中的每一个可以对应于多种不同的形式和形状,诸如环状、圆形、椭圆形、矩形或正方形。多于一个结合区域中的每一个可以具有中心点和直径。流通池表面上的结合区域可
以是有序的、堆积良好的和/或可以具有高密度。流通池表面上的结合区域的定位(或位置)可以是随机的和非预定的。在一些情况下,流通池表面包含由间断部(例如,5、10、15、20、
25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95、100个或这些值中的任何两个之间的数字或范围,或更多个间断部)分隔的至少10,000个有序的、堆积良好的和/或高密度的结
合区域的多于一个结合区域。有序的结合区域和/或间断部的配置可以是非预定的和/或可
以随机分布。
[0130] 结合区域可以考虑任何两个相邻结合区域之间的不同间隔或间距。在一些实施方案中,从第一结合区域的中心到最近相邻结合区域的中心测量的任何结合区域和任何最近
相邻结合区域之间的间距可以是第一结合区域的直径的至少两倍。例如,任何结合区域和
任何最近相邻结合区域之间的间距可以是约1nm至约100μm。从第一结合区域的边缘到最近相邻结合区域的中心测量的任何结合区域和任何最近相邻结合区域之间的间隔是第一结
合区域的直径的至少两倍。两个边缘比第一结合区域的任何其他边缘和第二结合区域的任
何边缘之间的距离更近(或至少一样近)。多于一个结合区域的尺寸(例如半径、直径、宽度或高度)可以是约1nm至约100μm。
[0131] 多于一个结合区域或一定百分比的结合区域可以共享共同的样式(例如形状或尺寸)或不同的样式。在一些实施方案中,多于一个结合区域包含未样式化的结合区域。多于一个结合区域或一定百分比的结合区域可以随机定位在流通池表面上,或者可以被布置
(arrayed)在流通池上的预定位置组中。在一些实施方案中,多于一个结合区域被布置以形成具有规则定位(或有序)的结合区域的第一区域和具有随机(或不规则)定位的结合区域
的第二区域。
[0132] 表面上的结合区域可以被功能化以促进引物的附接。例如,结合区域可以包含羧酸酯部分或琥珀酰亚胺酯部分以附接胺修饰的引物,包含烷基化试剂(例如碘乙酰胺或马
来酰亚胺)以附接硫醇修饰的引物,包含环氧硅烷或异硫氰酸酯以附接胺修饰的引物,包含氨基苯基或氨基丙基部分以附接琥珀酰化引物,包含醛或环氧化物部分以附接酰肼修饰的
引物,或包含硫醇基团以附接硫醇修饰的引物。前述反应性对的成员可以关于存在于结合
区域上或引物上而转换。点击化学可用于将核酸附接至表面区域。用于点击化学的示例性
试剂和方法在美国专利第6,737,236号;第7,375,234号;第7,427,678号和第7,763,736号
中阐述,其中每一篇都通过引用并入本文。用于功能化流通池表面的结合区域的方法还描
述于2021年1月13日提交的题为“Surface Structuring With Colloidal Assembly”的美
国临时申请第63/137,064号中,该美国临时申请的内容通过引用并入本文。
[0133] 聚合酶
[0134] 多种聚合酶中的任何一种都可以用于本文阐述的方法或组合物中,例如,以形成聚合酶‑核酸复合物或进行引物延伸。可以使用的聚合酶包括天然存在的聚合酶及其修饰
的变体,包括但不限于突变体、重组体、融合体、遗传修饰、化学修饰、合成物和类似物。天然存在的聚合酶及其修饰的变体不限于具有催化聚合反应能的聚合酶。天然存在的和/或
其修饰的变体可以例如具有在至少一种在稳定化的三元复合物的形成或检查期间不使用
的条件下催化聚合反应的能力。参与聚合酶‑核酸复合物的天然存在的和/或修饰的变体可以例如具有修饰的性质,例如,增强的与核酸的结合亲和力、降低的与核酸的结合亲和力、增强的与核苷酸的结合亲和力、降低的与核苷酸的结合亲和力、增强的对下一个正确的核
苷酸的特异性、降低的对下一个正确的核苷酸的特异性、降低的催化速率、无催化活性等。
突变体聚合酶包括例如其中一个或更多个氨基酸被其他氨基酸替换或者一个或更多个氨
基酸的插入或缺失的聚合酶。可以用于形成稳定化的三元复合物的示例性聚合酶突变体包
括,例如,在以下中阐述的那些:美国专利申请公布第2020/0087637号和美国专利第10,
584,379号和第10,597,643号,它们的每一个通过引用并入本文。在一些实施方案中,本文使用的聚合酶单独地具有链置换活性或与链置换因子诸如解旋酶组合具有链置换活性。
[0135] 本文使用的聚合酶可以附接外源性标记部分(例如外源性荧光团),该外源性标记部分可以用于检测聚合酶。例如,标记部分可以在使用蛋白质分离技术至少部分地纯化聚
合酶之后附接。例如,可以使用聚合酶的游离巯基或游离胺部分将外源性标记部分共价连
接至聚合酶。这可以涉及通过半胱氨酸残基的侧链或通过N‑末端的游离氨基部分与聚合酶的共价连接。外源性标记部分也可以经由蛋白质融合附接至聚合酶。可以经由蛋白质融合
附接的示例性标记部分包括例如绿色荧光蛋白(GFP)、藻胆蛋白(例如,藻蓝蛋白和藻红蛋
白)或者GFP或藻胆蛋白的波长移位变体。在一些实施方案中,本文使用的聚合酶不需要附
接至外源性标记。
[0136] 聚合酶的不同活性可以在本文阐述的方法中利用。聚合酶可用于例如RCA扩增(例如在引物延伸步骤中)或核酸测序。聚合酶可以从多种已知来源获得,并且根据本文阐述的教导和聚合酶的公认活性应用。聚合酶可以是DNA聚合酶、RNA聚合酶或其他类型的聚合酶
诸如逆转录酶。
[0137] 示例性DNA聚合酶包括但不限于细菌DNA聚合酶、真核生物DNA聚合酶、古菌DNA聚合酶、病毒DNA聚合酶和噬菌体DNA聚合酶。细菌DNA聚合酶包括大肠杆菌(E.coli)DNA聚合
酶I、II和III、IV和V,大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段,粪堆梭菌(Clostridium 
stercorarium)(Cst)DNA聚合酶,热纤梭菌(Clostridium thermocellum)(Cth)DNA聚合酶
和硫磺矿硫化叶菌(Sulfolobus solfataricus)(Sso)DNA聚合酶。真核生物DNA聚合酶包括
DNA聚合酶α、β、γ、δ、€、η、ζ、λ、σ、μ和k,以及Revl聚合酶(末端脱氧胞苷转移酶)和末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)。病毒DNA聚合酶包括T4 DNA聚合酶、phi‑29DNA聚合酶、GA‑l、phi‑29样DNA聚合酶、PZA DNA聚合酶、phi‑15DNA聚合酶、Cpl DNA聚合酶、Cp7 DNA聚合酶、T7 DNA聚合酶和T4聚合酶。其他有用的DNA聚合酶包括热稳定DNA聚合酶和/或嗜热DNA聚合酶,诸
生栖热菌(Thermus aquaticus)(Taq)DNA聚合酶、丝状栖热菌(Thermus filiformis)
(Tfi)DNA聚合酶、兹氏热球菌(Thermococcus zilligi)(Tzi)DNA聚合酶、嗜热栖热菌
(Thermus thermophilus)(Tth)DNA聚合酶、黄栖热菌(Thermus flavusu)(Tfl)DNA聚合酶、沃氏火球菌(Pyrococcus woesei)(Pwo)DNA聚合酶、激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)
(Pfu)DNA聚合酶和Turbo Pfu DNA聚合酶、滨海嗜热球菌(Thermococcus litoralis)(Tli)
DNA聚合酶、火球菌属物种(Pyrococcus sp.)GB‑D聚合酶、海栖热袍菌(Thermotoga 
maritima)(Tma)DNA聚合酶、嗜热脂肪芽孢杆菌(Bacillus stearothermophilus)(Bst)DNA
聚合酶、Pyrococcus Kodakaraensis(KOD)DNA聚合酶、Pfx DNA聚合酶、热球菌属物种
(Thermococcus sp.)JDF‑3(JDF‑3)DNA聚合酶、高氏热球菌(Thermococcus gorgonarius)(Tgo)DNA聚合酶、嗜酸热球菌(Thermococcus acidophilium)DNA聚合酶;嗜酸热硫化叶菌
(Sulfolobus acidocaldarius)DNA聚合酶;热球菌属物种9°(Thermococcus sp.9°)N‑7DNA聚合酶;隐蔽热网菌(Pyrodictium occultum)DNA聚合酶;沃氏甲烷球菌(Methanococcus 
voltae)DNA聚合酶;热自养甲烷杆菌(Methanococcus thermoautotrophicum)DNA聚合酶;
詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)DNA聚合酶;硫还原球菌属(Desulfurococcus)
菌株TOK DNA聚合酶(D.Tok Pol);深海火球菌(Pyrococcus abyssi)DNA聚合酶;堀越火球
菌(Pyrococcus horikoshii)DNA聚合酶;海岛火球菌(Pyrococcus islandicum)DNA聚合
酶;烟生热球菌(Thermococcus fumicolans)DNA聚合酶;敏捷气热菌(Aeropyrum pernix)
DNA聚合酶;和异二聚体DNA聚合酶DP1/DP2。工程化的和修饰的聚合酶也可用于所公开的技术。例如,可以使用极端嗜热的海洋古菌热球菌属物种9°N(例如,来自New England 
BioLabs Inc.;Ipswich,MA的Therminator DNA聚合酶)的修饰变体。
[0138] 示例性RNA聚合酶包括,但不限于,病毒RNA聚合酶诸如T7 RNA聚合酶、T3聚合酶、SP6聚合酶和Kll聚合酶;真核生物RNA聚合酶,诸如RNA聚合酶I、RNA聚合酶II、RNA聚合酶III、RNA聚合酶IV和RNA聚合酶V;以及古菌RNA聚合酶。
[0139] 示例性逆转录酶包括但不限于来自人类免疫缺陷病毒1型(PDB 1HMV)的HIV‑1逆转录酶、来自人类免疫缺陷病毒2型的HIV‑2逆转录酶、来自Moloney鼠白血病病毒的M‑MLV逆转录酶、来自禽成髓细胞血症病毒的AMV逆转录酶和维持真核生物染色体端粒的端粒酶
逆转录酶。
[0140] 测序中的应用
[0141] 在流通池表面的结合区域上产生的扩增的核酸可以被测序。本文公开的方法可以用于多种测序平台,包括但不限于合成测序或结合测序(有时统称为掺入测序化学)、基于
pH的测序、通过聚合酶监测测序、通过杂交测序以及大规模平行测序或下一代测序的其他
方法。在一些实施方案中,如美国专利第10,077,470号中描述的进行测序,该美国专利通过引用以其整体并入本文。用于进行测序的合适的表面包括但不限于平面基底、水凝胶、纳米孔阵列、微粒或纳米颗粒。
[0142] 结合测序
[0143] 本文公开的用于进行RCA的方法、组合物和系统可以用于结合测序(SBB)的方法、组合物和系统。
[0144] 例如,在美国专利第10,443,098号和第10,246,744号以及美国专利申请公布第2018,0044727号中描述了结合测序,每一篇的内容通过引用以其整体并入本文。在SBB中,聚合酶在反应的离散步骤期间经历开放构象和封闭构象之间的构象转变。在一个步骤中,
聚合酶与引发的模板核酸结合以形成二元复合物,在本文中也被称为插入前构象。在随后
的步骤中,进入的核苷酸被结合,并且聚合酶指关闭,形成包含聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸的化学前构象,其中结合的核苷酸尚未被掺入。该步骤也被称为检查步骤。核苷酸可以被标记或未被标记。同样,聚合酶可以被标记或未被标记。检测步骤可以涉及提供引发的模板核酸,并且使引发的模板核酸与聚合酶(例如DNA聚合酶)和一个或更多个作为可能的
下一个正确核苷酸被研究的测试核苷酸接触。可以在检查步骤期间监测聚合酶构型和/或
与引发的模板核酸以及进一步与核苷酸的相互作用,以鉴定模板核酸中的下一个正确碱
基。因此,在一些实施方案中,SBB程序包括监测步骤,该监测步骤在测试核苷酸存在的情况下监测或测量聚合酶和引发的模板核酸之间的相互作用。在一些实施方案中,检查步骤确
定下一个正确核苷酸的身份,而不需要掺入该核苷酸(例如,不存在该核苷酸通过共价键与引物的3’‑末端化学连接,或在这之前)。例如,引发的模板核酸分子的引物可以包括封闭基团,该封闭基团阻止进入的核苷酸酶促掺入到引物中。检查步骤中使用的反应混合物可以
例如包含低水平或不足水平的催化金属离子,以阻止核苷酸化学掺入到引发的模板核酸的
引物中。在一些实施方案中,检查步骤中使用的反应混合物包含稳定三元复合物同时阻止
任何核苷酸掺入到引物中的稳定剂,诸如抑制聚合的非催化金属离子。
[0145] 通常,检查步骤涉及在包含一种或更多种核苷酸的反应混合物中将聚合酶结合至引发的模板核酸的聚合引发位点,以及监测相互作用。检查步骤通常包括以下子步骤:(1)提供引发的模板核酸(即,与可以任选地在其3’末端被阻断延伸的引物杂交的模板核酸分
子);(2)使引发的模板核酸与包含聚合酶和至少一种核苷酸的反应混合物接触;(3)在存在核苷酸并且没有任何核苷酸化学掺入到引发的模板核酸中的情况下,监测聚合酶与引发的
模板核酸分子的相互作用;以及(4)根据监测的相互作用确定模板核酸中下一个碱基的身
份(即,下一个正确的核苷酸)。检查通常涉及检测聚合酶与模板核酸的相互作用。检测可以包括光学手段、电学手段、热学手段、声学手段、化学手段和机械手段。在一些实施方案中,测序反应的检查步骤可以在任选的掺入步骤之前重复1次、2次、3次、4次或更多次。
[0146] 在SBB中,用于检查步骤的反应混合物可以包含1种、2种、3种或4种类型的核苷酸分子。核苷酸可以选自dATP、dTTP(或dUTP)、dCTP和dGTP。检查反应混合物可以包含一种或更多种三磷酸核苷酸和一种或更多种二磷酸核苷酸。三元复合物可以在引发的模板核酸、
聚合酶和四种核苷酸分子中的任何一种之间形成,使得可以形成四种类型的三元复合物。
[0147] 掺入步骤可以与检查步骤同时进行,或者可以与检查步骤分开。在SBB程序的一些实施方案中,检查步骤之后是掺入步骤,该掺入步骤将一个或更多个互补核苷酸添加至引
发的模板核酸的引物组分的3’末端。聚合酶、引发的模板核酸和新掺入的核苷酸产生化学后构象。化学前构象和化学后构象两者都可以被被称为三元复合物,各自都包含聚合酶、引发的模板核酸和核苷酸,其中聚合酶处于封闭状态,并且促进下一个正确的核苷酸和引发
2+
的模板核酸之间的相互作用。在掺入步骤期间,二价催化金属离子,诸如Mg ,介导涉及引物末端的3’‑羟基对焦磷酸酯(PPi)的亲核置换的化学步骤。聚合酶在PPi释放后返回开放状态。
[0148] 掺入步骤可以通过掺入反应混合物促进。掺入反应混合物可以具有不同于检查反应的核苷酸的组成。例如,检查反应可以包括一种类型的核苷酸,并且掺入反应可以包括另一种类型的核苷酸。通过另一个实例的方式,检查反应包括一种类型的核苷酸,并且掺入反应包括四种类型的核苷酸,反之亦然。检查反应混合物可以被掺入反应混合物改变或替换。
[0149] 在SBB程序的一些实施方案中,检查步骤之后是去除未掺入的标记的核苷酸,并且然后是引发的模板核酸的引物(或延伸的引物)的3’末端的去封闭,以便使其适合于延伸。
然后添加未标记的3’封闭的核苷酸,随后进行化学掺入步骤,其中形成磷酸二酯键,伴随着从核苷酸的焦磷酸裂解(核苷酸掺入),以形成延伸链,该延伸链已经延伸了一个碱基,并且在没有修饰的情况下不能进一步延伸。去除未掺入的封闭的延伸碱基并且添加标记的碱
基,使得它们可以在与模板碱基配对的位置形成三元复合物。测定这些三元复合物的荧光
或其他输出,以确定配对碱基的身份,并且然后通过去除标记的碱基、化学修饰延伸链以暴露3’OH,并且与3’封闭的未标记的核苷酸的群体接触以获得另一个单碱基延伸,重复该过程。
[0150] 合成测序
[0151] 本文公开的用于进行RCA的方法、组合物和系统可以用于合成测序(SBS)的方法、组合物和系统。
[0152] SBS通常涉及通过针对与引物杂交的模板链迭代添加核苷酸来对新生引物进行酶促延伸。SBS与上述SBB的不同之处在于,标记的核苷酸被掺入到延伸链中,被测定,并且然后标记被去除或失活,并且3’封闭被去除,以迭代地测序模板。在SBB中,标记的碱基不被掺入到延伸链中。相反,三元复合物的形成被测定,通常是针对标记的碱基的存在,但有时是针对标记的聚合酶的存在或其他特征,之后复合物被分解,并且将3’封闭的未标记的碱基用于延伸引物链。简言之,SBS可以通过使附接至流通池中的位点的靶核酸与一个或更多个标记的核苷酸、DNA聚合酶等接触来引发。那些使用靶核酸作为模板延伸引物的位点将掺入可以检测的标记的核苷酸。检测可以包括使用本文阐述的设备或方法进行扫描。例如,标记的核苷酸还可以包括在核苷酸已经被添加到引物之后使进一步的引物延伸终止的可逆终
止性质。例如,具有可逆终止子部分的核苷酸类似物可以被添加到引物,使得随后的延伸不能发生,直到去封闭剂被递送以去除该部分。因此,对于使用可逆终止的实施方案,去封闭剂可以被递送到容器(在检测发生之前或之后)。可以在各递送步骤之间进行洗涤。循环可
以进行n次,以将引物延伸n个核苷酸,从而检测长度n的序列。例如,在Bentley等人,Nature 
456:53‑59(2008),WO 04/018497;WO 91/06678;WO 07/123744;美国专利第7,057,026号;
第7,329,492号;第7,211,414号;第7,315,019号或第7,405,281号和美国专利申请公布第
2008/0108082 A1号中描述了可以容易地适用于本公开内容的方法、系统或设备的示例性
SBS程序、试剂和检测部件,文献中每一篇都通过引用并入本文。
[0153] 系统
[0154] 本文公开的用于核酸扩增、检测和/或测序的系统可以包括用于进行核酸扩增、检测和/或测序的容器、固体支持物或其他设备。例如,系统可以包括阵列、流通池、多孔板、试管、基底中的通道、液滴或囊泡的集合、托盘、离心管、管道或其他方便的设备。设备可以是可移除的,从而允许其被放置到系统中或从系统中去除。因此,系统可以被配置为顺序地或并行地处理多于一个设备(例如容器或固体支持物)。该系统可以包括流体部件,该流体组
件被配置为例如经由通道或液滴转移设备(例如,电润湿设备)将一种或更多种试剂(例如,溶液中的一种或更多种试剂)递送至容器或固体支持物。多种检测设备中的任何一种都可
以被配置为检测其中试剂相互作用的容器或固体支持物。示例性系统具有流体部件和检测
部件,这些部件在以下中阐述:美国专利申请公布第2018/0280975A1号;美国专利第8,241,
573号;第7,329,860号或第8,039,817号;或者美国专利申请公布第2009/0272914A1号或第
2012/0270305A1号,这些文献中的每一篇通过引用并入本文。
[0155] 在一些实施方案中,用于核酸扩增的系统包括流通池,该流通池上分布有多于一个结合区域,每个结合区域附接有本文描述的多于一个寡核苷酸A和多于一个寡核苷酸B。
寡核苷酸A被设计成与待扩增的模板核酸的一部分互补,而寡核苷酸B被设计成与模板核酸
的不同部分大体上相同。在一些实施方案中,多于一个结合区域或结合区域的群体可以附
接有通用寡核苷酸引物,使得相同的寡核苷酸A和寡核苷酸B呈现在结合区域上。
[0156] 在至少一些先前描述的实施方案中,在实施方案中使用的一个或更多个要素可以互换地用于另一种实施方案中,除非这样的替换在技术上不可行。本领域技术人员将理解,在不偏离所要求保护的主题的范围的情况下,可以对上文描述的方法和结构进行多种其他
的省略、添加和修改。所有这样的修改和改变都旨在落在由所附权利要求限定的主题的范
围内。
[0157] 关于本文中基本上任何复数和/或单数术语的使用,在对于上下文和/或应用适当的情况下,本领域技术人员可以从复数转换为单数和/或从单数转换为复数。为了清楚起
见,可以在本文明确阐述各种单数/复数排列。如本说明书和所附权利要求书中使用的,单数形式“一(a)”、“一(an)”和“所述/该(the)”包括复数指代物,除非上下文另外明确指示。
除非另外说明,否则在本文中对“或”的任何提及旨在涵盖“和/或”。
[0158] 本领域技术人员将理解,通常,本文使用的术语,并且特别是所附权利要求书(例如,所附权利要求书的主体)中的术语,通常旨在作为“开放性的”术语(例如,术语“包括/包含(including)”应解释为“包括但不限于(including but not limited to)”,术语“具有(having)”应解释为“具有至少(having at least)”,术语“包括/包含(includes)”应解释为“包括但不限于(includes but is not limited to)”等)。本领域技术人员将进一步理解,如果意图所介绍的权利要求陈述中的特定数字,则这样的意图将明确地陈述于权利要
求中,并且在这种陈述不存在的情况下,不存在这种意图。例如,作为对理解的帮助,以下所附权利要求可以包含介绍性措辞“至少一种”和“一种或更多种”的使用,以介绍权利要求陈述。然而,此类措辞的使用不应解释为意味着由不定冠词“一(a)”或“一(an)”介绍权利要求陈述会将任何包含此类介绍的权利要求陈述的具体权利要求限制到包含仅一种此类陈述
的实施方案,甚至当同一权利要求包括介绍性措辞“一种或更多种”或“至少一种”以及不定冠词诸如“一(a)”或“一(an)”时也是如此(例如,“一(a)”和/或“一(an)”应解释为意指“至少一种”或“一种或更多种”);这对于使用定冠词来介绍权利要求陈述同样适用。此外,即使明确地陈述了介绍的权利要求陈述的特定数字,本领域技术人员将认识到,此类陈述应解
释为意指至少所陈述的数字(例如,仅陈述“两种陈述”而没有其他修饰词意指至少两种陈述或两种或更多种陈述)。此外,在使用类似于“A、B和C等中的至少一种”的惯例的那些情况下,通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例如,“具有A、B和C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A,具有单独的B,具有单独的C,A和B一起,A和C一起,B和C一起,和/或A、B和C一起等的系统)。在使用类似于“A、B或C等中的至少一种”的惯例的那些情况下,通常这种句法结构意图为本领域技术人员将理解该惯例的意义(例
如,“具有A、B或C中的至少一种的系统”将包括但不限于具有单独的A,具有单独的B,具有单独的C,A和B一起,A和C一起,B和C一起,和/或A、B和C一起等的系统)。本领域技术人员将进一步理解,实际上,无论在说明书、权利要求书还是在附图中,呈现两个或更多个替代术语的任何分离性词语和/或措辞应被理解为考虑到包括术语之一、任一术语或两个术语的可
能性。
[0159] 此外,当本公开内容的特征或方面以马库什组(Markush group)描述时,本领域技术人员将意识到本公开内容还由此以马库什组的任何个体成员或成员子组描述。
[0160] 如本领域技术人员将理解的,为了任何和所有目的,诸如在提供书面描述方面,本文公开的所有范围还包括该范围的任何和所有可能的子范围和子范围的组合。任何列出的范围都可以容易地被识别为充分描述并使相同的范围能被分解为至少相等的一半、三分之
一、四分之一、五分之一、十分之一等。作为非限制性实例,本文讨论的每个范围可以容易地分解为下三分之一、中三分之一和上三分之一等。如本领域技术人员还将理解的,所有语
言,诸如“多达”、“至少”、“大于”、“小于”等包括所陈述的数字,并且指可以随后分解为如上文讨论的子范围的范围。最后,如本领域技术人员将理解的,范围包括每个单独的成员。因此,例如,具有1‑3个物品的组指的是具有1个、2个或3个物品的组。类似地,具有1‑5个物品的组指的是具有1个、2个、3个、4个或5个物品的组,等等。
[0161] 尽管本文已经公开了各种方面和实施方案,但其他方面和实施方案对本领域技术人员将是明显的。本文公开的各种方面和实施方案用于说明的目的而并不旨在限制,且实
际范围和精神由附随权利要求指示。